Summary
Vi presenterar ett protokoll med ett framåtriktat genetiskt förhållningssätt till Screen för mutanter som uppvisar neurodegeneration i Drosophila melanogaster. Den innehåller ett klättrings test, histologisk analys, Genkartläggning och DNA-sekvensering för att slutligen identifiera nya gener relaterade till processen för neuroskydd.
Abstract
Det finns mycket att förstå om uppkomsten och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive de bakomliggande gener som är ansvariga. Framåtriktad genetisk screening med hjälp av kemiska mutagena ämnen är en användbar strategi för att kartlägga muterade fenotyper till gener bland Drosophila och andra modellorganismer som delar bevarade cellulära vägar med människor. Om den muterade genen av intresse inte är dödlig i tidiga utvecklingsstadier av flugor, kan en klätter analys utföras för att skärmen för fenotypiska indikatorer för minskad hjärnans funktion, såsom låg klättring priser. Därefter, sekundär histologisk analys av hjärnvävnad kan utföras för att kontrollera neuroprotektiva funktionen av genen genom att poänggöra neurodegeneration fenotyper. Gen kartläggnings strategier inkluderar meiotiska metafaserna och brist kartläggning som förlitar sig på dessa samma analyser kan följas av DNA-sekvensering för att identifiera möjliga nukleotidförändringar i genen av intresse.
Introduction
Nervceller är till största delen post-mitotiska och oförmögna att dividera1,2. I de flesta djur, neuroprotektiva mekanismer finns för att bibehålla dessa celler hela organismens livslängd, särskilt vid ålderdom när neuroner är mest sårbara för skador. Gener som ligger bakom dessa mekanismer kan identifieras i mutanter som uppvisar neurodegeneration, en fenotypisk indikator för förlust av neuroskydd, med hjälp av ett framåtriktat genetiskt protokoll. Framåt genetiska skärmar med hjälp av kemiska mutagena ämnen såsom etylmetanesulfonat (EMS) eller N-etyl-N-nitrosourea (ENU) är särskilt användbara på grund av de slumpmässiga punktmutationer de inducerar, vilket resulterar i en inneboende opartisk metod som har belysa många gen funktioner i eukaryotiska modellorganismer3,4,5 (i motsats till detta skapar röntgenmuta Genes DNA-avbrott och kan resultera i omordning snarare än punktmutationer6).
Den gemensamma fruktfluga Drosophila melanogaster är ett idealiskt ämne för dessa skärmar på grund av dess höga kvalitet, väl kommenterade genomsekvens, dess långa historia som en modellorganism med högt utvecklade genetiska verktyg, och mest signifikant, dess delade evolutions-historia med människor7,8. En begränsande faktor för tillämpligheten av detta protokoll är tidig dödlighet orsakad av muterade gener, vilket skulle förhindra tester vid ålderdom9. Men för icke-dödliga mutationer, en klätter analys, som utnyttjar negativa geotaxis, är en enkel, även om omfattande, metod för att kvantifiera nedsatt motoriska funktion10. Att uppvisa tillräcklig rörelse reaktivitet, flugor beror på neurala funktioner för att bestämma riktning, känsla dess position, och samordna rörelse. Oförmåga flugor att tillräckligt klättra som svar på stimuli kan därför tyda på neurologiska defekter11. När en viss defekt klättring fenotyp identifieras, ytterligare tester med hjälp av en sekundär skärm som histologisk analys av hjärnvävnad, kan användas för att identifiera neurodegeneration i klättring-defekta flugor. Efterföljande gen mappning kan sedan användas för att avslöja genomisk regionen på kromosomen som transporterar den defekta neuroprotektiva genen av intresse. För att begränsa den kromosomala regionen av intresse, meiotiska metafaserna kartläggning med muterade fluglinor redovisade dominerande markörgener med kända platser på kromosom kan utföras. Markörgener fungerar som en referenspunkt för mutationen eftersom frekvensen av rekombination mellan två loci ger ett mätbart avstånd som kan användas för att kartlägga den ungefärliga placeringen av en gen. Slutligen, korsar muterade linjer med linjer redovisade balanserade brister på meiotically kartlagda kromosomala regionen av intresse skapar ett komplement test där genen av intresse kan verifieras om dess kända fenotyp uttrycks5. Polymorfa nukleotidsekvenser i den identifierade genen, möjligen resulterar i en förändrad aminosyresekvenser, kan utvärderas genom sekvensering av genen och jämföra den med Drosophila genomsekvensen. Efterföljande karakterisering av genen av intresse kan innefatta testning av ytterligare Mutant alleler, Mutations räddning experiment och undersökning av ytterligare fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelse och åldring av flugor
- Skaffa eller generera6 en samling Drosophila mutanter som kommer att användas för den genetiska skärmen. Här, ENU-mutagenized linjer mappas till den andra kromosomen och balanseras över CYO används.
- Amplifiera experimentella genotyp linjer i en inkubator inställd på 25 ° c, 12 h ljus/mörker cykel på majsmjöl-Molasses medium.
- Samla runt 20 homozygot avkomma mellan 0-2 dagar av vuxna eclosion från varje experimentell genotyp. Eliminera kön bias genom att konsekvent samla antingen manliga eller kvinnliga flugor.
- Ålder flugorna på majsmjöl-Molasses medium som önskas vid 29 ° c, vända flaskorna varje 2-3 dagar för att bibehålla flugorna på färsk mat när de åldras. På skärmen som presenteras här, flugor var i åldrarna 10-12 dagar.
