Summary
Hier presenteren we een protocol om de Chemotactische activiteit van bloed monocyten in muizen modellen te kwantificeren, om de effecten van nutritionele, farmacologische en genetische interventies op bloed monocyten te beoordelen en om de in het bloed geafgeleide macrofagen te karakteriseren in Muismodellen met behulp van monocyte-chemoaantretant proteïne-1 (MCP-1)-geladen in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers.
Abstract
Weefselhomeostase en reparatie zijn kritisch afhankelijk van de werving van monoyte-afgeleide macrofagen. Zowel de onder-als de overrekrutering van monoyte-afgeleide macrofagen kan de wondgenezing aantasten. We toonden aan dat hoge vetten en hoge suiker diëten monocyt priming en dysfunctie bevorderen, waardoor gezonde bloed monocyten in een Hyper chemotactisch fenotype worden omgezet om te differentiëren in macrofagen met disgereguleerde activerings profielen en verminderde fenotypische Plasticiteit. De overmatige rekrutering van monoyte-afgeleide macrofagen en rekrutering van macrofagen met disgereguleerde activerings profielen wordt verondersteld een belangrijke bijdrage te leveren aan de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten die gepaard gaan met metabole stoornissen, met inbegrip van atherosclerose en obesitas. Het doel van dit protocol is om de Chemotactische activiteit van bloed monocyten te kwantificeren als een biomarker voor monocyt priming en dysfunctie en om het macrofaag fenotype bloed monocyten te karakteriseren, zijn klaar om te differentiëren in deze Muismodellen. Met behulp van single cell Western Blot-analyse laten we zien dat 33% van de cellen die zijn gerekruteerd in MCP-1-geladen in kelder membraan-afgeleide gelpluggen die in muizen zijn geïnjecteerd, monocyten en macrofagen zijn; 58% na dag 3. Op dag 5 werden monocyt en macrofaag getallen echter significant verlaagd. Tot slot tonen we aan dat deze assays ook de isolatie van levende macrofagen van de chirurgisch opgehaalde, in het membraan afgeleide gelpluggen mogelijk maken, die vervolgens kunnen worden onderworpen aan een daaropvolgende karakterisatie door een single cell Western Blot-analyse.
Introduction
De werving van monoyte-afgeleide macrofagen is essentieel voor de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten geassocieerd met metabole stoornissen, waaronder atherosclerose en obesitas1,2,3, 4. Het aantal monoyte-afgeleide macrofagen op plaatsen van weefsel letsel, alsmede hun plasticiteit zijn essentieel voor het weefselhomeostase en reparatie. Zowel de onder-als de overrekrutering van monoyte-afgeleide macrofagen kan de wondgenezing aantasten5. Triggering lokale weefsel ontsteking, bijvoorbeeld door de accumulatie en oxidatie van low-density lipoproteïne (LDL) in de aorta muur of inflammatoire activering van adipocytes door vetzuren of bacteriële lipopolysaccharide lekken door de intestinale barrière, leidt tot het vrijkomen van ontstekingsmediatoren, met inbegrip van chemokines zoals monocyt chemoaantretant proteïne-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 is een lid van de c-c Chemokine familie en een belangrijke chemoaantretant die verantwoordelijk is voor de werving van monoyte-afgeleide macrofagen aan plaatsen van weefsel ontsteking en-letsel6,7,8, 9,10. Inflammatoire activering van vasculaire endotheel resulteert in de uitdrukking van verklevingen moleculen zoals intercellulaire adhesie molecuul 1 (ICAM-1) en vasculaire cel adhesie molecuul 1 (VCam-1)11,12, waardoor circulerende monocyten geactiveerd door MCP-1 om mee te rollen, stevig vasthouden aan en vervolgens transmigreren in de subendotheliale ruimte12. Infiltreren monocyten differentiëren in macrofagen, die kunnen worden geactiveerd in een proinflammatoire fenotype, het stimuleren van het acute ontstekingsproces. Gedreven door de micro-omgeving, pro-inflammatoire macrofagen kunnen omzetten in ontsteking-oplossen van macrofagen, die spelen kritieke rollen in de clearing van inflammatoire cellen, pro-inflammatoire signalen te verwijderen en het voltooien van weefsel reparatie en wond genezing van12,13.
