Summary
Vi præsenterer en protokol ved hjælp af en fremadrettet genetisk tilgang til skærmen for mutanter udviser neurodegeneration i Drosophila melanogaster. Det indeholder en klatring assay, histologi analyse, genkort lægning og DNA sekventering til sidst identificere nye gener i forbindelse med processen med neuroprotection.
Abstract
Der er meget at forstå om udbrud og progression af neurodegenerative sygdomme, herunder de underliggende gener ansvarlige. Forward genetisk screening ved hjælp af kemiske mutagener er en nyttig strategi for kortlægning af mutant fænotyper til gener blandt Drosophila og andre modelorganismer, der deler bevaret cellulære veje med mennesker. Hvis det muterede gen af interesse ikke er dødelig i tidlige udviklingsmæssige stadier af fluer, kan en klatring analyse udføres til skærmen for fænotypiske indikatorer for nedsat hjernens funktion, såsom lav klatring satser. Efterfølgende kan der udføres sekundær histologisk analyse af hjernevæv for at verificere den neuroprotektive funktion af genet ved at score neurodegeneration fænotyper. Genkortlægnings strategier omfatter meiotisk og mangel kortlægning, der er afhængige af disse samme assays kan efterfølges af DNA sekventering at identificere mulige nukleotid ændringer i genet af interesse.
Introduction
Neuroner er for det meste post-mitotisk og ude af stand til at dividere1,2. I de fleste dyr, neuroprotektive mekanismer eksisterer for at opretholde disse celler i hele organismens levetid, især i alderdommen, når neuroner er mest sårbare over for skader. Gener underliggende disse mekanismer kan identificeres i mutanter udviser neurodegeneration, en fænotypisk indikator for tab af neuroprotection, ved hjælp af en Forward genetiske protokol. Fremad genetiske skærme, der anvender kemiske mutagener såsom ethylmethanesulfonat (EMS) eller N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU), er særligt nyttige på grund af de tilfældige punktmutationer, de inducerer, hvilket resulterer i en iboende upartisk tilgang, der har kastet lys over talrige gen funktioner i eukaryote model organismer3,4,5 (i modsætning, X-ray mutagenese skaber DNA-pauser og kan resultere i omorganisering snarere end punktmutationer6).
Den fælles frugtflue Drosophila melanogaster er et ideelt emne for disse skærme på grund af sin høje kvalitet, godt kommenteret genom sekvens, dens lange historie som en model organisme med højt udviklede genetiske værktøjer, og mest væsentligt, dens fælles evolutionær historie med mennesker7,8. En begrænsende faktor i anvendeligheden af denne protokol er tidlig dødelighed forårsaget af de muterede gener, som ville forhindre testning i alderdommen9. Men for ikke-dødelige mutationer, en klatring assay, som udnytter negative geotaxis, er en simpel, men omfattende, metode til kvantificering af nedsat motorisk funktion10. For at udstille tilstrækkelig bevægelses reaktivitet, er fluer afhængige af neurale funktioner for at bestemme retningen, fornemme dens position og koordinere bevægelsen. Fluens manglende evne til at klatre tilstrækkeligt i respons på stimuli kan derfor indikere neurologiske defekter11. Når en bestemt defekt klatring fænotype er identificeret, yderligere testning ved hjælp af en sekundær skærm, såsom histologisk analyse af hjernevæv, kan bruges til at identificere neurodegeneration i klatring-defekte fluer. Efterfølgende genkort lægning kan derefter bruges til at afsløre genomområdet på kromosom, der bærer det defekte neuroprotektive gen af interesse. For at indsnævre det kromosomale område af interesse, kan meiotisk kortlægning ved hjælp af mutant flyve linjer, der transporterer dominerende markørgener med kendte steder på kromosom, udføres. Markør generne tjener som referencepunkt for mutationen, da hyppigheden af rekombination mellem to loci giver en målelig afstand, der kan bruges til at kort sætte den omtrentlige placering af et gen. Endelig skaber passage af de mutante linjer med linjer, der medfører afbalancerede mangler på det meiotisk kortlagte kromosomale område af interesse, en komplementerings test, hvor det genfundne gen kan verificeres, hvis dens kendte fænotype udtrykkes5. Polymorfe nukleotidsekvenser i det identificerede gen, som muligvis resulterer i en ændret aminosyresekvens, kan evalueres ved at sekvente genet og sammenligne det med Drosophila genom-sekvensen. Efterfølgende karakterisering af genet af interesse kan omfatte afprøvning af yderligere mutant alleler, mutation redning eksperimenter og undersøgelse af yderligere fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse og ældning af fluer
- Få eller Generer6 en samling Drosophila mutanter, der vil blive brugt til den genetiske skærm. Her anvendes ENU-mutagenicerede linjer, der er knyttet til det andet kromosom og afbalanceret over CYO .
