Summary
Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.
Abstract
Hay mucho que entender sobre la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo los genes subyacentes responsables. El cribado genético hacia adelante utilizando mutágenos químicos es una estrategia útil para mapear fenotipos mutantes a genes entre Drosophila y otros organismos modelo que comparten vías celulares conservadas con los seres humanos. Si el gen mutado de interés no es letal en las primeras etapas de desarrollo de las moscas, se puede llevar a cabo un ensayo de escalada para detectar indicadores fenotípicos de disminución del funcionamiento cerebral, como bajas tasas de escalada. Posteriormente, el análisis histológico secundario del tejido cerebral se puede realizar con el fin de verificar la función neuroprotectora del gen mediante la puntuación de fenotipos de neurodegeneración. Las estrategias de mapeo genético incluyen mapeo meiótico y deficiencia que se basan en estos mismos ensayos pueden ser seguidos por la secuenciación del ADN para identificar posibles cambios de nucleótidos en el gen de interés.
Introduction
Las neuronas son en su mayor parte post-mitotica sin dividir1,2. En la mayoría de los animales, existen mecanismos neuroprotectores para mantener estas células a lo largo de la vida útil del organismo, especialmente a la edad anterior cuando las neuronas son más vulnerables al daño. Los genes subyacentes a estos mecanismos se pueden identificar en mutantes que presentan neurodegeneración, un indicador fenotípico para la pérdida de neuroprotección, utilizando un protocolo genético directo. Las pantallas genéticas delanteras que utilizan mutágenos químicos como el metanoesulfonato etílico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU) son particularmente útiles debido a las mutaciones de puntos aleatorios que inducen, lo que resulta en un enfoque inherentemente imparcial que ha arrojado luz sobre numerosas funciones genéticas en los organismos modelo eucariotas3,4,5 (en contraste, la mutagénesis de rayos X crea roturas de ADN y puede dar lugar a reorganización en lugar de mutaciones puntuales6).
La mosca fruta común Drosophila melanogaster es un tema ideal para estas pantallas debido a su alta calidad, secuencia de genoma bien anotada, su larga historia como organismo modelo con herramientas genéticas altamente desarrolladas, y lo más significativo, su compartido historia evolutiva con los seres humanos7,8. Un factor limitante en la aplicabilidad de este protocolo es la letalidad temprana causada por los genes mutados, lo que impediría las pruebas a la edad de9años. Sin embargo, para las mutaciones no letales, un ensayo de escalada, que aprovecha la geotaxis negativa, es un método simple, aunque extenso, para cuantificar el funcionamiento motor deteriorado10. Para exhibir suficiente reactividad locomotora, las moscas dependen de las funciones neuronales para determinar la dirección, detectar su posición y coordinar el movimiento. Por lo tanto, la incapacidad de las moscas para subir lo suficiente en respuesta a los estímulos puede indicar defectos neurológicos11. Una vez que se identifica un fenotipo de escalada defectuoso en particular, se pueden utilizar más pruebas utilizando una pantalla secundaria como el análisis histológico del tejido cerebral para identificar la neurodegeneración en moscas que escalan. La cartografía genética posterior se puede utilizar para revelar la región genómica en el cromosoma que lleva el gen neuroprotector defectuoso de interés. Para reducir la región cromosómica de interés, se puede realizar un mapeo meiotico utilizando líneas volantes mutantes que transportan genes marcadores dominantes con ubicaciones conocidas en el cromosoma. Los genes marcadores sirven como punto de referencia para la mutación, ya que la frecuencia de recombinación entre dos loci proporciona una distancia medible que se puede utilizar para mapear la ubicación aproximada de un gen. Por último, el cruce de las líneas mutantes con líneas que llevan deficiencias equilibradas en la región cromosómica meiotamente mapeada de interés crea una prueba de complementación en la que se puede verificar el gen de interés si se expresa su fenotipo conocido5. Las secuencias de nucleótidos polimórficos en el gen identificado, lo que puede resultar en secuencias de aminoácidos alteradas, se pueden evaluar secuenciando el gen y comparándolo con la secuencia del genoma de Drosophila. La caracterización posterior del gen de interés puede incluir pruebas de alelos mutantes adicionales, experimentos de rescate de mutaciones y examen de fenotipos adicionales.
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Protocol
1. Preparación y envejecimiento de las moscas
- Obtener o generar6 una colección de mutantes Drosophila que se utilizarán para la pantalla genética. Aquí, se utilizan líneas mutadas de ENU asignadas al segundo cromosoma y equilibradas sobre CyO.
- Amplificar las líneas experimentales del genotipo en una incubadora establecida a 25oC, ciclo claro/oscuro de 12 h en medio de melaza de harina de maíz.
- Recoger alrededor de 20 progenie homocigota entre 0-2 días de eclosión adulta de cada genotipo experimental. Elimine el sesgo sexual recogiendo constantemente moscas macho o hembra.
- Envejecer las moscas en el medio de melaza de harina de maíz como se desee a 29 oC, volteando los viales cada 2-3 días con el fin de mantener las moscas en los alimentos frescos a medida que envejecen. En la pantalla presentada aquí, las moscas fueron envejecidas durante 10-12 días.
- Montar una cámara de ensayo de escalada utilizando dos viales y cinta como se describió anteriormente10. Los viales deben estar conectados en ambos extremos abiertos. Utilice una regla para marcar una línea de 5 cm en un extremo de la cámara.