Chronische metabole stress priemgetallen monocyten voor een dramatisch verbeterde responsiviteit op chemo-loktanten en verhoogde monocyt rekrutering, en we toonden aan dat klaar monocyten aanleiding geven tot macrofagen met disgereguleerde activerings Programma's en polarisatie Staten14,15,16. Monocyte priming bevordert atherosclerose, obesitas, en eventueel andere chronische ontstekingsziekten geassocieerd met metabole aandoeningen zoals Steatohepatitis, nierziekten en mogelijk kanker. Om monocyten te beoordelen en te kwantificeren in muizen modellen van menselijke ziekten, ontwikkelden we een nieuwe techniek om de priming-toestand van bloed monobytes te beoordelen door het meten van de Chemotactische activiteit in vivo14,15,16, 17. Onze aanpak omvat de injectie van in de kelder afgeleide gel geladen met ofwel een chemoaantretant — we gebruiken vaak MCP-1 — of voertuig in de linker-en rechterflank, respectievelijk, van muizen. Wanneer voorzichtig subcutaan geïnjecteerd, de kelder membraan-afgeleide gel zal een enkele stekker, waaruit de chemokines kunnen diffuus en creëren een gedefinieerde Chemotactische gradiënt die niet wordt beïnvloed door de metabole of inflammatoire toestand van de omringende het weefsel of de muis van de ontvanger.
De in de kelder afgeleide gel die we gebruiken voor onze assay is een ontbindend kelder membraan voorbereiding geëxtraheerd uit de engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis Sarcoom, een tumor die rijk is aan dergelijke extracellulaire matrix (ECM) eiwitten. Dit complexe eiwitmengsel bevat laminine (60%), collageen IV (30%), het overbruggings molecuul entactin (8%), en een aantal groeifactoren. De kelder membraan matrix plug assay werd oorspronkelijk ontwikkeld om angiogenese te onderzoeken in reactie op verschillende groeifactoren18,19. Echter, met het oog op de studie van monocyt chemotaxis, het is belangrijk om te gebruiken groeifactor-uitgeput kelder membraan-afgeleide gel te minimaliseren endotheliale cel werving en angiogenese. Wat Matrigel (aangeduid als "kelder-membraan-afgeleide gel voortaan") uniek en vooral nuttig maakt, is dat bij temperaturen onder de 10 °C het vloeibaar wordt, waardoor chemokinen kunnen worden opgelost. Bij temperaturen boven 22 °C ondergaat de in de kelder afkomstige membraan oplossing snel een faseovergang en vormt deze snel een hydrogel. De stekkers kunnen chirurgisch worden uitgesneden, gereinigd en opgelost met een door Bacillus afgeleide neutrale Metalloprotease voor het opleveren van suspensies van één cel, die kunnen worden geanalyseerd op een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS), door RNAseq, eencellig RNA en een verscheidenheid aan andere omics-technieken. Hier beschrijven we het gebruik van single-cell Western Blot analyse voor de karakterisering van de celpopulaties gerekruteerd in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers één, drie of vijf dagen na injectie.
Protocol
Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Wake Forest School of Medicine.
1. bereiding van de MCP-1-geladen groei factor-verlaagde oplossing in de kelder membraan-afgeleide
Opmerking: Dit is een steriele procedure.
- Reinig de celcultuurkap met een ontsmettingsmiddel voordat u de in het membraan afgeleide oplossing bereidt (bijv. Matrigel).
- Bereid individueel verpakte steriele 1 mL spuit en veeg de bovenkant van de injectieflacon met de basis membraan afgeleide oplossing af met een alcoholdoekje voordat u het in de spuit laadt.
- Volledig ontdooien de groeifactor-verlaagde kelder membraan-afgeleide oplossing op ijs.
