Summary
Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren (TFs) mit der RNA-Polymerase werden in der Regel mit Pulldown-Assays untersucht. Wir wenden eine Biolayer Interferometry (BLI) Technologie an, um die Wechselwirkung von GrgA mit der Chlamydien-RNA-Polymerase zu charakterisieren. Im Vergleich zu Pulldown-Assays erkennt BLI Echtzeit-Assoziation und Dissoziation, bietet eine höhere Empfindlichkeit und ist sehr quantitativ.
Abstract
Ein Transkriptionsfaktor (TF) ist ein Protein, das die Genexpression reguliert, indem es mit der RNA-Polymerase, einem anderen TF und/oder Schablonen-DNA interagiert. GrgA ist ein neuartiger Transkriptionsaktivator, der speziell im obligaten intrazellulären bakteriellen Erreger Chlamydien gefunden wurde. Protein-Pulldown-Assays mit Affinitätsperlen haben gezeigt, dass GrgA zwei Faktoren bindet, nämlich66 und28, die verschiedene Sätze von Promotoren für Gene erkennen, deren Produkte in Entwicklungsstadien unterschiedlich benötigt werden. Wir haben BLI verwendet, um die Interaktionen zu bestätigen und weiter zu charakterisieren. BLI zeigt mehrere Vorteile gegenüber Pulldown: 1) Es zeigt Echtzeit-Assoziation und Dissoziation zwischen Bindungspartnern, 2) Es erzeugt quantitative kinetische Parameter, und 3) Es kann Bindungen erkennen, die Pulldown-Assays oft nicht erkennen. Diese Eigenschaften haben es uns ermöglicht, die physiologischen Rollen von GrgA bei der Genexpressionsregulation in Chlamydienund mögliche detaillierte Wechselwirkungsmechanismen abzuleiten. Wir stellen uns vor, dass diese relativ erschwingliche Technologie äußerst nützlich für das Studium der Transkription und anderer biologischer Prozesse sein kann.
Introduction
Die Transkription, die RNA-Moleküle unter Verwendung von DNA als Vorlage produziert, ist der allererste Schritt der Genexpression. Die bakterielle RNA-Synthese beginnt nach der Bindung des RNA-Polymerase(RNAP)-Holoenzyms an einen Zielpromotor1,2. Das RNAP-Holoenzym (RNAPholo) besteht aus einem katalytischen Multi-Subunit-Kern (RNAPcore) und einem Faktor , der für die Erkennung der Promotorsequenz erforderlich ist. Transkriptionsaktivatoren und Repressoren, kollektiv tFs, regulieren die Genexpression durch die Bindungskomponenten des RNAPcore, Faktoren und/oder DNA. Je nach Organismus kann ein erheblicher Teil seines Genoms TFs gewidmet werden, die die Transkription als Reaktion auf physiologische Bedürfnisse und Umwelthinweise regulieren3.
Chlamydien ist ein obligat intrazelluläres Bakterium verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheiten bei Menschen und Tieren4,5,6,7,8. Zum Beispiel ist Chlamydia trachomatis wohl die Nummer eins sexuell übertragbarer Erreger beim Menschen weltweit und eine der Hauptursachen für Erblindung in einigen unterentwickelten Ländern4,5. Chlamydien hat einen einzigartigen Entwicklungszyklus gekennzeichnet durch zwei abwechselnde zelluläre Formen, die als Elementarkörper (EB) und Retikulatkörper (RB)9bezeichnet werden. Während EBs in einer extrazellulären Umgebung überleben können, sind sie nicht in der Lage, sich zu vermehren. EBs gelangen durch Endozytose in Wirtszellen und differenzieren sich innerhalb weniger Stunden nach der Inokulation in größere RBs in einer Vakuole im Wirtszytoplasma. Nicht mehr infektiös, RBs vermehren sich durch binäre Spaltung. Gegen 20 h beginnen sie sich wieder zu den EBs zu differenzieren, die die Wirtszellen um 30-70 h verlassen.