2. Protocolo 1: Ensayo de escalada (Adaptado de Ali et al.10)
- Validar el ensayo de escalada. En este estudio, pruebe el ensayo de escalada basado en la metodología previamente descrita por Ali et al.10, utilizando ElavC155>UAS-TauR406W (que exhibe tasas de apaso de escalada más bajas) y ElavC155>UAS-GFP ( control) y ElavC155>UAS-mCherry (control) vuela.
- Voltear las moscas en una cámara de prueba, una línea a la vez (no usar anestesia CO 2) y permitir que se recuperen durante 5 minutos. Si las pruebas se realizan en días diferentes, realice el ensayo a la misma hora del día. En este estudio, todos los ensayos de escalada se realizaron por la tarde para controlar los efectos circadianos en la locomoción12.
NOTA: Evite exponer las moscas a la luz solar directa al realizar pruebas; esto interferirá con su capacidad de escalar. - Toque la cámara (marcada hacia abajo) sobre una almohadilla del ratón colocada sobre una superficie sólida 3 veces para que todas las moscas comiencen el ensayo en la parte inferior. Observar la locomoción de mosca durante un período de 10 s.
- Registre el número de moscas que alcanzan o pasan la línea de 5 cm dentro de este tiempo, así como el número total de moscas probadas. Repita el protocolo, esperando 1 min entre cada prueba, para un mínimo de 3 réplicas de prueba por línea.
NOTA: En el presente estudio, cada vial contenía entre 2 y 19 moscas para el cribado inicial (moscas macho) y entre 6 y 21 moscas para el análisis de deficiencia mutante de líneas femeninas cruzadas (Sección 5.3.).
3. Protocolo 2: Selección de las cepas de Drosophila para un análisis posterior
- Introduzca los datos del ensayo de escalada en Microsoft Excel o software similar y calcule la tasa de paso de escalada para cada línea en todas las réplicas como un porcentaje.
-
Realizar análisis estadísticos para detectar líneas mutantes que se desvían significativamente del valor medio de porcentaje de escalada de todas las líneas utilizando el paquete de software R13.
- Leer archivos de datos seleccionados para R (archivos .csv o .txt con una columna para cada variable o factor y filas que representan los valores específicos).
NOTA: Aquí, los datos de los machos (ensayo inicial) y las hembras (línea 867 cruzadas a las líneas de deficiencia) se introdujeron en hojas separadas .xlsx como dos columnas, una donde las filas de la columna identifican la línea mutante y cuántas veces se replicó el ensayo y la otra donde las filas representan el éxito medio de escalada (como porcentaje) para cada vial de réplica de moscas. - Lea los datos en R utilizando el siguiente código:
mali<-read.csv(".. /male_init.csv")
femdef<-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
NOTA: El ".." en los directorios de ruta de acceso son rutas absolutas desde el directorio raíz del equipo del usuario y tendría que ser especificado por el usuario individual para las rutas de directorio de su equipo. - Realizar modelado lineal
- Realice la regresión variable ficticia con la función lm en R. Para el análisis inicial de las líneas mutantes, evalúe la importancia de los efectos de nivel de factor (líneas mutantes) en porcentaje de éxito de escalada en lugar de la gran media para una variable de respuesta centrada media cero (porcentaje de éxito).
NOTA: El "-1" al final de la llamada a la función lm en la sección 3.2.3.2. elimina la interceptación y nos permite probar todos los niveles de factor contra la media media media cero centrada de la tasa de paso de escalada porcentual. - Imprima los resultados en la pantalla utilizando la función de resumen R:
mali_anova<-lm(scale(mali$P_Success)-mali$Mutant_line -1)
summary(mali_anova) - Utilice las líneas de control (si están presentes) como línea de base para probar los efectos de nivel de factor contra el uso del siguiente código R: x<-relevel(femdef$Mutant_line, ref-"a867_plus")
femdef_anova<-lm(femdef$P_success-x)
summary(femdef_anova)
NOTA: La primera línea de código reordena los niveles de factor para que la línea de control negativa se convierta en la interceptación de línea base a la que se prueban todos los demás niveles de factor (líneas mutantes) con las pruebas tintegradas en la función lm.
- Realice la regresión variable ficticia con la función lm en R. Para el análisis inicial de las líneas mutantes, evalúe la importancia de los efectos de nivel de factor (líneas mutantes) en porcentaje de éxito de escalada en lugar de la gran media para una variable de respuesta centrada media cero (porcentaje de éxito).
- Leer archivos de datos seleccionados para R (archivos .csv o .txt con una columna para cada variable o factor y filas que representan los valores específicos).
- Elija un umbral para las líneas candidatas en función de la edad en el momento de la prueba. Para determinar el umbral, realizar una prueba preliminar a la edad deseada utilizando mutantes conocidos que exhiben neurodegeneración y bajas tasas de apaso de escalada en comparación con el tipo salvaje, el control vuela10.
NOTA: Una tasa de aprobación por debajo del 50% puede ser apropiada para las moscas de 10 días de edad como se informó anteriormente para las líneas de Drosophila sobreexpresando el gen tau relacionado con la neurodegeneración humana en el sistema nervioso10. Las moscas más viejas deben tener un umbral de velocidad de paso más alto, ya que se espera que presenten una disminución de la locomoción, por lo tanto, aumento de la neurodegeneración.
