Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En enhetlig Skjuvanalys för humant trombocyt-och cell yta receptorer via Cone-plattan Viscometry

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

Vi beskriver en in-Solution metod för att tillämpa enhetlig skjuvning till trombocyt yta receptorer med hjälp av kon-plattan viscometry. Denna metod kan också användas i större utsträckning för att tillämpa skjuvning på andra cell typer och cellfragment och behöver inte rikta ett specifikt ligand-receptorpar.

Abstract

Många biologiska celler/vävnader känner de mekaniska egenskaperna hos sina lokala miljöer via mechanoreceptorer, proteiner som kan reagera på krafter som tryck eller mekaniska störningar. Mechanoreceptors upptäcka deras stimuli och överföra signaler via en stor mångfald av mekanismer. Några av de vanligaste rollerna för mekanoreceptorer är i neuronala svar, som beröring och smärta, eller hår celler som fungerar i balans och hörsel. Mechanosensation är också viktigt för cell typer som regelbundet utsätts för skjuvning stress såsom endotelceller, som linje blod kärl, eller blod kroppar som upplever skjuvning i normal cirkulation. Viscometers är anordningar som detekterar vätskans viskositet. Roterande Viskosimetrar kan också användas för att tillämpa en känd skjuvkraft till vätskor. Förmågan hos dessa instrument för att införa enhetlig skjuvning till vätskor har utnyttjats för att studera många biologiska vätskor inklusive blod och plasma. Viscometry kan också användas för att applicera skjuvning på cellerna i en lösning, och för att testa effekterna av skjuvning på specifika ligand-receptorpar. Här använder vi Cone-Plate rotationsviskosimetri för att testa effekterna av endogena nivåer av skjuvspänning på trombocyter som behandlats med anti kroppar mot trombocyt mechanosensorisk receptor komplex gpib-IX.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mechanoreceptors är proteiner som reagerar på mekaniska stimuli, såsom tryck eller mekanisk perturbation/deformation. För vissa mechanoreceptorer är avkänning av dessa mekaniska störningar explicit för funktionen hos de cell typer i vilka de uttrycks. Ta, till exempel, stretch receptorer i baroreceptor nerv celler; dessa mekanokänsliga Jon kanaler reglerar blod trycket genom att känna vaskulär "stretch"1,2. I innerörat, Jon kanaler på hår celler upptäcka mekaniska deformationer som orsakas av ljud vågor3, och kutan låg tröskel mekanoreceptorer (ltmrs) under lätta överföring av taktil information4. I andra fall, mekanoreceptorer ger viktig information till cellen för etablering av adhesion eller tillväxt. Celler kan känna stelheten i sin lokala miljö, och kan förlita sig på kontraktila krafter via aktin cytoskelettet och integriner att diktera tillväxt eller sprida5,6.

Vid studier av receptor-ligand interaktioner i cell-eller vävnadsbaserade modeller, vanliga analyser finns som snabbt och korrekt kan rapportera effekterna av att ändra temperatur, pH, ligand koncentration, tonicitet, membran potential, och många andra parametrar kan variera in vivo. Emellertid, dessa samma analyser kan falla kort när det gäller att upptäcka bidraget av mekanisk kraft till receptor aktivering. Oavsett om cellerna känner av sin mikromiljö, upptäcker ljud vågor, eller svarar på stretch, en sak de ovan nämnda mekanoreceptorer har gemensamt är att de deltar i interaktioner där ligand, receptor, eller båda, är förankrade i en Ytan. Assays utvecklats för att testa effekterna av mekaniska krafter på receptor interaktioner återspeglar ofta detta paradigm. Mikrofluidik och flödes kammare används för att studera effekterna av skjuvflöde på celler och receptorer7,8. Dessa typer av experiment har fördelen av att tillåta fin justering av skjuvhastigheter via fastställda flödes hastigheter. Andra tekniker använder fluorescerande molekyl ära prober för att detektera krafter som används av celler på ligand-rika ytor, vilket ger en noggrann avläsning av omfattningen och rikt linjerna för de krafter som deltar i interaktionen9,10.