Das Fortschreiten des Chlamydien-Entwicklungszyklus wird durch Transkription reguliert. Während während des Midzyklus, in dem sich RBs aktiv replizieren, eine Übermehrheit der fast 1.000 Chlamydiengene exprimiert wird, wird nur eine kleine Anzahl von Genen unmittelbar nach dem Eintritt von EBs in die Wirtszellen transkribiert, um die Umwandlung von EBs in RBs, und ein weiterer kleiner Satz von Genen werden transkribiert oder zunehmend transkribiert, um die Differenzierung von RBs in EBs10,11zu ermöglichen.
Das Chlamydien-Genom kodiert drei Faktoren, nämlich66,28 und54. 66, was der Haushaltsführung von E. coli und anderen Bakterien entspricht, ist für die Erkennung von Promotoren von Frühen- und Midcycle-Genen sowie einiger später Gene verantwortlich, währendfür die transkription bestimmter später Gene. Es ist bekannt, dassmehrere Gene sowohl einen -66-abhängigen Promotor als auch einen 28-abhängigen Promotor12tragen.
Trotz eines komplizierten Entwicklungszyklus wurde nur eine geringe Anzahl von TFs in Chlamydiengefunden 13. GrgA (früher als hypothetisches Protein CT504 in C. trachomatis serovar D und CTL0766 in C. trachomatis L2) ist ein Chlamydien-spezifischerTF, der ursprünglich als Aktivator von66-abhängigen Genen14anerkannt wurde. Affinity Pulldown-Assays haben gezeigt, dass GrgA ihre Transkription aktiviert, indem sie sowohl66 € als auch DNA bindet. Interessanterweise wurde später festgestellt, dass GrgA auch mit28, und aktiviert Transkription von28-abhängigen Promotoren in vitro15. Um zu untersuchen, ob GrgA ähnliche oder unterschiedliche Affinitäten für66 und28€ hat, haben wir auf die Verwendung von BLI zurückgegriffen. BLI-Assays haben gezeigt, dass GrgA mit einer 30-fach höheren Affinität als mit28000 Personen interagiert, was darauf hindeutet, dass GrgA unterschiedliche Rollen in der -66-abhängigen Transkription und der28-abhängigenTranskription spielen kann. 15.
BLI erkennt das Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Schicht immobilisierten Proteins an der Spitze eines Biosensors reflektiert wird, und vergleicht es mit dem einer internen Referenzschicht16. Durch die Analyse dieser beiden Interferenzmuster kann BLI wertvolle und Echtzeitinformationen über die Menge an Protein liefern, die an die Spitze des Biosensors gebunden ist. Das Protein, das bis zur Spitze des Biosensors immobilisiert ist, wird als Liganden bezeichnet und in der Regel mit Hilfe eines gemeinsamen Antikörpers oder Epitop-Tags (z. B. einem Poly-His- oder Biotin-Tag) immobilisiert, das eine Affinität zu einem assoziierten Teilchen (wie NTA oder Streptavidin) auf der Spitze des Biosensors. Die Bindung eines Sekundärproteins, das als Analyt bezeichnet wird, mit dem Liganden an der Spitze des Biosensors führt zu Veränderungen in der Deckkraft des Biosensors und führt somit zu Veränderungen der Interferenzmuster. Bei wiederholter Konzentration verschiedener Konzentrationen des Analyten kann BLI nicht nur qualitative, sondern auch quantitative Informationen über die Affinität zwischen Liganden und Analyt16liefern.
Nach bestem Wissen und Gewissen waren wir die ersten, die BLI einsetzten, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Transkription15zu charakterisieren. In dieser Publikation zeigen wir, dass ein GrgA-Fragment, das zuvor für die Bindung von28€ erforderlich war, die Bindung tatsächlich vermittelt. Dieses Manuskript konzentriert sich auf Schritte der BLI-Assays und die Generierung von BLI-Diagrammen und Parametern der Bindungskinetik. Methoden zur Herstellung (und Reinigung) von Liganden und Analyten werden hier nicht behandelt.