4. Protocolo 3: Análisis histológico
- Usando guantes, corta cabezas volantes con una cuchilla quirúrgica siguiendo el ensayo de escalada y usa un pincel para colocarlos suavemente en 1 ml del fijador de Carnoy (6:3:1 de 100% EtOH: cloroformo: ácido acético glacial) en un tubo de microcentrífuga O/N de 1,5 ml a 4oC. Asegúrese de que las cabezas se hundan en la solución fijativa.
- Sustituya la solución fijativa al día siguiente por 1 ml de 70% EtOH y mantenga las muestras todavía a 4 oC para su análisis futuro.
NOTA: El protocolo puede estar en pausa en este paso. - Coloque las cabezas del paso 4.2. un máximo de cinco por casete de microbiopsia. Coloque inmediatamente los cassettes en un recipiente lleno de 70% EtOH. Almacene el recipiente a 4 oC antes de enviarlo a una instalación de histología para el procesamiento y la incrustación de parafina de las cabezas. Si hay disponible equipo para el procesamiento e incrustación de tejidos, siga el paso 4.4.
- Incruste las cabezas en parafina para el seccionamiento del microtome:
- Siga los ajustes del programa para una máquina automatizada de procesamiento de tejidos en el orden presentado en la Tabla 1 para deshidratar, limpiar e infiltrarse con parafina en las cabezas.
- Transfiera las muestras a moldes de base de metal que se ajusten al cassette utilizando parafina calentada a 60 oC utilizando una estación de incrustación de parafina.
- Orientar las cabezas (orientación antero-posterior frente a la parte superior) en el molde base utilizando fórceps finos para permitir la visualización adecuada del tejido cerebral después del seccionamiento. Esto se puede hacer recalentando la parafina a 60 oC y reposicionando las cabezas si es necesario.
NOTA: Los moldes metálicos se pueden reemplazar por moldes de base desechables. - Coloque el cassette en la parte superior del molde de base correspondiente y muévalo suavemente al lado refrigerado de la estación de incrustación de parafina (4 oC). Espere hasta que el bloque se endurezque antes de retirarlo de la estación.
- Retire el bloque del molde disociando suavemente el molde del cassette.
- Recorte cada bloque de parafina de sección previa para minimizar la superficie que se seccionará.
- Ajuste el microtomo para cortar secciones de 5 m de cada bloque.
- Colocar la cinta de parafina seccionada que contenga el tejido en un baño de agua caliente (35 oC) durante un máximo de 5 min.
- Sumerja un portaobjetos recubierto de polilisina (ayuda a retener el tejido) en el baño de agua caliente, colocando la cinta seccionada en el portaobjetos utilizando aplicadores de madera. Deje que los portaobjetos sese al aire O/N a temperatura ambiente.
- Calentar las diapositivas durante 15 minutos a 63 oC con un calentador de diapositivas.
- Coloque los portaobjetos en un portaobjetos y manchar con hematoxilina y eosina (H&E) debajo de una campana de humo respetando los siguientes pasos.
- Coloque el bastidor en Histochoice (reemplazo no tóxico de Xileno, que ayuda a eliminar la parafina de la muestra) durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de Histochoice durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de 100% EtOH 1 durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de 100% EtOH 2 durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno con 95% EtOH durante 3 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de 70% EtOH durante 3 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno con H2O destilado durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de Harris Hematoxylin durante 2-5 min.
- Saque el bastidor de la solución de hematoxilina y colóquelo bajo el agua corriente del grifo durante 10 minutos.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de agua destilada haciendo un trozo corto.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de Eosin durante 1-2 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de 95% EtOH haciendo un dunk corto.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de 95% EtOH durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de 100% EtOH durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de 100% EtOH durante 5 min.
- Transfiera el bastidor en un recipiente lleno de Histochoice (o Xileno) durante 5-10 minutos hasta que todos los portaobjetos estén montados.
- Monte el portaobjetos y el soporte (24 mm x 60 mm de tamaño). Con fórceps, saque la diapositiva de la solución Histochoice o Xylene y haga una fina tira de medio de montaje en la parte superior. Coloque suavemente el cubreobjetos en la parte superior, tratando de evitar la formación de burbujas.
- Deje que el medio de montaje en las correderas montadas endurezca O/N debajo de la campana de humos antes del análisis.
- Almacene los portaobjetos manchados en una caja a temperatura ambiente.
- Cuantifique la neurodegeneración mirando todas las secciones seriales de la diapositiva con un aumento de 20x bajo un microscopio de luz. Examine todo el cerebro, tomando nota cualitativa del tamaño y el número de vacuolas que aparecen en tres secciones consecutivas.
- Obtenga imágenes de secciones cerebrales representativas en aproximadamente la mitad del cerebro utilizando un microscopio de luz equipado con software de imágenes.
5. Protocolo 4: Mapeo gene del fenotipo mmutant recesivo
- Cruce la línea candidata a un tipo salvaje CantonS (BL_ 9517) u otro tipo salvaje o cepa isogenizada (por ejemplo, OregonR (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) o yw (BL_ 6599) para determinar si el fenotipo es dominante o dominante o yw (BL_ 6599) para determinar si el fenotipo es dominante o dominante o yw (BL_ 6599) para determinar si el fenotipo es dominante o dominante o yw (BL_ 6599) para determinar si el fenotipo es dominante o dominante o yw (BL_ 6599) para determinar si el fenotipo es dominante o dominante o yw (BL_ 6599) Recesivo.