- Montera en klätter analys testkammare med två flaskor och tejp som tidigare beskrivits10. Injektionsflaskorna ska anslutas i båda öppna ändarna. Använd en linjal för att markera en 5 cm linje i ena änden av kammaren.
2. protokoll 1: klätter analys (anpassad från Ali et al.10)
- Validera klättrings analysen. I denna studie, testa klättrings analysen baserat på tidigare beskrivna metoden av Ali et al.10, med hjälp av elavc155≫ UAS-TauR406W (uppvisar lägre klättring passera priser) och elavc155> UAS-GFP ( kontroll) och Elavc155> UAS-mcherry (kontroll) flyger.
- Vänd flugorna i en testkammare, en rad i taget (Använd inte CO2 anestesi) och låt dem återhämta sig i 5 min. Om testning görs på olika dagar, utföra analysen vid samma tidpunkt på dagen. I denna studie utfördes alla klättrings analyser på eftermiddagen för att kontrollera cirkadiska effekter på förflyttning12.
Anmärkning: Undvik att utsätta flugorna för direkt solljus när du testar; Detta kommer att störa deras förmåga att klättra. - Tryck med våld på kammaren (markerad sida nedåt) på en musmatta placerad på en fast yta 3 gånger så att alla flugor börjar analysen längst ner. Observera fly Locomotion under en period av 10 s.
- Registrera antalet flugor som når eller passera 5 cm linjen inom denna tid, liksom det totala antalet flugor testade. Upprepa protokollet, väntar 1 min mellan varje testperiod, för minst 3 prov replikat per rad.
Anmärkning: I denna studie innehöll varje injektionsflaska mellan 2 och 19 flugor för den första screeningen (manliga flugor) och mellan 6 och 21 flugor för den muterade brist analysen av korsade kvinno linjer (avsnitt 5,3).
3. protokoll 2: val av Drosophila -stammar för vidare analys
- Ange klättrings analysen data i Microsoft Excel eller liknande programvara och beräkna klättring passera hastighet för varje rad över alla replikat som en procentsats.
-
Utför statistisk analys för att detektera muterade linjer som avviker markant från medelvärdet för klättrings procenten för alla linjer med hjälp av R-programpaketet13.
- Läs i datafiler som är kurerade för R-(. csv-eller. txt-filer med en kolumn för varje variabel eller faktor och rader som representerar de specifika värdena).
Anmärkning: Här har data för män (initial assay) och honor (linje 867 passerats till brist linjer) införts i separata. xlsx ark som två kolumner, en där raderna i kolumnen identifierar den muterade linjen och hur många gånger analysen replikeras och den andra där rader representera den genomsnittliga klättrings framgången (i procent) för varje replikflaska med flugor. - Läsa data till R med hjälp av följande kod:
Mali <-Read. csv (".. /male_init.csv ")
femdef <-Read. csv (".. /fem_def_cross.csv ")
Anmärkning: Den ".." i sökvägen kataloger är absoluta sökvägar från rotkatalogen på användarens dator och skulle behöva anges av den enskilde användaren för deras dators katalogsökvägar. - Utför linjär modellering
- Utför dummy variabel regression med LM -funktionen i R. För den inledande analysen av muterade linjer, utvärdera betydelsen av faktor nivå effekter (Mutant linjer) på procent klättring framgång mot den stora medelvärdet för en nollmedelcentrerad responsvariabel (procent framgång).
Anmärkning: "-1" i slutet av LM -funktionens anrop i avsnitt 3.2.3.2. tar bort skärningspunkten och tillåter oss att testa alla faktor nivåer mot noll medelvärdet centrerad medelvärdet av procent klättring passera rate. - Skriv ut resultaten på skärmen med hjälp av R- summerings funktionen:
mali_anova <-LM (skala (Mali $ P_Success) ~ Mali $ Mutant_line-1)
Sammanfattning (mali_anova) - Använd kontroll linjer (om sådana finns) som baslinje för att testa faktor nivå effekter mot att använda följande R-kod: x <-relevel (femdef $ Mutant_line, Ref = "a867_plus")
femdef_anova <-LM (femdef $ P_success ~ x)
Sammanfattning (femdef_anova)
Anmärkning: Den första raden i koden beställer om faktor nivåerna så att den negativa Kontrolllinjen blir den baslinje skärningspunkt som alla andra faktor nivåer (muterade linjer) testas mot med de inbyggda t-testerna i LM -funktionen.
- Utför dummy variabel regression med LM -funktionen i R. För den inledande analysen av muterade linjer, utvärdera betydelsen av faktor nivå effekter (Mutant linjer) på procent klättring framgång mot den stora medelvärdet för en nollmedelcentrerad responsvariabel (procent framgång).
- Läs i datafiler som är kurerade för R-(. csv-eller. txt-filer med en kolumn för varje variabel eller faktor och rader som representerar de specifika värdena).
- Välj ett tröskelvärde för kandidat rader beroende på ålder vid tidpunkten för testning. För att bestämma tröskeln, utföra en preliminär test på önskad ålder med hjälp av kända mutanter som uppvisar neurodegeneration och låg klättring passera priser i jämförelse med Wild typ, kontroll flugor10.
Anmärkning: En passnings hastighet under 50% kan vara lämplig för 10 dagar gamla flugor som tidigare rapporterats för Drosophila linjer överuttrycker den mänskliga neurodegeneration-relaterade Gene Tau i nervsystemet10. Äldre flugor bör ha en högre passera ränta tröskel eftersom de förväntas uppvisar minskad förflyttning, sålunda, ökad neurodegeneration.
