Summary
عادة ما تدرس تفاعلات عوامل النسخ (TFs) مع بوليميراز الحمض النووي الريبي باستخدام اختبار السحب. نحن نطبق تقنية قياس التداخل الحيوي (BLI) لتوصيف تفاعل GrgA مع بوليميراز الحمض النووي الريبي الكلاميديا. بالمقارنة مع الاختبارات المنسدلة، بلي يكشف في الوقت الحقيقي الارتباط والتفكك، ويقدم حساسية أعلى، وكمية للغاية.
Abstract
عامل النسخ (TF) هو البروتين الذي ينظم التعبير الجيني من خلال التفاعل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي، TF آخر، و / أو قالب الحمض النووي. GrgA هو منشط النسخ رواية وجدت على وجه التحديد في الممرض البكتيري داخل الخلايا ملزمة الكلاميديا. وقد كشفت اختبارات سحب البروتين باستخدام الخرز التقارب أن GrgA يربط عاملين، وهما66 و 28 ، والتي تعترف مجموعات مختلفة من المروجين للجينات التي هي مطلوبة بشكل تفاضلي في مراحل التنمية. وقد استخدمنا هذا النظام لتأكيد التفاعلات ومواصلة توصيفها. BLI يوضح العديد من المزايا على الانسحاب: 1) فإنه يكشف في الوقت الحقيقي الارتباط والتفكك بين الشركاء ملزمة، 2) أنه يولد المعلمات الحركية الكمية، و 3) فإنه يمكن الكشف عن الروابط التي غالبا ما تفشل الاختبارات المنسدلة للكشف. وقد مكنتنا هذه الخصائص من استنتاج الأدوار الفسيولوجية للGrgA في تنظيم التعبير الجيني في الكلاميديا، وآليات التفاعل التفصيلية الممكنة. ونحن نتصور أن هذه التكنولوجيا بأسعار معقولة نسبيا يمكن أن تكون مفيدة للغاية لدراسة النسخ والعمليات البيولوجية الأخرى.
Introduction
النسخ، الذي ينتج جزيئات الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي كقالب، هو الخطوة الأولى جدا من التعبير الجيني. يبدأ تخليق الحمض النووي الريبي البكتيري بعد ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) الهولوإنزيم إلى المروج المستهدف1،2. يتكون إنزيم الهولوانزيم RNAP (RNAPholo) من نواة محفزة متعددة الوحدات الفرعية (RNAPcore) وعامل ، وهو مطلوب للتعرف على تسلسل المروج. تقوم أجهزة النسخ وأجهزة الكبت، التي يطلق عليها مجتمعة بـ TFs، بتنظيم التعبير الجيني من خلال المكونات الملزمة لـ RNAPcore، و/أو العوامل، و/أو الحمض النووي. اعتمادا على الكائن الحي، يمكن تخصيص جزء كبير من الجينوم لTFs التي تنظم النسخ استجابة للاحتياجات الفسيولوجية والعظة البيئية3.
الكلاميديا هي بكتيريا داخل الخلايا ملزمة مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأمراض في البشر والحيوانات4،5،6،7،8. على سبيل المثال، يمكن القول أن الكلاميديا تراخوماتيهوال هو الممرض رقم واحد المنقولة جنسيا في البشر في جميع أنحاء العالم، والسبب الرئيسي للعمى في بعض البلدان المتخلفة4،5. الكلاميديا لديها دورة تنموية فريدة من نوعها تتميز باثنين من الأشكال الخلوية بالتناوب تسمى الجسم الابتدائي (EB) والجسم reticulate (RB)9. في حين أن الـ EBs قادرة على البقاء في بيئة خارج الخلية، فهي غير قادرة على الانتشار. تدخل الـ EBs الخلايا المضيفة من خلال بطانة الرحم وتفرق في الـ RBs أكبر في vacuole في السيتوبلازم المضيف في غضون ساعات بعد التلقيح. لم تعد معدية، تنتشر الـ RBs من خلال الانشطار الثنائي. حوالي 20 ساعة، فإنها تبدأ في التمييز مرة أخرى إلى EBs، التي تخرج من الخلايا المضيفة حول 30-70 ساعة.
