Summary
אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.
Abstract
יש הרבה מה להבין על התחלתה והתקדמות של מחלות ניווניות, כולל הגנים הבסיסיים האחראים. הקרנה גנטית קדימה באמצעות מוטגנים כימיים היא אסטרטגיה שימושית עבור מיפוי פנוטיפים מוטנטים לגנים בקרב דרוזופילה ואורגניזמים אחרים של מודל החולקים מסלולים סלולריים שמרו עם בני אדם. אם גן העניין המוטציה אינו קטלני בשלבים התפתחותיים מוקדמים של זבובים, ניתן לנהל שיטת טיפוס על המסך עבור אינדיקטורים פנופי של תפקוד מוחי מופחת, כגון שיעורי טיפוס נמוכים. לאחר מכן, ניתוח היסטולוגית משנית של רקמת המוח ניתן לבצע על מנת לאמת את תפקוד נוירוגני של הגן על ידי הבקיע פנוטיפים נוירוניוון. אסטרטגיות מיפוי גנטי כוללות meiotic ומיפוי מחסור המסתמכים על אותו בחני שיכול להיות ואחריו ברצף DNA כדי לזהות שינויים של נוקלאוטיד אפשרי בגנים של עניין.
Introduction
נוירונים הם עבור החלק ביותר post-mitotic ולא מסוגל לחילוק1,2. ברוב החיות, מנגנוני הגנה מפני המוח קיימים כדי לשמור על תאים אלה במהלך תוחלת החיים של האורגניזם, במיוחד בגיל הזקנה כאשר הנוירונים פגיעים ביותר לנזק. גנים המשמשים את המנגנונים האלה ניתן לזהות במוטציות המציגות ניוון, מחוון גמישות פנוטיפית לאובדן הגנה עצבית, באמצעות פרוטוקול גנטי קדמי. המסכים הגנטיים הקדמיים באמצעות מוטגנים כימיים כגון אתיל מתיונין (EMS) או N-אתיל-N-ניטרוגליצרין (אנו) שימושיים במיוחד בשל מוטציות בנקודה אקראית שהם לגרום, וכתוצאה מכך גישה משוחדת מטבעו כי יש לשפוך אור על מספר רב של פונקציות גנים באורגניזמים המודל איקריוטית3,4,5 (לעומת זאת, X-ray מוטאנזיס יוצר הפסקות DNA ויכול לגרום לסידור מחדש ולא מוטציות נקודה6).
זבוב הפירות הנפוץ דרוסופילה מלאנוסטר הוא נושא אידיאלי עבור מסכים אלה בשל איכות גבוהה, רצף הגנום מסומן היטב, ההיסטוריה הארוכה שלה כאורגניזם מודל עם כלים גנטיים מפותחים מאוד, ומשמעותית ביותר, משותף שלה היסטוריה אבולוציונית עם בני אדם7,8. גורם מגביל בתחולתה של פרוטוקול זה הוא מוקדם מאוד שנגרם על ידי הגנים מוטציה, אשר ימנע בדיקה בגיל הזקנה9. עם זאת, עבור מוטציות שאינן קטלניות, שיטת טיפוס, אשר מנצלת מוניות גאו שליליות, היא פשוטה, למרות נרחב, שיטה של ככמת לקויי התפקוד מנוע10. כדי להפגין הlocomotor פעילות מספקת, זבובים תלויים בפונקציות עצביות כדי לקבוע כיוון, לחוש את מיקומו ולתאם תנועה. חוסר היכולת של זבובים לטפס מספיק בתגובה לגירויים יכול אפוא להצביע על פגמים נוירולוגיים11. פעם אחת הפנוטיפ פגום הטיפוס מזוהה, בדיקות נוספות באמצעות מסך משני כגון ניתוח היסטולוגית של רקמת המוח, ניתן להשתמש כדי לזהות ניוון נוירוטים בתוך הטיפוס, זבובים פגומים. מיפוי הגנים הבאים ניתן להשתמש כדי לחשוף את האזור גנומית על כרומוזום נושאת את הגן פגום המגן של ריבית. כדי לצמצם את האזור הכרומוזומים של עניין, מיפוי meiotic באמצעות שורות לטוס מוטציה נושאת גנים סמן דומיננטי עם מיקומים ידועים על כרומוזום ניתן לבצע. גנים סמן לשמש נקודת התייחסות המוטציה כתדירות של שילוב מחדש בין שני המקום מספק מרחק מדיד שניתן להשתמש בו כדי למפות את המיקום המשוער של הגן. בסופו של דבר, חציית קווי המוטציות עם קווים הכוללים ליקויים מאוזנים על אזור כרומוזום ממופה ממופים של עניין יוצר מבחן מלא שבו הגן של עניין יכול להיות מאומת אם הפנוטיפ הידוע שלה מתבטא5. פולימורית מנוונת רצפי הגאות בגנים מזוהה, אולי כתוצאה מכך רצפי חומצות אמינו שהשתנו, ניתן להעריך על ידי רצף הגנים והשוואת אותו לרצף הגנום Drosophila ילה . האפיון הבאים של גן העניין יכול לכלול בדיקות של alleles מוטציות הצלה ניסויים ובדיקה של פנוטיפים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה והזדקנות זבובים
- השג או צור6 אוסף של מוטציות דרוזופילה שישמשו עבור המסך הגנטי. כאן, הקווים אנו-מוטזזזד ממופה הכרומוזום השני ומאוזנת על Cyo משמשים.
- ההגביר את קווי הגנוטיפ הניסיוניים בחממה שנקבעה ב -25 ° c, 12 h מחזור אור/כהה על מדיום קמח-מולסה.
- לאסוף סביב 20 homozygous צאצאים בין 0-2 ימים של eclosion מבוגר מכל גנוטיפ ניסיוני. למנוע הטיית מין על ידי איסוף עקבי של גברים או נשים זבובים.
- בגיל הזבובים על מדיום קמח-מולסה כנדרש ב -29 ° c, היפוך הבקבוקונים כל 2-3 ימים על מנת לשמור על הזבובים על מזון טרי כפי שהם מזדקנים. במסך שהוצגו כאן, הגיעו לכאן זבובים ב10-12 ימים.
- הכנס תא בדיקה לטיפוס הרים באמצעות שני מבחנות וקלטת כמתואר בעבר10. הבקבוקונים צריכים להיות מחוברים. בשני הכיוונים הפתוחים השתמש בסרגל כדי לסמן קו של 5 ס מ בקצה אחד של התא.
