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Immunology and Infection

विवो में मोनोसाइट केमोटेक्टिक गतिविधि का परिमाणीकरण और रक्त मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की विशेषता

Published: August 12, 2019 doi: 10.3791/59706
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Internal Medicine, Section on Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Wake Forest School of Medicine

Summary

यहाँ हम माउस मॉडल में रक्त monocytes की chemotactic गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, रक्त मोनोसाइट पर पोषण, औषधीय और आनुवंशिक हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने के लिए और रक्त monocytes व्युत्पन्न मैक्रोफेज की विशेषता के लिए एकासाइट-केमोएक्टेंट प्रोटीन-1 (एमसीपी-1) लोडेड बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग का उपयोग करने वाले माउस मॉडल।

Abstract

ऊतक होमोस्टेसिस और मरम्मत एककोशिका व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती पर गंभीर रूप से निर्भर हैं। मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की कम और अधिक भर्ती दोनों घाव भरने को बाधित कर सकते हैं। हमने दिखाया है कि उच्च वसा और उच्च चीनी आहार monocyte प्राइमिंग और रोग को बढ़ावा देने, एक अति chemotactic phenotype में स्वस्थ रक्त monocytes परिवर्तित करने के लिए dysregulated सक्रियण प्रोफाइल और बिगड़ा phenotypic के साथ मैक्रोफेज में अंतर करने के लिए तैयार Plasticity. मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की अधिक भर्ती और डिस्विनियमित सक्रियण प्रोफाइल के साथ मैक्रोफेज की भर्ती चयापचय विकारों से जुड़े पुरानी सूजन रोगों के विकास में एक प्रमुख योगदानकर्ता माना जाता है, atherosclerosis और मोटापा सहित. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य monocyte प्राइमिंग और रोग के लिए एक biomarker के रूप में रक्त monocytes की chemotactic गतिविधि मात्रा निर्धारित करने के लिए और मैक्रोफेज phenotype रक्त monocytes की विशेषता के लिए इन माउस मॉडल में अंतर करने के लिए तैयार हैं. एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके, हम बताते हैं कि 24 एच 33% के बाद एमसीपी-1-लोडेड तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती किया गया है जो चूहों में इंजेक्ट किया जाता है मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज हैं; दिन 3 के बाद 58%. हालांकि, 5 दिन, मोनोसाइट और मैक्रोफेज संख्या में काफी कमी आई थी। अंत में, हम बताते हैं कि इस परख भी शल्य चिकित्सा से प्राप्त तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग, जो तब एकल सेल पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा बाद में विशेषता के अधीन किया जा सकता से रहते मैक्रोफेज के अलगाव के लिए अनुमति देता है.

Introduction

मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती चयापचय विकारों से जुड़े पुराने भड़काऊ रोगों के विकास के लिए आवश्यक है, जिसमें एथेरोस्क्लेरोसिस और मोटापा1,2,3, 4. ऊतक चोट के स्थलों पर मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की संख्या के साथ-साथ उनकी प्लास्टिकता ऊतक होमोस्टेसिस और मरम्मत के लिए महत्वपूर्ण हैं। मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की कम और अधिक भर्ती दोनों घाव भरने को बाधित कर सकते हैं5. स्थानीय ऊतक सूजन ट्रिगर, उदाहरण के लिए, कम घनत्व लिपोप्रोटीन के संचय और ऑक्सीकरण द्वारा (एलडीएल) महाधमनी दीवार में या फैटी एसिड या बैक्टीरिया lipopolysaccharide आंतों के माध्यम से लीक द्वारा adipocytes के भड़काऊ सक्रियण बाधा, इस तरह के मोनोसाइट chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1/ MCP-1 सी-सी रसायन परिवार का एक सदस्य है और ऊतक सूजन और चोट6,7,8, की साइटों के लिए मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख chemoattractant है, 9,10. संवहनी endothelium की भड़काऊ सक्रियण आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति में परिणाम इस तरह के intercellular आसंजन अणु के रूप में 1 (ICAM-1) और संवहनी सेल आसंजन अणु 1 (VCAM-1)11,12, अनुमति एमसीपी-1 द्वारा सक्रिय मोनोसाइट्स को साथ रोल करने के लिए, दृढ़ता से पालन करें और बाद में सबएंडोथेलियल अंतरिक्ष12में स्थानांतरित करें। मोनोसाइट्स में घुसपैठ मैक्रोफेज में अंतर करती है, जिसे एक प्रो इंफ्लेमेटरी फीनोटाइप में सक्रिय किया जा सकता है, जिससे तीव्र सूजन प्रक्रिया बढ़ जाती है। माइक्रोएनवायरनमेंट से प्रेरित, समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज सूजन को हल करने वाले मैक्रोफेज में परिवर्तित हो सकते हैं, जो सूजन कोशिकाओं के समाशोधन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, समर्थक भड़काऊ संकेतों को हटा सकते हैं और ऊतक की मरम्मत और घाव को पूरा कर सकते हैं उपचार12,13.

क्रोनिक चयापचय तनाव प्राइम्स मोनोसाइट्स के लिए नाटकीय रूप से बढ़ाया प्रतिक्रिया के लिए chemo-attractants और बढ़ी हुई monocyte भर्ती, और हमने दिखाया कि primed monocytes dyregulated सक्रियण कार्यक्रमों और ध्रुवीकरण के साथ मैक्रोफेज को जन्म देते हैं राज्यों14,15,16. Monocyte प्राइमिंग atherosclerosis को बढ़ावा देता है, मोटापा, और संभवतः अन्य पुरानी भड़काऊ ऐसे steatohepatitis के रूप में चयापचय विकारों के साथ जुड़े रोगों, गुर्दे की बीमारियों और संभवतः कैंसर. मानव रोगों के माउस मॉडल में मोनोसाइट प्राइमिंग का आकलन और परिमाणित करने के लिए, हमने विवो14,15,16में रसायन विज्ञान गतिविधि को मापने के द्वारा रक्त मोनोसाइट्स की प्राइमिंग स्थिति का आकलन करने के लिए एक नई तकनीक विकसित की , 17. हमारे दृष्टिकोण तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल या तो एक chemoattractant के साथ भरी हुई इंजेक्शन शामिल है - हम आमतौर पर MCP-1 का उपयोग करें - या वाहन में छोड़ दिया और सही पार्श्व में, क्रमशः, चूहों की. जब ध्यान से subcutaneously इंजेक्शन, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल एक एकल प्लग, जिसमें से chemokines फैलाना और एक परिभाषित chemotactic ढाल है कि आसपास के चयापचय या भड़काऊ राज्य से प्रभावित नहीं है बना सकते हैं फार्म का निर्माण होगा ऊतक या प्राप्तकर्ता माउस.

तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल हम अपने परख के लिए उपयोग एक solubilized तहखाने झिल्ली तैयार Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) माउस सार्कोमा, इस तरह के extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन में समृद्ध एक ट्यूमर से निकाला है. इस जटिल प्रोटीन मिश्रण में लेमिनिन (60%), कोलेजन IV (30%), ब्रिजिंग अणु एन्ैक्टिन (8%), और कई विकास कारक होते हैं। बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स प्लग परख को मूल रूप से विभिन्न विकास कारकों18,19के प्रत्युत्तर में एंजियोजेनेसिस की जांच करने के लिए विकसित किया गया था . हालांकि, मोनोसाइट कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए, एंडोथेलियल सेल भर्ती और एंजियोजेनेसिस को कम करने के लिए विकास कारक-विक्षत तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। क्या Matrigel बनाता है (के रूप में तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल अब से संदर्भित) अद्वितीय और विशेष रूप से उपयोगी है कि 10 डिग्री सेल्सियस से नीचे तापमान पर यह तरल पदार्थ, chemokines भंग करने के लिए अनुमति देता है. 22 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान तेजी से एक चरण संक्रमण से होकर गुजरती है और तेजी से एक हाइड्रोजेल बनाती है। प्लग शल्य चिकित्सा excised किया जा सकता है, साफ और एक बेसिलस व्युत्पन्न तटस्थ धातु loprotease के साथ भंग करने के लिए एकल सेल निलंबन उपज, जो एक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) पर विश्लेषण किया जा सकता है, आरएनएसेक द्वारा, एकल सेल आरएनए और अन्य की एक किस्म omics तकनीक. यहाँ हम तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग एक, इंजेक्शन के बाद तीन या पांच दिनों में भर्ती सेल आबादी की विशेषता के लिए एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के उपयोग का वर्णन.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी विधियों को वेक वन स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. MCP-1-लोडेड ग्रोथ फैक्टर-कम बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न समाधान की तैयारी

नोट: यह एक बाँझ प्रक्रिया है।

  1. तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान (उदाहरण के लिए, Matrigel) तैयार करने से पहले कीटाणुनाशक के साथ स्वच्छ सेल संस्कृति हुड।
  2. व्यक्तिगत रूप से पैक बाँझ 1 एमएल सिरिंज तैयार करें और इसे सिरिंज में लोड करने से पहले तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान शीशी के शीर्ष को एक शराब झाड़ू के साथ पोंछें।
  3. पूरी तरह से बर्फ पर विकास कारक कम तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान thaw.
    चेतावनी: यदि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कमरे के तापमान (आरटी) पर thawed है, एक छोटे से बर्फ कण gelling से समाधान को रोकने के लिए रहता है सुनिश्चित करें.
  4. एक बार thawed, शीशी खोलने के लिए और सेल संस्कृति हुड में 0.1% बीएसए के साथ MCP-1 या 1xPBS मिश्रण.
  5. एक 26 जी सुई के साथ बाँझ सिरिंज के एक 1 एमएल तैयार है और बर्फ पर ठंडा.
  6. एमसीपी-1 के एक शेयर समाधान 0.1% बीएसए के साथ 1x पीबीएस में 50 ग्राम/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए MCP-1 भंग करके तैयार करें।
  7. 5 एमएल ठंड तहखाने झिल्ली में MCP-1 500 एनजी /एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए व्युत्पन्न समाधान। केवल वाहन के साथ तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान की एक समान राशि तैयार करें (1x पीबीएस में 0.1% बीएसए होते हैं)।
  8. ठंड 1 एमएल सिरिंज में तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान (के साथ या बिना MCP-1) के 500 $L लोड करें।
  9. एक समान प्लग गठन सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन बनाने से पहले तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान-लोडेड सिरिंज से सभी हवा के बुलबुले निकालें।

2. बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न समाधान का इंजेक्शन

  1. पर्यावरण को कीटाणुरहित करने के लिए इंजेक्शन से पहले और दौरान प्रक्रिया क्षेत्र के आसपास 70% इथेनॉल स्प्रे करें।
  2. संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए, एक संज्ञाहरण कक्ष में माउस जगह है और 1 लीटर / मिनट के लिए हे2 प्रवाह मीटर सेट तो 2% आइसोलुरेन के लिए vaporizer समायोजित करें।
  3. श्वसन दर (दर/मिनट), कॉर्निया प्रतिवर्त और मूंछों की आवाजाही की निगरानी करके संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करें।
  4. पूरी प्रक्रिया के दौरान, नाक शंकु का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें।
  5. प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करने के लिए श्वसन दर (दर/मिनट), कॉर्निया प्रतिवर्त और मूंछों की आवाजाही की निगरानी करते रहें।
  6. टो चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, धीरे धीरे सुई (लगभग 100 $L/s) तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान नीचे दाईं ओर (कोई MCP-1) और छोड़ दिया (एमसीपी-1) माउस के पार्श्व, क्रमशः. यदि इंजेक्शन बहुत धीमा है, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग अनियमित आकार का हो सकता है, या यहां तक कि खंडित, और दूर करने के लिए मुश्किल.
  7. समाधान के रिसाव को रोकने के लिए इंजेक्शन के बाद 20-30 एस के लिए सिरिंज पकड़ो और एक एकल चिकनी जेल प्लग बनाने के लिए अनुमति देने के लिए।
  8. इंजेक्शन के बाद, वसूली तक निगरानी के साथ वार्मिंग पैड पर माउस रखकर.
  9. माउस पूरी तरह से बरामद होने के बाद माउस को मूल पिंजरे में वापस करें।

3. फसल बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग

  1. प्रत्येक माउस के लिए दो अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का वजन करें और उन्हें लेबल करें।
  2. तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान के इंजेक्शन के बाद तीन दिन, 3% isoflurane गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद का उपयोग कर संवेदनाहारी कक्ष में माउस euthanize.
  3. बाल क्लिपर का उपयोग कर माउस के पृष्ठीय फर निकालें या 5 मिनट के लिए कपास की पट्टी चिपक जाती है के साथ बाल पदच्युत क्रीम लागू होते हैं और फिर बंद पोंछ.
  4. निचले वक्ष और ऊपरी काठ कशेरुक के चारों ओर संदंश का उपयोग करके माउस की त्वचा को पकड़ो और त्वचा में 2 मिमी लंबा चीरा बनाएं।
  5. ग्रीवा कशेरुकी के लिए बनाया एक चीरा से माउस के पीछे की मिडलाइन काट और शल्य कैंची का उपयोग कर के ऊपर 1 सेमी से ऊपर 1 सेमी करने के लिए।
  6. मांसपेशियों की परत से त्वचा को अलग करें और एक पॉलीस्टाइरीन फोम प्लेटफॉर्म पर त्वचा को पिन-डाउन करें।
  7. ध्यान से रेशेदार कैप्सूल है कि तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग ठीक संदंश का उपयोग कर शामिल है पकड़ और प्लग साफ करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग रेशेदार कैप्सूल को हटा दें।
  8. साफ तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग निकालें और 1.5 एमएल microcentrifuge करने के लिए स्थानांतरण (देखें 3.1).
  9. साफ तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के साथ microcentrifuge ट्यूब वजन और तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के वजन की गणना.

4. बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग डाइजेस्ट

  1. बर्फ पर Thaw dispase (10 एमएल)।
  2. तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग microcentrifuge ट्यूब में साफ ठीक कैंची का उपयोग कर मिन्स.
  3. तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग युक्त प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में dispase के 800 $L जोड़ें.
  4. 10 s प्लग को बाधित करने के लिए अधिकतम गति के साथ भंवर.
  5. एक थर्मोमिक्सर में 1,400 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को पूरी तरह से तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग को पूरी तरह से भंग करने के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. 2 ज के बाद, आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रण ध्यान से निकालें और supernatant त्याग दें।
  7. पलटने या दोहन द्वारा 1x पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. आरटी पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन को ध्यान से निकालें और सुपरनेंट को त्याग दें।
  9. पीबीएस के 300 डिग्री एल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  10. एक अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 50 डिग्री सेल्सियस कोशिका निलंबन लें।
  11. सेल निलंबन के लिए कैल्सीन AM (1 M) के 0.5 $L जोड़ें।
    नोट: Calcein AM एक हरे फ्लोरोसेंट सेल व्यवहार्यता डाई जो केवल जीवित कोशिकाओं में जमा है.
  12. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  13. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर हरी फ्लोरोसेंट (लाइव) और गैर फ्लोरोसेंट (मृत) कोशिकाओं की गणना।

5. एकल कोशिका पश्चिमी ब्लाट (scWB) विश्लेषण का उपयोग सेल निलंबन में सेल संरचना का निर्धारण

  1. आरटी में कम से कम 10 मिनट के लिए एक पेट्री डिश में 1x निलंबन बफर के 15 एमएल में उपयोग करने से पहले sWB चिप को फिर से हाइड्रेट करें।
  2. रिहाइड्रेटेड चिप में पतला एकल सेल निलंबन (10,000-100,000 सेल/एमएल) का 1 एमएल जोड़ें। सतह को 10 सेमी पेट्री डिश के तल पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि सतह फ्लैट सेट है.
  3. सुखाने को रोकने के लिए पेट्री डिश को ढक दें और कोशिकाओं को ग्रेडिएंट द्वारा 5-15 मिनट के लिए व्यवस्थित करें।
  4. चिप को एक उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी के नीचे रखें और 10x आवर्धन पर कुओं का निरीक्षण करें।
    नोट: लगभग 15-20% microwells एक एकल सेल द्वारा कब्जा कर लिया जाना चाहिए, कम से कम 2% कुओं के 2 या अधिक कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए
  5. 10 सेमी पेट्री डिश को 45 डिग्री से चिप युक्त झुकाएं।
  6. चिप के ऊपर से नीचे तक कोमल pipeting द्वारा चिप की सतह से uncaptured कोशिकाओं को दूर करने के लिए 1x निलंबन बफर के साथ चिप धो लें। 3 बार दोहराएँ.
  7. एकल कोशिका पश्चिमी यंत्र तैयार की।
  8. lysis समय सेट, इलेक्ट्रोफोरोसिस समय, और यूवी कब्जा समय. तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग से बरामद भर्ती मैक्रोफेज का विश्लेषण करने के लिए, निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: lysis समय: 0 s; वैद्युतधरकाल समय: 160 s; यूवी कब्जा समय 240 एस.
  9. ध्यान से एकल सेल पश्चिमी साधन, जेल साइड का सामना करना पड़ के इलेक्ट्रोफोरोसिस सेल में चिप लोड. चिप के जेल पक्ष को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधानी का प्रयोग करें।
  10. कक्ष में lysis / चल बफर डालो और पूरी तरह से पूरे एकल सेल पश्चिमी चिप को कवर. सेल lysis शुरू करो.
  11. 5.8 में सूचीबद्ध सेटिंग का उपयोग कर sWB साधन चलाएँ।
  12. एक बार रन पूरा हो गया है, एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए चिप हस्तांतरण और आर टी पर 10 मिनट के लिए 1x धोने बफर के साथ दो बार चिप धो.
  13. प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने की तैयारी करें (एंटी-विनकुलिन: 1:10; एंटी-सीडी45: 1:15, एंटी-सीडी11बी: 1:20, एंटी-एफ 4/80: 1:10) की कुल मात्रा में 80 डिग्री सेल्सियस की एंटीबॉडी डिल्यूएंट (मिश्रण 8 डिग्री सेल्सियस के एंटीबॉडी 1 प्लस 8 एल के 64 डिग्री सेल्सियस)।
  14. एंटीबॉडी जांच कक्ष के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 80 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और चिप जेल साइड नीचे कम इतना है कि चिप भर में एंटीबॉडी समाधान wicks.
  15. आरटी में 2 एच के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ इनक्यूबेट करें।
  16. चिप को शेकर पर 1x धोने बफर में 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  17. जेल को अलग करने के लिए शेकर पर पानी में 10 मिनट के लिए एक बार चिप को धो लें।
  18. 80 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा में माध्यमिक एंटीबॉडी का 1:20 कमजोर पड़ने की तैयारी करें (माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण 2 डिग्री सेल्सियस प्लस 78 डिग्री सेल्सियस की डिल्यूएंट)।
  19. प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 1 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ चिप को इनक्यूबेट करें।
  20. चिप को शेकर पर 1x धोने बफर के साथ 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  21. किसी भी शेष धोने बफर को हटाने के लिए एक स्लाइड स्पिनर का उपयोग कर चिप स्पिन।
  22. एक दोहरी लेजर microarray स्कैनर पर चिप को स्कैन 5 डिग्री मीटर फ्लोरोफोर के वर्णक्रमीय चैनल पर माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए युग्मित संकल्प.
  23. SCWB-विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें.

6. scWB चिप अलग करना

  1. पट्टी करने के लिए तैयार जब तक धोने बफर में स्कैन चिप स्टोर.
  2. एक धूआं हुड में पानी स्नान प्लेस.
  3. रैक के ऊपर पानी के साथ पानी के स्नान में 50 एमएल ट्यूब रैक रखें और पानी के तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  4. अलग करना बफर तैयार करें. बफर समाधान अलग करने के 1 ल के लिए, आसुत पानी के 900 एमएल में Tris-HCl (pH 6.8) और 20 ग्राम एसडीएस के 9.85 ग्राम भंग और पीएच समायोजित करें। फिर आसुत जल से 1L में भरें. प्रत्येक उपयोग से ठीक पहले $-mercaptoethanol (जेड-ME; 14.3 M) का 0.8% (v/v) जोड़ें।
  5. प्रारंभिक स्कैन के बाद, अलग करना से पहले एक 10 सेमी पेट्री डिश में चिप जगह है.
  6. प्रत्येक चिप के लिए बफर अलग करने के 40 एमएल ले लो और $-ME के 320 डिग्री एल जोड़ें।
    चेतावनी: जेड-एमई विषाक्त और मानव और पर्यावरण के लिए खतरनाक है। निम्नलिखित प्रक्रिया एक धूआं हुड में किया जाना चाहिए.
  7. कनस्तर में चिप रखें और कनस्तर में लीक होने वाले पानी को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ कनस्तर को सील करें।
  8. पूर्व गर्म पानी स्नान में ट्यूब रैक के अंदर कनस्तर रखें।
  9. 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  10. ध्यान से कनस्तर से चिप को हटा दें और एक ताजा पेट्री डिश में जगह है।
  11. संक्षेप में 1x धोने बफर के साथ एक बार चिप धो लें. फिर पेट्री डिश में 1x धोने बफर के 15 एमएल जोड़ें।
  12. एक शेकर पर 15 मिनट के लिए चिप धो लें. धोने कदम चार बार दोहराएँ.
    नोट: चिप अगले प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए तैयार है (देखें कदम 5.12 - 5.21).

Representative Results

chemoattractants के लिए रक्त monocytes की प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए, हम वाहन से भरी हुई इंजेक्शन और MCP-1 भरी हुई तहखाने झिल्ली प्रत्येक माउस के बाएँ और दाएँ flanks में समाधान व्युत्पन्न. बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग इंजेक्शन के बाद 1, 3 और 5 दिन हटा दिया गया, भंग और प्रत्येक प्लग में भर्ती कोशिकाओं को गिना गया (चित्र 1A)। MCP-1 लोडेड प्लग (बंद सलाखों) में सेल गिनती से वाहन से भरी हुई प्लग (खुले सलाखों) में सेल गिनती घटाकर, हम विशेष रूप से MCP-1 के जवाब में भर्ती कोशिकाओं की संख्या प्राप्त (जेड सेल संख्या, चित्र 1B). हमने 5 दिन की अवधि में एक त्वरित MCP-1-विशिष्ट भर्ती और कोशिकाओं के संचय को देखा, दर 31,000 कोशिकाओं/दिन (दिन 1) से बढ़कर 78,000 सेल/दिन (दिन 3) और दिन में 136,000 सेल/

तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में प्रवेश किया है कि सेल प्रकार की पहचान करने के लिए, हम प्रत्येक प्लग से एकल सेल पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (scWB) के लिए अलग कोशिकाओं के अधीन, CD45 के लिए जांच, CD11b और F4/80 अभिव्यक्ति monocytes की पहचान करने के लिए (CD11b+F4/ -), मैक्रोफेज (CD11b+F4/80+ प्लस CD11b-F4/80+ )और शेष गैर-मोनोसाइटिक ल्यूकोसाइट्स (CD45+CD11b-F4/80- )(चित्र ााा २) SWB चिप्स तो vinculin के लिए जांच की प्रत्येक जेल पर कुल सेल संख्या निर्धारित करने के लिए और sWB चिप पर microwells के एकल सेल अधिभोग की पुष्टि कर रहे थे. MCP-1-लोडेड बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के भीतर monocytes का प्रतिशत दिन 1, 20% पर कम था, 47% पर क्रमशः दिन 3 पर नुकीला, दिन में 14% करने के लिए छोड़ने से पहले 5 (चित्र 2 डी). MCP-1-लोडेड तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के भीतर Macrophage संख्या दिन 1 में 13% से तेजी से वृद्धि हुई, दिन 3 पर 22% और दिन 5 पर 23%. MCP-1-लोडेड प्लग के लिए, अलग सेल आबादी के भीतर monocytes प्लस मैक्रोफेज का प्रतिशत दिन में सबसे अधिक था 3, वाहन लोड ेड प्लग में 31% (चित्र 3 ए) और MCP-1-लोडेड प्लग में 58% ( चित्र3B),यह दर्शाता है कि 3 दिनों के बाद MCP-1-निर्भर रसायन रोग द्वारा भर्ती कोशिकाओं के विशाल बहुमत monocytes और मैक्रोफेज हैं. यद्यपि दिन 3 की तुलना में मोनोसाइट्स प्लस मैक्रोफेज की कुल संख्या दिन 5 में अधिक थी (चित्र 3C और D), कुल कोशिका जनसंख्या में मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज के काफी अधिक अनुपात के कारण ( चित्र3A औरबी), दिन 3 में सेल गिनती अधिक सही रक्त monocyte chemotaxis और भर्ती को दर्शाता है. इसलिए, हम नियमित रूप से जानवरों का त्याग करने से तीन दिन पहले तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान इंजेक्ट करते हैं। क्या एमसीपी-1 द्वारा भर्ती किए गए सभी मैक्रोफेज मोनोसाइट व्युत्पन्न हैं या पड़ोसी ऊतकों से भर्ती निवासी मैक्रोफेज हैं जो योगदान दिया गया था।

यहाँ दिखाए गए आंकड़ों का सांख्यिकीय विश्लेषण विश्लेषण सॉफ्टवेयर (उदा., सिग्माप्लॉट 14) के साथ किया गया था। ANOVA फिशर LSD परीक्षण के बाद प्रयोगात्मक समूहों के बीच मतलब मूल्यों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सभी डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं - कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों की एसडी. परिणाम ों को पी एंड एलटी; 0.05 स्तर पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था।

Figure 1
चित्र 1 : स्त्वकित: तलवंसी तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती कोशिकाओं की मात्रा. (क) वाहन से भरी हुई (खुली छड़) और एमसीपी-1-लोडेड बेसमेंट झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग (बंद बार) के लिए पूर्ण सेल नंबर। (ख) एम सी पी-1 द्वारा बेसमेंट मेम्ब्रेन व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती कोशिकाओं की संख्या की गणना एमसीपी-1-लोडेड और वाहन से भरी हुई प्लग ों के बीच सेल संख्यामें तब्दील होने के रूप में की जाती है। परिणाम मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं - एसडी (n ]4) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 2
चित्र 2 : एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग में भर्ती सेल आबादी का विश्लेषण। (ए + बी) प्रतिनिधि उदाहरण एक वाहन लोड (नियंत्रण) और एक MCP-1 नेतृत्व प्लग (MCP-1) इंजेक्शन के बाद तीन दिन एक माउस से अलग के sWB विश्लेषण के लिए दिखाए जाते हैं. सीडी 45, सीडी 11बी और एफ 4/80 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ लेबल चिप्स, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद। प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए लेबल बैंड की फ्लोरोसेंट तीव्रता शिखर क्षेत्र के रूप में दिखाया गया है। (सी + डी) सेल आबादी monocytes के रूप में पहचान की गई (CD11b+F4/80-, Image 1 , ), मैक्रोफेज (CD11b+F4/80+ प्लस CD11b-F4/80+, , Image 2 ) या गैर-monocytic ल्यूकोसाइट्स के रूप में (CD45+ , Image 3). शेष कक्षों को "अन्य"Image 4() लेबल किया गया था। परिणाम माध्य के रूप में दिखाए जाते हैं - एसडी (द र् 3)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 3
चित्र 3 : तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग के मोनोसाइट और मैक्रोफेज सामग्री। वाहन से भरी हुई और एमसीपी-1-लोडेड प्लग में भर्ती मोनोसाइट और मैक्रोफेज सामग्री का मात्रात्मक विश्लेषण दिन 1, 3 और 5 के बाद इंजेक्शन पर हटा दिया गया। मान कुल कोशिका जनसंख्या के प्रतिशत के रूप में दिखाए जाते हैं (ए + बी) और पूर्ण कक्ष संख्याओं में प्रति प्लग (ब़् त द) . परिणाम माध्य के रूप में दिखाए जाते हैं - एसडी (द र् 3)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Discussion

हम एक में विवो chemotaxis परख विकसित की है, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न मैट्रिक्स और chemokines के साथ इस अद्वितीय मैट्रिक्स लोड और यह चूहों में इंजेक्ट करने की क्षमता के अद्वितीय भौतिक गुणों का उपयोग कर. परख हमें रहने वाले चूहों में मोनोसाइट्स की जवाबदेही का आकलन करने की अनुमति देता है (और मैक्रोफेज) chemokines के लिए, के रूप में MCP-1 के लिए यहाँ सचित्र, और या तो आनुवंशिक हेरफेर या औषधीय, आहार और monocyte पर अन्य पर्यावरण जोखिम के प्रभाव रसोटैक्सिस। क्योंकि chemokine ढाल हम इन चूहों में बनाने के अनिवार्य रूप से आनुवंशिक, औषधीय, आहार या पर्यावरण जोखिम से अप्रभावित है, monocyte chemotactic गतिविधि में परिवर्तन वास्तव में इन monocytes में कार्यात्मक परिवर्तन को प्रतिबिंबित और, जैसा कि हम दिखाया पहले भी दोनों प्रोटीन और प्रतिलेखन स्तर17,20पर reprogramming. हमने बताया कि चूहों में चयापचय तनाव chemoattractant के लिए monocyte प्रतिक्रिया बढ़ जाती है और यह कि इस अति-चेमोटेक्टिक गतिविधि वृद्धि हुई प्रोटीन एस-ग्लूटोथाइयोनिलन, एक प्रतिवर्ती, redox-निर्भर posttranslational के साथ संबंधित प्रोटीन संशोधन , जो ज्यादातर मामलों में एंजाइमी और प्रोटीन समारोह21,22की हानि की ओर जाता है , और कुछ मामलों में भी प्रोटीन गिरावट को बढ़ावा देताहै 16,23.

सफलतापूर्वक इस प्रक्रिया को निष्पादित करने के लिए और इस परख के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान की सटीक मात्रा धीरे धीरे एक विलक्षण अच्छी तरह से गठित प्लग बनाने के लिए इंजेक्शन हैं और रेशेदार कैप्सूल हटाया जाना चाहिए पूरी तरह से साफ प्लग पाने के लिए जब फसल तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग, dispase समाधान में पूरे प्लग के विघटन की सुविधा. हमारे डेटा बताते हैं कि तीन दिनों के लिए जानवरों में प्लग छोड़ने 1) संकेत तीव्रता का अनुकूलन, अर्थात्, प्रत्येक प्लग में भर्ती monocytes और मैक्रोफेज की संख्या, 2) संकेत की चयनात्मकता, अर्थात्, monocytes और मैक्रोफेज के भीतर कुल सेल आबादी और 3) संकेत की विशिष्टता, अर्थात वाहन की तुलना में MCP-1 के जवाब में monocytes और मैक्रोफेज में वृद्धि. अंत में, हम प्रदर्शित कैसे राज्य के-the-कला एकल सेल आधारित तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न जेल प्लग परख के साथ संयोजन के रूप में दृष्टिकोण प्लग में भर्ती monocytes की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस तरह के संभावित phenotype का एक स्नैपशॉट प्राप्त एककोशिका व्युत्पन्न मैक्रोफेज विशिष्ट आनुवंशिक, औषधीय, आहार या पर्यावरणीय हस्तक्षेप के जवाब में किसी भी माउस मॉडल में चोट के स्थलों के लिए भर्ती किया जा रहा है।

वहाँ परख की सीमाओं के एक नंबर रहे हैं पर विचार किया जाना है. सबसे पहले, माउस हैंडलिंग, संज्ञाहरण सहित, तहखाने झिल्ली व्युत्पन्न समाधान के इंजेक्शन, और शल्य विच्छेदन एकल प्लग और reproduible डेटा उत्पन्न करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता है. दूसरा, जबकि MCP-1 भरी हुई प्लग में भर्ती अधिकांश कोशिकाओं monocytes और मैक्रोफेज हैं, एक पर्याप्त संख्या नहीं हैं. यह अन्य की व्याख्या को प्रभावित कर सकता है, गैर एकल सेल आधारित विश्लेषणात्मक इस सेल आबादी पर प्रदर्शन पर परख. अंत में, के बाद से scWB के लिए सेल lysis शर्तों हल्के हैं, प्रोटीन के प्रवास दूरी मानक WB से अलग हो सकता है और प्रोटीन आकार के साथ सहसंबंधित नहीं हो सकता है. इसलिए, दोनों सेल lysis और रन बार प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए मान्य किया जा करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए और प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया.

Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

इस परियोजना को एनआईएच (AT006885) से आर.ए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm petri dish griner bio-one 664 160
10x suspension buffer proteinsimple R101
15 cm petri dish Falcon 353025
2-Mercaptoethanol MP BIOMEDICALS 2194705
5% washing buffer proteinsimple R252
Antibody diluent proteinsimple 042-203
Bench Top Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Centrifuge
Bovine Serim Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Calcein AM ThermoFisher C3099 1 mL
CD11b Novus Biologicals NB110-89474
CD45 (D4H7K) rabbit mAb Cell Signal Technologies 727987S
CD68/SR-D1 (FA-11) Novus Biologicals NBP2-33337SS
Cellometer Vision Nexcelom
Dispase BD 354235 100 mL
Dissecting sissor
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] Novus Biologicals NL004 NL 557 conjugate
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] Novus Biologicals NBP1-75655 DyLight 650 conjugate
F4/80 (CI-A3-1) Novus Biologicals NB600-404SS
Heat Block effendorf 22331 Thermomixer
Lysis/Running buffer proteinsimple R200
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) BD 354230 10 ml
Microarray scanner PerkinElmer ScanArray Gx
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-129
Microscope ThermoFisher Evos fl
Milo proteinsimple Single cell western
Needle BD 305111 26 G
Parafilm
Probing chamber proteinsimple 035-020
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein R&D 479-JE-050
scWEST chip proteinsimple C300
Shaker Bioexpress Gene mate orbital shaker
Single cell western chip canister proteinsimple 035-118
Slide spinner Labnet C1303-T
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP 166-500
Syringe BD 309602 1 mL
Tris-Hydrochloride Fisher Scientific BP 153-500
Tweezer proteinsimple 035-020
Water bath ThermoFisher

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 150 Matrigel MCP-1 Monocyte Macrophage एकल कोशिका पश्चिमी धब्बा माउस मॉडल Atherosclerosis
विवो में मोनोसाइट केमोटेक्टिक गतिविधि का परिमाणीकरण और रक्त मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफेज की विशेषता
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Ahn, Y. J., Wang, L., Asmis, R.… More

Ahn, Y. J., Wang, L., Asmis, R. Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (150), e59706, doi:10.3791/59706 (2019).

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