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Protocol
1. Herstellung von Proteinen
- Verwenden Sie einen Dialysebeutel (mit einer entsprechenden Cut-off-Größe), um jedes Protein, das für BLI-Assays verwendet werden soll (einschließlich des Mitbezeichenten Liganden und des Analyten), gegen 1.000 Volumina des BLI-Puffers (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2) zu dialysieren. , 0,1 mM DTT, pH 8,0, vorgekühlt auf 4 °C) bei 4 °C für 4 h.
HINWEIS: BLI-Assays erfordern, dass der Liganden in Konzentrationen vorhanden ist, die die Bindungsstellen am Biosensor und dem Analyten sättigen, um hoch gereinigt zu werden, so dass die Molkonzentrationen des Analyten, die mit dem Liganden reagieren, bekannt sind. Methoden zur Expression und Reinigung von His- und Strep-markierten Proteinen werden hier nicht behandelt, können aber in früheren Publikationen14,15gefunden werden. Obwohl dieses System nicht erfordert, dass der Liganden in hochgereinigter Form ist, ist es wichtig, auch ungereinigte Liganden in den BLI-Puffer zu dialysieren, um Verschiebungen in Weißlicht-Interferenzmustern zu minimieren, die durch Pufferänderungen während des Assays verursacht werden. - Wechseln Sie zu einem frischen BLI-Puffer und setzen Sie die Dialyse für weitere 4 h fort.
2. Biosensor-Hydratation und Assay-Einrichtung
- Ungefähr 10 min vor Beginn eines Assays, Pipette 200 l des BLI-Puffers in ein PCR-Rohr.
- Entfernen Sie einen Ni-NTA-Biosensor aus der Originalverpackung, indem Sie den breiten Teil des Biosensors mit einer handgeliebten Hand halten.
- Legen Sie den Biosensor über die PCR-Röhre, so dass nur die Glasspitze des Biosensors in den BLI-Puffer eingetaucht ist.
- Halten Sie die Biosensorspitze mindestens 10 min unter Wasser, um eine vollständige Hydratation zu gewährleisten.
- Stellen Sie sicher, dass die Glasspitze des Ni-NTA-Biosensors während des obigen Schritts nichts anderes als den BLI-Puffer berührt.
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen Ni-NTA-Biosensor in Verbindung mit einem Mithis-tags agged Ligand. Bei Bedarf kann ein SA-Streptavidin-Biosensor stattdessen in Verbindung mit einem biotinylierten Liganden verwendet werden, wenn: (i) sowohl der Liganden als auch der Analyt ein His-Tag tragen oder (ii) keiner von ihnen.
- Stellen Sie sicher, dass die Glasspitze des Ni-NTA-Biosensors während des obigen Schritts nichts anderes als den BLI-Puffer berührt.
- Schalten Sie die BLItz-Maschine ein.
- Stellen Sie sicher, dass das Gerät über einen USB-Datenausgangsanschluss auf der Rückseite des Geräts mit dem Computer verbunden ist.
- Öffnen Sie auf dem Computer die zugehörige Software (z. B. BLItz Pro) und klicken Sie auf Advanced Kinetics auf der linken Seite des Bildschirms.
- Geben Sie in der Software alle entsprechenden Informationen über das Experiment (einschließlich Desatonname, Beschreibung, Beispiel-ID und Proteinkonzentration) unter den jeweiligen Überschriften ein.
- Klicken Sie auf Biosensor Type und wählen Sie Ni-NTA aus dem Dropdown-Menü.
- Überprüfen Sie unter der Überschrift Ausführungseinstellungen, ob der Shaker auf Aktivierenfestgelegt ist.