2. פרוטוקול 1: שיטת טיפוס (מותאם לעלי ואח '10)
- אמת את שיטת הטיפוס. במחקר זה, בדוק את שיטת הטיפוס המבוססת על מתודולוגיה שתוארה בעבר על ידי עלי ואח '10, באמצעות elavC155≫ uas-טאוR406W (מציג את תעריפי המעבר התחתון לטפס) ו elavC155> uas-gfp ( שליטה) ו ElavC155> Uas-mcherry (שליטה) זבובים.
- הפוך את הזבובים לתוך תא בדיקה, קו אחד בכל פעם (לא להשתמש CO2 הרדמה) ולאפשר להם להתאושש 5 דקות. אם נעשה בדיקה בימים שונים, בצע את הבדיקה באותו הזמן של היום. במחקר זה, כל מוסר הטיפוס התבצע בשעות אחר הצהריים כדי לשלוט על השפעות מעגליות על תנועה12.
הערה: הימנע מחשיפת הזבובים לאור השמש הישיר בעת בדיקה; זה יפריע ליכולתם לטפס. - בכוח להקיש על החדר (מסומן בצד למטה) על משטח העכבר ממוקם על משטח מוצק 3 פעמים כל הזבובים להתחיל את הקבוע בתחתית. להתבונן לטוס תנועה מעל תקופה של 10 s.
- הקלט את מספר הזבובים המגיעים או עוברים את קו ה -5 ס מ בתוך זמן זה, כמו גם את המספר הכולל של הזבובים שנבדקו. חזור על הפרוטוקול, המתנה 1 דקות בין כל ניסוי, למינימום של 3 שכפול ניסיון לכל שורה.
הערה: במחקר הנוכחי, כל בקבוקון הכלול בין 2 ו 19 זבובים עבור ההקרנה הראשונית (גברים זבובים) ו בין 6 ו 21 זבובים לניתוח מחסור מוטציה של שורות נקבה חצה (סעיף 5.3.).
3. פרוטוקול 2: בחירת זנים לבדיקות נוספות
- הזן את נתוני שיטת הטיפוס לתוך Microsoft Excel או לתוכנה דומה וחשב את קצב מעבר הטיפוס עבור כל שורה על כל שכפול כאחוזים.
-
בצע ניתוח סטטיסטי כדי לזהות קווי מוטציה החורגים באופן משמעותי מערך אחוז הטיפוס הממוצע של כל הקווים באמצעות חבילת התוכנה R13.
- קרא בקבצי נתונים שנקראו עבור קבצי R (. csv או. txt עם עמודה עבור כל משתנה או גורם ושורות המייצגות את הערכים הספציפיים).
הערה: כאן, נתונים לזכרים (שיטה ראשונית) ונקבות (קו 867 שעברו לקווי מחסור) הוזנו לגליונות. xlsx נפרדים כשתי עמודות, אחד שבו השורות של העמודה מזהות את קו המוטציות ואת מספר הפעמים שהנתון שוכפל והשני שבו שורות מייצגים את ההצלחה טיפוס ממוצע (כאחוז) עבור כל בקבוקון שכפול של זבובים. - קרא את הנתונים לתוך R באמצעות הקוד הבא:
מאלי <-read. csv ("... /מלפי_ init csv)
ב< לנשים בלבד... /באמצעות שליטה מרבית בלבד)
הערה: ה "..." במדריכי הנתיבים הם נתיבים מוחלטים מספריית השורש של מחשב המשתמש ויהיה צורך לציינו על-ידי המשתמש הבודד עבור נתיבי הספריות של המחשב שלהם. - ביצוע מידול ליניארי
- בצע רגרסיה משתנה בדמה עם הפונקציה lm ב-R. לניתוח הראשוני של קווי מוטציה, הערך את המשמעות של אפקטים ברמת הפקטור (קווי מוטציה) באחוז הצלחת הטיפוס נגד הממוצע הממוצע עבור משתנה תגובה ממורכז ברמה אפס (אחוז הצלחה).
הערה: ה-" -1" בסוף קריאת הפונקציה lm בסעיף 3.2.3.2. מסיר את החיתוך ומאפשר לנו לבדוק את כל רמות הפקטור נגד ממוצע האפס הממורכז של קצב המעבר של אחוז הטיפוס. - הדפס את התוצאות למסך באמצעות פונקציית הסיכום R:
mali_anova <-lm (קנה מידה (מאלי $ P_Success) ~ מאלי $ Mutant_line-1)
תקציר (mali_anova) - השתמש בקווי בקרה (אם קיימים) כקו הבסיס לבדיקת אפקטים ברמת הפקטור נגד השימוש בקוד R הבא: x <-relevel (בMutant_line באמצעות שימוש ב-a867_plus)
femdef_anova <-lm (שליטה באיכות P_success ~ x)
תקציר (femdef_anova)
הערה: שורת הקוד הראשונה מזמנת מחדש את רמות הפקטור כך ששורת הבקרה השלילית תהפוך לנקודת החיתוך הבסיסית שאליה נבדקים כל רמות הגורמים האחרות ( שורות מוטציה) נגד הבדיקות המוכללות של הפונקציה lm .
- בצע רגרסיה משתנה בדמה עם הפונקציה lm ב-R. לניתוח הראשוני של קווי מוטציה, הערך את המשמעות של אפקטים ברמת הפקטור (קווי מוטציה) באחוז הצלחת הטיפוס נגד הממוצע הממוצע עבור משתנה תגובה ממורכז ברמה אפס (אחוז הצלחה).
- קרא בקבצי נתונים שנקראו עבור קבצי R (. csv או. txt עם עמודה עבור כל משתנה או גורם ושורות המייצגות את הערכים הספציפיים).
- בחר סף עבור קווים מועמדים בהתאם לגיל בזמן הבדיקה. כדי לקבוע את הסף, לבצע בדיקה ראשונית בגיל הרצוי באמצעות מוטציות ידועות כי מפגין ניוון ומעבר טיפוס נמוך בהשוואה לסוג פראי, שליטה זבובים10.
הערה: שיעור חולף מתחת ל 50% עשוי להיות מתאים 10 ימים-זבובים הישן כפי שדווחו בעבר עבור Drosophila ילה קווי מבטאים את הגן האנושי הקשורים הנוירוניוון טאו במערכת העצבים10. זבובים מבוגרים צריך סף קצב העברת גבוה יותר מאז הם צפויים להפגין ירידה תנועה, ובכך, מוגברת נוירוניוון.