- Amplify eksperimentelle genotype linjer i en inkubator sat til 25 °C, 12 h lys/mørk cyklus på cornmeal-melasse medium.
- Indsamle omkring 20 homozygot afkom mellem 0-2 dage af voksne eclosion fra hver eksperimentel genotype. Eliminer sexbias ved konsekvent at indsamle enten mandlige eller kvindelige fluer.
- Alder fluerne på cornmeal-melasse medium som ønsket ved 29 °C, flipping hætteglassene hver 2-3 dage for at opretholde fluer på friske fødevarer, som de alder. På skærmen præsenteret her, fluer blev alderen for 10-12 dage.
- Saml en klatring assay test kammer ved hjælp af to hætteglas og tape som tidligere beskrevet10. Hætteglassene skal tilsluttes i begge åbne ender. Brug en lineal til at markere en 5 cm linje i den ene ende af kammeret.
2. protokol 1: klatring assay (tilpasset fra Ali et al.10)
- Validere klatring assay. I denne undersøgelse, teste klatring assay baseret på tidligere beskrevne metode ved Ali et al.10, ved hjælp af elavC155> UAS-TauR406W (udstiller lavere klatring pass satser) og elavC155> UAS-gfp ( kontrol) og ElavC155≫ UAS-mcherry (Control) flyver.
- Flip fluer i en test kammer, en linje ad gangen (brug ikke CO2 anæstesi) og give dem mulighed for at inddrive i 5 min. Hvis testning sker på forskellige dage, udføre analysen på samme tidspunkt af dagen. I denne undersøgelse blev alle klatre assays udført om eftermiddagen for at kontrollere for cirkadiske virkninger på bevægelses12.
Bemærk: Undgå at udsætte fluerne for direkte sollys ved testning; Dette vil forstyrre deres evne til at klatre. - Tryk med magt på kammeret (markeret side ned) på en musemåtte placeret på en fast overflade 3 gange, så alle fluer begynder analysen i bunden. Observere flyve bevægelse over en periode på 10 s.
- Optag antallet af fluer, der når eller passerer 5 cm linje inden for denne tid, samt det samlede antal fluer testet. Gentag protokollen, vent 1 min mellem hvert forsøg, for et minimum af 3 prøvetid replikater per linje.
Bemærk: I nærværende undersøgelse flyver hvert hætteglas mellem 2 og 19 til den indledende screening (hanfluer) og mellem 6 og 21 fluer for at analysere den mutante mangelanalyse af krydsede kvindelige linjer (afsnit 5,3.).
3. protokol 2: udvælgelse af Drosophila stammer til yderligere analyse
- Indtast klatring analysedata i Microsoft Excel eller lignende software og beregne klatring pass sats for hver linje over alle replikater som en procentdel.
-
Udfør statistisk analyse for at detektere mutant linjer, der afviger betydeligt fra den gennemsnitlige klatre procentværdi af alle linjer ved hjælp af R-softwarepakken13.