- Überprüfen Sie unter der Überschrift Schritttypliste, ob 5 Elemente aufgeführt sind: Anfangsbasislinie, Laden, Baseline, Zuordnung und Dissoziation.
HINWEIS: Die Dauer jedes Schritts kann bei Bedarf von der Standardeinstellung geändert werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie mindestens 30 s für Initial Baseline und Baseline. und 120 s für Vereinigung und Dissoziation. Die Dauer des Ladeschritts (von 120 bis 240 s) hängt von der Konzentration des Liganden und der Affinität des His-Epitop-Tags auf dem Liganden zum Ni-NTA-Biosensor ab.
- Entfernen Sie den hydratisierten Ni-NTA-Biosensor aus dem PCR-Rohr und befestigen Sie ihn an der Biosensorhalterung an der Maschine, indem Sie den breiten Teil des Biosensors auf die Halterung schieben.
HINWEIS: Lassen Sie den Biosensor während des Experiments nicht austrocknen. - Legen Sie ein 0,5 ml schwarzes Mikrozentrifugenrohr in den Rohrhalter der Maschine und die Pipette 400 l des BLI-Puffers hinein.
- Stellen Sie sicher, dass der Schieberegler der Maschine so positioniert ist, dass sich der Rohrhalter vor dem schwarzen Pfeil auf der Maschine befindet.
- Schließen Sie die Abdeckung der Maschine so, dass die Biosensorspitze in den Puffer im Mikrozentrifugenrohr eingetaucht wird.
- Klicken Sie auf Weiter in der Software, um mit der Aufnahme der Initial Baseline zu beginnen.
3. Verladen von Liganden auf Biosensor
- Öffnen Sie nach Abschluss der Aufnahme der Initial Baseline die Abdeckung der Maschine.
- Bewegen Sie den Schieberegler so nach rechts, dass sich der Fallhalter (anstelle des Rohrhalters) vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Pipette 4 l eines dialysierten Zintands (ab Schritt 1.1) auf den Fallhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine.
HINWEIS: Die optimale Konzentration des zu verwendenden Liganden kann für jedes Protein variieren. Eine Konzentration zwischen 1,0 und 2,0 mg/ml ist in der Regel ausreichend, um die NTA an der Spitze des Biosensors in 240 s zu sättigen. - Klicken Sie in der Software auf Weiter, um mit dem Laden zu beginnen.
4. Zusätzliche Liganden wegwaschen
- Nachdem der Ladeschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
- Bewegen Sie den Schieberegler so nach links, dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Schließen Sie den Deckel der Maschine und stellen Sie sicher, dass die Biosensorspitze in den BLI-Puffer des Rohres im Rohrhalter eingetaucht ist.
- Klicken Sie erneut auf weiter in der Software, um mit der Aufnahme der Baseline zu beginnen.
5. Assoziation von Analyten zu Ligand
- Nachdem der Baseline-Schritt die Aufnahme abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
- Entfernen Sie den Tropfenhalter und reinigen Sie ihn, indem Sie ein Protein auspfeifen und mit doppelt-deionisiertem Wasser (ddH2O) für insgesamt 5 Mal ausspülen.
- Verwenden Sie ein Tuch, um die Oberfläche des Tropfenhalters nach dem Waschen zu reinigen.
- Ersetzen Sie den Fallhalter wieder auf die Maschine.
- Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine so nach rechts, dass sich der Fallhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Pipette 4 l eines Dialysed-Analyten (ab Schritt 1.1) auf den Fallhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine.
- Klicken Sie in der Software auf Weiter, um die Zuordnung zu starten.
6. Dissoziation des Analyten von Ligand
- Nachdem der Assoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
- Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine so nach rechts, dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Klicken Sie in der Software auf Weiter, um mit der Dissoziation zu beginnen.
- Nachdem der Dissoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
- Entfernen Sie den Fallhalter und den Rohrhalter.
- Spülen Sie beide mit ddH2O gründlich ab, um jedes Protein wegzuwaschen.
- Entfernen Sie den Biosensor und entsorgen Sie ihn sicher.
7. Sichwiederholende Wechselwirkungen mit unterschiedlichen Konzentrationen
- Wiederholen Sie die Schritte 2-7 für dasselbe Ligand-Analyt-Paar mit unterschiedlichen Analytkonzentrationen.
HINWEIS: Die Konzentration des Analyten muss möglicherweise über mehrere Durchläufe angepasst werden, bevor optimale Ergebnisse erzielt werden können. Unserer Erfahrung nach ist ein Verhältnis von 1:5:10 an Analytkonzentrationen, beginnend mit 75 nM, in der Regel ausreichend.
8. Analysieren der Daten mit der Software
- Sobald alle Durchläufe abgeschlossen sind, speichern Sie die Daten in der Software, indem Sie auf Datei klicken und dann Experiment speichern wie auf der linken Seite des Bildschirms.
- Wählen Sie unter der Überschrift Daten ausführen die Option Schrittkorrektur und Anpassung (1:1) aus, und klicken Sie auf Analysieren, um kinetische Daten zu generieren.
- Um die quantitativen Daten in ein Arbeitsblatt zu extrahieren und Diagramme zu generieren, klicken Sie auf In CSV exportieren und speichern Sie die aufgezeichneten Daten als CSV-Datei. Öffnen Sie die CSV-Datei mit Tabellenkalkulationssoftware.
- Um die Zuordnungs- und Dissoziationskintik am effektivsten anzuzeigen, entfernen Sie alle Plotpunkte vor dem Baseline-Schritt, und normalisieren Sie alle nachfolgenden Plotpunkte aus dem endgültigen Basiswert.
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Representative Results
Durch BLI-Assays haben wir zuvor festgestellt, dass die Bindung von GrgA an 28 Dollar von einem 28 Aminosäure-Mittelbereich (Rückstände 138-165) von GrgA15abhängt. Dementsprechend hatte ein GrgA-Löschkonstrukt ohne diese Region (NH-GrgA-138-165) im Vergleich zu N-terminally His-tagged Full-Length GrgA (NH-GrgA) eine verringerte Assoziationsrate und eine erhöhte Dissoziationsrate, was zu einem 3-millionenfachen Verlust der Gesamt- Affinität (Tabelle 1). Hier zeigen wir, dass diese mittlere Region in Ermangelung des restlichen GrgA-Proteins direkt 28 Dollar bindet. In diesen Experimenten wurde der mit einem N-terminalen His-Tag (NH-GrgA138-165) markierte mittlere Bereich als Liganden verwendet, der zuerst bis zur Spitze eines Ni-NTA-Biosensors immobilisiert wurde (Abbildung 1A). Nach dem Waschen ungebundenNH-GrgA138-165 aus dem Biosensor, Wurde Echtzeit-Assoziation mit dem Analyten28 nach der Zugabe von28. Schließlich wurde die Echtzeit-Dissoziation nach der Wäsche aufgezeichnet. Aufnahmen von Experimenten mit drei verschiedenen Analytkonzentrationen ab 30 s vor der Ligandenbindung und 2 Minuten nach Beginn der Wäsche sind in Abbildung 1Adargestellt. Um die Ligandenanalyt-Interaktion besser zu visualisieren, entfernen wir Daten vor dem Hinzufügen des Liganden und setzen die Baseline auf 0 zurück, um Abbildung 1Babzuleiten.
Die Werte der kinetischen Parameter für die Wechselwirkung des NH-GrgA138-165-Fragments mit28 € sind in Tabelle 1dargestellt. Im Vergleich zur NH-GrgAX-28-Wechselwirkung zeigte die NH-GrgA138-165 X-28-Wechselwirkung eine statistisch signifikante Trendreduktion von 60 % in ka, eine hochstatistisch signifikante Zunahme von 64 % in k d , und ein hochstatistisch signifikanter Anstieg um das 3,5-fache in KD. Diese Veränderungen zeigen, dass NH-GrgA138-165 im Vergleich zu NH-GrgA 28 langsamer bindet, sich schneller von28 € trennt und eine verminderte Gesamtaffinität mit28. Daher bindet die Rückstande 138-165 in GrgA28, jedoch mit reduzierter Affinität im Vergleich zu GrgA in voller Länge.