4. פרוטוקול 3: ניתוח היסטולוגיה
- לבישת כפפות, לחתוך ראשי לטוס עם להב כירורגי בעקבות שיטת הטיפוס ולהשתמש במכחול כדי למקם אותם בעדינות 1 מ ל של Carnoy של התיקונים (6:3:1 של 100% אטוח: כלורופורם: חומצה אצטית קרחוני) ב 1.5 מיקרו-מיקרוצנטר של מ. א. ב. ב 4 ° c. ודאו שראשי הראשים. מטביעים את התמיסה
- החליפו את התמיסה הקבע ביום המחרת עם 1 מ ל של 70% אטוח ושמרו על הדגימות עדיין ב -4 ° c לניתוח עתידי.
הערה: ייתכן שהפרוטוקול הושהה בשלב זה. - מניחים את הראשים. משלב 4.2 בחמש מקסימום של קלטת מיקרוביופסה. מיד מניחים את הקלטות לתוך מיכל מלא 70% אטוח. לאחסן את המיכל ב 4 ° צ' לפני המשלוח למתקן היסטולוגיה לעיבוד פרפין הטבעה של הראשים. אם ציוד עיבוד והטבעה של רקמות זמין, בצע את שלב 4.4.
- הטמע את הראשים בפרפין לגבי הסטום:
- בצע את הגדרות התוכנית עבור מכונת עיבוד הרקמה האוטומטית בסדר המוצג בטבלה 1 כדי dehydrate ימה, ברור לחדור עם פרפין את הראש.
- העבירו את הדגימות לתוך תבניות בסיס מתכת המתאימות לקלטת באמצעות פרפין מחומם ב-60 ° צ' באמצעות תחנת פרפין.
- המזרח הראשי (הכיוון האחורי הפנים מול העליון) בתבנית הבסיס באמצעות מלקחיים עדינים כדי לאפשר ויזואליזציה נכונה של רקמת המוח לאחר הסדר. ניתן לעשות זאת על-ידי חימום מחדש של הפרפין ב-60 ° צ' ומיקום הראשים במידת הצורך.
הערה: תבניות מתכת ניתן להחליף בתבניות בסיס חד פעמיות. - מקמו את הקלטת על החלק העליון של תבנית הבסיס המתאימה והזיזו בעדינות את אלה לצד הקירור של תחנת הטבעת הפרפין (4 ° c). המתן עד שהבלוק מתקשה להסיר אותו מהתחנה.
- הסר את הטופס לחסום את העובש על ידי בעדינות לנתק את התבנית מתוך הקלטת.
- לקצץ כל בלוק פרפין מראש כדי למזער את פני השטח כי יהיה מנות.
- הגדר את המיקרוטומה לחתוך 5 מקטעים יקרומטר של כל בלוק.
- מניחים את סרט הפרפין המכיל את הרקמה באמבט מים מחומם (35 ° c) למקסימום של 5 דקות.
- הישאב שקופית מצופה פולי ליזין (מסייעת לשמור על הרקמה) באמבט המים המחומם, תוך הצבת רצועת הכלים בשקופית באמצעות מכשירי עץ. שקופיות האוויר יבש O/N בטמפרטורת החדר.
- חמם את השקופיות במשך 15 דקות ב-63 ° צ' באמצעות מחמם שקופית.
- מקם את השקופיות על מדף מכתים שקופית ומכתים עם המטאוקסילין והאאוזין (H & E) תחת מכסה המנוע על-ידי כיבוד השלבים הבאים.
- מניחים את הארון היסטרבחירה (החלפת שאינם רעילים של קסילין, אשר מסייעת להסיר את הפרפין מן המדגם) עבור 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במכולה מלאה בבחירה היסטהבית במשך 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא ב-100% אטוח 1 למשך 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא ב-100% אטוח 2 עבור 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא ב-95% אטוח למשך 3 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא ב-70% אטוח למשך 3 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל מלא עם מזוקק H2O עבור 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא באריס המטאוקסילין עבור 2-5 דקות.
- הניחו את המדף מתוך התמיסה של המטאוקסילין ומניחים אותו תחת הפעלת מי ברז במשך 10 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל מלא מים מזוקקים על ידי ביצוע דאנק קצר.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא באאוזין עבור 1-2 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל מלא 95% אטואה על ידי ביצוע דאנק קצר.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא ב-95% אטוח למשך 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא ב-100% אטוח למשך 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל שמולא ב-100% אטוח למשך 5 דקות.
- העבר את ארון התקשורת במיכל המלא באפשרויות היסטולות (או קסילן) עבור 5-10 דקות עד לטעינת כל השקופיות.
- הר את השקופית ואת coverslip (24 מ"מ x 60 מ"מ גודל). באמצעות מלקחיים, להוציא את השקופית מתוך הפתרון היסטרירה או קסילן ולעשות רצועה דקה של מדיום גובר על החלק העליון של זה. בעדינות למקם את הכיסויים על החלק העליון, מנסה למנוע את היווצרות של בועות.
- הנח לאמצעי ההרכבה הנטענים על גבי שקופיות מתחת למכסה המנוע לפני הניתוח.
- אחסן שקופיות מוכתמות בתיבה בטמפרטורת החדר.
- מכמת ניוון מוחי על ידי התבוננות בכל הסעיפים הסידוריים על השקופית בהגדלה של 20x תחת מיקרוסקופ אור. בדוק את המוח כולו, לקיחת הערה איכותית של גודל ומספר חללים המופיעים בשלושה חלקים רצופים.
- להשיג תמונות של סעיפים המוח נציג בערך באמצע המוח באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד תוכנת הדמיה.
5. פרוטוקול 4: מיפוי ג'ין של מוטאנטים מושגים רצבי
- Outcross קו המועמד לקנטונים סוג פראי (BL_ 9517) או סוג אחר של זן או הזנים איזוגניים (למשל, OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) או שתיכם (BL_ 6599) כדי לקבוע אם הפנוטיפ הוא דומיננטי או רצסיבי.
הערה: תוצאות משלב זה ינחו את השלבים הבאים של המיפוי. אם הפנוטיפ הוא רצסיבי, אזי ניתן לבצע מיפוי מחסור.- באמצעות מברשת צבע, להפוך את הצלב על ידי הצבת מזון מכיל בקבוקון2מורדם זבובים של קו המוטציות של עניין (5 זכרים) ואת קו הקנטונים (10-15 נקבות הבתולה). מניחים את המבחנה ב -25 ° c.
