Wir beschreiben eine In-Solation-Methode, mit der mittels der Vonenplattenviskometrie einheitliche Schere auf Plattenoberflächen aufgetragen werden kann. Diese Methode kann auch breiter verwendet werden, um Schere auf andere Zelltypen und Zellfragmente aufzutragen und muss nicht auf ein bestimmtes Liga-Rezeptor-Paar zielen.
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Methodenartikel
Ein Uniform Shear Assay für menschliche Platelets und Zelloberflächen per Cone-plate Viscometry
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Viele biologische Zellstoffe spüren die mechanischen Eigenschaften ihrer lokalen Umgebung durch Mechanorezeptoren, Proteine, die auf Kräfte wie Druck oder mechanische Störungen reagieren können. Mechaniker erkennen ihre Reize und übertragen Signale über eine Vielzahl von Mechanismen. Einige der häufigsten Rollen für Mechanorezeptoren sind in neuronalen Reaktionen, wie Berührung und Schmerz, oder Haarzellen, die im Gleichgewicht und Hören funktionieren. Das Mechanosensation ist auch wichtig für Zelltypen, die regelmäßig Scherkelsteinen ausgesetzt sind, wie Endothelzellen, die Blutgefäße säumen, oder Blutkörperchen, die im normalen Kreislauf Schere erleben. Viscometer sind Geräte, die die Viskosität von Flüssigkeiten erkennen. Rotationsviskometer können auch verwendet werden, um eine bekannte Scherkraft auf Flüssigkeiten anzuwenden. Die Fähigkeit dieser Instrumente, eine gleichmäßige Schere zu Flüssigkeiten einzuführen, wurde genutzt, um viele biologische Flüssigkeiten einschließlich Blut und Plasma zu untersuchen. Die Viscometrie kann auch verwendet werden, um die Schere auf die Zellen in einer Lösung aufzutragen und die Wirkung der Schere auf bestimmte Liga-Rezeptor-Paare zu testen. Hier verwenden wir die Visometrie der Kegelplatte, um die Auswirkungen der endogenen Scherkräbellenstress auf die Blutplättchen zu testen, die mit Antikörpern gegen den Plattenmechanosensoren-Rezeptor-Komplex GPIb-IX behandelt werden.
Einleitung
Mechanorezeptoren sind Proteine, die auf mechanische Reize reagieren, wie Druck oder mechanische Störungen/Verformung. Bei einigen Mechanorezeptoren ist das Empfinden dieser mechanischen Störungen explizit für die Funktion der Zelltypen, in denen sie ausgedrückt werden. Nehmen wir zum Beispiel die Stretchrezeptoren in Baroreceptor-Neuronen; Diese mechanoempfindlichen Ionenkanäle regulieren den Blutdruck, indem sie Gefäß-"Dehnung" 1,2wahrnehmen. Im Innenohr erkennen Ionenkanäle an Haarzellen mechanische Verformungen,die durch Schallwellen 3 verursacht werden, und kutane niedrige Schwelle....
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Protokoll
Alle Methoden, die von Spendern abgeleitete menschliche Blutplättchen verwenden, wurden vom Institutional Review Board der Emory University/Children es Healthcare of Atlanta genehmigt.
1. Blutverlosung und Platzverungrank-Isolation
- Ziehen Sie menschliches Blut von einvernehmlichen gesunden erwachsenen Spendern über Venipunktion am Tag des Experiments in 3,8% Trisodium Citrate. Ein 4,5 mL Blutrohr reicht aus, um genügend plateletreiches Plasma (PRP) für 20-25 Bedingungen bei Spendern zu liefern, deren Plattenzählungen bei fast 250 x 103 pro μL liegen.
Hinweis: Vermeiden Sie es, Blut über Schmalspurnadeln zu ziehen (kl....
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Ergebnisse
Abbildung 1 skizziert, wie das Triggermodell der GPIb-IX-Aktivierung, das ursprünglich eingeführt wurde, um die schiearabhängige Rezeptor-Aktivierung zu erklären, wenn es an der Gefäßwand verankert ist, kann auch die Aktivierung von Platten unterstützen, die durch einen multivalenten Ligand miteinander verbunden sind. Abbildung 2 zeigt Auslesungen der Aktivierung menschlicher Blutplättchen, die von zwei Antikörpern behandelt werden, die auf die N-Terminal-Domäne.......
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Diskussion
Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht eine schnelle und vielseitige Beurteilung der Wirkung von Laminarschere auf Platelets und Zelloberflächen. Die hier vorgestellten spezifischen repräsentativen Ergebnisse unterstreichen, wie die Auswirkungen multimerischer oder bivalenter Liganden durch den Scherfluss beeinflusst werden können. Zusätzlich zu dieser Anwendung hat ein einheitlicher Scherenansatz breite Anwendungen in der Beobachtung von schierabhängigen Effekten. In Ermangelung eines bekannten Liga-.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Arbeit, die für diese Studie relevant ist, wurde zum Teil von National Institutes of Health (NIH) National Heart, Lung und Blood Institute, HL082808, HL123984 (R.L.) und F31HL134241 (M.E.Q.), unterstützt. Die Finanzierung auch durch das NIH-Nationale Institut für Allgemeine medizinische Wissenschaften gewährt T32GM008367 (M.E.Q.); Und Pilotzuschüsse von Children es Healthcare of Atlanta und der Emory University Pediatric Flow Cytometry Core. Die Autoren danken Dr. Hans Deckmyn für die gemeinsame Nutzung des 6B4-Antikörpers und des Emory Children es Pediatric Research Center Flow Cytometry Core für die technische Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| APC Anti-Human-CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viskosimeter | |||
| Erythrina cristagalli Lektin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Gepooltes normales menschliches Plasma | Präzisions-Biologikum | CCN-10 | |
| Vacutainer Hellblaues Blutentnahmeröhrchen (Natriumcitrat) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blutentnahme-Set, 21G x ¾ " Nadel | BD | 367287 |
Referenzen
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Sing....
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Nachdrucke und Genehmigungen