Förutom mechanosensation inträffar där en eller båda parter är förankrade till en yta, skjuvning stress kan påverka proteiner och celler i lösningen. Detta observeras ofta i blod kroppar/proteiner som ständigt cirkulerar, och kan manifesteras via aktivering av mechanoreceptorer som normalt är ytförankrade11, eller genom exponering av målsekvenser som skulle vara ockluderade under statiska förhållanden12. Emellertid, relativt färre tekniker assay effekterna av skjuvning kraft på partiklar i lösningen. Vissa i-lösning metoder införa skjuvning via vortexa celler i vätska fjädring med varierande hastigheter och varaktigheter, även om dessa metoder kanske inte tillåter en mycket exakt bestämning av skjuvning stress genereras. Roterande Viskosimetrar mäta viskositet genom att tillämpa en specifik skjuvning kraft till vätskor. Häri beskriver vi en tillämpad metod för att bestämma effekten av specifika laminära skjuvhastigheter på celler eller cellfragment i lösning.

Ett av de mest uttryckta proteinerna på trombocyt ytan är glykoprotein (GP) IB-IX-komplexet. GPIb-IX är den primära receptorn för plasma proteinet von Willebrand Factor (VWF). Tillsammans, detta receptor-ligand par har länge erkänts som grunden för trombocyt svar på skjuvning stress13. I händelse av vaskulära skador, VWF binder till exponerade kollagen i sub-endotelial matris14, alltså rekrytera trombocyter till platsen för skadan via VWF-GPIb-IX interaktion. VWF Engagement till sin bindnings plats i GPIbα-subenheten om GPIb-IX under fysiologisk skjuvning stress inducerar utfällning av en membran-proximal mechanosensorisk domän (MSD) som i sin tur aktiverar GPIb-IX15. I en färsk studie, har vi visat att anti kroppar mot GPIbα, som de som genereras i många immun trombocytopeni (ITP) patienter, är också kapabla att inducera trombocyt signalering via MSD veckning under skjuvning stress11. Men till skillnad från VWF, som underlättar skjuvinducerad GPIb-IX-aktivering genom att immobilisera komplexet under normal cirkulation, kan de bivalenta anti kropparna korslänka trombocyter via GPIb-IX och fälla ut MSD i omlopp. På detta sätt, en Mekanoreceptorfysiologi som normalt aktive ras av ytan immobilisering under skjuvning kan aktive ras i lösningen. I den här rapporten kommer vi att visa hur en viscometer-baserade enhetliga skjuvanalys var lånefinansierade att upptäcka effekterna av specifika nivåer av skjuvning stress på receptor aktivering i lösningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla metoder som använder donator-härledda mänskliga blodplättar som beskrivs häri godkändes av den institutionella översyn styrelsen för Emory University/Children ' s Healthcare i Atlanta.

1. blod provs-och trombocyt isolering

  1. Draw humant blod från samtyckande friska vuxna donatorer via ven punktion på dagen för experimentet i 3,8% Trinatriumcitrat. En 4,5 mL tub med blod är tillräckligt för att ge tillräckligt trombocyt rik plasma (PRP) för 20-25 villkor hos donatorer vars trombocyt antal är nära 250 x 103 per μl.
    Anmärkning: Undvik att dra blod via smala mätnålar (mindre än 21 G).
  2. Bered PRP genom centrifugering vid 22 ° c och 140 x g i 12 min med lång broms. Detta kommer att resultera i två distinkta lager, med röda blod kroppar i botten och den ljusa PRP upptill.
  3. Isolera det övre, grumliga, gula lagret av PRP via noggrann pipettering genom en pipettspets skuren i en 45 ° vinkel och få trombocyt antalet via en fullständig blod status (CBC).
  4. Vid behov, tvätta trombocyter i en rör-buffrad saltlösning (150 mM NaCl, 20 mM rör) i närvaro av Prostaglandin E1 (PGE1) och resuspendera i Tyrodes buffert (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCl, 1 mM mgcl2,5mm glukos, 12 mm NaHCO 3, 20 mm Hepes, pH 7,35) med 5 mm glukos, annars, gå vidare till steg 1,5. Följande steg beskriver tvätten i korthet.
    1. Justera PRP-volymen till 10 mL med rör-buffrad saltlösning och tillsätt 0,6 μM PGE1.
    2. Centrifugera i 8 min vid 1 900 x g, kassera sedan supernatanten och låt trombocyt pelleten sitta i 400 ΜL tyrodes och glukos lösning i 5 min.
    3. Resuspendera försiktigt trombocytpelleten och förvara den ostörd i 30 min.
  5. Justera trombocyt antalet till ~ 250 x 103 blodplättar per μl med Poolat humant trombocyt fattigt plasma (PPP) och bibehålla SUS pensionen vid 22 ° c ostörd eller under lätt rotation.