يتم تنظيم تطور دورة النمو الكلاميديا عن طريق النسخ. في حين يتم التعبير عن الغالبية العظمى من الجينات الكلاميديا ما يقرب من 1000 خلال الدورة المتوسطة التي يتم خلالها تكرار RBs بنشاط، يتم نسخ عدد قليل فقط من الجينات مباشرة بعد دخول EBs إلى الخلايا المضيفة لبدء تحويل يتم نسخ EBs إلى RBs، ومجموعة صغيرة أخرى من الجينات أو نسخها بشكل متزايد لتمكين التمايز بين RBs في EBs10و11.
الجينوم الكلاميديا ترميز ثلاثة عوامل ، وهي66،28 و54. 66، وهو ما يعادل التدبير المنزلي 70 من القولونية والبكتيريا الأخرى ، هو المسؤول عن التعرف على المروجين للجينات في وقت مبكر ومنتصف دورة فضلا عن بعض الجينات في وقت متأخر ، في حين أن28 و54 مطلوبة ل نسخ بعض الجينات المتأخرة. ومن المعروف أن العديد من الجينات تحمل كل من المروج66التابعة والمروج28تعتمدعلى 12.
على الرغم من دورة التنمية المعقدة، تم العثور على عدد قليل فقط من TFs في الكلاميديا13. GrgA (مشروح سابقا كبروتين افتراضي CT504 في C. التراخوماتيسي المصلي D و CTL0766 في C. التراخوماتيس L2) هو TF الكلاميديا محددة المعترف بها فيالبداية كمنشط من الجينات المعتمدةعلى 6614. وقد أظهرت اختبارات الانسحاب التقارب أن GrgA ينشط النسخ عن طريق ربط كل من66 والحمض النووي. ومن المثير للاهتمام، تم العثور عليه في وقتلاحق مع أن GrgA أيضا شارك في التعجيل مع 28 ، وينشط النسخ من المروجين28تعتمد في المختبر15. للتحقيق في ما إذا كان GrgA لديه تقارب مماثل أو مختلف ل66 و 28 ، لجأنا إلى استخدام BLI. وقد أظهرت الاختبارات BLI أن GrgA يتفاعل مع 66 في تقارب أعلى 30 أضعاف من مع28، مما يشير إلى أن GrgA قد تلعب أدوارا تفاضلية في 66 - النسخ المعتمدة و28 - النسخ تعتمد على 15.
يكتشف BLI نمط التداخل للضوء الأبيض الذي يعكس من طبقة من البروتين المعطلة على طرف جهاز استشعار حيوي ويقارنه بطبقة المرجع الداخلي16. ومن خلال تحليل هذين النوعين من التداخل، يمكن لـ BLI توفير معلومات قيمة وفي الوقت الحقيقي عن كمية البروتين المرتبطة بطرف جهاز الاستشعار الحيوي. يُشار إلى البروتين المعطلة إلى طرف جهاز الاستشعار الحيوي باسم الرباط، ويتم تعطيله بشكل عام بمساعدة جسم مضاد شائع أو علامة epitope (على سبيل المثال، علامة بولي-له أو البيوتين) التي لها تقارب للجسيمات المرتبطة بها (مثل NTA أو NTA أو NTA Streptavidin) على طرف جهاز الاستشعار الحيوي. ربط بروتين ثانوي، يشار إليه باسم analyte، مع الرباط في طرف جهاز الاستشعار الحيوي يخلق تغييرات في عتامة جهاز الاستشعار الحيوي، وبالتالي يؤدي إلى تغييرات في أنماط التداخل. عندما تتكرر على تركيزات مختلفة من analyte، يمكن أن توفر BLI ليس فقط معلومات نوعية ولكن أيضا كمية حول التقارب بين ligand وanalyte16.