Let op: Als de kelder membraan matrix is ontdooid bij kamertemperatuur (RT), zorg ervoor dat een klein ijsdeeltje blijft om te voorkomen dat de oplossing Gelling. - Eenmaal ontdooid, open de injectieflacon en meng MCP-1 of 1xPBS met 0,1% BSA in de celcultuurkap.
- Bereid een 1 mL van de steriele spuit met een 26 G naald en koel op ijs.
- Bereid een stamoplossing van MCP-1 door MCP-1 op te lossen tot een eindconcentratie van 50 μg/mL in 1x PBS met 0,1% BSA.
- Verdun MCP-1 in 5 mL koude kelder membraan-afgeleide oplossing tot een eindconcentratie van 500 ng/mL. Bereid een gelijke hoeveelheid in de kelder membraan afgeleide oplossing met alleen voertuig (1x PBS bevatten 0,1% BSA).
- Plaats 500 μL in de koude 1 mL spuit met membraan afgeleide oplossing (met of zonder MCP-1).
- Verwijder alle luchtbellen uit de kelder membraan-afgeleide oplossing geladen spuit voor het maken van de injectie om een uniforme plug vorming te garanderen.
2. injectie van in de kelder afgeleide oplossing
- Spray 70% ethanol rond het procedure gebied voor en tijdens de injecties om het milieu te ontsmetten.
- Om anesthesie te induceren, plaats de muis in een anesthesie kamer en stel de O2 -stromingsmeter in op 1 liter/min en pas vervolgens de vaporizer aan op 2% isoflurane.
- Bewaak de diepte van de anesthesie door het bewaken van de ademhalingsfrequentie (snelheid/min), corneale reflex en beweging van snorharen.
- Gedurende de hele procedure, handhaaf anesthesie met behulp van een neuskegel.
- Tijdens de procedure houden bewaken van de ademhalingsfrequentie (snelheid/min), corneale reflex en beweging van snorharen om te controleren of de diepte van de anesthesie.
- Na bevestiging van gebrek aan reactie op Teen knijpen, langzaam injecteren (ongeveer 100 μL/s) de kelder membraan-afgeleide oplossing subcutaan in de rechter (geen MCP-1) en links (met MCP-1) flank van de muis, respectievelijk. Als de injectie te traag is, kunnen de in de kelder gevormde gelpluggen onregelmatig worden gevormd, of zelfs gefragmenteerd, en moeilijk te verwijderen zijn.
- Houd de spuit vast voor 20-30 s na de injectie om lekkage van de oplossing te voorkomen en om een enkele gladde gel-plug te vormen.
- Na de injectie, het plaatsen van de muis op de verwarmende pad met bewaking tot herstel.
- Keer de muis terug naar de originele kooi zodra de muis volledig is hersteld.
3. oogst de kelder membraan-afgeleide Gelplugs
- Weeg twee afzonderlijke micro centrifugebuizen van 1,5 mL voor elke muis en label ze.
- Drie dagen na de injectie van de in de kelder membraan afgeleide oplossing, euthanaseer de muis in de verdovings kamer met behulp van 3% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.
- Verwijder de rugvacht van de muis met behulp van haar Tondeuses of breng haarverwijderingcrème met wattenstaafjes gedurende 5 minuten aan en veeg vervolgens af.
- Houd de muis huid met behulp van een tang rond de onderste thoracische en bovenste lumbale wervel en maak een 2 mm-lange incisie in de huid.
- Snijd de middenlijn van de achterkant van de muis van een incisie gemaakt tot halswervels en tot 1 cm boven caudal wervel kruising (staart kruising) met behulp van chirurgische schaar.
- Scheid de huid van de spierlaag en pin-down de huid op een polystyreenschuim platform.
- Houd de vezelloze capsule met de in de kelder membraan afgeleide gelplug met behulp van fijne Tang en verwijder de vezelloze capsule met een fijne schaar om de stekker te reinigen.
- Verwijder de gereinigde door een kelder membraan afgeleide gelplug en breng deze over naar 1,5 mL micro centrifuge (zie 3,1).
- Weeg de micro centrifugebuis met de gereinigde in de kelder membraan afgeleide gelplug en bereken het gewicht van de in de kelder van membraan afgeleide gelplug.