- איסוף heterozygous F1 צאצאים ולחזור על טיפוס וניסויים היסטולוגיה.
- השווה את התוצאות המתקבלות לקו הבקרה לבד ולמוטציות homozygous. אינדיקציה טובה של פנוטיפים הרצבים יהיה אם heterozygous מוטציות להציג פנוטיפים דומים כמו זבובים סוג פראי.
- ביצוע מיפוי meiotic כדי בערך להעריך את המיקום של המוטציה על הכרומוזום השני באמצעות WgSp-1 J1 L2 פינים1/cyo (BL_3227) או זן שווה ערך עם סמנים דומיננטי הקשורים הידוע מיקום ציטולוגי. במקרה זה, המוטציה היה ידוע בעבר להיות ממוקם על הכרומוזום השני.
- באמצעות מברשת צבע, להפוך את הצלב על ידי הצבת מזון מכיל בקבוקון2-מורדם זבובים של קו המוטציות של העניין (5 זכרים) ו- wgSp-1 J1 L2 פין1/cyo קו (10 נקבות). מניחים את המבחנה ב -25 ° c.
הערה: המטרה של הצלב הזה היא ליצור heterozygous נקבות נושאת את כרומוזום עם מוטציה חדשה וכרומוזום סמן, אשר ישלב מחדש במהלך מיוזה6,14. צאצאים F1 הנשי נבחרים ולא זכרים מאז שילוב מחדש אינו מתרחש אצל זכרים. - לאסוף לפחות 15 צאצאים נקבה הבתולה נושאת את כרומוזום עם מוטציה חדשה וכרומוזום סמן לחצות אותם 5 זכרים מקו מאוזן הנושאת אחר סמן דומיננטי לעין (למשל, Cyo/SnaSco (BL_2555) או שווה ערך).
- לאסוף צאצאים זכר heterozygous נושאת או Sco או cyo ואת כרומוזום משולב בפוטנציה מן הצלב בשלב 5.2.2. ולחבר אותם בנפרד לנקבות הבתולה מהמלאי נושאת את כרומוזום מוטציה.
- לאסוף את צאצאי הצלב הסופי המתואר בשלב 5.2.3. ובגיל הזבובים בשנת 29 ° צ' (בשנת הלימודים הזאת ה10-14).
- לאסוף ראשים, לבצע ניתוח היסטולוגיה כמתואר בפרוטוקול 3 ולהסתכל על שקופיות עם סעיפים המוח כדי לקבוע את דרגת נוירופתולוגיה כפי שמתואר בשלב 4.11. ניתוח היסטולוגיה מבוצע ולא ניתוח תנועה עקב פנוטיפים העשויים להשפיע על שיטת הטיפוס, כגון נתקע (J), הגורם להצטברות נוזלים בכנפיים15.
- באמצעות מברשת צבע, להפוך את הצלב על ידי הצבת מזון מכיל בקבוקון2-מורדם זבובים של קו המוטציות של העניין (5 זכרים) ו- wgSp-1 J1 L2 פין1/cyo קו (10 נקבות). מניחים את המבחנה ב -25 ° c.
- לבצע מיפוי מחסור על האזור המצטמצם של הכרומוזום כדי לחדד את המיקום של מוטציה רצסיבי באמצעות שיטת הטיפוס. כל קו מחסור יש מחיקה של אזור שונה של כרומוזומים, המאפשר להם לשמש עבור בדיקות קומפלמנטציה.
- התחל עם ליקויים גדולים המשתרעים על פני האזור המזוהה במיפוי meiotic, אשר לאחר מכן ניתן לצמצם עוד יותר על ידי שימוש בליקויים קטנים יותר. אם ניתוח מחסור התוצאות ביותר מאשר גן אחד מועמד, השימוש בהפרעות RNA (RNAi) מניות מומלץ למקד אותם.
- לחצות קווים מחסור בקיט של דרוזופילה 16 עבור הכרומוזום השני (DK2L במחקר זה) ולחפש לא משלימה של הפנוטיפ של עניין (במחקר זה: המעבר טיפוס של 8.5% אשר תואם את קצב המעבר של homozygous זבובים מתוך קו 867 משמש כשליטה חיובית).
- אשר באמצעות אימות היסטולוגיה כמתואר בסעיף 4 (פרוטוקול 3).
6. פרוטוקול 5: רצפי DNA וניתוח
הערה: זכרו כי מוטארסיס של אנו מציג את נקודת המוטציות11.
- עיצוב קדימה רצפים הפוכה החוצה את האזור exon-קידוד של הגן פרחח עבור הגברה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) של אזור העניין (במקרה של קו 867 קטע DNA של גודל 3,247 bp הוא הוגדל עבור רצף17).
-
לחלץ דנ א מזבוב אחד18 :
- בעדינות למחוץ את הזבוב בצינורית מיקרו 0.5 mL המכילה 50 μL של מאגר השרבוט (10 מ"מ טריס-Cl pH 8.2, 1 מ"מ EDTA, 25 מ"מ הנרוג, 200 ו-μg/mL פרוטאינאז K; האנזים צריך להיות מדולל טרי ממניה קפואה לפני כל שימוש) באמצעות P100 או P200 pipet טיפ.
- מודטה למשך 30 דקות ב 37 ° c
- נטרל את הפרוטאינאז K על ידי הצבת הצינור ב 95 ° c עבור 2 דקות.
הערה: ה-DNA המחולצים ניתן לאחסן ב -4 ° c במשך מספר חודשים.
- בצע את תגובת ה-PCR באמצעות דנ א באיכות גבוהה DNA Taq פולימראז (ריאגנטים ומצבי אופניים תרמיים המשמשים במחקר זה מוצגים בטבלה 2 ושולחן 3, בהתאמה) על ידי כיבוד הוראות היצרן ולהפעיל את המוצר PCR על 1 % agarose ג'ל המכיל את ה-DNA ג'ל בטוח, שהוא חלופה לא רעילה של אתידיום ברומיד.
- בלו הלהקה של הגודל הנכון מן הג עם אזמל ולטהר את מוצר ה-PCR באמצעות האשף SV ג'ל ו-PCR לנקות את המערכת (Promega או ערכה שוות ערך, על ידי כיבוד הוראות היצרן.