على حد علمنا، كنا أول من استخدم BLI لوصف التفاعلات البروتين البروتين في النسخ15. في هذا المنشور، نثبت أن جزء GrgA، الذي ثبتفي السابق أنه مطلوب لـ 28-binding، يتوسط بالفعل في الإلزام. تركز هذه المخطوطة على خطوات من الاختبارات BLI، وتوليد الرسوم البيانية BLI والمعلمات من الحركية ملزمة. لا يتم تغطية طرق لإنتاج (وتنقية) من الأربطة وanalytes هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد البروتينات
- استخدام كيس غسيل الكلى (مع حجم قطع المناسبة) لdialyze كل بروتين لاستخدامها في الاختبارات BLI (بما في ذلك كل من ligand له الموسومة وanalyte) ضد 1000 وحدة التخزين من المخزن المؤقت BLI (25 mTs-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 ، 0.1 m DTT، درجة الحموضة 8.0، قبل المبردة إلى 4 درجة مئوية) في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
ملاحظة: تتطلب الاختبارات BLI أن تكون الأربطة موجودة في التركيزات التي تشبع مواقع الربط على جهاز الاستشعار الحيوي وanalyte لتكون عالية النقاء بحيث تكون تركيزات الأضراس من analyte التي تتفاعل مع الرباط. لا يتم تغطية منهجيات التعبير وتنقية البروتينات له والعقدية الموسومة هنا، ولكن يمكن العثور عليها في المنشورات السابقة14،15. على الرغم من أن هذا النظام لا يتطلب الرباط أن تكون في شكل منقى للغاية، فمن الضروري أن dialyze حتى الأربطة غير المنقية إلى المخزن المؤقت BLI من أجل تقليل التحولات في أنماط التداخل الضوء الأبيض الناجمة عن أي تغييرات العازلة أثناء فحص. - قم بالتبديل إلى المخزن المؤقت الجديد BLI ومواصلة غسيل الكلى لمدة 4 ساعة أخرى.
2. ترطيب أجهزة الاستشعار الحيوي والإعداد اختبار
- حوالي 10 دقائق قبل بدء التصاق، ماصة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت BLI في أنبوب PCR.
- إزالة جهاز استشعار ني-NTA-الحيوي من التعبئة والتغليف الأصلي عن طريق عقد جزء واسع من جهاز الاستشعار الحيوي باستخدام يد القفاز.
- ضع جهاز الاستشعار الحيوي فوق أنبوب PCR بحيث يتم غمر الطرف الزجاجي فقط للمستشعر الحيوي في المخزن المؤقت BLI.
- حافظ على طرف الاستشعار الحيوي مغمورًا لمدة 10 دقائق على الأقل لضمان الترطيب الكامل.
- تحقق من أن الطرف الزجاجي للمستشعر الحيوي Ni-NTA لا تلمس أي شيء آخر غير المخزن المؤقت BLI أثناء الخطوة أعلاه.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول جهاز استشعار حيوي Ni-NTA بالاقتران مع ligand له الموسومة. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام جهاز استشعار SA-Streptavidin-biosensor بالاقتران مع الرباط biotinylated بدلا ً من ذلك إذا: '1' كل من الرباط وanalyte تحمل علامته أو (2) لا أحد منهما.
- تحقق من أن الطرف الزجاجي للمستشعر الحيوي Ni-NTA لا تلمس أي شيء آخر غير المخزن المؤقت BLI أثناء الخطوة أعلاه.
- قم بتشغيل آلة BLItz.
- تأكد من توصيل الجهاز بالكمبيوتر من خلال منفذ إخراج بيانات USB في الجزء الخلفي من الجهاز.
- على الكمبيوتر، افتح البرنامج المقترن (على سبيل المثال، BLItz Pro)، وانقر على الحركية المتقدمة على الجانب الأيسر من الشاشة.
- على البرنامج، اكتب كافة المعلومات المناسبة حول التجربة (بما في ذلك اسم التجربة والوصف ومعرف العينة وتركيز البروتين) تحت كل عنوان.
- انقر على نوع المستشعر الحيوي واختر Ni-NTA من القائمة المنسدلة.
- ضمن عنوان تشغيل الإعدادات، تحقق من تعيين شاكر إلى تمكين.
- ضمن عنوان "قائمة نوع الخطوة"، تحقق من وجود 5 عناصر مسرودة: الأساس الأولي، التحميل، الأساس، الاقتران، والتفكك.