4. Digest de kelder membraan-afgeleide gel stekkers
- Ontdooien (10 mL) op het ijs.
- Gehakt de in de kelder van membraan afgeleide gelplug in de microcentrifuge buis met behulp van schone fijne schaar.
- Voeg 800 μL dispase toe aan elke micro centrifugebuis met een in de kelder membraan afgeleide gelplug.
- Vortex met maximale snelheid voor 10 sec. om de stekker te verstoren.
- Inbroed de microcentrifugebuisjes gedurende 2 uur bij 37 °C bij 1.400 rpm in een thermomixer om de in de kelder afgeleide gelstekker volledig los te maken.
- Na 2 uur Centrifugeer met 400 x g gedurende 10 min bij RT. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg.
- Regeer de pellet in 1 mL 1x PBS door te inverteren of te tikken.
- Herhaal de centrifugeren bij 200 x g gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg.
- Respendeer de pellet in 300 μL PBS.
- Neem 50 μL celsuspensie in een aparte microcentrifuge buis.
- Voeg 0,5 μL calceïne am (1 M) toe aan de celsuspensie.
Opmerking: Calcein AM is een groene fluorescerende cel levensvatbaarheid kleurstof die alleen accuiteert in levende cellen. - Incuberen de cellen in een CO2 -incubator bij 37 °c gedurende 10 minuten.
- Tel groene fluorescerende (levende) en niet-fluorescerende (dode) cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller.
5. bepaling van de Celsamenstelling in de celsuspensie met behulp van een scWB-analyse (single-cell Western Blot)
- Hydrateer de scWB-chip voor gebruik in 15 mL 1x suspensie buffer in een Petri schaaltje gedurende ten minste 10 minuten bij RT.
- Voeg 1 mL van de verdunde enkelvoudige celsuspensie (10000-100000 cellen/mL) toe aan de gerehydrateerde chip. Zet het oppervlak op de bodem van een 10 cm Petri schaaltje. Zorg ervoor dat het oppervlak plat is ingesteld.
- Bedek de Petri schaal met een deksel om uitdroging te voorkomen en laat de cellen 5-15 min. per gradiënt regelen.
- Plaats de chip onder een helder-veld microscoop en Inspecteer de putjes bij 10x vergroting.
Opmerking: Ongeveer 15-20% micro putten moeten worden bezet door een enkele cel, minder dan 2% van putten moet bevatten 2 of meer cellen - Kantel de 10 cm Petri schaal met de chip met 45 graden.
- Was de chip met de 1x suspensie buffer om niet-vastgelegde cellen van het oppervlak van de chip te verwijderen door voorzichtig pipetteren van boven naar beneden van de chip. Herhaal dit 3 keer.
- Bereid de single cell Western instrument.
- Stel de lysis-tijd, elektroforese tijd en UV-opnametijd in. Om gerekruteerde macrofagen te analyseren die zijn teruggewonnen uit de in het kelder membraan afgeleide gelplug, gebruikt u de volgende instellingen: lysis tijd: 0 s; elektroforese tijd: 160 s; UV-opnametijd 240 s.
- Laad de chip voorzichtig in de elektroforese cel van een enkele cel westers instrument, gel-kant gericht. Let op dat u de gelzijde van de chip niet beschadigt.
- Giet de lysis/lopende buffer in de kamer en dek de gehele Western chip van één cel volledig af. Start de cel lysis.
- Voer scWB instrument uit met behulp van de instelling vermeld in 5,8.
- Zodra de run voltooid is, zet de chip over naar een 10 cm Petri schaaltje en was de chip tweemaal met 1x wasbuffer gedurende 10 min bij RT.
- Bereid verdunningen van primair antilichaam (anti-vinculin: 1:10; anti-CD45:1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80:1:10) in een totaal volume van 80 μL antistof verdunningsmiddel (Meng 8 μL antilichaam 1 plus 8 μL antilichaam 2 plus 64 μL verdunningsmiddel).
- Voeg 80 μL van de primaire antilichaam oplossing toe aan de antilichaamprobing kamer en verlaag de gel-zijde naar beneden zodat de antilichaam oplossing over de chip wikt.
- Inincuberen met de primaire antilichaam oplossing voor 2 uur bij RT.
- Was de chip drie keer gedurende 10 min in 1x wasbuffer op de shaker.
- Was de chip eenmaal voor 10 min in het water op de shaker om de gel te ontzouten.
- Maak een 1:20 verdunning van het secundaire antilichaam in een totaal volume van 80 μL (Meng 2 μL secundair antilichaam plus 78 μL verdunningsmiddel).
- Incuberen de chip met secundair antilichaam voor 1 uur bij RT beschermd tegen licht.
- Was de chip drie keer gedurende 10 minuten met 1x wasbuffer op de shaker.
- Draai de chip met behulp van een Slide spinner om de resterende wasbuffer te verwijderen.
- Scan de chip op een Dual-Laser Microarray scanner met een resolutie van 5 μm op het spectrale kanaal van de de gekoppeld aan de secundaire antilichamen.
- Analyseer gegevens met behulp van scWB-specifieke software.
6. strippen van de scWB chip
- Bewaar de gescande chip in de wasbuffer totdat u klaar bent om te strippen.
- Plaats het waterbad in een rook afzuigkap.
- Plaats een tube rack van 50 mL in het waterbad met het water op slechts 1 cm boven het rek en stel de watertemperatuur in op 60 °C.
- Bereid de strip buffer. Voor 1 L strip bufferoplossing, los 9,85 g van tris-HCl (pH 6,8) en 20 g SDS in 900 mL gedistilleerd water op en pas de pH aan. Vul vervolgens met gedestilleerd water aan 1L. Voeg 0,8% (v/v) van β-mercaptoethanol (β-ME; 14,3 M) direct voor elk gebruik toe.
- Na de eerste scan, plaats de chip in een 10 cm Petri schaal voor het strippen.
- Neem voor elke chip 40 mL van de strip buffer en voeg 320 μl β-ME toe.
Let op: β-me is giftig en gevaarlijk voor mens en milieu. De volgende procedure moet worden uitgevoerd in een rook afzuigkap. - Plaats de chip in de bus en sluit de bus met Parafilm om te voorkomen dat er water in de bus lekt.
- Plaats de bus in het buisrek in het voorverwarmde waterbad.
- Incuberen gedurende 90 min.
- Verwijder voorzichtig de chip uit de bus en plaats deze in een verse Petri schaal.
- Was de chip één keer kort met 1x Wash buffer. Voeg vervolgens 15 mL 1x wasbuffer toe aan de Petri schaal.
- Was de chip 15 min op een shaker. Herhaal de Wash stap vier keer.
Opmerking: Chip is klaar voor het volgende primaire antilichaam (Zie stappen 5,12-5,21).
Representative Results
Om toegang te krijgen tot de responsiviteit van bloed monocyten aan chemoloktanten, hebben we de in het voertuig geladen en MCP-1 geladen kelder membraan-afgeleide oplossing in de linker-en rechter flanken van elke muis geïnjecteerd. In de kelder van membraan afgeleide gelpluggen werden 1, 3 en 5 dagen na injecties verwijderd, en de cellen die in elke stekker werden gerekruteerd, werden geteld (Figuur 1a). Door het aantal cellen in de in het voertuig geladen stekker (open balken) af te trekken van de celtelling in de MCP-1 geladen plug (gesloten balken), hebben we het in reactie op MCP-1 (Δ Cell Number, Figuur 1b) speciaal gerekruteerde celbereik verkregen. We observeerden een versnelde MCP-1-specifieke werving en accumulatie van cellen gedurende de periode van 5 dagen, met percentages die toenemen van 31.000 cellen/dag (dag 1) tot 78.000 cellen/dag (dag 3) en 136.000 cellen/dag op dag 5 (Figuur 1b).
Voor het identificeren van de celtypen die in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers, we onderworpen aan de cellen geïsoleerd van elke plug naar single cell Western Blot analyse (scwb), indringende voor CD45, CD11b en F4/80 expressie om monocyten te identificeren (CD11b+F4/80 -), macrofagen (CD11b+F4/80+ plus CD11b-F4/80+) en resterende niet-monocytische leukocyten (CD45+CD11b-F4/80-) (Figuur 2). De scWB-chips werden vervolgens voor vinculin geprotebred om de totale celaantallen op elke gel te bepalen en om de eencelbezetting van de micro putten op de scWB-chip te bevestigen. Het percentage monocyten binnen de met MCP-1 belaste gelpluggen in kelder membraan-afgeleide was laag op dag 1, 20%, piek op dag 3 bij 47%, respectievelijk voordat het naar 14% op dag 5 (figuur 2D) daalt. Macrofaag getallen binnen de MCP-1-loaded gelstekkers van in het souterrain afkomstige membraan stegen gestaag van 13% op dag 1 tot 22% op dag 3 en 23% op dag 5. Voor MCP-1-geladen stekkers was het percentage monocyten plus macrofagen binnen de geïsoleerde celpopulatie het hoogst op dag 3, 31% in voertuigen geladen stekkers (Figuur 3a) en 58% in MCP-1-geladen stekkers (Figuur 3b), wat aangeeft dat na 3 dagen de overgrote meerderheid van de cellen gerekruteerd door MCP-1-afhankelijke chemotaxis zijn monocyten en macrofagen. Hoewel het totale aantal monocyten plus macrofagen hoger was op dag 5 in vergelijking met dag 3 (figuur 3c en D), als gevolg van het significant hogere aandeel monocyten en macrofagen in de totale celpopulatie (Figuur 3a en B), het aantal cellen op dag 3 nauwkeuriger weerspiegelt bloed monocyt chemotaxis en werving. Wij, daarom, routinematig injecteren de kelder membraan-afgeleide oplossing drie dagen voorafgaand aan het offeren van de dieren. Of alle macrofagen die door MCP-1 worden gerekruteerd, monocyt-afgeleid zijn of ingezeten macrofagen die worden gerekruteerd uit naburige weefsels, zijn niet bepaald.
Statistische analyse van de hier getoonde gegevens werd uitgevoerd met analyse software (bijv. Sigmaplot 14). ANOVA gevolgd door de Fischer LSD-test werd gebruikt om de gemiddelde waarden tussen experimentele groepen te vergelijken. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van ten minste 3 onafhankelijke experimenten. De resultaten werden als statistisch significant beschouwd op het niveau P < 0,05.
Figuur 1 : Kwantatie van cellen gerekruteerd in onderhuidse membraan-afgeleide geldoppen. A) absolute celnummers voor in het voertuig geladen (open balken) en met MCP-1 belaste gelstekkers van in het kelder membraan afgeleide (gesloten staven). B) het aantal cellen dat is gerekruteerd in door MCP-1 aangeworven gelstekkers in de kelder membranen, berekend als het verschil in celaantallen tussen MCP-1-geladen en met voertuig belaste stekkers. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 4) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Analyse van celpopulaties gerekruteerd in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers door single cell Western Blot analyse. (A + B) Representatieve voorbeelden worden getoond voor de scWB-analyse van een voertuig-geladen (controle) en een MCP-1-leaded plug (MCP-1) geïsoleerd van een muis drie dagen na de injectie. Chips gelabeld met antilichamen gericht tegen CD45, CD11b en F4/80 gevolgd door fluorescerende secundaire antilichamen zoals beschreven in het protocol. De intensiteit van de fluorescentie van de gelabelde band voor elke afzonderlijke cel wordt weergegeven als piek gebied. (C + D) Celpopulaties werden geïdentificeerd als monocyten (CD11b+F4/80-, 
), macrofagen (CD11b+F4/80+ plus CD11b-F4/80+, 
) of als niet-monocytische leukocyten (CD45+ , 
). De overige cellen kregen het label "other"
(). Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Monocyte en macrofaag inhoud van in de kelder membraan afgeleide gelpluggen. Kwantitatieve analyse van gerekruteerde monocyten en macrofaag-inhoud in voertuig-geladen en MCP-1-geladen stekkers verwijderd op dag 1, 3 en 5 na de injectie. Waarden worden weergegeven als percentage van de totale celpopulatie (a + B) en in absolute celaantallen per stekker (C + D). Resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
We ontwikkelden een in vivo chemotaxis test, die gebruik maakt van de unieke fysische eigenschappen van de in de kelder verkregen membraan-afgeleide matrix en de mogelijkheid om deze unieke matrix te laden met chemokines en deze in muizen te injecteren. De bepaling stelt ons in staat om in levende muizen de responsiviteit van monocyten (en macrofagen) aan chemokines te beoordelen, zoals hier geïllustreerd voor MCP-1, en de effecten van genetische manipulatie of farmacologische, dieet-en andere milieu blootstellingen op monocyt chemotaxis. Omdat de Chemokine gradiënt die we in deze muizen creëren in essentie niet beïnvloed wordt door genetische, farmacologische, dieet-of milieublootstelling, reflecteren veranderingen in monocyt Chemotactische activiteit feitelijk functionele veranderingen in deze monocyten en, zoals we toonden eerder, ook de herprogrammering op zowel het eiwit en transcriptionele niveau17,20. We rapporteerden dat metabole stress bij muizen de responsiviteit van monocyt op chemoaantretant verhoogt en dat deze Hyper-Chemotactische activiteit correleert met verhoogde proteïne S-glutathionylatie, een reversibele, redox-afhankelijke posttranslationele eiwit modificatie, die in de meeste gevallen leidt tot verlies van enzymatische en eiwit functie21,22, en in sommige gevallen zelfs bevordert eiwitafbraak16,23.
Om deze procedure met succes uit te voeren en om optimale resultaten met deze assay te verkrijgen, is het van cruciaal belang dat nauwkeurige volumes van de in de kelder afkomstige membraan-afgeleide oplossing langzaam worden geïnjecteerd om een enkelvoudig goed gevormde plug te maken en vezelachtige capsules moeten worden verwijderd volledig te krijgen schone stekkers wanneer oogst kelder membraan-afgeleide gel stekkers, vergemakkelijkt de ontbinding van de hele plug in de dispase oplossing. Onze gegevens tonen aan dat het verlaten van de stekker in de dieren gedurende drie dagen optimaliseert 1) de signaalintensiteit, d.w.z. het aantal monocyten en macrofagen dat in elke stekker wordt gerekruteerd, 2) de selectiviteit van het signaal, d.w.z. het gehalte aan monocyten en macrofagen binnen de totale celpopulaties en 3) de specificiteit van het signaal, d.w.z. de toename van monocyten en macrofagen in reactie op MCP-1 in vergelijking met voertuig. Tot slot tonen we aan hoe State-of-the-art eencellige benaderingen in combinatie met de in de kelder afgeleide gel-plug assay kunnen worden gebruikt om de monocyten die in de stekkers worden gerekruteerd, te karakteriseren en zo een momentopname te verkrijgen van het mogelijke fenotype van de monoyte-afgeleide macrofagen die worden gerekruteerd op plaatsen van letsel in een bepaald muismodel als reactie op specifieke genetische, farmacologische, dieet-of milieu interventies.
Er zijn een aantal beperkingen van de bepaling die in aanmerking moeten worden genomen. Eerste, muis behandeling, met inbegrip van anesthesie, injectie van de kelder membraan-afgeleide oplossing, en chirurgische dissectie vereist praktijk om single stekkers en reproduceerbare gegevens te genereren. Ten tweede, terwijl de meeste cellen die worden gerekruteerd in de MCP-1 geladen stekkers monocyten en macrofagen zijn, is een substantieel aantal niet. Dit kan invloed hebben op de interpretatie van andere, niet-eencellige analytische assays uitgevoerd op deze celpopulatie. Tot slot, omdat de celllysiscondities voor scWB mild zijn, kunnen migratie afstanden van eiwitten afwijken van standaard WB en kunnen ze niet correleren met de eiwit grootte. Daarom moeten zowel de cellyse als de looptijden worden gevalideerd voor elk nieuw te testen eiwit en elk primair antilichaam dat wordt gebruikt.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit project werd gesteund door subsidies aan R.A. uit de NIH (AT006885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
| 10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
| 15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
| 2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
| 5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
| Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
| Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
| Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 mL |
| CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
| CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
| CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
| Cellometer Vision | Nexcelom | ||
| Dispase | BD | 354235 | 100 mL |
| Dissecting sissor | |||
| Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
| F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
| Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
| Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
| Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
| Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
| Milo | proteinsimple | Single cell western | |
| Needle | BD | 305111 | 26 G |
| Parafilm | |||
| Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
| Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
| scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
| Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
| Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
| Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
| Syringe | BD | 309602 | 1 mL |
| Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
| Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
| Water bath | ThermoFisher |
References
- Moore, K. J., Tabas, I.