NOTA: Los resultados de este paso guiarán los siguientes pasos de la asignación. Si el fenotipo es recesivo, se puede realizar la asignación de deficiencia.- Usando un pincel, haz una cruz colocando en un vial que contiene alimentos las moscas anestesizadas CO2de la línea de interés mutante (5 machos) y la línea CantonS (10-15 hembras vírgenes). Coloque el vial a 25oC.
- Recoge la progenie heterocigia de F1 y repite los experimentos de escalada e histología.
- Compara los resultados obtenidos con la línea de control sola y con los mutantes homocigotos. Una buena indicación del fenotipo recesivo será si los mutantes heterocigotos exhiben fenotipos similares como moscas de tipo salvaje.
- Realizar mapeo meiotico para estimar aproximadamente la ubicación de la mutación en el segundo cromosoma usando el wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL_3227) o una cepa equivalente con marcadores dominantes asociados en conocidos ubicación citológica. En este caso, la mutación se sabía anteriormente que se encontraba en el segundo cromosoma.
- Usando un pincel, haz una cruz colocando en un vial que contiene alimentos CO2-moscas anestesiadas de la línea mutante de interés (5 machos) y la línea wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (10 hembras). Coloque el vial a 25oC.
NOTA: El objetivo de esta cruz es generar hembras heterocigotas que lleven el cromosoma con lanueva mutación y el cromosoma marcador, que se recombinará durante la meiosis 6,14. La progenie F1 femenina se elige en lugar de los machos, ya que la recombinación no se produce en los machos. - Recoger al menos 15 progenie femenina virgen que lleva el cromosoma con la nueva mutación y el cromosoma marcador y cruzarlos a 5 machos de una línea equilibrada que lleva otro marcador dominante visible (por ejemplo, CyO/snaSco (BL_2555) o equivalente).
- Recoger la progenie masculina heterocigota que lleva Sco o CyO y el cromosoma potencialmente recombinado de la cruz en el paso 5.2.2. y aparezándolas individualmente a hembras vírgenes de la población que transporta el cromosoma mutado.
- Recoja la progenie de la cruz final descrita en el paso 5.2.3. y envejecer las moscas a 29oC (en este estudio las moscas envejecieron durante 10-14 días).
- Recoger cabezas, realizar análisis de histología como se describe en el Protocolo 3 y mirar las diapositivas con secciones cerebrales para determinar el grado de neuropatología como se describe en el paso 4.11. El análisis de histología se realiza en lugar del análisis de locomoción debido a fenotipos que pueden afectar el ensayo de escalada, como Jammed (J),que causa acumulación de líquido en las alas15.
- Usando un pincel, haz una cruz colocando en un vial que contiene alimentos CO2-moscas anestesiadas de la línea mutante de interés (5 machos) y la línea wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (10 hembras). Coloque el vial a 25oC.
- Realizar mapeo de deficiencia en la región estrecha del cromosoma para refinar la ubicación de la mutación recesiva utilizando el ensayo de escalada. Cada línea de deficiencia tiene una eliminación de diferentes regiones de los cromosomas, lo que les permite ser utilizados para pruebas de complementación.
- Comience con grandes deficiencias que abarcan la región identificada en el mapeo meiótico, que luego se puede reducir aún más mediante el uso de deficiencias más pequeñas. Si el análisis de deficiencia da como resultado más de un gen candidato, se recomienda el uso de poblaciones de interferencia de ARN (ARN) para atacarlas.
- Líneas cruzadas del kit de deficiencia de Drosophila 16 para el segundo cromosoma (DK2L en este estudio) y buscar la no complementación del fenotipo de interés (en este estudio: tasa de paso de escalada del 8,5% que corresponde a la tasa de apaso de moscas homocigotas de la línea 867 utilizadas como control positivo).
- Confirmar el fenotipo de neurodegeneración utilizando la verificación histológica como se describe en la Sección 4 (Protocolo 3).
6. Protocolo 5: Secuenciación y análisis del ADN
NOTA: Tenga en cuenta que la mutagénesis ENU introduce mutaciones puntuales11.
- Diseñar secuencias de imprimación hacia adelante y hacia atrás que flanqueen la región de codificación exón del gen brat para amplificación por Polymerase Chain Reaction (PCR) de la región de interés (en el caso de la línea 867 se amplifica un fragmento de ADN del tamaño de 3.247 bp para secuenciación17).
-
Extraer ADN de una sola mosca18 :
- Apriete suavemente la mosca en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml que contiene 50 ml de tampón de calamar (10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM de NaCl y 200 g/ml de proteína saciása K; la enzima debe diluirse fresca de un material congelado antes de cada uso) utilizando una punta P100 o P200t.
- Incubar durante 30 min a 37oC
- Desactive la Proteinase K colocando el tubo a 95 oC durante 2 min.
NOTA: El ADN extraído se puede almacenar a 4 oC durante varios meses.
- Realizar la reacción PCR utilizando un ADN de alta fidelidad Taq Polimerasa (los reactivos y las condiciones de ciclo térmico utilizados en este estudio se muestran en la Tabla 2 y la Tabla3, respectivamente) respetando las instrucciones del fabricante y ejecutando el producto PCR en un 1 % gel de agarosa que contiene Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, que es una alternativa no tóxica del bromuro de etidio.
- Exijo la banda del tamaño correcto del gel con un bisturí y purifica el producto PCR usando el Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System (Promega) o kit equivalente, respetando las instrucciones del fabricante.
- Diseñar imprimadores hacia adelante y hacia atrás que se utilizarán para la secuenciación de ADN con el fin de cubrir toda la región de interés, si es posible. Secuenciar el ADN purificado por gel del paso anterior para identificar mutaciones puntuales. Se podría lograr una alta precisión en la secuenciación fluorescente automatizada de Sanger de hasta 700 bp.