ملاحظة: يمكن تغيير مدة كل خطوة من الافتراضي حسب الحاجة. للحصول على أفضل النتائج، استخدم ما لا يقل عن 30 ق للخط الأساس الأولي والأساس؛ و120 s للرابطة والتفكك. وستتوقف مدة خطوة التحميل (التي تتراوح بين 120 و240 ق) على تركيز الرباط والتقارب بين علامة النعت على الرباط إلى جهاز الاستشعار البيولوجي Ni-NTA.
- قم بإزالة مستشعر ني-NTA-الحيوي المرطب من أنبوب PCR ولصقه على حامل أجهزة الاستشعار الحيوية على الجهاز عن طريق انزلاق الجزء الواسع من جهاز الاستشعار الحيوي على الجبل.
ملاحظة: لا تدع جهاز الاستشعار الحيوي يجف أثناء التجربة. - وضع أنبوب الطرد المركزي الأسود 0.5 مل في حامل أنبوب من الجهاز وماصة 400 درجة مئوية من المخزن المؤقت BLI في ذلك.
- تحقق من وضع شريط التمرير الخاص بالجهاز بحيث يقع حامل الأنبوب أمام السهم الأسود على الجهاز.
- أغلق غطاء الجهاز بحيث يصبح طرف جهاز الاستشعار الحيوي مغمورًا في المخزن المؤقت في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- انقر فوق التالي على البرنامج لبدء تسجيل الأساس الأولي.
3. تحميل الرباط على أجهزة الاستشعار الحيوي
- بعد انتهاء خطوة "الأساس الأولي" من التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
- حرك شريط التمرير إلى اليمين بحيث يقع حامل الإسقاط (بدلاً من حامل الأنبوب) أمام السهم الأسود.
- ماصة 4 ميكرولتر من ligand له الموسومة dialyzed (من الخطوة 1.1) على حامل قطرة وإغلاق غطاء الجهاز.
ملاحظة: قد يختلف التركيز الأمثل للربط لاستخدامها لكل بروتين. التركيز بين 1.0 إلى 2.0 ملغ/مل عادة ما يكون كافياً لتشبع NTA في طرف جهاز الاستشعار الحيوي في 240 s. - على البرنامج، انقر فوق التالي لبدء التحميل.
4. غسل بعيدا الرباط إضافية
- بعد الانتهاء من خطوة التحميل التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
- حرك شريط التمرير إلى اليسار بحيث يقع حامل الأنبوب مرة أخرى أمام السهم الأسود.
- أغلق غطاء الجهاز وتأكد من غمر طرف جهاز الاستشعار الحيوي في المخزن المؤقت BLI للأنبوب في حامل الأنبوب.
- انقر فوق التالي مرة أخرى على البرنامج لبدء تسجيل الأساس.
5. رابطة أناليت إلى ليكان
- بعد انتهاء خطوة الأساس من التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
- إزالة حامل قطرة وتنظيفها عن طريق الأنابيب من أي بروتين والرينة مع الماء منزوع الأيونات مزدوجة (ddH2O) لما مجموعه 5 مرات.
- استخدام مسح الأنسجة لتنظيف سطح حامل قطرة بعد الغسيل.
- استبدل حامل الإسقاط مرة أخرى على الجهاز.
- حرك شريط التمرير على الجهاز إلى اليمين بحيث يقع حامل الإسقاط مرة أخرى أمام السهم الأسود.
- ماصة 4 ميكرولتر من analyte dialyzed (من الخطوة 1.1) على حامل قطرة وإغلاق غطاء الجهاز.
- على البرنامج، انقر فوق التالي لبدء الاقتران.
6. فصل analyte من ligand
- بعد الانتهاء من خطوة اقتران التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
- حرك شريط التمرير على الجهاز إلى اليمين بحيث يقع حامل الأنبوب مرة أخرى أمام السهم الأسود.
- على البرنامج، انقر فوق التالي لبدء التفكك.
- بعد الانتهاء من خطوة التفكك التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
- إزالة حامل قطرة وحامل أنبوب.
- شطف على حد سواء مع ddH2O جيدا لغسل أي بروتين.