4. protokoll 3: histologisk analys
- Bär handskar, Sever flyga huvuden med ett kirurgiskt blad efter klättring analysen och använda en pensel för att försiktigt placera dem i 1 mL av Carnoy s fixativ (6:3:1 av 100% EtOH: kloroform: isättika) i en 1,5 mL Micro centrifug Tube O/N vid 4 ° c. Se till att huvuden sjunker i fixativ lösning.
- Byt ut fixativ lösningen följande dag med 1 mL 70% EtOH och behåll proverna fortfarande vid 4 ° c för framtida analys.
Anmärkning: Protokollet kan pausas i det här steget. - Placera huvuden från steg 4,2. högst fem per microbiopsikassett. Placera omedelbart kassetterna i en behållare fylld med 70% EtOH. Förvara behållaren vid 4 ° c före leverans till en histologisk anläggning för bearbetning och paraffin inbäddning av huvudena. Om utrustning för vävnads bearbetning och inbäddning finns tillgänglig, Följ steg 4,4.
- Bädda in huvudena i paraffin för snittning av mikrotomen:
- Följ programinställningarna för en automatiserad vävnads bearbetningsmaskin i den ordning som presenteras i tabell 1 för att torka, rensa och infiltrera med paraffin huvudena.
- Överför proverna till metall bas formar som passar kassetten med paraffin uppvärmd vid 60 ° c med hjälp av en paraffin inbäddnings Station.
- Orientera huvuden (Antero-posterior orientering vänd mot toppen) i basen mögel med hjälp av fina pinvar för att möjliggöra ordentlig visualisering av hjärnvävnaden efter snittning. Detta kan göras genom att värma paraffin vid 60 ° c och ompositionera huvuden om det behövs.
Anmärkning: Metall formar kan ersättas av disponibel bas formar. - Placera kassetten ovanpå motsvarande bas form och flytta försiktigt dessa till den kylda sidan av paraffin inbäddnings stationen (4 ° c). Vänta tills blocket hårdnar innan du tar bort det från stationen.
- Ta bort blocket form formen genom att försiktigt separera mögel från kassetten.
- Trimma varje paraffinblock innan snittning för att minimera ytan som kommer att sektioneras.
- Ställ in mikrotomen att skära 5 μm delar av varje block.
- Placera sektionerat paraffin band som innehåller vävnaden i ett uppvärmt vattenbad (35 ° c) i högst 5 min.
- Sänk en poly-Lysine belagda Slide (hjälper till att behålla vävnaden) i den uppvärmda vattenbad, placera den sektionerade bandet på bilden med hjälp av trä applikatorer. Låt bilderna lufttorka O/N i rumstemperatur.
- Värm upp glasen i 15 min vid 63 ° c med en glid värmare.
- Placera glidbanorna på en glid färgställning och fläcken med hematoxylin och eosin (H & E) under ett draghuv genom att respektera följande steg.
- Placera racket i Histochoice (giftfri ersättning av xylen, som hjälper till att ta bort paraffin från provet) i 5 min.
- Överför racket i en behållare fylld med Histochoice i 5 min.
- Överför racket i en behållare fylld med 100% EtOH 1 för 5 min.
- Överför racket i en behållare fylld med 100% EtOH 2 för 5 min.
- Överför racket i en behållare fylld med 95% EtOH för 3 min.
- Överför racket i en behållare fylld med 70% EtOH för 3 min.
- Överför racket i en behållare fylld med destillerat H2O i 5 min.
- Överför racket i en container fylld med Harris hematoxylin för 2-5 min.
- Ta rack ut ur hematoxylin lösning och placera den under rinnande kranvatten i 10 min.
- Överför racket i en behållare fylld med destillerat vatten genom att göra en kort dunk.
- Överför racket i en behållare fylld med eosin för 1-2 min.
- Överför racket i en container fylld med 95% EtOH genom att göra en kort dunk.
- Överför racket i en behållare fylld med 95% EtOH i 5 min.
- Överför racket i en behållare fylld med 100% EtOH i 5 min.
- Överför racket i en behållare fylld med 100% EtOH i 5 min.
- Överför racket i en behållare fylld med Histochoice (eller xylen) för 5-10 min tills alla bilder är monterade.
- Montera bilden och täckglaset (24 mm x 60 mm i storlek). Med hjälp av pinkoppar, ta bilden ur Histochoice eller xylen lösning och gör en tunn remsa av monteringsmedel på toppen av den. Försiktigt placera täckslip på toppen, försöker undvika bildandet av bubblor.
- Låt monterings mediet på monterade diabilder härda O/N under draghuven före analys.
- Förvara färgade glas i en låda i rumstemperatur.
- Kvantifiera neurodegeneration genom att titta på alla seriella sektioner på bilden vid 20x förstoring under ett ljusmikroskop. Undersök hela hjärnan, med kvalitativ notering av storlek och antal vakuoler som visas i tre på varandra följande avsnitt.
- Få bilder av representativa hjärn sektioner vid ungefär mitten av hjärnan med hjälp av ett ljusmikroskop utrustad med bildprogram.
5. protokoll 4: gen mappning av recessiv Mmutant fenotyp
- Outcross kandidat linjen till en vild typ kantoner (BL_ 9517) eller annan vildtyp eller isogenized stam (t. ex. oregonr (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) eller YW (BL_ 6599) för att avgöra om fenotypen är dominerande eller Recessiv.
Anmärkning: resultat från det här steget vägleder nästa steg i mappningen. Om fenotypen är recessiv, då brist kartläggning kan utföras.- Med hjälp av en pensel, gör ett kors genom att placera i en mat-innehållande injektionsflaska CO2-sövda flugor av den muterade linjen av intresse (5 hanar) och kantonerna linjen (10-15 jungfru honor). Placera injektionsflaskan vid 25 ° c.
- Samla heterozygot F1 avkomman och upprepa klättring och histologi experiment.
- Jämför de erhållna resultaten till Kontrolllinjen ensam och till homozygot mutanter. En bra indikation på recessiv fenotyp kommer att vara om heterozygot mutanter uppvisar liknande fenotyper som vild typ flugor.
- Utför meiotiska kartläggning för att grovt uppskatta placeringen av mutationen på den andra kromosomen med hjälp av WGSP-1 J1 L2 stift1/CYO (BL_3227) eller en likvärdig stam med tillhörande dominerande markörer vid kända cytologiskt läge. I detta fall var mutationen tidigare känd för att vara placerad på den andra kromosomen.
- Med hjälp av en pensel, gör ett kors genom att placera i en mat-innehållande injektionsflaska CO2-sövda flugor av den muterade linjen av intresse (5 hanar) och WGSP-1 J1 L2 stift1/CYO linje (10 honor). Placera injektionsflaskan vid 25 ° c.
Anmärkning: Målet med detta kors är att generera heterozygot honor bär kromosomen med den nya mutationen och markör kromosomen, som kommer att återförenas under meios6,14. Kvinnlig F1-avkomma väljs hellre än hanar eftersom rekombination inte förekommer hos män. - Samla minst 15 jungfru kvinnlig avkomma som transporterar kromosomen med den nya mutationen och markör kromosomen och korsa dem till 5 hanar från en balanserad linje som bär en annan synlig dominerande markör (t. ex. CYO/SNASCO (BL_2555) eller likvärdiga).
- Samla in heterozygot manlig avkomma som transporterar antingen SCO eller CYO och potentiellt rekombinerat kromosom från korset i steg 5.2.2. och individuellt para dem med jungfru honor från beståndet bär den muterade kromosomen.
- Samla in avkomman från Final korset som beskrivs i steg 5.2.3. och ålder flugorna vid 29 ° c (i denna studie flugor var i åldrarna 10-14 dagar).
- Samla huvuden, utföra histologisk analys som beskrivs i protokoll 3 och titta på bilderna med hjärn sektioner för att bestämma graden av neuropatologi som beskrivs i steg 4,11. Histologisk analys utförs i stället för förflyttning analys på grund av fenotyper som kan påverka klätter analys, såsom fastnat (J), som orsakar vätska uppbyggd i vingarna15.
- Med hjälp av en pensel, gör ett kors genom att placera i en mat-innehållande injektionsflaska CO2-sövda flugor av den muterade linjen av intresse (5 hanar) och WGSP-1 J1 L2 stift1/CYO linje (10 honor). Placera injektionsflaskan vid 25 ° c.
- Utför brist mappning på trånga regionen av kromosomen att förfina placeringen av recessiv mutation med hjälp av klättring analysen. Varje brist linje har en radering av olika områden av kromosomerna, så att de kan användas för komplemen testning.
- Börja med stora brister som spänner över den region som identifierats i meiotiska metafaserna kartläggning, som sedan kan ytterligare begränsas av användningen av mindre brister. Om bristen analysen resulterar i mer än en kandidat gen, användning av RNA-interferens (RNAi) bestånd rekommenderas att rikta dem.
- Cross Lines från Drosophila deficiency kit16 för den andra KROMOSOMEN (DK2L i denna studie) och leta efter icke-komplettering av fenotyp av intresse (i denna studie: klättring passera klassar av 8,5% vilket motsvarar till passera klassar av homozygot flugor från linje 867 används som positiv kontroll).
- Bekräfta neurodegeneration fenotyp med hjälp av histologisk verifiering enligt beskrivningen i avsnitt 4 (protokoll 3).
6. protokoll 5: DNA-sekvensering och analys
Anmärkning: Tänk på att ENU mutesis introducerar punktmutationer11.
- Design framåt och omvänd primer sekvenser flanera exon-kodning regionen av Brat genen för förstärkning av polymeras kedjereaktion (PCR) i regionen av intresse (i fråga om linje 867 är ett DNA-fragment av storleken 3 247 BP förstärks för sekvensering17).
-
Extrahera DNA från en enda fluga18 :
- Försiktigt squish flugan i en 0,5 mL Micro centrifug tub som innehåller 50 μL av squishing buffert (10 mM Tris-cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, och 200 μg/mL Proteinase K; enzymet måste spädas färskt från en fryst lager före varje användning) med hjälp av en P100 eller P200 Pipettera spets.
- Inkubera i 30 min vid 37 ° c
- Avaktivera proteinas K genom att placera röret vid 95 ° c i 2 min.
Anmärkning: Det extraherade DNA kan förvaras vid 4 ° c i flera månader.
- Utför PCR-reaktionen med hjälp av en High-Fidelity DNA Taq-polymeras (reagenser och termiska cyklings förhållanden som används i denna studie visas i tabell 2 respektive tabell 3) genom att respektera tillverkarens anvisningar och köra PCR-produkten på en 1 % aguppstod gel som innehåller Invitrogen SYBR Safe DNA gel fläck, som är ett giftfritt alternativ för etidiumbromid.
- Accis bandet av rätt storlek från gelen med en skalpell och rena PCR-produkten med hjälp av Wizard SV gel och PCR Clean-up system (Promega) eller motsvarande kit, genom att respektera tillverkarens anvisningar.
- Design framåt och omvänd primers som kommer att användas för DNA-sekvensering för att täcka hela regionen av intresse, om möjligt. Sekvens gel-renat DNA från föregående steg för att identifiera punktmutationer. Hög noggrannhet i automatiserad fluorescerande Sanger sekvensering kan uppnås för upp till 700 BP.
Anmärkning: Ex Taq polymeras (Takara) kan användas för att förstärka PCR-produkter från genomisk DNA-mallar upp till 20 KB av storlek. -
Analysera erhållna DNA-sekvenser med hjälp av en Plasmid-redigerare (ApE, by M. Wayne Davis) eller liknande programvara genom att rikta in dem och jämföra dem med de sekvenser som erhålls efter sekvensering av samma genomisk region av en referensstam (t. ex. ursprungligen mutageniserad Line).
- Öppna sekvenserings filer med ApE. Som referens, Använd en ApE-fil som innehåller den genomiska konsensus sekvens av Brat genen ner i en fasta format från flybase, eller en fil som innehåller resultat för sekvens av genetiska bakgrundskontroll (t. ex., ursprungligen mutageniserad Drosophila Line).
- Gå till verktygoch Justera sedan sekvenser. Använd datorns mus och välj alla sekvenser som du vill jämföra. Kom ihåg att ange den referenssekvens som används för justeringen i drop-menyn.
- Inspektera den sekvenserade regionen för nukleotidförändringar jämfört med referenssekvens. Om du vill kan du spara justeringen på datorn i. RTF-format genom att klicka på textoch sedan på Spara.
Anmärkning: Om inga mutationer identifierades skulle DNA-sekvenserings-och analys protokollet upprepas med primers som utformats för att inkludera icke-kodande regioner av genen.
7. protokoll 6: ytterligare analys av kandidat genfunktion
- Utföra räddnings experiment i neuroblaster för att avgöra om genen Brat är ansvarig för neurodegeneration fenotyp.
- Dubbel balans en UAS-Brat19 och en neuroblast-specifika worniu-Gal4 (WOR-G4) lager bärande konstruktioner på den tredje kromosomen, liksom 867 linjen, som är Mutant för genen Brat ligger på andra Kromosom.
- Gör tre separata korsningar genom att placera i tre olika livsmedel som innehåller flaskor 5 hanar från UAS-Brat, WOR-G4 och 867 linjer och lägga till varje uppsättning av män 10-15 jungfru honor från en linje som transporterar markörer och Balanserare för andra och tredje kromosomer (SP/CyO; Dr/avsett TM3, SB; BL_59967).
- Samla 10-15 jungfru honor från F1 av varje kors med följande genotyper: +/CYO; UAS-Brat/avsett TM3, SB, +/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB och 867/CYO; +/TM3, SB och 5 hanar av var och en av följande genotyper: +/SP; UAS-Brat/avsett TM3, SB, +/SP; WOR-G4/avsett TM3, SB och 867/CYO; +/Dr.
- Cross collelcted +/CYO; UAS-Brat/avsett TM3, SB jungfru honor till +/SP; UAS-Brat/avsett TM3, SB hanar; i en separat flaska gör ett andra kors med +/CYO; WOR-G4/Tm3, SB Virgin honor till +/SP; WOR-G4/avsett TM3, SB hanar och sedan i en tredje flaska Cross 867/CYO; +/TM3, SB Virgin honor och 867/CYO; +/Dr hanar.
- Från F1 av var och en av dessa korsningar, samla både män och kvinnor av följande genotyper: SP/CyO; UAS-Brat/avsett TM3, SB från första korset, SP/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB från andra korset och 867/CYO; Dr/avsett TM3, SB från andra korset.
- Utför en sista korsning mellan bröder och systrar som samlats in från varje F1-avkomma för att etablera permanenta dubbelbalanserade bestånd för alla tre linjerna.
- Kombinera UAS-Brat och WOR-G4 med 867 -mutationen.
- Samla tillräckligt antal (~ 20-30 flugor) av jungfru honor från 867/CyO; Dr/avsett TM3, SB dubbel balanserade lager för att utföra två kors.
- Placera 10-15 jungfru honor med ~ 5 hanar från SP/CyO; UAS-Brat/avsett TM3, SB (cross #1) och i en andra injektionsflaska 10-15 jungfru honor med ~ 5 SP/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB hanar.
- Samla bröder och systrar från F1 av varje kors med följande genotyper: 867/CyO; UAS-Brat/avsett TM3, SB från cross #1 och 867/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB från Cross #2. Använd insamlade F1 avkomman från varje kors för att etablera permanenta bestånd genom att korsa bröder och systrar mellan dem.
Anmärkning: Efter detta sista steg, bestånd för 867/CyO; UAS-Brat/avsett TM3, SB och 867/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB ska genereras.
- Utför räddnings experimentet.
- Samla ~ 15-20 jungfru honor från 867/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB- beståndet och korsa dem till 5-10 hanar från beståndet 867/CYO; UAS-Brat/avsett TM3, SB. Som kontroll, Cross ~ 15-20 Virgin honor från 867/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB och ~ 15-20 jungfru honor från 867/CYO; UAS-Brat/avsett TM3, SB- linjen till enbart 867/CYO -linjen.
Anmärkning: 867 flugor bär en temperatur känslig allel av Brat och räddnings korsets bör utföras vid 29 ° c. - Samla följande F1-avkomma från varje kors genom att noggrant välja bort markerade Balanserare: 867/867; WOR-G4/UAS-Brat (räddning), 867/867; WOR-G4/+ (kontroll) och 867/867; UAS-Brat/+ (kontroll).
- Ålder flugorna som önskas vid 29 ° c och utföra histologisk analys på hjärnor för att leta efter neurodegeneration med hjälp av protokollet som beskrivs i avsnitt 4 (protokoll 3).
- Samla ~ 15-20 jungfru honor från 867/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB- beståndet och korsa dem till 5-10 hanar från beståndet 867/CYO; UAS-Brat/avsett TM3, SB. Som kontroll, Cross ~ 15-20 Virgin honor från 867/CYO; WOR-G4/avsett TM3, SB och ~ 15-20 jungfru honor från 867/CYO; UAS-Brat/avsett TM3, SB- linjen till enbart 867/CYO -linjen.
- Dubbel balans en UAS-Brat19 och en neuroblast-specifika worniu-Gal4 (WOR-G4) lager bärande konstruktioner på den tredje kromosomen, liksom 867 linjen, som är Mutant för genen Brat ligger på andra Kromosom.
- Utföra åldersberoende analys av neurodegeneration i 867 mutanter.
- Samla in 867; PCna-GFP och YW Control flugor, som bär en reporter gen (PCna-GFP) och är livskraftiga vid 25 ° c och uppvisar både högre penetrans och högre uttrycksförmåga av neurodegeneration fenotyp än 867 ensam på denna temperatur17.
- Ålder flugorna upp till 5, 15 och 25 som beskrivs i avsnitt 1,4 och utföra efterföljande histologisk analys genom att följa protokollet i avsnitt 4 (protokoll 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna aerticle, presenterar vi de steg som används för att identifiera genen hjärntumör (Brat) som spelar en roll i upprätthållandet av neuronala integritet (t. ex., neuroskydd) hos vuxna flugor17; en metodik som kan användas för att identifiera gener som är involverade i neuroskydd. Vi använde en framåtriktad genetisk metod (strategin beskrivs i figur 1a) för att avskärma genom en samling av kemiskt mutageniserade flugor med hjälp av en klätter analys (den apparat som används för denna analys visas i figur 1b). Bland 235 homozygot linjer, cirka 37% av testade linjer uppvisade en klättring passera hastighet under 50% när testas vid en ålder av 10-12 dagar (figur 1c). 58% av testade linjer uppvisade betydligt olika klättrings beteenden när deras procent klättrings pass Rate (CPR) jämfördes med medelvärdet för klättrings procent svärdet för alla testade linjer med enkelriktad ANOVA (figur 1d). Efterföljande histologisk skärm på 51 av linjerna uppvisar den lägsta klättring passera hastighet visade att 29 av dessa linjer visade synligt utseende av hål i hjärnan neuropil (allt från mild till svår) indikativt för neurodegeneration20 ( Figur 2). Bland de linjer som visar defekt klättring beteende och svår neurodegeneration, vi väljer att kartlägga den mutation som underliggande fenotyp i linje 867 (0% HLR och P värde = 1,36 e-14 baserat på enkelriktad ANOVA). Den neurodegeneration fenotyp i 867 flugor är recessiv eftersom hjärnor heterozygot 867 flugor som har passerat över till en vild typ stam är jämförbara med dessa kontroller (figur 3a). Använda histologi, meiotiska Mapping ligger mutationen i 31-51 cytologiska platser, mellan fenotypiska markörer J (fastnat) och L (LOB) på den andra Drosophila kromosomen. Med hjälp av klätter analys, mappning av brister mellan cytologiska platser 31 och 51 med linjer från Drosophila deficiency kit för kromosom 2L (DK2L)16 kartlade mutationen i en region som omfattar 118 gener (figur 3b; där 867/+ fungerar som kontroll för statistisk analys). Undersökning av hjärnans fenotyp av 867 mutanter som korsas till ytterligare brist linjer (figur 3c) bekräftade att mutationen finns i en region av genomet som inkluderar genen Brat. En fullständig lista över alla ytterligare gener som finns inom dessa borttagningar kan hittas i Flybase genom att klicka på länken i samband med det borttagna segmentet (t. ex. för DF (2L) ED1272 det borttagna segmentet är 37C5-38A2). Baserat på tidigare observationer att Brat mutanter har överflödiga celler i deras hjärnor21, en fenotyp också observerats i 867 mutanter, Brat valdes för DNA-sekvensering analys. Sanger-sekvensering av Brat -genen som innehåller exon-kodning regionen identifierade G/A nukleotidförändring vid position 37 739 av genen (figur 4a), vilket leder till glycin till glutaminsyra (G/E) förändring vid position 470 av Brat protein17 (Figur 4b). Räddnings experiment bekräftar att Brat spelar en nervskyddande roll, eftersom överuttryck av funktionell gen i 867 linjen undertrycker neurodegeneration fenotyp (figur 5a). Dessutom, fenotypen i 867 mutanter förvärras över tid, vilket tyder på att Brat spelar en åldersberoende roll i neuroprotektion17 (Figur 5b).
Figur 1 : Framåt genetisk skärm för att identifiera nya neuroprotektiva gener. (A) skärm strategi. B) Provningsutrustning för klättrings analys. (C) klättring assay resultat för män från 235 homozygot ENU-mutagenized linjer. Cirkeldiagrammet representerar proportionerna av testade fluglinor som faller i 4 grupper av klättring passera priser: 0%, 1-20%, 21-50%, och 51-100%. (D) resultat från 1 Way ANOVA statistisk analys där muterade linjer jämfördes med medelvärdet klättring procent värdet av alla testade linjer. Representerade är siffran för två P-värde kategorier: P < 0,05 (signifikant förändring) och P > 0,05 (ej signifikant förändring).
Figur 2 : Sekundär histologisk skärm. H & E-färgade mitten av hjärnan avsnitt illustrerar, från vänster till höger, ingen neurodegeneration, mild neurodegeneration, och bekräftade neurodegeneration. Totalt 51 homozygot linjer testades genom histologi efter identifiering av kandidater som använder klätter analys. Pilar indikerar hålen i hjärnan indikativt för neurodegeneration. Regionen cirklade av de streckade linjerna visar den svåra Neurodegenration som observerats i linje 867.
Figur 3 : Identifiering av den neuroprotektiva genen Brat efter brist mappning med hjälp av klättrings analysen. (A) visas representativa bilder av H & E-färgade mitten av hjärnan delar av 18-20 dagar gamla w1118 (kontroll), heterozygot 867 (867/+) och homozygot 867 Mutant flugor. B) brist linjen DF (2L) ED1272 (BL_24116) kompletterar inte 867 Mutant fenotyp (svart histogram) baserat på klättrings analysen. Histologisk kontroll visar att DF (2L) ED1272 linje inte kompletterar 867 neurodegeneration fenotyp, medan DF (2L) ED1315 (BL_9269) gör. Grafen representerar medelvärdet och standardavvikelsen för 5 klätter försök för varje linje. Asterisker indikerar signifikans baserat på enkelriktad ANOVA, där medelvärdet för klättrings procenten för varje rad jämfördes med medelvärdet för klättrings procenten på linje 867/+ (grönt histogram). * P < 0,05, * * P < 0,01 och * * * P < 0,001. C) schematisk representation av ytterligare brist linjer som visar icke-komplectering av 867 fenotyp genom histologi. Denna siffra har modifierats från Loewen et al.17; en artikel publicerad under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figur 4 : Punktmutation i Brat genen leder till en aminosyraförändring i spiral-Coil domän av Brat protein. A) Brat gen modell och primers som används för förstärkning och sekvensering av kodnings området. B) DNA-sekvensering av Brat Locus identifierar en nukleotidförändring som leder till en aminosyraförändring i det lindade proteiners spiral område. Denna siffra har modifierats från Loewen et al.17; en artikel publicerad under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figur 5 : Ytterligare analys av Brat mutanter bekräftar sin nervskyddande roll i Drosophila. (A) med hjälp av gal-4 > UAS system22 , neuroblast-specifikt uttryck för den funktionella Brat genen räddar neurodegeneration fenotyp i 867 mutanter. (B) åldersrelaterad neurodegeneration observeras hos 867 mutanter som bär en rapportör gen PCna-GFP. BratCHS motsvarar namnet på Brat allel i linje 867, som hette Cheesehead (CHS). Visat är representativa H & E-färgade mellanhjärnan sektioner av YW (kontroll) och homozygot BratCHS; PCna-GFP flugor av de indikerade åldrarna. Denna siffra har modifierats från Loewen et al.17; en artikel publicerad under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
| Station | Tid | Temperatur | Vakuum/tryck | Lösning |
| 1 | INGEN FÖRDRÖJNING-SNABB START | |||
| 2 | Av | Av | Av | |
| 3 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | 80% EtOH |
| 4 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | 95% EtOH |
| 5 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | 100% EtOH |
| 6 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | 100% EtOH |
| 7 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | 100% EtOH |
| 8 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | Xylener |
| 9 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | Xylener |
| 10 | : 15 | 37 ° c | PÅ/PÅ | Xylener |
| 11 | : 30 | 58 ° c | PÅ/PÅ | Paraffin |
| 12 | : 15 | 58 ° c | PÅ/PÅ | Paraffin |
| 13 | Av | 58 ° c | Av | Paraffin |
| 14 | : 15 | 58 ° c | PÅ/PÅ | Paraffin |
Tabell 1: Rekommenderade programinställningar för automatiserad vävnads processor. Stegen i den ordning som anges här kan användas med en automatiserad vävnads processor för fasta huvuden.
| Reagens | Volym (μL) |
| 10X ExTaq buffert (mg2 + plus) (20 mm) | 2,5 |
| Framåtriktad primer (10 μM) | 2,5 |
| Omvänd primer (10 μM) | 2,5 |
| 2,5 mM dNTPs | 2 |
| Mall-DNA | 2 |
| TaKaRa ex TQ (5 U/μL) | 0,25 |
| Nukleasfritt vatten | 13,25 |
| Total volym | 25 |
Tabell 2: Reagenser som används för PCR-reaktion. Reagenser och respektive volymer som används i PCR-reaktionen för att förstärka den Brat-kodning regionen.
| Steg | Temperatur | Tid |
| 35 cykler | 95 ° c | 15 s |
| 55 ° c | 45 s | |
| 72 ° c | 3 min 10 s | |
| Hålla | 4 ° c | ∞ |
Tabell 3: Termiska cyklings förhållanden som används för PCR. Stegen i den ordning som anges här kan användas för att programmera en termisk apparat med hjälp av reaktionsblandningen som visas i tabell2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framåtriktade genetiska skärmar i Drosophila har varit ett effektivt sätt att identifiera gener som är involverade i olika biologiska processer, inklusive åldersberoende neuroprotektion5,23,24, 25. med hjälp av denna strategi, vi lyckades identifiera Brat som en roman neuroprotektiva genen17.
Ett kritiskt steg i detta protokoll inbegriper korrekt orientering av huvuden (som beskrivs i avsnitt 4.4.3.) för histologisk analys. Dessutom, markörer för den linje som används för meiotiska metafaserna kartläggning bör inte störa fenotyp av den nya mutationen (i denna studie: neurodegeneration). Vi rekommenderade ett första test för att bekräfta att de valda markörer inte orsakar neurodegeneration av sina egna. Till exempel, fastnat (J) orsakar vinge blåsor som möjligen kan störa klättring som är fallet för amyloid föregångare protein (app)-overuttryckande flugor som också har blåsor vingar26. Lob (L) leder till minskad ögon storlek; emellertid, vi observerar inte Central hjärn degeneration och denna markör kan användas för att kartlägga centrala hjärn neurodegeneration. Stift och sternoplural (SP) är också lämpliga att använda, eftersom hjärnor av flugor som transporterar dessa markörer är jämförbara med hjärnor av Wild Type Controls.
En nackdel med den framåtriktade genetiska metodiken i flugor är den tidslängd som krävs för att begränsa DNA-regioner till genen av intresse3,5. Användningen av förbättrade kartläggnings strategier27 tillsammans med tillgången till nästa generations sekvenserings teknik 28 bör möjliggöra ännu enklare identifiering av mutationer i samband med fenotyper av intresse. Framåt genetiska skärmar kan vara arbetsintensiva. Till exempel, histologi bekräftelse, som analyser direkt för neurodegeneration i hjärnan, ensamt kräver en avsevärd tid. Detta tillvägagångssätt kommer dock att bli mycket svårare och dyrare att utföra i däggdjurs modeller, vilket inte nödvändigtvis medger omfattande genetiska studier. Kemiska mutagenes-skärmar är fördelaktiga eftersom identifieringen av punktmutationer kan ge kritisk information om funktionen hos de drabbade genernas produkter. Identifieringen av en punktmutation som orsakar en aminosyraförändring i en bevarad domän av Brat-proteinet (figur 4b) illustrerar betydelsen av det lindade området för detta trim-NHL-protein i neuroprotektion18. Klättrings analysen, som mäter rörelse beteende, är förvisso fördelaktigt genom att tillåta snabb testning av ett stort antal flugor för defekter i rörligheten, också ofta sett i människans neurodegeneration25. Denna analys kan också utföras i en annan skärm inställning som genombred in vivo RNA-interferens (RNAi) skärm som kan användas för att identifiera nervskyddande gener. Även om vi minskade avståndet mellan botten av testkammaren och passerar linjen från 8 cm10 till 5 cm för att ställa in en strängare passerar i den nuvarande studien, låg klättring priser inte spegla neurodegeneration för stort antal linjer. Neurodegeneration kan bli uppenbara efter uppkomsten av beteendemässiga defekter, vilket innebär att flugor kan behöva åldras längre innan vakuoler visas. En annan möjlighet är att de motoriska defekter vi Observera i vissa linjer är inte på grund av defekt neurologisk funktion utan snarare att muskelsvaghet eller mer allmänt unfitness av flugorna. Dessutom är det möjligt att vi saknar potentiella kandidater, där klätter defekter inte manifesteras vid yngre ålder (t. ex. 10 dagar gamla) utan snarare bli framträdande senare i livet. Denna screening strategi skulle säkerligen kunna tillämpas för att identifiera åldersberoende gener, vilket eliminerar gener i samband med potentiella defekter av neurala utveckling. Det protokoll som presenteras här kan justeras beroende på den önskade sannolikheten för att kandidat linjer ska innehålla den muterade genen som är inblandad i neuroskydd. Att sänka tröskeln för passerande ränta direkt är ett annat sätt att uppnå samma resultat. Dessa kandidater skulle teoretiskt uppvisar större neurodegeneration, vilket skulle kunna spara tid och resurser under bekräftelse och kartläggning.
I allmänhet beskriver protokollet ett enkelt sätt att avskärma för neurodegeneration och därefter identifiera neuroprotektiva gen kandidater. Denna genetiska tillvägagångssätt är inte begränsat till beteende och histologiska analyser som beskrivs här, och kan också användas för att skärmen för andra fenotyper som temperaturkänsliga (TS) förlamning, äggläggning eller fertilitet fenotyper, bara för att citera några. Till exempel, Drosophila TS-paralytiska mutanter är kända för att berikas för neurodegeneration29 och kan utgöra en ytterligare källa för identifiering av neuroprotektiva gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är särskilt tacksamma för Dr Barry Ganetzky, i WHO ' s Lab den genetiska skärmen utfördes, vilket möjliggör identifiering och karakterisering av Brat som en nervskyddande gen. Vi tackar Dr Steven Robinow för vänligt tillhandahålla insamling av ENU-mutagenized flugor som används i den genetiska skärmen som presenteras i denna artikel. Vi tackar medlemmarna i ganetzky Lab, DRS. Grace Boekhoff-Falk och David wassarman för hjälpsamma diskussioner under hela varaktigheten av detta projekt, Ling Ling Ho och Bob kreber för tekniskt stöd, Dr Aki Ikeda för användning av hans mikrotomen anläggning vid University of Wisconsin och Dr. Kim Lackey och den optiska analys anläggningen vid University of Alabama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al.
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).