NOTA: La ex polimerasa Ex Taq (TaKaRa) se puede utilizar para amplificar productos de PCR a partir de plantillas de ADN genómica de hasta 20 kb de tamaño. -
Analizar las secuencias de ADN obtenidas utilizando el Editor de plásmidos A (ApE, por M. Wayne Davis) o software similar alineándolos y comparándolos con las secuencias obtenidas tras la secuenciación de la misma región genómica de una cepa de referencia (por ejemplo, originalmente mutada línea).
- Abra los archivos de secuenciación con ApE. Como referencia, utilice un archivo ApE que contenga la secuencia de consenso genómico del gen mocoso descargado en un formato FASTA de Flybase, o un archivo que contenga resultados para la secuencia de control de fondo genético (por ejemplo, Drosophila mutada originalmente línea).
- Vaya a Herramientasy, a continuación, a Alinear secuencias. Con el ratón del ordenador, seleccione todas las secuencias que desee comparar. Recuerde indicar la secuencia de referencia utilizada para esta alineación en el menú desplegable.
- Inspeccione la región secuenciada en busca de cambios de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Si lo desea, guarde la alineación en el equipo en formato .rtf haciendo clic en Textoy, a continuación, en Guardar.
NOTA: Si no se identificaran mutaciones, el protocolo de secuenciación y análisis del ADN se repetiría con imprimaciones diseñadas para incluir regiones no codificantedeles del gen.
7. Protocolo 6: Análisis adicional de la función genealista candidata
- Realizar experimentos de rescate en neuroblastos para determinar si el gen brat es responsable del fenotipo de neurodegeneración.
- Doble equilibrio un UAS-brat19 y un neuroblast específico worniu-Gal4 (wor-G4 ) stocks que llevan las construcciones en el tercer cromosoma, así como la línea 867, que es mutante para el mocote genético ubicado en el segundo Cromosoma.
- Haga tres cruces separados colocando en tres viales diferentes que contienen alimentos 5 machos de las líneas UAS-Brat, wor-G4 y 867 y añada a cada conjunto de machos 10-15 hembras vírgenes de una línea que lleva marcadores y equilibradores para la segunda y terceros cromosomas (Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL_59967).
- Recoger 10-15 hembras vírgenes de la F1 de cada cruz con los siguientes genotipos: +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, +/CyO; wor-G4/Tm3,sb y 867/CyO;+/Tm3,sb y 5 machos de cada uno de los siguientes genotipos: +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb, +/Sp; wor-G4/Tm3,sb y 867/CyO; +/Dr.
- Cross collelcted +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb hembras vírgenes a +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb machos; en un vial separado hacer una segunda cruz con +/CyO; wor-G4 /Tm3,sb hembras vírgenes a +/Sp; wor-G4/Tm3, machos de sb y luego en un tercer vial cruz 867/CyO;+/Tm3, hembras vírgenes y 867/CyO; +/Dr machos.
- A partir de la F1 de cada una de estas cruces, recoger tanto machos como hembras de los siguientes genotipos: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb de la primera cruz, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb de la segunda cruz y 867/CyO; Dr/Tm3, sb de la segunda cruz.
- Realizar un cruce final entre hermanos y hermanas recogidos de cada progenie F1 para establecer acciones permanentes de doble balanceo para las tres líneas.
- Combina UAS-brat y wor-G4 con la mutación 867.
- Recoger el número suficiente (20-30 moscas) de las hembras vírgenes de la 867 / CyO; Dr/Tm3,sb doble material equilibrado para realizar dos cruces.
- Colocar 10-15 hembras vírgenes con 5 machos de la Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (cruz #1) y en un segundo vial 10-15 hembras vírgenes con 5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3, machos sb.
- Recoger hermanos y hermanas de la F1 de cada cruz con los siguientes genotipos: 867/CyO; UAS-brat/Tm3, sb de cross #1 y 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb de cross #2. Utilice la progenie F1 recogida de cada cruz para establecer existencias permanentes cruzando hermanos y hermanas entre ellos.
NOTA: Después de este último paso, las acciones para 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb y 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb debe generarse.
- Realice el experimento de rescate.
- Recoger 15-20 hembras vírgenes de la 867 /CyO; wor-G4/Tm3, sb stock y cruzarlos a 5-10 machos de la acción 867 / CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Como control, cruce 15-20 hembras vírgenes de la 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb y 15-20 hembras vírgenes de la 867/CyO; UAS-brat/Tm3, línea sb a la línea 867/CyO sola.
NOTA: 867 moscas llevan un alelo sensible a la temperatura de mocoso y la cruz de rescate debe realizarse a 29 oC. - Recoger la siguiente progenie F1 de cada cruz seleccionando cuidadosamente equilibradores marcados: 867/867; wor-G4/UAS-brat (rescate), 867/867; wor-G4/+ (control) y 867/867; UAS-brat/+ (control).
- Envejecer las moscas como se desee a 29oC y realizar análisis histológicos en los cerebros para buscar neurodegeneración utilizando el protocolo descrito en la Sección 4 (Protocolo 3).
- Recoger 15-20 hembras vírgenes de la 867 /CyO; wor-G4/Tm3, sb stock y cruzarlos a 5-10 machos de la acción 867 / CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Como control, cruce 15-20 hembras vírgenes de la 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb y 15-20 hembras vírgenes de la 867/CyO; UAS-brat/Tm3, línea sb a la línea 867/CyO sola.