- إزالة جهاز الاستشعار الحيوي والتخلص منه بأمان.
7- تكرار التفاعلات مع تركيزات مختلفة
- كرر الخطوات 2-7 لنفس زوج ligand-analyte باستخدام تركيزات analyte مختلفة.
ملاحظة: قد تحتاج إلى تعديل تركيز analyte عبر عدة أشواط قبل الحصول على النتائج المثلى. في تجربتنا، نسبة 1:5:10 من تركيزات analyte، بدءا من 75 nM، وعادة ما تكون كافية.
8. تحليل البيانات باستخدام البرنامج
- بمجرد الانتهاء من جميع المسارات، احفظ البيانات على البرنامج بالنقر فوق ملف ثم حفظ التجربة باسم على الجانب الأيسر من الشاشة.
- ضمن عنوان تشغيل البيانات، حدد تصحيح الخطوة وتركيبها (1:1) وانقر فوق تحليل لإنشاء بيانات حركية.
- لاستخراج البيانات الكمية إلى ورقة عمل وإنشاء الرسوم البيانية، انقر على تصدير إلى CSV وحفظ البيانات المسجلة كملف .csv. افتح ملف .csv باستخدام برنامج جدول البيانات.
- لإظهار حركية الاقتران والتفكك بشكل أكثر فعالية، قم بإزالة كافة نقاط الرسم قبل خطوة الأساس، وتطبيع كافة نقاط الرسم اللاحقة من قيمة الأساس النهائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من خلال اختبارات BLI، أنشأنا سابقا أن ربط GrgA إلى28 يعتمد على 28 الأحماض الأمينية المنطقة الوسطى (بقايا 138-165) من GrgA15. وفقا لذلك، بالمقارنة مع N-terminally له الموسومة طول كامل GrgA (NH-GrgA)، وإزالة GrgA بناء تفتقر إلى هذه المنطقة (NH-GrgAΔ138-165) كان انخفاض معدل الارتباط وزيادة معدل التفكك، مما أدى إلى فقدان 3 ملايين أضعاف من إجمالي التقارب(الجدول1). هنا، ونحن نثبت أن هذه المنطقة الوسطى يربط مباشرة28 في غياب بقية البروتين GrgA. في هذه التجارب، تم استخدام المنطقة الوسطى الموسومة مع N-terminally له العلامة (NH-GrgA138-165) كما ligand، الذي تم شل لأول مرة إلى غيض من جهاز استشعار حيوي Ni-NTA (الشكل1A). بعد غسل غير منضم NH-GrgA138-165 قبالة جهاز الاستشعار الحيوي، تم تسجيل الارتباط في الوقت الحقيقي مع analyte 28 بعد إضافة28. وأخيرا، تم تسجيل التفكك في الوقت الحقيقي بعد الغسيل. يتم عرض تسجيلات التجارب مع ثلاثة تركيزات analyte مختلفة بدءا من 30 ثانية قبل ربط ligand وتنتهي 2 دقيقة بعد بداية الغسيل في الشكل 1A. لتصور أفضل للتفاعل ligand-analyte، ونحن إزالة البيانات قبل إضافة ligand وإعادة تعيين خط الأساس إلى 0 لاشتقاق الشكل 1B.
وترد في الجدول 1قيم البارامترات الحركية للتفاعل بين جزء NH-Grga138-165 مع28. بالمقارنة مع NH-GrgA X 28 التفاعل, عرض NH-GrgA138-165 X €28 اتجاه انخفاض كبير إحصائيا 60% في كأ, زيادة كبيرة إحصائيا 64% في كد ، وزيادة كبيرة إحصائيا 3.5 أضعاف في KD. هذه التغييرات تبين أنه بالمقارنة مع NH-GrgA، NH-GrgA138-165 يربط28 ببطء أكثر، ينفصل عن28 أسرع، ولها تقارب إجمالي مع 28 . لذلك، بقايا 138-165 في GrgA يربط28 ولكن مع انخفاض التقارب مقارنة مع طول كامل GrgA.
الشكل 1: A 28 الأحماض الأمينية المنطقة الوسطى من GrgA يربط28 في المختبر.