- Læs i datafiler, der er kureret for R-(. csv-eller. txt-filer med en kolonne for hver variabel eller faktor, og rækker, der repræsenterer de specifikke værdier).
Bemærk: Her blev data for hanner (Initial assay) og hunner (linje 867 krydsede til mangel linjer) opført i separate. xlsx-ark som to kolonner, en hvor rækkerne i kolonnen identificerer den mutante linje, og hvor mange gange analysen blev replikeret, og den anden, hvor rækkerne repræsenterer den gennemsnitlige klatring succes (som en procentdel) for hver replikat hætteglas med fluer. - Læs dataene i R ved hjælp af følgende kode:
Mali <-Read. csv (".. /male_init.csv ")
femdef <-Read. csv (".. /fem_def_cross.csv ")
Bemærk: ".." I stien mapper er absolutte stier fra rodmappen på brugerens computer og skal specificeres af den enkelte bruger for deres computers mappestier. - Udfør lineær modellering
- Udfør dummy variabel regression med LM -funktionen i R. For den indledende analyse af mutant linjer, evaluere betydningen af faktor niveau effekter (mutant linjer) på procent klatring succes mod Grand Mean for en nul gennemsnitlig centreret responsvariabel (procent succes).
Bemærk: "-1" i slutningen af LM -funktionens kald i afsnit 3.2.3.2. fjerner skæring og giver os mulighed for at teste alle faktor niveauer mod nul gennemsnit centreret gennemsnit af procent klatring pass sats. - Udskriv resultaterne på skærmen ved hjælp af R- sumfunktionen :
mali_anova <-LM (skala (Mali $ P_Success) ~ Mali $ Mutant_line-1)
Resumé (mali_anova) - Brug kontrollinjer (hvis de er til stede) som udgangspunkt for at afprøve faktor niveau-effekter mod brug af følgende R-kode: x <-relevel (femdef $ Mutant_line, Ref = "a867_plus")
femdef_anova <-LM (femdef $ P_success ~ x)
Resumé (femdef_anova)
Bemærk: Den første kodelinje genbestiller faktor niveauerne, så den negative kontrol linje bliver til den baseline skæring, som alle andre faktor niveauer (mutant linjer) testes imod med de indbyggede t-tests i LM -funktionen.
- Udfør dummy variabel regression med LM -funktionen i R. For den indledende analyse af mutant linjer, evaluere betydningen af faktor niveau effekter (mutant linjer) på procent klatring succes mod Grand Mean for en nul gennemsnitlig centreret responsvariabel (procent succes).
- Læs i datafiler, der er kureret for R-(. csv-eller. txt-filer med en kolonne for hver variabel eller faktor, og rækker, der repræsenterer de specifikke værdier).
- Vælg en tærskel for kandidat linjer afhængigt af alder på tidspunktet for testen. For at bestemme tærsklen, udføre en foreløbig test på den ønskede alder ved hjælp af kendte mutanter, der udviser neurodegeneration og lav klatring pass satser i forhold til vildtype, kontrol fluer10.
Bemærk: En forbipasserende sats under 50% kan være passende for 10 dage gamle fluer som tidligere rapporteret for Drosophila Lines overudtrykker den menneskelige neurodegeneration-relaterede gen Tau i nervesystemet10. Ældre fluer bør have en højere passerer sats tærskel, da de forventes at udvise nedsat bevægelse, dermed øget neurodegeneration.
4. protokol 3: histologi analyse
- Iført handsker, bryde flyve hoveder med en kirurgisk klinge efter klatring assay og bruge en pensel til forsigtigt placere dem i 1 mL af Carnoys fiktivt (6:3:1 af 100% EtOH: chloroform: iseddike) i en 1,5 mL mikro centrifuge tube O/N ved 4 °C. Sørg for, at hovederne synker i fiktionativ opløsning.