2. ligand och enhetlig skjuvning behandling

Obs: alla steg i avsnitt 2 som kräver pipettering bör göras långsamt, för att inte införa någon skjuvning.

  1. Tillsätt den önskade anti kroppen eller ligan till PRP eller tvättade blodplättar och blanda försiktigt genom att Pipettera upp och ner eller under omrörning med en pipettspets. Lämna den ostörd i rums temperatur under 5-10 min. Lägg till en motsvarande volym PPP eller Tyrodes buffert till en negativ kontroll.
  2. Slå på konen-plattan viscometer, Ställ in plattans temperatur till 22 ° c och ge tid att låta plattan nå denna temperatur.
  3. Pipettera den behandlade PRP eller tvättade blodplättar på den temperaturreglerade konen-plattan viskometer direkt i mitten av plattan. Se till att alla prover deponeras mellan konen och plattan vid kontakt punkten, och inte på utsidan av konen kant.
  4. Skjuvning med lämplig hastighet och varaktighet.
    1. Beräkna skjuvning som indikeras av viscometerhandboken, eller som tidigare visats15,16.
    2. Bestäm skjuvhastighet från viskositet och önskad skjuvspänning via Newtons lag av viskositet; Equation 1; plasma viskositet 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Till exempel, ett normalt skjuvintervall för mänsklig cirkulation är 5-30 dyn/cm2 och skjuvning bör tillämpas på ensiffriga minut tids skalan.
  5. Lyft konen från plattan en aning (~ 2 mm) så att provet förblir i kontakt med både plattan och konen, och Använd en gel-loading eller annan lång pipettspets för att samla in 5-10 μL från mitten av prov volymen.
  6. Inkubera de klippt proverna med önskade markörer i 20 min vid rums temperatur. För markörer av fosfatidylserin, β-galaktos, och P-selektin exponering använder lactadherin C2 domän (LactC2) på 0,08 μM18, erythrina Auktor lektin (ecl) på 6,25 μg/ml, och anti-P-selektin anti kropp (20 μg/ml), respektive.
  7. Fixera proverna i 2% paraformaldehyd under 20 min vid RT före spädning eller kall lagring, och fortsätt till steg 3,1 eller förvara proverna vid 4 ° c i högst 12 timmar.

3. detektering av ytmarkörer och tvär bindning via flödesctometri

  1. Analysera provet via flödescytometri, samla minst 20 000 händelser för varje villkor.
  2. Kvantifiera signal styrkan hos fluorescerande markörer med hjälp av höjdvärdet för intensiteten hos varje fluorophore, eller den geometriska medelvärdet av fluorescensintensiteten (MFI).
  3. Om syftet är att upptäcka trombocyt korsning efter skjuvning behandling, analysera provet på en Imaging-kapabla flödescytometern och kvantifiera crosslinking av Area och proportioner parametrar.
    1. Rita ett histogram över Area och/eller bild förhållande.
    2. Använd en negativ kontroll med bovint serumalbumin (BSA) eller fordon för att dra en grind exklusive de flesta helt cirkulära händelser (denna grind är vanligt vis dras med ett bild förhållande ~ 0,819,20) och kvantifiera andelen händelser innanför denna grind. Händelser med ett lägre bild förhållande är mer benägna att vara tvär bundna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 beskriver hur trigger modellen av gpib-IX aktivering, inlednings vis infördes för att förklara skjuvberoende receptor aktivering när förankrade i kärl väggen, kan också stödja aktivering av trombocyter tvär bunden av en multivalenta ligand. Figur 2 visar avläsning av humant trombocyt aktivering behandlas av två anti kroppar som riktar sig mot N-Terminal domän gpib-IX (6b4 och 11a8), och en kontroll anti kropp (normal IgG) under klippt och statiska förhållanden. I figur 3behandlades trombocyter med 6B4 och en anti kropp med en obindande kraft för låg för att utlösa GPIb-IX aktivering, AK2. Figur 4 visar en tids kurs. Markörer för trombocyt aktivering probed och upptäcktes vid progressiva tidpunkter under skjuvning behandling med 11A8 eller AK2. I figur 5a, anti kropp crosslinking blodplättar stora pärlor dekorerad med gpib-IX N-Terminal domän var analyseras via konventionella flödescytometri. Figur 5 b visar 6B4-medierad tvär bindning av blodplättar som avbildas via Imaging flödescytometri. I figur 6användes kliniska prover av serum från patienter med immunologisk trombocytopeni i stället för de divalenta monoklonala anti kropparna mot GPIb-IX som användes i tidigare siffror. Plasma-innehållande anti kroppar mot GPIb-IX utlöste skjuvberoende svar, i motsats till plasma från ITP-patienter utan anti kroppar inriktade på GPIb-IX.