(أ) التغيرات في الوقت الحقيقي في أنماط التداخل الضوئي المسجلة في أربع مراحل: '1' ربط NH-GrgA138-165 (Ligand) بجهاز استشعار حيوي Ni-NTA، '2' غسل، '3' ربط NS-28 (Analyte) بتركيزات مختلفة للمعوّق NH-GrgA-138-165 (Ligand)، و '4' غسل اللاحقة. (ب) تعزيز التصور من الارتباط ligand-analyte وتفكك بعد إزالة القيم في المرحلتين الأولى والثانية من (أ) وإعادة تعيين خط الأساس. تم تعديل اللوحة B من Desai وآخرون، 201815. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ليكان | ن | كأ | كد | KD | مراجع | |||||||||||
| 1/مللي ثانية | النسبة المئوية للتحكم | 1/ ث | النسبة المئوية للتحكم | م | النسبة المئوية للتحكم | |||||||||||
| إن إتش -جرجا | 8 | (1.5 ± 1.7) × 104 | 100 | (2.8 ± 0.8) × 10-3 | 100 | (2.2 ± 0.3) × 10-7 | 100 | ديساي وآخرون، 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ138-165 | 2 | (5.6 ± 0.1) × 103 | 37 | (4.1 ± 0.3) × 102 | 1.5 × 107 | (6.9 ± 4.5) × 10-2 | 3.1 x 108 | ديساي وآخرون، 2018 | ||||||||
| p= 0.125 | p<0.002 | p<0.001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6.0 ± 1.0) × 103 | 40 | (4.6 ± 0.4) × 10-3 | 164 | (7.7 ± 0.3) × 10-7 | 350 | هذه الدراسة | ||||||||
| ص = 0.074 | p = 0.006 | p<0.001 | ||||||||||||||
الجدول 1: متحولة من GrgA، تحتوي على بقايا الأحماض الأمينية فقط 138-165، يربط28 على الرغم من انخفاض التقارب مقارنة مع GrgA كامل طول.
تم إجراء الاختبارات BLI مع أجهزة الاستشعار الحيوية Ni-NTA باستخدام له الموسومة كامل طول GrgA أو حذف المسوخ كما ligands وتنقية العقدية الموسومة28 كما analyte. وترد الرسوم البيانية للتسجيلات في الشكل 1. تم إنشاء قيم المعلمات الحركية (المتوسطات ± الانحرافات المعيارية) مع البرنامج المرتبطبها 17. (ك) (a) (ثابت معدل الاقتران) يتم تعريفه على أنه عدد المجمعات التي تتشكل لكل ثانية في حل مولي 1 من A و B. kd (ثابت معدل التفكك) يتم تعريفه على أنه عدد المجمعات التي تتحلل في الثانية. كاف D (ثابت توازن التفكك)، ويعرف بأنه التركيز الذي يتم فيه احتلال 50٪ من مواقع ربط الأربطة من قبل analytes، هو كد مقسوما على كأ. n، عدد التكرارات التجريبية. تم حساب قيم p باستخدام اختبارات t للطلاب ذي الذيل 2. وكانت المعلمات الحركية لNH-GrgA وNH-GrgAΔ138-165 من Desai وآخرون، 201815.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التفاعلات البروتين البروتينية حاسمة لتنظيم النسخ والعمليات البيولوجية الأخرى. يتم دراستها الأكثر شيوعا من خلال الاختبارات الانسحاب. وعلى الرغم من أن عمليات السحب سهلة الأداء نسبياً، فإنها كمية سيئة وقد تفشل في الكشف عن تفاعلات ضعيفة ولكنها ذات مغزى من الناحية البيولوجية. في المقابل، من خلال الكشف عن الارتباط في الوقت الحقيقي والتفكك بين الرباط وanalyte، يوفر BLI الارتباط والتنافر معدل الثوابت، فضلا عن، التقارب العام.
بالمقارنة مع الاختبارات المنسدلة، والاختبارات BLI توفر حساسية أعلى. على سبيل المثال، يتم الكشف عن التفاعلات GrgA-28 مع تركيزات nM أقل من analytes من قبل BLI ولكن ليس عن طريق الاختبارات المنسدلة (البيانات غير المنشورة). على عكس الانسحاب، لا تعتمد BLI على جسم مضاد للكشف، مما قد يؤثر بشكل كبير على الحساسية.