Abbildung 1: Ein 28-Aminosäure-Mittelbereich von GrgA bindet in vitro28 Us-Dollar.
(A) Echtzeit-Änderungen der Lichtinterferenzmuster, die in vier Stufen aufgezeichnet werden: (i) Bindung von NH-GrgA138-165 (Ligand) an einen Ni-NTA-Biosensor, (ii) Waschen, (iii) Bindung von NS-28 (Analyt) in unterschiedlichen Konzentrationen an den immobilisierten NH-GrgA-138-165 (Ligand) und (iv) nachfolgende Wäsche. (B) Verbesserte Visualisierung der Liganand-Analyt-Assoziation und Dissoziation nach Dementfernen von Werten in den ersten beiden Stufen von (A) und Zurücksetzen der Basislinie. Panel B wurde von Desai et al., 201815geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Liganden | N | ka | kd | KD | Verweise | |||||||||||
| 1/Frau | % Kontrolle | 1/s | % Kontrolle | m | % Kontrolle | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1,5 x 1,7) x 104 | 100 | (2,8 x 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 x 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgA-138-165 | 2 | (5,6 x 0,1) x 103 | 37 | (4,1 x 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 x 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| p=0,125 | p<0,002 | p<0,001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 x 1,0) x 103 | 40 | (4,6 x 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 x 0,3) x 10-7 | 350 | Diese Studie | ||||||||
| p=0,074 | p=0,006 | p<0,001 | ||||||||||||||
Tabelle 1: Eine Mutante von GrgA, die nur Aminosäurerückstände 138-165 enthält, bindet trotz geringerer Affinität im Vergleich zur GrgA in voller Länge28 .
BLI-Assays wurden mit Ni-NTA-Biosensoren mit His-tagged-Volllängen-GrgA- oder Deletionsmutanten als Liganden und gereinigten Strep-tags28 als Analyt durchgeführt. Abbildung 1zeigt Abbildungen von Aufnahmen . Mit der zugehörigen Software17wurden Werte der kinetischen Parameter (Mittelwerte - Standardabweichungen) generiert. k a (Assoziationsrate konstant) ist definiert als die Anzahl der komplexe Komplexe, die pro s in einer 1-Molaren-Lösung von A und B. kd (Dissoziationsrate konstant) gebildet werden, ist definiert als die Anzahl der Komplexe, die pro Sekunde zerfallen. K D (Dissoziationsgleichgewichtskonstante), definiert als die Konzentration, bei der 50% der Ligandenbindungsstellen von den Analyten belegt werden, ist kd geteilt durch ka. n, Anzahl der experimentellen Wiederholungen. die p-Werte wurden mit den t-Tests des 2-tailed Student berechnet. Kinetische Parameter für NH-GrgA und NH-GrgA-138-165 stammten von Desai et al., 201815.
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Discussion
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für die Regulierung der Transkription und anderer biologischer Prozesse. Sie werden am häufigsten durch Pulldown-Assays untersucht. Obwohl Pulldown-Assays relativ einfach durchzuführen sind, sind sie schlecht quantitativ und können schwache, aber biologisch sinnvolle Wechselwirkungen möglicherweise nicht erkennen. Im Vergleich dazu bietet BLI durch die Erkennung von Echtzeitassoziation und Dissoziation zwischen einem Liganden und einem Analyten Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten sowie die Allgemeine Affinität.
Im Vergleich zu Pulldown-Assays bieten BLI-Assays eine höhere Empfindlichkeit. Beispielsweise werden GrgA-28-Wechselwirkungen mit niedrigeren nM-Konzentrationen von Analyten durch BLI, aber nicht durch Pulldown-Assays (unveröffentlichte Daten) erkannt. Im Gegensatz zu Pulldown verlässt sich BLI nicht auf einen Detektionsantikörper, der die Empfindlichkeit erheblich beeinflussen kann.
Noch wichtiger ist, dass BLI-Analysen mechanistische Einblicke in die Wechselwirkung zwischen Proteinen liefern können, während Pulldown-Assays dies nicht können. Dies wird durch die Wechselwirkungen von28 € mit verschiedenen GrgA-Konstrukten veranschaulicht. Im Vergleich zu NH-GrgA erleiden NH-GrgA-138-165 und NH-GrgA138-165 nur einen 60%igen Verlust in ka in Bindung. Diese Ergebnisse stimmen mit unseren früheren BLI-Daten überein, die zeigen, dass GrgA ohne N-Terminal 64-Rückstände eine verminderte Affinität zu28€ aufweist, was darauf hindeutet, dass die N-Terminal-Sequenz von GrgA zur Bindung von28 € beiträgt. Obwohl NH-GrgA-138-165 und NH-GrgA138-165 ähnliche k-Werte in Bindungs. 28aufweisen, weist erstere eine 91.000-fach höhere kd als die letztere auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bindung von 138-165 strukturelle Veränderungen in GrgA auslöst und den Komplex stark stabilisiert.
Mit einer längeren Geschichte als BLI kann die Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) auch die Echtzeit-Protein-Protein-Wechselwirkungen18,19quantifizieren. Während die Empfindlichkeit von BLI als niedriger als die von SPR20angesehen wird, übertrifft erstere derzeit letztere in der Kostenwirksamkeit. Beispielsweise sind die Kosten für SPR-Biosensoren viel höher als die von BLI-Biosensoren.
Aufgrund der Natur des zugrunde liegenden Prinzips von SPR wird es stark von der Mikrofluidik der Medien beeinflusst, die das Protein umgeben. Daher erfordern Experimente mit einigen SPR-Instrumenten eine beträchtliche Wahrnehmung seitens des Forschers, um optimale Pufferbedingungen zu gewährleisten21,22,23,24. Auf der anderen Seite verfügen aktuelle BLI-Instrumente über einen sehr begrenzten Temperaturregelungsbereich25 und sind daher schlecht geeignet, um thermodynamische Parameter (wie Enthalpie und Gibbs freie Energie) für eine bestimmte Wechselwirkung zu bestimmen.
Glycerin, ein häufig verwendetes Kryoprotektor, ist trotz seiner breiten chemischen Verträglichkeit mit BLI nicht kompatibel. Daher ist es wichtig, Glycerin aus dem Liganden zu entfernen und durch Dialyse analyt zu analysieren. Die resultierenden glyzerinfreien Proteine müssen bei 4 °C gelagert werden, was zu erhöhter Instabilität und ungenauen kinetischen Parametern führen kann. Wir empfehlen, BLI-Assays kurz nach der Dialyse durchzuführen, insbesondere wenn inkonsistente kinetische Parameter zu unterschiedlichen Zeiten erhalten werden. Der genaue Zeitrahmen, innerhalb derer BLI-Tests abgeschlossen werden sollten, variiert zwischen den Proteinen und wird durch ihre Konzentrationen beeinflusst.
Wie bei SPR wurde BLI für das kleine Molekülscreening26verwendet. Wenn man bedenkt, dass neuere BLI-Instrumente einen hohen Durchsatz für das Screening bieten, stellen wir uns vor, dass BLI sehr nützlich für die Identifizierung und Charakterisierung kleiner Moleküle werden kann, die Protein-Protein-Wechselwirkungen erleichtern oder stören.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grants AI122034 und AI140167) und der New Jersey Health Foundation (Grant- PC 20-18) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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