Figure 1
Figur 1 : Mekanoreceptorn GPIb-IX med trombocyt yta kan binda en löslig, divalenta ligand (t. ex. en anti kropp). När två GPIb-IX komplex på motsatta blodplättar binder till samma divalenta ligand, crosslinking uppstår. Under fysiologisk skjuvning, kan de tvär bundna trombocyter generera en drag kraft att agera på GPIb-IX och vika MSD däri. Som en konsekvens av MSD utspelas, GPIb-IX aktive ras, och inducerar trombocyt signalering och nedströms trombocyt clearance, enligt illustrationen. Siffran anpassades från Quach et al.21vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Uttryck av markörer för trombocyt aktivering hos humant PRP som behandlats med kontroll-IgG eller anti-gpib-IX-antikroppar 11a8 och 6b4 under statiska eller klippt (30 dyn/cm2) förhållanden. I dessa representativa resultat, trombocyt ytan exponeringen av fosfatidylserin (PS), β-galaktos, och P-selectin var probed av grönt fluorescerande protein (GFP)-konjugerad Lact-C2, FITC-konjugerad erythrina Auktor lektin (ecl) och APC-konjugerad anti kroppar mot P-selektin. Fluorescens upptäcktes via flödescytometri. Data uttrycks i procent av händelser med fluorescens över negativ kontroll. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; betydelse som bestäms genom Students t-test. Felstaplar representerar standard avvikelse (SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Humant PRP behandlat med två anti-GPIb-IX-antikroppar. Humant PRP behandlat med två anti-GPIb-IX-antikroppar, ett med hög obindande kraft (6B4) och ett med låg obindande kraft (AK2) under statiska (0 dyn/cm2), låg skjuvning (5dyn/cm 2) och hög skjuvning (30 dyn/cm2) villkor. Diagrammen visar procent andelen av händelserna positiva för ytuttryck av β-galaktos, PS och P-selektin. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. Signifikans bestämdes via en enkelriktad ANOVA med Tukey-test. Felstaplar representerar SD. siffran har anpassats från Quach et al.11vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Tids förlopp för skjuvning exponering (20 dyn/cm2) för humant PRP behandlas med kontroll IgG, 11a8, eller AK2. Exponering av trombocyter av PS och P-selektin upptäcktes via flödescytometri för prover som utklippt för 0, 0,5, 1, 3 och 5 min. * * * P ≤ 0,001, * * * * P ≤ 0,0001. Signifikans bestämdes via en enkelriktad ANOVA med Tukey-test. Felstaplar representerar SD. please Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Kvantifiera tvär bindnings grad efter Area-och bild bredds parametrar. (a) korn av trombocyt storlek (4 μm) Konjugerades med N-terminaldomänen för GPIbα och inkuberades med IgG (grått), AK2 (röd) eller 6B4 (blå) under skjuvade (20 dyn/cm2) förhållanden. Här visas kon tur diagram av framåtscatter (FSC-A) kontra anti-mus anti kropp fluorescens. (b) histogram för proportionerna av trombocyter i PRP inkuberas med 6b4 och fluorescensmarkerade märkt anti-CD41 (en trombocyt markör) anti kroppar under skjuvning. Representativa bilder på olika bild förhållanden visas. Siffran har anpassats från Quach et al.11vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Kliniska prover av serum från patienter med immunologisk trombocytopeni användes i stället för de divalenta monoklonala anti kropparna mot GPIb-IX. (a) gpib-IX-bindningskapaciteten för plasma från patienter med ITP, analyseras via enzymkopplad immunsorbent analys (Elisa). (b) tvättade humana trombocyter som rekonstituerats i plasma av ITP under statiska och klippt (30 dyn/cm2) tillstånd. Diagrammen visar procent andelen av händelserna positiva för ytuttryck av P-selektin eller PS. * * * * P ≤ 0,0001. Signifikans bestämdes via enkelriktad ANOVA med Tukey-test. Felstaplar representerar SD. siffran har anpassats från Quach et al.11vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som beskrivs i detta manuskript möjliggör en snabb och mångsidig bedömning av effekten av laminär skjuvning på blodplättar och cell ytan receptorer. De specifika representativa resultat som presenteras här understryker hur effekterna av multimeric eller bivalenta ligander kan påverkas av skjuvflöde. Utöver denna applikation har en enhetlig skjuvanalys breda tillämpningar för att observera skjuvberoende effekter. I avsaknad av en känd ligand-receptor par, en enhetlig skjuvning analys kan också upptäcka effekterna av skjuvning på faktorer som cell form och signalering, särskilt när de paras ihop med flödescytometriska analyser. En enhetlig skjuvnings analys, som delvis har nämnts i figur 5b, lämpar sig för en mängd olika detektions metoder än eller i komplement till standardiserade flödescytometriska analyser som beskrivs i detta protokoll, inklusive Imaging, biokemiska och cellbaserade Analyser.