والأهم من ذلك، يمكن أن توفر تحليلات BLI رؤى ميكانيكية في التفاعل بين البروتينات، في حين أن الاختبارات المنسدلة لا يمكن. ويتجلى ذلك في تفاعلات28 مع بنيات GrgA المختلفة. بالمقارنة مع NH-GrgA، NH-GrgAΔ138-165 وNH-GrgA138-165 تعاني فقط خسارة 60٪ في كأ في ملزمة28. هذه النتائج تتفق مع بيانات BLI السابقة التي تبين أن GrgA تفتقر إلى المخلفات N-المحطة الطرفية 64 لديه تقارب انخفاض مع28، مما يشير إلى أن التسلسل N-المحطة الطرفية من GrgA يساهم في 28 ملزمة. على الرغم من أن NH-GrgAΔ138-165 وNH-GrgA138-165 لها قيم مماثلة ك في ملزمة28، الأول لديه 91،000 أضعاف أعلى كد من هذا الأخير. وتشير هذه النتائج إلى أن الربط من 138-165 يؤدي إلى تغييرات هيكلية في GrgA، وتحقيق الاستقرار إلى حد كبير في المجمع.
مع تاريخ أطول من BLI، يمكن أيضا الرنين بلازمون السطح (SPR) قياس التفاعلات البروتين البروتين في الوقت الحقيقي18،19. وفي حين يعتقد أن حساسية BLI أقل من حساسية تقرير أداء البرنامجالخاص 20،فإن الأولى تتفوق حالياً على هذه الأخيرة من حيث الفعالية من حيث التكلفة. فعلى سبيل المثال، تكون تكاليف أجهزة الاستشعار الأحيائي SPR أعلى بكثير من تكاليف أجهزة الاستشعار الأحيائية BLI.
بسبب طبيعة المبدأ الأساسي من SPR، فإنه يتأثر بشدة من قبل microfluidics من وسائل الإعلام المحيطة بالبروتين. لذلك، فإن التجارب التي تنطوي على بعض أدوات SPR تتطلب تصورا كبيرا من جانب الباحث لضمان الظروف العازلة المثلى21،22،23،24. ومن ناحية أخرى، تتميز أجهزة BLI الحالية بنطاق محدود جداً للتحكم في درجة الحرارة25، وعلى هذا النحو، فهي غير مهيأة لتحديد المعلمات الدينامية الحرارية (مثل الطاقة الخالية من الطاقة الناثبية وجيبز) للتفاعل المحدد.
الجلسرين، وهو يستخدم عادة cryoprotectant، غير متوافق مع BLI، على الرغم من توافقه الكيميائي الواسع. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لإزالة الجلسرين من الرباط وanalyte عن طريق غسيل الكلى. يجب تخزين البروتينات الخالية من الجلسرين الناتجة عند 4 درجة مئوية، مما قد يؤدي إلى زيادة عدم الاستقرار والمعلمات الحركية غير الدقيقة. نوصي بإجراء الاختبارات BLI بعد وقت قصير من غسيل الكلى، لا سيما إذا تم الحصول على المعلمات الحركية غير متناسقة من في أوقات مختلفة. ويختلف الإطار الزمني الدقيق الذي ينبغي أن تكتمل فيه الاختبارات التي ينبغي أن يتم خلالها إعداد الدراسة بـ BLI بين البروتينات ويتأثر بتركيزاتها.
كما هو الحال مع SPR، وقد استخدمت BLI لفحص جزيء صغير26. وبالنظر إلى أن أحدث أدوات BLI توفر خيارات الإنتاجية العالية للفحص، فإننا نتصور أن BLI يمكن أن تصبح مفيدة جدا لتحديد وتوصيف الجزيئات الصغيرة التي تسهل أو تتداخل مع تفاعلات البروتين والبروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (المنح رقم AI122034 وAI140167) ومؤسسة نيو جيرسي الصحية (Grant # PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