- Doble equilibrio un UAS-brat19 y un neuroblast específico worniu-Gal4 (wor-G4 ) stocks que llevan las construcciones en el tercer cromosoma, así como la línea 867, que es mutante para el mocote genético ubicado en el segundo Cromosoma.
- Realizar análisis dependientes de la edad de neurodegeneración en 867 mutantes.
- Recoger 867;pcna-GFP y moscas de control de guisos, que llevan un gen de reportero (pcna-GFP) y son viables a 25 oC y exhiben tanto mayor penetrancia y mayor expresividad del fenotipo de neurodegeneración que 867 solo en este temperatura17.
- Envejecer las moscas hasta 5, 15 y 25 como se describe en la Sección 1.4 y realizar análisis histológicos posteriores siguiendo el protocolo de la Sección 4 (Protocolo 3).
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Representative Results
En esta ertícula, presentamos los pasos utilizados para identificar el tumor cerebral del gen (mocoso) como un papel en el mantenimiento de la integridad neuronal (por ejemplo, neuroprotección) en moscas adultas17; una metodología que puede utilizarse para identificar genes implicados en la neuroprotección. Utilizamos un enfoque genético hacia adelante (la estrategia se describe en la Figura 1A)para examinar a través de una colección de moscas químicamente mutadas utilizando un ensayo de escalada (el aparato utilizado para este ensayo se muestra en la Figura 1B). Entre las 235 líneas homocigotas, alrededor del 37% de las líneas probadas presentaron una tasa de pase de escalada por debajo del 50% cuando se probó a la edad de 10-12 días (Figura1C). El 58% de las líneas probadas mostraron un comportamiento de escalada significativamente diferente cuando su porcentaje de velocidad de apaso de escalada (CPR) se comparó con el valor medio porcentual de escalada de todas las líneas probadas utilizando ANOVA unidireccional (Figura1D). La pantalla histológica posterior en 51 de las líneas que exhiben la tasa de paso de escalada más baja reveló que 29 de estas líneas mostraron la aparición visible de agujeros en el cerebro neuropil (que van de leves a graves) indicativo sindicativo de neurodegeneración20 ( Figura 2). Entre las líneas que muestran un comportamiento de escalada defectuoso y una neurodegeneración grave, elegimos mapear la mutación subyacente al fenotipo en la línea 867 (0% De RCP y valor P 1.36e-14 basado en ANOVA unidireccional). El fenotipo de neurodegeneración en 867 moscas es recesivo porque los cerebros de las moscas heterocigotos 867 que han sido cruzados a una cepa de tipo salvaje son comparables a los de los controles (Figura3A). Usando histología, el mapeo meiotico situó la mutación en las ubicaciones citológicas 31-51, entre los marcadores fenotípicos J (Jammed) y L (Lobe) en el segundo cromosoma Drosophila. Utilizando el ensayo de escalada, el mapeo de deficiencia entre las ubicaciones citológicas 31 y 51 con líneas del Kit de Deficiencia de Drosophila para el cromosoma 2L (DK2L)16 mapeó la mutación en una región que abarca 118 genes (Figura3B); donde 867/+ sirve como control para el análisis estadístico). El examen del fenotipo cerebral de 867 mutantes cruzados a líneas de deficiencia adicionales (Figura3C)confirmó que la mutación está contenida en una región del genoma que incluye el mocosogenético. Una lista completa de todos los genes adicionales contenidos en estas eliminaciones se puede encontrar en Flybase haciendo clic en el enlace asociado con el segmento eliminado (por ejemplo, para Df(2L)ED1272 el segmento eliminado es 37C5-38A2). Basándose en observaciones anteriores de que los mutantes de mocosos tienen células supernumerarias en sus cerebros21,un fenotipo también observado en 867 mutantes, el mocoso fue seleccionado para el análisis de secuenciación de ADN. Secuenciación de Sanger del gen mocoso que contiene la región de codificación de exón identificó el cambio de nucleótido G/A en la posición 37.739 del gen (Figura4A),lo que llevó al cambio de glicina a ácido glutámico (G/E) en la posición 470 de la proteína Brat17 (Figura 4B). Los experimentos de rescate confirman que Brat desempeña un papel neuroprotector, ya que la sobreexpresión del gen funcional en la línea 867 suprime el fenotipo de neurodegeneración (Figura5A). Además, el fenotipo en 867 mutantes empeora con el tiempo, lo que sugiere que el mocoso desempeña un papel dependiente de la edad en la neuroprotección17 (Figura5B).
Figura 1 : Pantalla genética hacia adelante para identificar nuevos genes neuroprotectores. (A) Estrategia de pantalla. (B) Aparato de ensayo de escalada. (C) Resultados del ensayo de escalada para varones de 235 líneas homocigotas mutadas en UE. El gráfico circular representa las proporciones de líneas de vuelo probadas que se dividen en 4 grupos de tasas de pases de escalada: 0%, 1-20%, 21-50% y 51-100%. (D) Resultados del análisis estadístico ANOVA de 1 vía en el que se compararon las líneas mutantes con el valor medio del porcentaje de escalada de todas las líneas probadas. Representado es el número para dos categorías de valor P: P < 0.05 (cambio significativo) y P > 0.05 (cambio no significativo).
Figura 2 : Pantalla de histología secundaria. Secciones de cerebro medio manchadas de H&E que ilustran, de izquierda a derecha, sin neurodegeneración, neurodegeneración leve y neurodegeneración confirmada. Un total de 51 líneas homocigotas fueron reprobada por histología después de la identificación de los candidatos utilizando el ensayo de escalada. Las flechas indican los agujeros en el cerebro indicativos de neurodegeneración. La región rodeada por las líneas punteadas muestra la neurodegenación severa observada en la línea 867.
Figura 3 : Identificación del gen neuroprotector mocoso después de la cartografía de deficiencia utilizando el ensayo de escalada. (A) Se muestran imágenes representativas de secciones de cerebro medio teñidas de H&E de 18-20 días de edad w1118 (Control), heterocigoto 867 (867/+) y moscas mutantes homocigotos 867. (B) La línea de deficiencia Df(2L)ED1272 (BL_24116) no complementa el fenotipo mutante 867 (histograma negro) basado en el ensayo de escalada. La verificación histológica muestra que la línea Df(2L)ED1272 no complementa el fenotipo de neurodegeneración 867, mientras que Df(2L)ED1315 (BL_9269) sí. El gráfico representa la desviación media y estándar de 5 ensayos de escalada para cada línea. Los asteriscos indican la importancia basada en ANOVA unidireccional, en el que el valor medio del porcentaje de escalada de cada línea se comparó con el valor medio del porcentaje de escalada de la línea 867/+ (histograma verde). * P < 0.05, ** P < 0.01 y ***P < 0.001. (C) Representación esquemática de líneas de deficiencia adicionales que muestren la no complementación del fenotipo 867 por histología. Esta cifra ha sido modificada de Loewen et al.17; un artículo publicado bajo la Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0.
Figura 4 : Mutación puntual en el mocoso gen conduce a un cambio de aminoácidos en el dominio de bobina en espiral de la proteína Brat. (A) modelo de gen brat y imprimaciones utilizadas para la amplificación y secuenciación de la región de codificación. (B) La secuenciación del ADN del locus de moco identifica un cambio de nucleótido que conduce a un cambio de aminoácidos en el dominio bobinado de la proteína Brat. Esta cifra ha sido modificada de Loewen et al.17; un artículo publicado bajo la Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0.
Figura 5 : Análisis adicional de mocoso mutantes confirma su papel neuroprotector en Drosophila. (A) Utilizando el sistema Gal-4>UAS22 , la expresión específica de neuroblast del gen mocoso funcional rescata el fenotipo de neurodegeneración en 867 mutantes. (B) La neurodegeneración dependiente de la edad se observa en 867 mutantes portadores de un gen reportero pcna-GFP. el mocosocorresponde al nombre del alelo mocoso en la línea 867, que fue nombrado cabeza de queso (chs). Se muestran secciones representativas de h&E-teñidas midbrain de yw (control) y mocos homocigotos; moscas pcna-GFP de las edades indicadas. Esta cifra ha sido modificada de Loewen et al.17; un artículo publicado bajo la Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0.
| Estación | hora | Temperatura | Vacío/Presión | Solución |
| 1 | SIN RETRASO-INICIO RÁPIDO | |||
| 2 | OFF | OFF | OFF | |
| 3 | : 15 | 37 oC | ON/ON | 80%EtOH |
| 4 | : 15 | 37 oC | ON/ON | 95% EtOH |
| 5 | : 15 | 37 oC | ON/ON | 100% EtOH |
| 6 | : 15 | 37 oC | ON/ON | 100% EtOH |
| 7 | : 15 | 37 oC | ON/ON | 100% EtOH |
| 8 | : 15 | 37 oC | ON/ON | Xilenos |
| 9 | : 15 | 37 oC | ON/ON | Xilenos |
| 10 | : 15 | 37 oC | ON/ON | Xilenos |
| 11 | : 30 | 58 oC | ON/ON | Parafina |
| 12 | : 15 | 58 oC | ON/ON | Parafina |
| 13 | OFF | 58 oC | OFF | Parafina |
| 14 | : 15 | 58 oC | ON/ON | Parafina |
Tabla 1: Configuración de programa recomendada para el procesador de tejido automatizado. Los pasos en el orden indicado aquí se pueden utilizar con un procesador de tejido automatizado para cabezales fijos.
| Reactivo | Volumen (L) |
| 10x ExTaq Buffer (Mg2+ plus) (20 mM) | 2.5 |
| Imprimación delantera (10 m) | 2.5 |
| Imprimación inversa (10 m) | 2.5 |
| 2,5 mM dNTPs | 2 |
| ADN de plantilla | 2 |
| TaKaRa Ex Tq (5 U/L) | 0.25 |
| Agua libre de nucleasas | 13.25 |
| Volumen total | 25 |
Cuadro 2: Reactivos utilizados para la reacción de PCR. Reactivos y volúmenes respectivos utilizados en la reacción PCR para amplificar la región de codificación de mocosos.
| Paso | Temperatura | hora |
| 35 ciclos | 95 oC | 15 s |
| 55 oC | 45 s | |
| 72 oC | 3 min 10 s | |
| Mantener | 4 oC | ∞ |
Cuadro 3: Condiciones de ciclo térmico utilizadas para PCR. Los pasos en el orden indicado aquí se pueden utilizar para programar un ciclor térmico utilizando la mezcla de reacción que se muestra en la Tabla2.
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Discussion
Las pantallas genéticas delanteras en Drosophila han sido un enfoque eficaz para identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos, incluyendo la neuroprotección dependiente de la edad5,23,24, 25. Usando esta estrategia, logramos identificar al mocoso como un gen neuroprotector novedoso17.
Un paso crítico en este protocolo implica la orientación adecuada de las cabezas (como se describe en la Sección 4.4.3.) para el análisis histológico. Además, los marcadores de la línea utilizada para el mapeo meiótico no deben interferir con el fenotipo de la nueva mutación (en este estudio: neurodegeneración). Recomendamos una prueba inicial para confirmar que los marcadores elegidos no causan neurodegeneración propia. Por ejemplo, Jammed (J) causa ampollas en las alas que posiblemente podrían interferir con la escalada como es el caso de las moscas que precursoran el amiloide (APP) que también tienen alas ampollas26. El lóbulo (L) conduce a la reducción en el tamaño de los ojos; sin embargo, no observamos la degeneración cerebral central y este marcador se puede utilizar para mapear la neurodegeneración cerebral central. Pin y Sternoplural (Sp) también son apropiados para su uso, ya que los cerebros de moscas que llevan estos marcadores son comparables a los cerebros de controles de tipo salvaje.
Una desventaja de la metodología genética directa en las moscas es el tiempo necesario para estrechar las regiones del ADN al gen de interés3,5. El uso de estrategias de mapeo mejoradas27 junto con la disponibilidad de tecnologías de secuenciación de próxima generación 28 debería permitir una identificación aún más fácil de las mutaciones asociadas con los fenotipos de interés. Las pantallas genéticas delanteras pueden ser intensivas en mano de obra. Por ejemplo, la confirmación de la histología, que indica directamente la neurodegeneración en el cerebro, solo requiere una cantidad considerable de tiempo. Sin embargo, este enfoque será mucho más difícil y costoso de realizar en modelos de mamíferos, no necesariamente permitiendo estudios genéticos extensos. Las pantallas de mutagénesis química son ventajosas porque la identificación de mutaciones puntuales podría proporcionar información crítica sobre la función de los productos de genes afectados. La identificación de una mutación puntual que causa un cambio de aminoácido en un dominio conservado de la proteína Brat (Figura4B)ilustra la importancia del dominio de bobina enrollada de esta proteína TRIM-NHL en la neuroprotección18. El ensayo de escalada, que mide el comportamiento locomotor, es ciertamente ventajoso al permitir pruebas rápidas de un gran número de moscas en busca de defectos en la movilidad, también a menudo visto en la neurodegeneración humana25. Este ensayo también podría realizarse en otro entorno de pantalla, como la pantalla de interferencia de ARN in vivo (ARN) en todo el genoma que podría utilizarse para identificar genes neuroprotectores. Aunque disminuimos la distancia entre la parte inferior de la cámara de ensayo y la línea de paso de 8 cm10 a 5 cm para establecer una tasa de paso más estricta en el presente estudio, las bajas tasas de escalada no reflejaron la neurodegeneración para un gran número de líneas. La neurodegeneración puede hacerse evidente después de la aparición de defectos de comportamiento, lo que significa que las moscas pueden necesitar envejecer durante más tiempo antes de que aparezcan las vacuolas. Otra posibilidad es que los defectos locomotoras que observamos en ciertas líneas no se deban a un funcionamiento neurológico defectuoso, sino más bien a la debilidad muscular o a la incapacidad más general de las moscas. Además, es posible que nos falten candidatos potenciales, en los que los defectos de escalada no se manifiestan a la edad más temprana (por ejemplo, 10 días de edad), sino que se vuelven prominentes más adelante en la vida. Esta estrategia de cribado ciertamente podría aplicarse para identificar genes dependientes de la edad, eliminando así los genes asociados con posibles defectos del desarrollo neuronal. El protocolo presentado aquí se puede ajustar dependiendo de la probabilidad deseada de líneas candidatas para contener el gen mutado implicado en la neuroprotección. Bajar el umbral de velocidad de paso directamente es otro medio para lograr el mismo resultado. Estos candidatos teóricamente mostrarían una mayor neurodegeneración, lo que podría ahorrar tiempo y recursos durante la confirmación y el mapeo.
En general, el protocolo describe una manera sencilla de detectar la neurodegeneración y posteriormente identificar candidatos a genes neuroprotectores. Este enfoque genético no se limita al comportamiento y los ensayos histológicos descritos aquí, y también se puede utilizar para detectar otros fenotipos como parálisis sensible a la temperatura (ts), puesta de huevos o fenotipos de fertilidad, sólo para citar algunos. Por ejemplo, se sabe que los mutantes Drosophila ts-paralíticos están enriquecidos para la neurodegeneración29 y podrían representar una fuente adicional para la identificación de genes neuroprotectores.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Estamos particularmente agradecidos al Dr. Barry Ganetzky, en quién es el laboratorio de la pantalla genética que se realizó, permitiendo la identificación y caracterización del mocoso como un gen neuroprotector. Agradecemos al Dr. Steven Robinow por proporcionar amablemente la colección de moscas mutadas en uEN utilizadas en la pantalla genética presentada en este artículo. Agradecemos a los miembros del laboratorio Ganetzky, los doctores Grace Boekhoff-Falk y David Wassarman por sus útiles debates a lo largo de la duración de este proyecto, Ling Ling Ho y Bob Kreber por asistencia técnica, el Dr. Aki Ikeda para el uso de su instalación de microtome en el Universidad de Wisconsin y el Dr. Kim Lackey y el Centro de Análisis Óptico de la Universidad de Alabama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
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