- Den fikative opløsning udskiftes den følgende dag med 1 mL 70% EtOH, og prøverne holdes stadig ved 4 °C ved fremtidig analyse.
Bemærk: Protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette trin. - Placer hovederne fra trin 4,2. højst fem pr. mikrobiopsi kassette. Anbring straks kassetterne i en beholder fyldt med 70% EtOH. Beholderen opbevares ved 4 °C inden afsendelse til en histologi facilitet til forarbejdning og paraffin indlejring af hovederne. Hvis udstyr til vævs behandling og-integrering er tilgængeligt, Følg trin 4,4.
- Integrer hovederne i paraffin til mikrotomskæring:
- Følg programindstillingerne for en automatiseret vævs behandlings maskine i den rækkefølge, der er vist i tabel 1 , for at dehydrere, rydde og infiltrere med paraffin hovederne.
- Prøverne overføres til metal base forme, der passer til kassetten ved hjælp af paraffin opvarmet ved 60 °C ved hjælp af en paraffin indlejrings Station.
- Orientere hovederne (Antero-posterior orientering mod toppen) i bunden skimmel ved hjælp af fine tang til at tillade korrekt visualisering af hjernevæv efter skæring. Dette kan gøres ved opvarmning af paraffin ved 60 °C og om nødvendigt omplacering af hovederne.
Bemærk: Metal forme kan erstattes af engangs-base forme. - Placer kassetten på toppen af den tilsvarende bund form, og Flyt forsigtigt disse til den nedkølede side af paraffin integrerings stationen (4 °C). Vent, indtil blokken hærder, før du fjerner den fra stationen.
- Fjern blokken form formen ved forsigtigt dissociere formen fra kassetten.
- Trim hver paraffin blok tidligere skæring for at minimere overfladen, der vil blive skåret.
- Sæt mikrotomen til at skære 5 μm sektioner af hver blok.
- Placer det sektionerede paraffin bånd, der indeholder vævet i et opvarmet vandbad (35 °C), i højst 5 minutter.
- Sænk en poly-lysin belagt slide (hjælper med at bevare vævet) i det opvarmede vandbad, placere det sektionsopdelte bånd på diaset ved hjælp af træ applikatorer. Lad lysbilledet lufttørre O/N ved stuetemperatur.
- Opvarm lysbillederne i 15 minutter ved 63 °C ved hjælp af en glide varmer.
- Placer diasene på en slide farvnings stativ og bejdsning med hematoxylinlegemer og eosin (H & E) under en stinkhætte ved at respektere følgende trin.
- Placer stativet i Histochoice (ikke-toksisk udskiftning af xylen, som hjælper med at fjerne paraffin fra prøven) i 5 min.
- Overfør stativet i en beholder fyldt med Histochoice i 5 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med 100% EtOH 1 i 5 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med 100% EtOH 2 i 5 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med 95% EtOH i 3 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med 70% EtOH i 3 min.
- Overfør stativet i en beholder fyldt med destilleret H2O i 5 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med Harris Hematoxylin til 2-5 min.
- Tag rack ud af Hematoxylin-opløsningen, og Placer den under rindende ledningsvand i 10 minutter.
- Overfør stativet i en beholder fyldt med destilleret vand ved at lave en kort dunk.
- Overfør stativet i en container fyldt med eosin i 1-2 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med 95% EtOH ved at lave en kort dunk.
- Overfør stativet i en container fyldt med 95% EtOH i 5 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med 100% EtOH i 5 min.
- Overfør stativet i en container fyldt med 100% EtOH i 5 min.
- Overfør stativet i en beholder fyldt med Histochoice (eller xylen) i 5-10 min., indtil alle slides er monteret.
- Monter diaset og dæksedlen (24 mm x 60 mm størrelse). Ved hjælp af pincet skal du tage sliden ud af Histochoice-eller xylen-opløsningen og lave en tynd stribe monterings medium på toppen af den. Placer forsigtigt dæksedlen på toppen, og forsøg at undgå dannelsen af bobler.