- עיצוב התחל והפוך שישמשו לרצפי DNA כדי לכסות את כל האזור של עניין, אם אפשרי. רצף ה-DNA מטוהרים ג'ל מהשלב הקודם כדי לזהות מוטציות נקודה. דיוק גבוהה ברצף פלורסנט אוטומטי שניתן להשיג ברצפי המידע עד 700 bp.
הערה: לשעבר Taq פולימראז (Taq) ניתן להשתמש כדי להגביר את מוצרי ה-PCR מתבניות DNA גנומית עד 20 kb של גודל. -
ניתוח שהושג רצפי DNA באמצעות עורך הפלאמצע (ApE, על ידי M. ויין דייוויס) או תוכנה דומה על ידי יישור אותם והשוואת אותם רצפים שהתקבלו בעקבות רצף של אותו אזור גנומית של התייחסות זן (g., במקור מוטייזzed שורה).
- . פתח קבצים ברצף עם קוף כמו התייחסות, השתמש בקובץ ApE המכיל את רצף הקונצנזוס גנומית של הגן פרחח שהורדו בפורמט fasta מ flybase, או קובץ המכיל תוצאות רצף של בקרת רקע גנטי (g., במקור מוטניזזזהוההוהאבל דרוזוהילה שורה).
- עבור אל כליםולאחר מכן יישר רצפים. באמצעות עכבר המחשב, בחר את כל הרצפים להשוואה. זכור לציין את רצף ההפניות המשמש עבור יישור זה בתפריט הנפתח.
- בדוק את האזור הרציף לשינויים בנוקלאוטיד בהשוואה לרצף הייחוס. במקרה הצורך, שמור את היישור במחשב בתבנית. rtf על-ידי לחיצה על טקסטולאחר מכן שמור.
הערה: אם לא זוהו מוטציות, פרוטוקול ה-DNA ונוהל הניתוח יחזור על עצמו באמצעות התחל לכלול אזורים שאינם מצפינה קידוד של הגן.
7. פרוטוקול 6: ניתוח נוסף של פונקציית גן המועמד
- בצע ניסויים הצלה ב neuroblasts כדי לקבוע אם הפרחח הגן אחראי על הפנוטיפים נוירובלסטומה.
- יתרה כפולה Uas-פרחחית19 ו-Neuroblast -Gal4 ספציפיים ספציפי (העולם-G4) מניות נושאת את המבנים על הכרומוזום השלישי, כמו גם את קו 867, אשר הוא מוטציה עבור פרחח הגן הממוקם על השני כרומוזום.
- לעשות שלושה צלבים נפרדים על ידי הצבת שלושה מזון שונים המכילים מבחנות 5 זכרים מ Uas- G4 , העולם החדש ו 867 קווים ולהוסיף לכל קבוצה של זכרים 10-15 נקבות הבתולה מן הקו נושאת סמנים ו אזנים עבור השני וכרומוזומי שלישית (Sp/CyO; ד ר/Tm3, sb; BL_59967).
- לאסוף 10-15 נקבות הבתולה מ F1 של כל צלב עם גנוטיפים הבאים: +/Cyo; UAS-פרחחית/Tm3, sb, +/Cyo; העולם-G4/Tm3, sb ו 867/cyo; +/tm3, sb ו-5 זכרים של כל אחד מסוגי ה-גנוטיפים הבאים: +/sp; UAS-פרחחית/Tm3, sb, +/Sp; העולם G4/Tm3, sb ו 867/cyo; +/Dr.
- לחצות את הקולונו +/cyo; UAS-פרחח/Tm3, sb בתולה נקבות to +/sp; UAS-פרחחית/Tm3, זכרים sb ; במבחנה נפרדת להפוך את הצלב השני עם +/Cyo; העולם-G4/Tm3, הנקבות sb הבתולה ל +/Sp; העולם-G4/Tm3, הזכרים sb ולאחר מכן בתוך בקבוקון שלישי 867/cyo; +/tm3, הבתולה הנקבות sb ו 867/cyo; +/Dr
- מ F1 של כל אלה צלבים, לאסוף את שני הזכרים והנקבות של גנוסוגים הבאים: Sp/CyO; UAS-פרחחית/Tm3, sb מהצלב הראשון, Sp/cyo; העולם G4/Tm3, sb מהצלב השני 867/cyo; ד ר/Tm3, sb מהצלב השני.
- לבצע הצלב הסופי בין אחים ואחיות שנאספו מכל צאצא F1 להקים מניות מאוזנת כפולה קבועה עבור כל שלושת הקווים.
- לשלב Uas-פרחחית ו -G4 עם מוטציה 867 .
- לאסוף מספר מספיק (~ 20-30 זבובים) של נקבות הבתולה מן 867/CyO; Dr/Tm3, sb מלאי מאוזן כפול לבצע שני צלבים.
- מקום 10-15 נשים בתולה עם ~ 5 זכרים מ Sp/CyO; UAS-פרחחית/Tm3, sb (לחצות1) ו ב בקבוקון שני 10-15 נקבות הבתולה עם ~ 5 Sp/cyo; העולם G4/Tm3, הזכרים sb .
- לאסוף אחים ואחיות מ F1 של כל צלב עם הגנוטיפים הבאים: 867/CyO; UAS-פרחחית/Tm3, sb מחוצה1 ו 867/cyo; העולם-G4/Tm3, sb מחוצה2. השתמש שנאסף צאצאים F1 מכל צלב כדי להקים מניות קבועות על ידי חציית אחים ואחיות ביניהם.
הערה: לאחר שלב זה הסופי, מניות עבור 867/CyO; UAS-פרחחית/Tm3, sb ו 867/cyo; העולם-G4/Tm3, sb יש ליצור.
- . בצעו את ניסוי ההצלה
- לאסוף ~ 15-20 נקבות הבתולה מן 867/CyO; העולם G4/Tm3, sb stock לחצות אותם כדי 5-10 זכרים מן המניה 867/cyo; . אואס-פרחח/Tm3, sb כמו שליטה, לחצות ~ 15-20 נקבות הבתולה מן 867/cyo; העולם-G4/Tm3, sb ו ~ 15-20 נקבות הבתולה מן ה867 /cyo; UAS-פרחחית/Tm3, השורה sb לשורה 867/cyo לבד.