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Akiyama, T., et al. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. Journal of Biological Chemistry. 262 (12), 5592-5595 (1987).
- Nahrendorf, M., Pittet, M. J., Swirski, F. K. Monocytes: protagonists of infarct inflammation and repair after myocardial infarction. Circulation. 121 (22), 2437-2445 (2010).
- Gosling, J., et al. MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B. Journal of Clinical Investigation. 103 (6), 773-778 (1999).
- Fantuzzi, L., et al. Loss of CCR2 expression and functional response to monocyte chemotactic protein (MCP-1) during the differentiation of human monocytes: role of secreted MCP-1 in the regulation of the chemotactic response. Blood. 94 (3), 875-883 (1999).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature. 394 (6696), 894-897 (1998).
- Han, K. H., Tangirala, R. K., Green, S. R., Quehenberger, O. Chemokine receptor CCR2 expression and monocyte chemoattractant protein-1-mediated chemotaxis in human monocytes. A regulatory role for plasma LDL. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 18 (12), 1983-1991 (1998).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Davies, M. J., et al. The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, PECAM, and E-selectin in human atherosclerosis. Journal of Pathology. 171, 223-229 (1993).
- Anderson, T. J., et al. The effect of cholesterol-lowering and antioxidant therapy on endothelium-dependent coronary vasomotion (see comments). New England Journal of Medicine. 332 (8), 488-493 (1995).
- Herold, S., Mayer, K., Lohmeyer, J. Acute lung injury: how macrophages orchestrate resolution of inflammation and tissue repair. Frontiers in Immunology. 2, (2011).
- Qiao, M., et al. Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 29, 1779-1786 (2009).
- Ullevig, S., et al. NADPH Oxidase 4 Mediates Monocyte Priming and Accelerated Chemotaxis Induced by Metabolic Stress. Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology. 32 (2), 415-426 (2012).
- Kim, H. S., Ullevig, S. L., Zamora, D., Lee, C. F., Asmis, R. Redox regulation of MAPK phosphatase 1 controls monocyte migration and macrophage recruitment. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (41), E2803-E2812 (2012).
- Kim, H. S., Tavakoli, S., Piefer, L. A., Nguyen, H. N., Asmis, R. Monocytic MKP-1 is a Sensor of the Metabolic Environment and Regulates Function and Phenotypic Fate of Monocyte-Derived Macrophages in Atherosclerosis. Scientific Reports. 6, 34223 (2016).
- Ponce, M. L. Tube formation: an in vitro matrigel angiogenesis assay. Methods in Molecular Biology. 467, 183-188 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chemistry. 49 (1), 32-40 (2003).
- Kim, H. S., Ullevig, S. L., Nguyen, H. N., Vanegas, D., Asmis, R. Redox regulation of 14-3-3zeta controls monocyte migration. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (7), 1514-1521 (2014).
- Short, J. D., Downs, K., Tavakoli, S., Asmis, R. Protein Thiol Redox Signaling in Monocytes and Macrophages. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 816-835 (2016).
- Tavakoli, S., Asmis, R. Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis. Antioxidants and Redox Signaling. 17 (12), 1785-1795 (2012).
- Ullevig, S. L., et al. Protein S-Glutathionylation Mediates Macrophage Responses to Metabolic Cues from the Extracellular Environment. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 836-851 (2016).