Figur 2 exemplifierar den grundläggande tillämpningen av analysen, särskilt för att diskriminera mellan en skjuvberoende ligand-receptor interaktion och en negativ kontroll. 6B4, en anti kropp som kan korsa trombocyter via bindning till GPIb-IX-receptorer och bibehålla tillräckligt med kraft för att aktivera receptorn11, aktiverar trombocyter när den utsätts för skjuvning (avbildad i modellen i figur 1), till skillnad från kontrol lera IgG som inte binder trombocythämmande GPIb-IX. Denna ansökan ger samtidigt belägg för att effekten är specifik för det valda receptor-ligand paret och är beroende av skjuvning. Den enhetliga skjuvningstest kan också skilja mellan effekterna av ligander som kan och inte kan upprätthålla sina obligationer till en receptor under specifika skjuvning nivåer. I figur 3, ser vi en brist på signalering avläsning från anti-gpib-IX anti kropp AK2, som binder sin epitop med en särskilt svag ta bort bidning kraft11. Denna siffra visar också effekterna av varierande nivå av skjuvspänning tillämpas av konen-plattan viskometer från en låg till hög skjuvning.

Figur 4 visar att denna analys kan användas för att modulera längden på skjuvexponering och föreslår en strategi för att visa dessa data. I figur 5, två alternativa flödescytometri baserade avläsning för analysen används, som båda inte förlitar sig på fluorescerande markörer för receptor aktivering, men i stället kan användas för att beskriva tvär bindning och storlek/form förändring. Figur 5 b visar hur framåt Scatter, som ökar proportionellt till storleken på en händelse, kan skilja mellan olika populationer av olänkade (singlet), Doublet, triplett, eller högre multipleten tvär bunden händelser. Som i figur 5b, kan analysen appliceras på pärlor konjugerade till en receptor av intresse, vilket eliminerar risken för andra receptorer som deltar i crosslinking händelser ses via andra metoder. I figur 6, plasma, används en biologisk vätska som innehåller potentiella ligander för vår receptor av intresse i stället för renade monoklonala anti kroppar. Detta illustrerar en ansökan där en specifik känd ligand eller bindande partner för en receptor av intresse kanske inte är nödvändigt.

Även om analysen är ganska tillgänglig som skriftlig, det finns några viktiga steg som bör utföras med försiktighet. Främst bland dessa är att vara noga med att inte införa skjuvning från externa källor än själva skjuvning behandlingen själv. När du ritar blod, som nämns i steg 1,1 i detta protokoll, är det viktigt att dra den genom lämpliga mätnålar. För Human blod insamling via ven punktion från samtyckande vuxna donatorer, detta kan åstadkommas med en 21 G blod samling set (anges i material tabellen). När blod dras och PRP isoleras kan den förvaras i rums temperatur i upp till 6 timmar på bänken eller på en långsam Rotisserie.