הערה: 867 זבובים לשאת אלל רגיש טמפרטורה של פרחח ואת צלב ההצלה יש לבצע ב 29 ° c. - לאסוף את צאצאי F1 הבאים מכל צלב על ידי בחירה בקפידה משם מסומן אזנים: 867/867; העולם G4/UAS-פרחח (הצלה), 867/867; העולם-G4/+ (בקרה) ו- 867/867; UAS-פרחחית/+ (בקרה).
- גיל זבובים כנדרש ב 29 ° צ' ולבצע ניתוח היסטולוגיה על המוח כדי לחפש ניוון נוירולוגי באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 4 (פרוטוקול 3).
- לאסוף ~ 15-20 נקבות הבתולה מן 867/CyO; העולם G4/Tm3, sb stock לחצות אותם כדי 5-10 זכרים מן המניה 867/cyo; . אואס-פרחח/Tm3, sb כמו שליטה, לחצות ~ 15-20 נקבות הבתולה מן 867/cyo; העולם-G4/Tm3, sb ו ~ 15-20 נקבות הבתולה מן ה867 /cyo; UAS-פרחחית/Tm3, השורה sb לשורה 867/cyo לבד.
- יתרה כפולה Uas-פרחחית19 ו-Neuroblast -Gal4 ספציפיים ספציפי (העולם-G4) מניות נושאת את המבנים על הכרומוזום השלישי, כמו גם את קו 867, אשר הוא מוטציה עבור פרחח הגן הממוקם על השני כרומוזום.
- לבצע ניתוח תלויי גיל של ניוון נוירואני ב 867 מוטציות.
- לאסוף 867; pcna-gfp ו- שתיכם בקרת זבובים, אשר לשאת גן עיתונאי (pcna-gfp) והם קיימא ב 25 ° c והתערוכה הן החדירה גבוה יותר האקספרסיביות גבוהה יותר של פנוטיפ נוירוניוון מאשר 867 לבד על זה . טמפרטורה17
- גיל הזבובים עד 5, 15 ו -25 כמתואר בסעיף 1.4 ולבצע ניתוח היסטולוגיה בעקבות הפרוטוקול בסעיף 4 (פרוטוקול 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ב aerticle זה, אנו מציגים את הצעדים המשמשים כדי לזהות את הגידול המוח גנטי (פרחח) כמו לשחק תפקיד תחזוקה של שלמות עצבית (למשל, הגנה מפני העצבים) ב למבוגרים זבובים17; מתודולוגיה שיכולה לשמש לזיהוי גנים המעורבים בהגנה עצבית. השתמשנו בגישה גנטית מקדימה (האסטרטגיה מחולקת באיור 1A) כדי לדפדף באוסף של זבובים מוטניים כימיים באמצעות שיטת טיפוס (המנגנון המשמש לטיפול זה מוצג באיור 1a). בין 235 homozygous קווים, כ 37% מהקווים שנבדקו הציגו קצב מעבר טיפוס מתחת 50% כאשר נבדק בגיל של 10-12 ימים (איור 1C). 58% מהקווים הנבדקים הציגו באופן משמעותי התנהגות טיפוס שונה כאשר קצב העלייה באחוזי הטיפוס שלהם (החייאה) הושווה לערך אחוז הטיפוס הממוצע של כל הקווים הנבדקים באמצעות ANOVA בכיוון אחד (איור 1D). המסך היסטולוגית הבאים על 51 של הקווים המציגות את קצב מעבר הטיפוס הנמוך ביותר חשף כי 29 קווים אלה הראו המראה הגלוי של חורים במוח נוירופיל (החל מתון עד חמור) מעיד על ניוון נוירולוגי20 ( איור 2). בין הקווים המראים התנהגות הטיפוס פגום ניוון מוחי חמור, אנחנו בוחרים למפות את המוטציה בבסיס הפנוטיפ קו 867 (0% החייאה ו-P ערך = 1.36 e-14 מבוסס על דרך אחת ANOVA). פנוטיפ נוירוניוון ב 867 זבובים הוא רצסיבי כי המוחות של heterozygous 867 זבובים כי כבר outcrossed לתוך זן סוג פראי הם דומים אלה של פקדים (איור 3A). באמצעות היסטולוגיה, מיפוי meiotic ממוקם את המוטציה במיקומים 31-51 ציטולוגיים, בין סמנים פנוטימית J (נתקע) ו L (אונה) על כרומוזום drosophila ילה השני. באמצעות שיטת הטיפוס, מיפוי המחסור בין מיקומים ציטולוגיים 31 ו -51 עם קווים מן החסר קיט מחסור עבור כרומוזום 2L (DK2L)16 ממופה את המוטציה באזור המקיף 118 גנים (איור 3b; כאשר 867/+ משמש כשליטה בניתוח הסטטיסטי). בחינת המוח פנוטיפ של 867 מוטציות חצה לקווי מחסור נוספים (איור 3C) אישר כי מוטציה נכלל באזור של הגנום הכולל את הפרחחהגן. רשימה מלאה של כל הגנים הנוספים הכלולים בתוך מחיקות אלה ניתן למצוא ב Flybase על ידי לחיצה על הקישור המשויך קטע נמחק (למשל, עבור Df (2L) ED1272 מקטע נמחק הוא 37C5-38A2). בהתבסס על תצפיות קודמות כי מוטציות הפרחחית יש תאים סופר מונה במוחם21, פניטיפ נצפתה גם ב 867 מוטציות, פרחח נבחר לניתוח רצפי DNA. רצף sanger של גן הפרחח המכיל את האזור exon-קידוד זיהה G/A נוקלאוטיד שינוי במיקום 37,739 של הגן (איור 4a), המוביל גליצין כדי גלוטמית חומצה (G/E) שינוי במיקום 470 של חלבון הפרחח17 (איור 4b). ניסויים ההצלה לוודא כי הפרחח משחק תפקיד נוירוגני, כמו ביטוי יתר של הגן הפונקציונלי ב 867 קו מדכא את פנוטיפ נוירוניוון (איור 5A). יתר על כן, הפנוטיפ ב 867 מוטציות מחמיר לאורך זמן, הרומז כי הפרחח משחק תפקיד תלוי גיל בהגנה נוירולוגית17 (איור 5b).
איור 1 : המסך הגנטי הקדמי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן. (A) אסטרטגיית מסך. (ב) מכשיר לבדיקת שיטת טיפוס. (ג) התוצאות של שיטת הטיפוס לזכרים מ235 homozygous הקווים המווטוניים. תרשים עוגה מייצג את הפרופורציות של קווי מעוף שנבדקו הנופלים ל -4 קבוצות של תעריפי מעבר טיפוס: 0%, 1-20%, 21-50% ו-51-100%. (ד) תוצאות מניתוח סטטיסטי של ANOVA אחד, שבו קווי מוטציה הושוו לערך אחוז הטיפוס הממוצע של כל הקווים שנבדקו. מיוצגת כמספר עבור שתי קטגוריות של ערך P: P < 0.05 (שינוי משמעותי) ו-P > 0.05 (לא שינוי משמעותי).
איור 2 : מסך משני היסטולוגיה. H & E-מוכתם באמצע המוח סעיפים הממחישות, משמאל לימין, אין ניוון שיניים, נוירוניוון מתון, ואישר נוירוניוון. סך של 51 שורות homozygous נבדקו על ידי היסטולוגיה לאחר זיהוי של מועמדים באמצעות שיטת הטיפוס. חיצים מצביעים על החורים במוח. המצביעים על ניוון עצבי האזור בעיגול על ידי קווים מנוקדים מראה את הקצבה הנוירודגנציה החמורה נצפתה בקו 867.
איור 3 : זיהוי של הגן הנוירוגני פרחח לאחר מיפוי המחסור באמצעות שיטת הטיפוס. (A) המוצג הם תמונות מייצגות של H & E-מוכתם מקטעים המוח באמצע 18-20 ימים הישן w1118 (שליטה), heterozygous 867 (867/+) ו homozygous 867 מוטציה זבובים. (ב) שורת המחסור Df (2L) ED1272 (BL_24116) אינו משלים את 867 מוטציה פנוטיפ (היסטוגרמה שחורה) מבוסס על שיטת הטיפוס. אימות היסטולוגית מראה כי Df (2L) ED1272 line לא משלים את 867 הנוירוניוון neurodegeneration בעוד Df (2L) ED1315 (BL_9269) עושה. גרף מייצג ממוצע וסטיית תקן של 5 משפטי טיפוס עבור כל שורה. כוכביות מציינות משמעות המבוססת על ANOVA בכיוון אחד, שבה ערך אחוז הטיפוס הממוצע של כל שורה הושווה לערך אחוז הטיפוס הממוצע של קו 867/+ (היסטוגרמה ירוקה). * P < 0.05, * * P < 0.01 ו * * * P < 0.001. (ג) ייצוג סכמטי של קווי מחסור נוספים המראים שאינו ממלא את 867 פנוטיפ על ידי היסטולוגיה. דמות זו שונתה מלוואן ואח '17; מאמר שפורסם תחת הרישיון הבינלאומי Creative Commons ייחוס 4.0.
איור 4 : מוטציה נקודה בתוך פרחח ג'ין מוביל לשינוי חומצת אמינו בתחום המתפתל-סליל של חלבון הפרחח. (א) פרחח גן מודל ובשימוש התחל עבור הגברה ורצף של אזור הקידוד. (ב) רצפי דנ א של לוקוס הפרחח מזהה שינוי נוקלאוטיד שמוביל לשינוי חומצת אמינו בתחום של הסליל המתפתל של חלבון הפרחח. דמות זו שונתה מלוואן ואח '17; מאמר שפורסם תחת הרישיון הבינלאומי Creative Commons ייחוס 4.0.
איור 5 : ניתוח נוסף של פרחח מוטציות מאשרת את תפקידה הנוירומגן ב . דרוסופילה (א) באמצעות גל-4 > uas מערכת22 , neuroblast ביטוי ספציפי של הגן פרחח פונקציונלי מצילה את פנוטיפ נוירוניוון ב 867 מוטציות. (ב) ניוון מוחי לגיל שנצפו ב-867 מוטציות הנושאות גן כתבת PCNA-gfp. הפרחח מתאים לשמו של הפרחח אלל בשורה 867, אשר נקרא ראש גבינה (chs). המוצגים הם מייצגים H & E-מוכתם מקטעים המוח של שתיכם (שליטה) ו homozygous chs; pcna-gfp זבובים של הגילאים המצוין. דמות זו שונתה מלוואן ואח '17; מאמר שפורסם תחת הרישיון הבינלאומי Creative Commons ייחוס 4.0.
| תחנת | זמן | טמפרטורה | ואקום/לחץ | פתרון |
| 1 | ללא דיחוי-התחלה מהירה | |||
| 2 | את | את | את | |
| 3 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | 80% אטואה |
| 4 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | 95% |
| מיכל 5 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | 100% |
| 6 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | 100% |
| 7 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | 100% |
| 8 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | קסילן |
| 9 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | קסילן |
| 10 | : 15 דקות | 37 ° c | מופעל/מופעל | קסילן |
| 11 | : 30 | 58 ° c | מופעל/מופעל | פרפין |
| 12 | : 15 דקות | 58 ° c | מופעל/מופעל | פרפין |
| 13 | את | 58 ° c | את | פרפין |
| 14 | : 15 דקות | 58 ° c | מופעל/מופעל | פרפין |
טבלה 1: הגדרות תוכנית מומלצות עבור מעבד רקמות אוטומטי. ניתן להשתמש בשלבים המפורטים בסדר המפורט להלן עם מעבד רקמות אוטומטי לראשים קבועים.
| ריאגנט | אמצעי אחסון (μL) |
| מאגר ExTaq 10x (Mg2 + plus) (20 ממ) | 2.5 |
| פריימר קדימה (10 μM) | 2.5 |
| פריימר הפוך (10 μM) | 2.5 |
| 2.5 מ"מ | 2 |
| דנ א של תבנית | 2 |
| Tq לשעבר q (5 U/μL) | 0.25 |
| Nuclease-מים ללא תשלום | 13.25 |
| נפח כולל | 25 |
טבלה 2: ריאגנטים לשימוש בתגובת ה-PCR. החומרים השונים והנפחים המשמשים בתגובת ה -PCR כדי להגביר את אזור קידוד הפרחח.
| צעד | טמפרטורה | זמן |
| 35 מחזורים | 95 ° c | בנות 15 |
| 55 ° c | 45 ס | |
| 72 ° c | 3 דקות 10 | |
| החזיק | 4 מעלות צלזיוס | ∞ |
שולחן 3: תנאי אופניים תרמיים המשמשים ל-PCR. השלבים בסדר המפורט כאן ניתן להשתמש כדי לתכנת את הציקלייר תרמית באמצעות תערובת התגובה המוצגת בטבלה2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המסכים הגנטיים הקדמיים בדרוזוהילה מהווה גישה אפקטיבית לזיהוי גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הגנה מפני גיל5,23,24, 25. באמצעות אסטרטגיה זו, היינו מצליחים לזהות פרחח כמו גן נוירוגני הרומן17.
צעד קריטי אחד בפרוטוקול זה כרוך באוריינטציה הנכונה של ראשים (כפי שמתואר בסעיף 4.4.3.) לניתוח היסטולוגיה. בנוסף, סמנים של הקו המשמש מיפוי meiotic לא צריך להפריע הפנוטיפ של מוטציה חדשה (במחקר זה: נוירוניוון). המלצתי על בדיקה ראשונית כדי לוודא שהסמנים שנבחרו אינם גורמים לניוון מוחי משלהן. למשל, נתקע (J) גורם שלפוחיות כנף כי יכול להפריע לטיפוס כמו במקרה של חלבון מבשר עמילואיד (APP)-מביע היתר זבובים כי יש גם כנפיים26. האונה (L) מובילה להפחתה בגודל העיניים; עם זאת, אנחנו לא שומרים על ניוון המוח המרכזי ואת הסמן הזה ניתן להשתמש כדי למפות את מרכז ניוון המוח המרכזי. פין וסטרנורבים (Sp) הם גם מתאימים לשימוש, כמו מוח של זבובים נושאת סמנים אלה הם דומים למוחות של שולטת סוג פראי.
חיסרון אחד של מתודולוגיה גנטית קדימה בזבובים הוא אורך הזמן הנדרש כדי לצמצם אזורים של DNA אל הגן של עניין3,5. השימוש באסטרטגיות מיפוי משופר27 יחד עם זמינות של טכנולוגיות הדור הבא רצף 28 צריך לאפשר זיהוי קל אפילו יותר של מוטציות הקשורות פנוטיפים של עניין. המסכים הגנטיים הקדמיים יכולים להיות עתירי עבודה. למשל, אישור היסטולוגיה, אשר מוסר ישירות עבור ניוון במוח, לבד דורש כמות ניכרת של זמן. עם זאת, גישה זו תהיה הרבה יותר קשה ויקר לבצע במודלים היונקים, לא בהכרח מאפשר מחקרים גנטיים נרחבים. מסכי מוטגנזה כימיים הם יתרון מכיוון שזיהוי מוטציות הנקודות יכול לספק מידע חיוני אודות הפונקציה של מוצרי הגנים המושפעים. זיהוי של מוטציה נקודה גרימת שינוי חומצת אמינו בתחום שימור של חלבון הפרחח (איור 4B) ממחיש את החשיבות של התחום המתפתל סליל של חלבון זה NHL-הגנה מפני הגנת המוח18. הבדיקה הטיפוס, אשר מודד התנהגות locomotor, הוא בהחלט יתרון על ידי מתן בדיקה מהירה של מספר גדול של זבובים לפגמים בניידות, גם לעתים קרובות לראות נוירוניוון אנושי25. ניתן לבצע את היכולת הזאת גם בהגדרת מסך אחרת כגון הגנום-wide vivo הפרעות RNA (RNAi) המסך שניתן להשתמש בו כדי לזהות גנים נוירוגינים. למרות שהעברנו את המרחק בין החלק התחתון של תא הניסוי לבין קו העברת מ 8 ס"מ10 עד 5 ס מ כדי לקבוע שיעור העברה קפדנית יותר במחקר הנוכחי, שיעורי טיפוס נמוכים לא מראה ניוון מוחי עבור מספר רב של קווים. ניוון מוחי עשוי להיות גלוי לאחר התחלתה של פגמים התנהגותיים, כלומר זבובים ייתכן שיהיה צורך לגילאי זמן רב יותר לפני להופיע החללים. אפשרות נוספת היא כי פגמים locomotor אנו להתבונן בקווים מסוימים אינם בשל תפקוד נוירולוגי פגום אלא חולשה שרירים או יותר כללי הכושר של הזבובים. בנוסף, ייתכן שחסרים לנו מועמדים פוטנציאליים, שבהם פגמים מטפסים אינם מופיעים בגיל צעיר יותר (למשל, בן 10 ימים), אלא הופכים לבולטים יותר בחיים. אסטרטגיה זו הקרנה בהחלט יכול להיות מיושם כדי לזהות גנים תלויי גיל, ובכך לסלק גנים הקשורים פגמים פוטנציאליים של התפתחות עצבית. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מותאם בהתאם להסתברות הרצויה של קווי המועמד להכיל את הגן מוטציה מעורב הגנה עצבית. הנמכת סף הקצב החולף ישירות היא אמצעי נוסף להשגת אותה תוצאה. מועמדים אלה היו באופן תיאורטי מפגין ניוון מוחי גדול, אשר יכול לחסוך זמן ומשאבים במהלך אישור ומיפוי.
באופן כללי, הפרוטוקול מתאר דרך ישירה למסך עבור ניוון נוירולוגי ולאחר מכן לזהות מועמדים גנים נוירוגני. גישה גנטית זו אינה מוגבלת התנהגות ומוסר היסטולוגית המתואר כאן, יכול לשמש גם למסך עבור פנוטיפים אחרים כמו טמפרטורה רגיש (ts) שיתוק, הטלת ביצים או פנוטיפים לפוריות, רק כדי לצטט כמה. למשל, Drosophila ילה ts-מוטציות משותק ידועים להיות מועשר עבור ניוון נוירולוגי29 והוא יכול לייצג מקור נוסף לזיהוי של גנים נוירוהגנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה במיוחד לד ר בארי גאנצקי, במעבדה של מי המסך הגנטי בוצע, המאפשר זיהוי ואפיון של פרחח כמו גן נוירוגני. אנו מודים לד ר סטיבן רובינוב באדיבות לספק את האוסף של הזבובים של אנו-מוטייזד המשמשים במסך הגנטי המוצג במאמר זה. אנו מודים לחברי מעבדת גנצקי, ד"ר גרייס בוהוף-פלק ודוד ווסטמן לדיונים מועילים במהלך הפרויקט, לינג לינג הו ובוב קרבר לסיוע טכני, ד ר אקי אישידה לשימוש במתקן המיקרוטום שלו ב אוניברסיטת ויסקונסין וד ר קים לאקי והמכון לאנליזה אופטית באוניברסיטת אלבמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al.
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).