- Lad monterings mediet på monterede slides hærde O/N under røghætten før analyse.
- Opbevar farvede slides i en æske ved stuetemperatur.
- Kvantificer neurodegeneration ved at se på alle serielle sektioner på diaset ved 20x forstørrelse under et let mikroskop. Undersøg hele hjernen, idet kvalitative notat af størrelse og antallet af vakuoler, der vises i tre på hinanden følgende sektioner.
- Få billeder af repræsentative hjerne sektioner ved omtrent Mid-Brain ved hjælp af et let mikroskop udstyret med billedbehandlingssoftware.
5. protokol 4: Genkort Lægning af recessiv Mmutant fænotype
- Overgå kandidatlinjen til en vildtype kantoner (BL_ 9517) eller en anden vildtype eller isogenseret stamme (f. eks. Oregonr (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) eller YW (BL_ 6599) for at afgøre, om Fænotypen er dominerende eller Recessiv.
Bemærk: resultaterne fra dette trin vil guide de næste trin i tilknytningen. Hvis Fænotypen er recessiv, kan der udføres mangel kortlægning.- Ved hjælp af en pensel, lave et kryds ved at placere i en fødevare indeholdende hætteglas CO2-bedøvet fluer af den mutante linje af interesse (5 hanner) og kantoner linje (10-15 jomfru hunner). Anbring hætteglasset ved 25 °C.
- Saml heterozygot F1 afkom og Gentag klatring og histologi eksperimenter.
- Sammenlign de opnåede resultater med kontrollinjen alene og til de homozygot mutanter. En god indikation af recessiv fænotype vil være, hvis heterozygot mutanter udviser lignende fænotyper som vildtype fluer.
- Udfør meiotisk kortlægning for groft at estimere placeringen af mutationen på det andet kromosom ved hjælp af WGSP-1 J1 L2 PIN1/CYO (BL_3227) eller en tilsvarende stamme med tilknyttede dominerende markører ved kendte cytologiske placering. I dette tilfælde var mutationen tidligere kendt for at være placeret på det andet kromosom.
- Ved hjælp af en pensel, lave et kryds ved at placere i en fødevare indeholdende hætteglas CO2-bedøvet fluer af den mutante linje af interesse (5 hanner) og WGSP-1 J1 L2 PIN1/CYO linje (10 hunner). Anbring hætteglasset ved 25 °C.
Bemærk: Målet med dette kors er at generere heterozygot kvinder, der bærer kromosom med den nye mutation og markør kromosom, som vil rekombinere under meiose6,14. Kvindelige F1 afkom er valgt i stedet for mænd, da rekombination ikke forekommer hos mænd. - Saml mindst 15 jomfru kvindelig afkom, der bærer kromosom med den nye mutation og markør kromosom og krydser dem til 5 hanner fra en balanceret linje, som bærer en anden synlig dominerende markør (f. eks. CYO/SNASCO (BL_2555) eller ækvivalent).
- Saml heterozygot mandlig afkom, der bærer enten SCO eller CYO , og de potentielt rekombinerede kromosom fra korset i trin 5.2.2. og individuelt parre dem til jomfru kvinder fra bestanden transporterer muterede kromosom.
- Afhent afkom fra det sidste kryds, der er beskrevet i trin 5.2.3. og alder fluerne ved 29 °C (i denne undersøgelse fluer var alderen for 10-14 dage).
- Saml hoveder, udføre histologi analyse som beskrevet i protokol 3 og se på slides med hjernen sektioner til at bestemme graden af neuropatologi som beskrevet i trin 4,11. Histologi analyse udføres i stedet for bevægelses analyse på grund af fænotyper, der kan påvirke klatring assay, såsom fast klemte (J), som forårsager væskeophobning i vinger15.