Om centrifugen som används för att isolera PRP kan bromsa i olika hastigheter är det bäst att välja en långsam broms för att minimera störning av PRP-skiktet och tillämpning av onödig kraft. När PRP är isolerat eller cell typen av intresse är i vätske SUS pension, undvika pipettering av blandningar för snabbt. Istället aspirera och utvisa prover på ett långsamt och stadigt sätt, särskilt under steg 2,5, där provet dras genom en särskilt smal pipettspets. För prov volymer som exakt kan pipetteras via pipettspetsar av olika storlekar, är det tillrådligt att använda den största bland dem. För särskilt känsliga eller viskösa prover kan pipettens ända ände skäras i en vinkel för att bredda öppningen genom vilken provet ska ritas.

Många analyser som testar effekten av skjuvning på cellulär mechanosensation förlitar sig på en interaktion mellan en för ank rad ligand och dess receptor. Mikrofluidik och flödes kammare är ett sådant exempel, där interaktionen mellan en för ank rad ligand och en receptor, vanligt vis på en cell i lösning, kan observeras i real tid7,8. Andra tekniker använder mikroskopi för att upptäcka händelser som inträffar vid gränssnittet mellan ett cellager och det underliggande substratet eller sonden9. Dessa tekniker har använts för att särskilt stor effekt i att studera blod kroppar i omlopp. Å andra sidan, tekniker som gör att förhör av händelser som sker helt i lösning under flöde är mer begränsade. För generisk tillämpning av kraft i lösningen, vortexa ett prov kan fungera som en "snabb och smutsig" metod. Det är dock svårt att bestämma den exakta kraft som appliceras, och skjuvning är inte säkert att resultera från laminärt flöde. Detta är en av fördelarna med den enhetliga skjuvanalysen. Å andra sidan, den enhetliga skjuvning assay primära nack delen är en tids lucka mellan ansökan skjuvning och observera cellerna själva. Skjuvning appliceras, då cellerna är färgade och fasta, men Imaging tekniker kan inte Observera cellerna under skjuvning processen själv. En anpassning av denna metod skulle innebära att man lägger cellerna direkt till önskade markörer och klippning med de markörer som finns. Detta skulle göra det möjligt att omedelbart upptäcka eventuella övergående effekter.

Hittills har vi tillämpat denna analys för att upptäcka skjuvning-beroende i-lösningseffekt av anti kroppar riktade mot GPIb-IX-komplexet. Medan anti kropparna ger en bekväm, enkel, divalenta bindande partner, är det logiskt att anta att tvär bindning av mekanoreceptorer på motsatta celler i omlopp kan åstadkommas via otaliga multivalenta ligander med tillräckligt hög obindande Styrkor. Denna teknik kan vara användbart i framtiden för att upptäcka de specifika effekterna av sådana ligander. Dessutom kan den enhetliga skjuvanalysen användas tillsammans med avbildnings tekniker som inte beskrivs häri, såsom standardfluorescensmikroskopi. I ändan, den enhetliga skjuvning analysen ger en någorlunda billig, kvantitativ och specifik metod för att tillämpa laminär skjuvning till celler och cellfragment i lösning, och kan användas uppströms många detektions metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Arbete som är relevant för denna studie stöddes delvis av nationella institut för hälsa (NIH) nationella hjärta, lung, och Blood Institute beviljar HL082808, HL123984 (R.L.), och F31HL134241 (M.E.Q.). Finansiering som också tillhandahålls av NIH National Institute of General Medicine Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); och pilot bevilja medel från Children ' s Healthcare i Atlanta och Emory University pediatrisk Flow Cytometry core. Författarna vill tacka Dr hans Deckmyn för att dela 6B4 anti kropp, och Emory Children ' s pediatrisk Research Center Flow Cytometri Core för teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
En enhetlig Skjuvanalys för humant trombocyt-och cell yta receptorer via Cone-plattan Viscometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter