Summary
여기에서 우리는 마우스 모형에 있는 혈액 단핵구의 화학전술 활동을 정량화하고, 혈액 단핵구에 영양, 약리학 및 유전 내정간섭의 효력을 평가하고 혈액 단핵구 파생된 대식세포특성화하기 위하여 프로토콜을 제시합니다 단핵구 화학 유도제 단백질-1 (MCP-1)을 사용하여 마우스 모델 - 로드 지하 막 유래 젤 플러그.
Abstract
조직 항상성 및 수리는 단핵구 유래 대식세포의 모집에 크게 의존한다. 단핵구 유래 대식세포의 언더-및 과잉 모집은 상처 치유를 손상시킬 수 있습니다. 우리는 고지방 과 고당 식이요법이 단핵구 프라이밍과 기능 장애를 촉진하여 건강한 혈액 단핵구를 이형성 된 활성화 프로필과 손상된 표현형으로 대식세포로 분화 할 태세를 갖춘 하이퍼 화학 적 표현형으로 변환하는 것으로 나타났습니다. 가 소성. 단핵구 유래 대식세포의 과잉 모집 및 이형성 된 활성화 프로파일을 가진 대식세포의 모집은 대사 장애와 관련된 만성 염증성 질환의 발달에 중요한 기여가 될 것으로 여겨진다, 동맥 경화증과 비만을 포함. 이 프로토콜의 목적은 단핵구 프라이밍 및 기능 장애를 위한 바이오마커로서 혈액 단핵구의 화학활성을 정량화하고 대식세포 표현형 혈액 단핵구를 특성화하는 것이 이들 마우스 모델에서 분화될 태세이다. 단세포 서쪽 얼룩 분석을 사용하여, 우리는 마우스로 주입된 MCP-1 로드된 지하 막 유래 젤 플러그로 모집된 세포의 24 시간 33% 후에 단핵구 및 대식세포이다는 것을 보여줍니다; 58% 후 3. 그러나 5일째에는 단핵구와 대식세포 수가 현저히 감소했습니다. 마지막으로, 우리는 이 분석이 또한 외과로 회수된 지하 막 파생젤 플러그에서 살아있는 대식세포의 격리를 허용한다는 것을 보여주고, 그 후에 단 세포 서쪽 얼룩 분석에 의하여 후속 특성화를 복종될 수 있습니다.
Introduction
단핵구 유래 대식세포의 모집은 동맥경화증 및 비만을 포함한 대사성 질환과 관련된 만성염증성 질환의 발병에 필수적이다 1,2,3, 4. 조직 손상 부위의 단핵구 유래 대식세포의 수와 가소성은 조직 항상성 및 수리에 매우 중요합니다. 단핵구 유래 대식세포의 미과및 과다 모집 모두 상처치유를 손상시킬 수 있습니다 5. 국소 조직 염증을 유발하는 것은 예를 들어, 대동맥 벽에 저밀도 지단백(LDL)의 축적 및 산화에 의해 또는 지방산 또는 세균성 리포폴리당산에 의한 지방세포의 염증 활성화에 의해 장내를 통해 누출되는 단핵구 화학유채 단백질-1(MCP-1/CCL2)과 같은 케모카인을 포함한 염증성 매개체의 방출을 유도한다. MCP-1은 C-C 케모카인 가문의 일원이며 조직 염증 및손상부위에 단핵구 유래 대식세포의 모집을 담당하는 주요 화학유채6, 7,8, 9,10. 혈관 내피의 염증 성 활성화는 세포 간 부착 분자 1 (ICAM-1) 및 혈관 세포 접착 분자 1 (VCAM-1)11,12,12와 같은 유착 분자의 발현을 초래합니다. MCP-1에 의해 활성화된 순환 단핵구는 단단히 부착하고 이어서 위전공간(12)으로이동한다. 침투 단핵구는 대식세포로 분화되어 전염증성 표현형으로 활성화되어 급성 염증 과정을 유도할 수 있습니다. 미세 환경에 의해 구동, 염증 성 대식 세포로 변환 할 수 있습니다, 이는 염증 세포의 제거에 중요한 역할을, 염증 성 신호를 제거하고 조직 복구 및 상처를 완료 치유12,13.
만성 대사 스트레스는 화학 적 매력과 증가 단핵구 모집에 극적으로 향상된 응답성을 위해 단핵구를 소수, 우리는 프라임 단핵구가 dysregulated 활성화 프로그램 및 양극화와 대식세포에 상승을 초래한다는 것을 보여주었습니다 상태14,15,16. 단핵구 프라이밍은 동맥 경화증, 비만 및 지방 간염, 신장 질환 및 암과 같은 대사 장애와 관련된 다른 만성 염증성 질환을 촉진합니다. 인간 질병의 마우스 모델에서 단핵구 프라이밍을 평가하고 정량화하기 위해, 우리는 생체 내 화학 활성을 측정하여 혈액 단핵구의 프라이밍 상태를 평가하는 새로운 기술을 개발했다14,15,16, 17. 우리의 접근은 화학유채로 적재된 지하 막 유래 젤의 주입을 관련시킵니다 - 우리는 일반적으로 MCP-1를 사용합니다 - 또는 마우스의 좌우 측면에 각각 차량을 사용합니다. 조심스럽게 피하주사할 때, 지하 막 유래 젤은 단일 플러그를 형성할 것이며, 이 로부터 케모카인은 주변의 대사 또는 염증 상태에 의해 영향을 받지 않는 정의된 화학전술 그라데이션을 확산시키고 생성할 수 있습니다. 또는 수신자 마우스.
우리가 우리의 분석에 사용하는 지하 막 유래 젤은 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종, 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질이 풍부한 종양에서 추출한 용해된 지하 막 제제입니다. 이 복잡한 단백질 혼합물에는 라미닌 (60 %), 콜라겐 IV (30 %), 브리징 분자 엔탁틴 (8 %) 및 여러 성장 인자를 포함합니다. 지하막 매트릭스 플러그 분석기는 원래 다양한 성장 인자18,19에반응하여 혈관신생을 조사하기 위해 개발되었다. 그러나, 단핵구 화학요법을 연구하기 위해서는 내피 세포 모집 및 혈관신생을 최소화하기 위해 성장 인자 고갈 된 지하 막 유래 겔을 사용하는 것이 중요합니다. Matrigel (지하 막 유래 젤이라고도 함)을 독특하고 특히 유용하게 만드는 것은 10 °C 이하의 온도에서 화학성분이 용해될 수 있다는 것입니다. 22 °C 이상의 온도에서 지하 멤브레인 유래 용액은 단계 전이를 빠르게 겪고 하이드로겔을 빠르게 형성합니다. 플러그는 간균 유래 중성 금속 loprotrotease로 외과적으로 절제, 세척 및 용해될 수 있으며, 이는 RNAeq, 단세포 RNA 및 기타 다양한 형광 활성화 세포 선별기(FACS)에서 분석할 수 있습니다. 오믹스 기술. 여기서 우리는 주사 후 1, 3 또는 5일 후에 지하 막 유래 겔 플러그로 모집된 세포 집단의 특성화에 대한 단세포 웨스턴 블롯 분석의 사용을 설명한다.
Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 의학의 웨이크 포레스트 학교에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. MCP-1로드 성장 인자 감소 지하 멤브레인 유래 용액 의 준비
참고: 이것은 멸균 절차입니다.
- 지하 막 유래 용액(예를 들어, 마트리겔)을 준비하기 전에 소독제로 세포 배양 후드를 세척한다.
- 개별적으로 포장 된 멸균 1 mL 주사기를 준비하고 주사기에 로드하기 전에 알코올 면봉으로 지하 막 파생 용액 바이알의 상단을 닦아.
- 얼음에 성장 인자 감소 지하 막 유래 용액을 완전히 해동.
주의 사항: 지하 멤브레인 매트릭스가 실온(RT)에서 해동되는 경우, 용액이 겔화되는 것을 방지하기 위해 작은 얼음 입자가 남아 있는지 확인하십시오. - 일단 해동되면, 바이알을 열고 MCP-1 또는 1xPBS를 세포 배양 후드에서 0.1% BSA와 혼합한다.
- 멸균 주사기 1mL를 26G 바늘로 준비하고 얼음으로 식힙니다.
- MCP-1을 0.1% BSA로 1x PBS에서 50 μg/mL의 최종 농도로 용해시킴으로써 MCP-1의 재고 용액을 준비한다.
- 5 mL 의 차가운 지하 막 유래 용액에서 MCP-1을 500 ng/mL의 최종 농도로 희석하십시오. 차량 전용으로 동일한 양의 지하 멤브레인 유래 용액을 준비하십시오 (1x PBS는 0.1 % BSA를 포함합니다).
- 차가운 1 mL 주사기에 지하 멤브레인 유래 용액 (MCP-1 유무)의 500 μL을 로드하십시오.
- 균일 한 플러그 형성을 보장하기 위해 주입을하기 전에 지하 멤브레인 유래 용액로드 주사기에서 모든 기포를 제거합니다.
2. 지하 멤브레인 유래 용액 주입
- 주입 전과 주사 중에 시술 부위 주변에 70% 에탄올을 뿌려 환경을 소독하십시오.
- 마취를 유도하기 위해 마우스를 마취 챔버에 넣고 O2 유량계를 1 리터 / min으로 설정한 다음 기화기를 2 % 이소플루란으로 조정하십시오.
- 호흡속도(속도/분), 각막 반사 및 수염의 움직임을 모니터링하여 마취의 깊이를 모니터링합니다.
- 전체 절차 동안 코 콘을 사용하여 마취를 유지하십시오.
- 절차 도중 마취의 깊이를 확인하기 위하여 호흡 비율 (비율/분), 각막 반사 및 수염의 운동을 계속 감시합니다.
- 발가락 꼬치에 대한 반응부족을 확인한 후, 마우스의 오른쪽(MCP-1 없음)과 왼쪽(MCP-1 사용) 측면에 지하 막 유래 용액을 천천히 주입(약 100 μL/s)합니다. 주입이 너무 느리면, 지하 막 유래 젤 플러그는 불규칙하게 형성되거나 심지어 단편화될 수 있으며 제거하기가 어려울 수 있습니다.
- 주사기를 주입 후 20-30s 동안 잡아 용액의 누출을 방지하고 단일 매끄러운 젤 플러그가 형성될 수 있도록 합니다.
- 주입 후, 회복 될 때까지 모니터링과 함께 온난화 패드에 마우스를 놓습니다.
- 마우스가 완전히 복구되면 마우스를 원래 케이지로 되돌아갑니다.
3. 지하 멤브레인 유래 젤 플러그 수확
- 각 마우스에 대해 두 개의 별도의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 계량하고 라벨을 붙입니다.
- 지하막 유래 용액을 주입한 지 3일 후, 3% 이소플루란을 이용하여 마취실에서 마우스를 안락사시키고 자궁경부 탈구를 하였다.
- 헤어 클리퍼를 사용하여 마우스의 등도 털을 제거하거나 면으로 된 스틱으로 헤어 리무버 크림을 5분 간 닦은 다음 닦아냅니다.
- 하부 흉부 및 상류 척추 주위의 집게를 사용하여 마우스 피부를 잡고 피부에 2mm 길이의 절개를 합니다.
- 자궁 경부 척추로 만든 절개에서 마우스 뒷면의 중간선을 절단하고 수술 용 가위를 사용하여 척추 접합부 (꼬리 접합부) 위 1cm로 줄입니다.
- 근육 층에서 피부를 분리하고 폴리스티렌 폼 플랫폼에서 피부를 핀 다운합니다.
- 미세 한 집게를 사용 하 여 지하실 막 파생 된 젤 플러그를 포함 하는 섬유 캡슐을 신중 하 게 잡고 플러그를 청소 하는 미세 가위를 사용 하 여 섬유 캡슐을 제거.
- 세척된 지하 막 유래 젤 플러그를 제거하고 1.5 mL 미세 원심 분리기로 옮김(3.1 참조)으로 옮김을 제거합니다.
- 미세 원심 분리기 튜브를 청소 된 지하 멤브레인 유래 젤 플러그로 계량하고 지하 멤브레인 유래 젤 플러그의 무게를 계산합니다.
4. 지하 멤브레인 유래 젤 플러그 다이제스트
- 얼음에 해동 (10 mL).
- 깨끗한 미세 가위를 사용하여 미세 원심 분리튜브에 지하 막 유래 젤 플러그를 다진다.
- 지하 막 유래 젤 플러그를 함유한 각 미세 원심 분리튜브에 디스파스 800 μL을 추가합니다.
- 플러그를 방해하는 10 초 최대 속도의 소용돌이.
- 1,400 rpm에서 37°C에서 37°C에서 2시간 동안 미세원심지 튜브를 열믹서에서 배양하여 지하 막 유래 겔 플러그를 완전히 용해시킵니다.
- 2 시간 후, RT에서 10 분 동안 400 x g에서 원심 분리기를 조심스럽게 제거하고 상급을 폐기하십시오.
- 반전 또는 도청하여 1x PBS의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- RT에서 10 분 동안 200 x g에서 원심 분리를 반복하십시오.
- PBS의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 별도의 미세 원심 분리튜브에 50 μL의 세포 현탁액을 복용하십시오.
- 셀 서스펜션에 0.5 μL의 칼세인 AM(1M)을 추가합니다.
참고: Calcein AM은 살아있는 세포에서만 축적되는 녹색 형광 세포 생존 용염입니다. - 세포를CO2 인큐베이터에서 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 자동화된 세포 카운터를 사용하여 녹색 형광(live) 및 비형광(dead) 세포를 계산합니다.
5. 단세포 웨스턴 블롯 (scWB) 분석을 사용하여 세포 현탁액에서 세포 조성을 결정
- RT에서 적어도 10 분 동안 페트리 접시에 1x 서스펜션 버퍼의 15 mL에서 사용하기 전에 scWB 칩을 다시 수화.
- 희석된 단일 셀 현탁액(10,000-100,000 셀/mL)의 1mL를 재수화 된 칩에 추가하십시오. 표면을 10cm 페트리 접시의 바닥에 놓습니다. 표면이 평평하게 설정되어 있는지 확인합니다.
- 건조를 방지하기 위해 뚜껑으로 페트리 접시를 덮고 세포가 그라데이션으로 5-15 분 동안 정착하게하십시오.
- 칩을 밝은 필드 현미경 아래에 놓고 10배 배율로 우물을 검사합니다.
참고: 대략 15-20% 마이크로웰은 단 하나 세포에 의해 점유되어야 합니다, 우물의 2% 미만은 2 개 이상의 세포를 포함해야 합니다 - 칩이 들어있는 10cm 페트리 접시를 45도 기울입니다.
- 칩의 상부에서 하부로 부드럽게 피펫팅하여 칩 표면에서 캡처되지 않은 셀을 제거하기 위해 1x 서스펜션 버퍼로 칩을 세척합니다. 3회 반복합니다.
- 단일 셀 서양 악기를 준비합니다.
- 용해 시간, 전기 동공 시간 및 UV 캡처 시간을 설정합니다. 지하 막 유래 젤 플러그에서 회수 된 모집 된 대식 세포를 분석하려면 다음과 같은 설정을 사용하십시오 : 용해 시간 : 0 s; 전기 동공 시간 : 160 s; UV 캡처 시간 240 s.
- 조심스럽게 단일 셀 서양 악기의 전기 영동 셀에 칩을로드, 젤 측 직면. 칩의 젤 면이 손상되지 않도록 주의하십시오.
- 챔버에 라시스 / 실행 버퍼를 부어 완전히 전체 단일 셀 웨스턴 칩을 커버. 세포 를 시작 하십시오.
- 5.8에 나열된 설정을 사용하여 scWB 계측기를 실행합니다.
- 실행이 완료되면, 10cm 페트리 접시에 칩을 전송하고 RT에서 10 분 동안 1x 세척 버퍼로 두 번 칩을 세척합니다.
- 1 차 항체의 희석을 준비 (항 -vinculin: 1:10; 항 CD45: 1:15, 반대로 CD11b: 1:20, 반대로 F4/80: 1:10) 항체 희석제의 총 부피 80 μL (항체 의 8 μL 을 혼합 1 항체 의 8 μL 플러스 64μl 의 64l).
- 항체 프로빙 챔버에 1차 항체 용액의 80 μL을 추가하고 칩 겔 면을 아래로 낮추어 항체 용액이 칩 을 가로질러 심지 않도록한다.
- RT에서 2 시간 동안 1 차 항체 용액으로 배양하십시오.
- 셰이커의 1x 세척 버퍼에서 10분 동안 칩을 세 번 세척합니다.
- 칩을 셰이커의 물에 10분 동안 세척하여 젤을 탈염시다.
- 총 부피 80 μL에서 이차 항체의 1:20 희석을 준비합니다(이차 항체의 2 μL과 희석제 78 μL 혼합).
- RT에서 1 시간 동안 이차 항체로 칩을 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
- 셰이커에 1x 세척 버퍼로 칩을 10 분 동안 세 번 씻으하십시오.
- 슬라이드 스피너를 사용하여 칩을 회전하여 남은 세척 버퍼를 제거합니다.
- 이차 항체에 결합된 형광포의 스펙트럼 채널에서 5 μm 해상도로 듀얼 레이저 마이크로어레이 스캐너에서 칩을 스캔합니다.
- scWB 관련 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
6. scWB 칩 제거
- 스캔한 칩을 제거할 준비가 될 때까지 세척 버퍼에 보관하십시오.
- 연기 후드에 물 목욕을 배치합니다.
- 50 mL 튜브 랙을 랙 위에 1cm 의 물로 수조에 놓고 물 온도를 60 °C로 설정하십시오.
- 스트리핑 버퍼를 준비합니다. 스트리핑 버퍼 용액 1L의 경우, 900 mL의 증류수에서 Tris-HCl (pH 6.8) 및 SDS 20g9.85 g을 용해하고 pH를 조정하십시오. 그런 다음 증류수를 1L로 채우십시오. 각 사용 직전에 β-메르카포에탄올(β-ME; 14.3 M)의 0.8% (v/v)를 추가합니다.
- 초기 스캔 후, 칩을 10cm 페트리 접시에 담아 벗기전에 놓습니다.
- 각 칩에 대해 40 mL의 스트리핑 버퍼를 취하고 β-ME 320 μl을 추가합니다.
주의: β-ME는 인체와 환경에 유해하며 유해합니다. 다음 절차는 연기 후드에서 수행해야합니다. - 캐니스터에 칩을 넣고 캐니스터로 물이 새는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 캐니스터를 밀봉합니다.
- 튜브 랙 내부에 캐니스터를 미리 데운 수조에 놓습니다.
- 90 분 동안 배양하십시오.
- 조심스럽게 캐니스터에서 칩을 제거하고 신선한 페트리 접시에 놓습니다.
- 1x 세척 버퍼로 칩을 한 번 간략하게 씻으소서. 그런 다음 페트리 접시에 15 mL의 1x 세척 버퍼를 추가합니다.
- 셰이커에서 칩을 15분 동안 씻습니다. 세척 단계를 4번 반복합니다.
참고: 칩은 다음 1차 항체에 대해 준비되었습니다(단계 5.12 - 5.21 참조).
Representative Results
화학 물질에 혈액 단핵구의 응답성에 액세스하기 위해, 우리는 각 마우스의 왼쪽과 오른쪽 측면에 차량로드 및 MCP-1로드 지하 막 파생 솔루션을 주입. 지하막 유래 겔 플러그는 주사 후 1, 3 및 5일 후에 제거되었고, 각 플러그내로 모집된 용해 및 세포를 계수하였다(도1A). MCP-1 로드 플러그(closed bar)에서 차량 부하 플러그(open bar)에서 셀 수를 빼고, MCP-1에 반응하여 특별히 모집된 셀수를 얻었다(Δ 셀 번호, 도 1B). 우리는 5 일 기간 동안 세포의 가속된 MCP-1 특정 모집 그리고 축적을 관찰했습니다, 비율은 31,000 세포/일(1일)에서 78,000 세포/일 (3일) 및136,000 세포/일 (그림 1B)에서 증가했습니다.
지하 막 유래 젤 플러그에 들어간 세포 유형을 확인하기 위해 각 플러그에서 단일 세포 서부 얼룩 분석(scWB)으로 분리된 세포를 실시하여 CD45, CD11b 및 F4/80 식을 조사하여 단핵구(CD11b+F4/80)를 식별했습니다. -), 대식세포 (CD11b+F4/80+ + CD11b-F4/80+) 및 나머지 비단핵 백혈구 (CD45+CD11b-F4/80-그림2) scWB 칩은 각 겔의 총 세포 수를 확인하고 scWB 칩상에서 마이크로웰의 단일 세포 점유율을 확인하기 위해 비나쿨린을 조사했습니다. MCP-1-로드 지하 멤브레인 유래 겔 플러그 내 단핵구의 비율은 1일째, 20% 낮고, 3일째에는 47%로 정점을찍은 후 5일째에 14%로 떨어졌습니다(그림 2D). MCP-1로드 지하 멤브레인 유래 겔 플러그 내의 대식세포 수치는 1일째 13%에서 3일째 22%, 5일째 23%로 꾸준히 증가했습니다. MCP-1로드 플러그의 경우, 단핵구와 격리된 세포 집단 내의 대식세포의 비율이 3일째에 가장 높았으며, 차량 적재 플러그(그림3A)에서31%, MCP-1로드 플러그(그림3B)에서58%가 3일 후에 있음을 나타냅니다. MCP-1 의존성 화학요법에 의해 모집된 세포의 대다수는 단핵구 및 대식세포입니다. 단핵구와 대식세포의 총수는 3일째(도3C 및D)에 비해 5일째에 더 높았지만, 전체 세포 집단에서 단핵구와 대식세포의 비율이 현저히 높기 때문(도3A). B),3일째의 세포 수는 혈액 단핵구 화학요법과 모집을 보다 정확하게 반영한다. 따라서 동물을 희생하기 3일 전에 지하 막 유래 용액을 정기적으로 주입합니다. MCP-1에 의해 모집된 모든 대식세포가 인접한 조직에서 모집된 단일세포 유래 또는 상주 대식세포인지 여부는 결정되지 않았다.
여기에 도시된 데이터의 통계 분석은 분석 소프트웨어(예를 들어, SigmaPlot 14)로 수행하였다. ANOVA 다음에 Fischer LSD 시험을 사용하여 실험 군 간의 평균 값을 비교하였다. 모든 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로서 제시된다. 결과는 P< 0.05 수준에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
그림 1 : 피하 지하 막 유래 젤 플러그로 모집 된 세포의 정량. (A) 차량 적재(오픈 바) 및 MCP-1 로드 지하 멤브레인 유래 겔 플러그(폐쇄형 막대)에 대한 절대 셀 번호. (B) MCP-1에 의해 지하 막 유래 겔 플러그로 모집된 셀의 수는 MCP-1 로드 플러그와 차량 적재 플러그 사이의 셀 수의 차이로 계산됩니다. 결과는 평균 ± SD (n = 4)로 표시되어이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 단세포 서쪽 얼룩 분석에 의하여 지하 막 파생된 젤 플러그로 모집된 세포 집단의 분석. (A+B) 대표적인 예는 주사 3일 후 마우스로부터 분리된차량-로드(Control) 및 MCP-1-리드 플러그(MCP-1)의 scWB 분석에 대해 도시된다. CD45, CD11b 및 F4/80에 대한 항체로 표지된 칩은 프로토콜에 기재된 바와 같이 형광 이차 항체에 의해 뒤따랐다. 각 개별 세포에 대한 표지된 밴드의 형광 강도는 피크 영역으로 도시된다. (C+D) 세포 집단은 단핵구 (CD11b+F4/80 
-, 대식세포)로 확인되었으며, 대식세포 (CD11b+F4/80+ + CD11b-F4/80+ 
+) 또는 비단핵백혈소종(CD45++ , 
). 나머지 셀은 "기타"()로
표지되었다. 결과는 평균 ± SD(n=3)로 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 지하 막 유래 젤 플러그의 단핵구 및 대식세포 함량. 1일, 3일 및 5일 사후 주입시 제거된 차량 적재 및 MCP-1 로드 플러그에서 모집된 단핵구 및 대식세포 함량의 정량적 분석. 값은 총 셀 모집단(A+B)의 백분율과 플러그당 절대 셀 수(C+D)로 표시됩니다. 결과는 평균 ± SD(n=3)로 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리는 지하 막 파생 매트릭스의 독특한 물성과 화학으로이 독특한 매트릭스를로드하고 마우스에 주입 할 수있는 능력을 사용하여 생체 내 화학 요법 분석법을 개발했습니다. 이 분석법은 MCP-1에 대해 여기에 설명된 바와 같이 살아있는 마우스에서 단핵구(및 대식세포)의 반응성을 평가하고, 유전자 조작 또는 약리학, 식이 및 기타 환경 노출이 단핵구에 미치는 영향을 평가할 수 있게 해줍니다. 화학 요법. 우리가 이 마우스에서 만드는 chemokine 그라데이션은 유전, 약리학, 규정식 또는 환경 노출에 의해 본질적으로 영향을 받지 않습니다 때문에, 단핵구 화학 활성에 있는 변경은 실제로 이 단핵구에 있는 기능적인 변경을 반영하고, 우리가 보여주었듯이 이전에는 단백질 및 전사 수준 둘 다에서 재프로그래밍도17,20. 우리는 마우스에 있는 신진 대사 긴장이 화학력에 단핵구 반응을 증가시키고 이 hyper-chemotactic 활동이 증가한 단백질 S-glutathionylation, 가역적이고, 산화환원 의존적인 번역과 상관관계가 있다는 것을 보고했습니다 단백질 변형은 대부분의 경우 효소 및 단백질 기능 21,22의손실로 이어지며, 어떤 경우에는 단백질 분해를 촉진하기도한다 16,23.
이 절차를 성공적으로 실행하고 이 분석으로 최적의 결과를 얻으려면 지하 막 유래 용액의 정확한 부피가 천천히 주입되어 단수 의 잘 형성된 플러그및 섬유질 캡슐을 제거하는 것이 중요합니다. 완전히 수확 지하 막 유래 젤 플러그 때 깨끗한 플러그를 얻을, 디스파스 용액의 전체 플러그의 용해를 용이하게한다. 우리의 데이터는 3 일 동안 동물에 플러그를 남겨두는 것은 1) 신호 강도, 즉 각 플러그에 모집 된 단핵구 및 대식세포의 수, 2) 신호의 선택성, 즉 내의 단핵구 및 대식세포의 함량을 최적화한다는 것을 보여줍니다. 총 세포 집단 및 3) 신호의 특이성, 즉 차량에 비해 MCP-1에 대한 응답으로 단핵구 및 대식세포의 증가. 마지막으로, 우리는 지하 막 유래 젤 플러그 분석과 함께 최첨단 단일 세포 기반 접근법이 플러그에 모집 된 단핵구를 특성화하여 잠재적 인 표현형의 스냅 샷을 얻는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 특정 유전, 약리학, 식이 요법 또는 환경 적 개입에 대한 응답으로 주어진 마우스 모델에서 부상 부위에 모집되는 단핵구 유래 대식세포.
고려되어야 할 분석법의 여러 가지 제한사항이 있다. 첫째, 마취, 지하 막 유래 용액 의 주입 및 외과 용해를 포함한 마우스 처리는 단일 플러그 및 재현 가능한 데이터를 생성하는 연습이 필요합니다. 둘째, MCP-1 로 로드된 플러그로 모집된 대부분의 세포는 단핵구및 대식세포이지만, 상당수는 그렇지 않다. 이것은 이 세포 인구에 행한 그밖, 비 단세포 기지를 둔 분석 분석분석법의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, scWB를 위한 세포 용해 조건은 온화하기 때문에, 단백질의 이동 거리는 표준 WB와 다를 수 있고 단백질 크기와 상관관계가 없을 수 있습니다. 따라서, 세포 용해 및 실행 시간 둘 다 시험될 각각의 새로운 단백질및 사용된 각각의 1 차적인 항체에 대하여 검증되어야 합니다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 프로젝트는 NIH (AT006885)에서 R.A.에 대한 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
| 10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
| 15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
| 2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
| 5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
| Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
| Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
| Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 mL |
| CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
| CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
| CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
| Cellometer Vision | Nexcelom | ||
| Dispase | BD | 354235 | 100 mL |
| Dissecting sissor | |||
| Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
| F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
| Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
| Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
| Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
| Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
| Milo | proteinsimple | Single cell western | |
| Needle | BD | 305111 | 26 G |
| Parafilm | |||
| Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
| Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
| scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
| Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
| Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
| Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
| Syringe | BD | 309602 | 1 mL |
| Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
| Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
| Water bath | ThermoFisher |
References
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