- Ved hjælp af en pensel, lave et kryds ved at placere i en fødevare indeholdende hætteglas CO2-bedøvet fluer af den mutante linje af interesse (5 hanner) og WGSP-1 J1 L2 PIN1/CYO linje (10 hunner). Anbring hætteglasset ved 25 °C.
- Udfør mangel kortlægning på indsnævret region af kromosom at raffinere placeringen af recessiv mutation ved hjælp af klatring assay. Hver mangel linje har en sletning af forskellige områder af kromosomerne, så de kan anvendes til komplementering test.
- Start med store mangler, der spænder over den region, der er identificeret i den meiotiske kortlægning, som derefter kan blive yderligere indsnævret ved brug af mindre mangler. Hvis mangel analysen resulterer i mere end et kandidat gen, anbefales det at anvende RNA-interferens (RNAi) til at målrette mod dem.
- Kryds linjer fra Drosophila -mangel sættet16 for det andet KROMOSOM (DK2L i dette studie) og se efter ikke-komplementering af fænotype af interesse (i denne undersøgelse: klatring pass sats på 8,5%, hvilket svarer til pass sats på homozygot fluer fra linje 867 anvendes som positiv kontrol).
- Bekræft neurodegeneration fænotype ved hjælp af histologi verifikation som beskrevet i afsnit 4 (protokol 3).
6. protokol 5: DNA-sekvensering og-analyse
Bemærk: Husk, at ENU mutagenese introducerer punktmutationer11.
- Design fremad og omvendt primer sekvenser flankere exon-kodning region af brat genet for forstærkning af polymerase kædereaktion (PCR) i regionen af interesse (i tilfælde af linje 867 et DNA-fragment af størrelsen af 3.247 BP forstærkes for sekventering17).
-
Uddrag DNA fra en enkelt flue18 :
- Forsigtigt klemme flue i et 0,5 mL mikro centrifugeglas indeholdende 50 μL squishing buffer (10 mM Tris-CL pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, og 200 μg/mL proteinase K; enzymet skal fortyndes frisk fra en frossen bestand før hver brug) ved hjælp af et P100 eller P200 pipet spids.
- Inkuber i 30 min ved 37 °C
- Du deaktiverer proteinase K ved at anbringe røret ved 95 °C i 2 min.
Bemærk: Det ekstraherede DNA kan opbevares ved 4 °C i flere måneder.
- Udføre PCR-reaktionen ved hjælp af et high-fidelity DNA Taq-polymerase (reagenser og termiske cykel betingelser, der anvendes i dette studie, er vist i tabel 2 og tabel 3) ved at overholde producentens anvisninger og køre PCR-produktet på en 1 % agopstået gel indeholdende Invitrogen SYBR Safe DNA gel Stain, som er et ikke-giftigt alternativ til Ethidium-bromid.
- Afstem båndet med den korrekte størrelse fra gelen med en skalpel, og rens PCR-produktet ved hjælp af Wizard SV gel og PCR Clean-up system (Promega) eller tilsvarende kit, ved at overholde producentens anvisninger.
- Design fremad og reverse primere, der vil blive brugt til DNA-sekvensering for at dække hele regionen af interesse, hvis det er muligt. Sekvens det gelrensede DNA fra det foregående trin for at identificere punktmutationer. Høj nøjagtighed i automatiseret fluorescerende sanger sekvensering kunne opnås for op til 700 BP.
Bemærk: Ex Taq polymerase (TaKaRa) kan bruges til at forstærke PCR-produkter fra genomiske DNA-skabeloner op til 20 kb størrelse. -
Analysér opnåede DNA-sekvenser ved hjælp af en plasmid-redaktør (ApE, af M. Wayne Davis) eller lignende software ved at tilpasse dem og sammenligne dem med de sekvenser, der opnås efter sekventering af den samme genomiske region af en referencestamme (f. eks. oprindeligt mutagenicerede linje).
- Åbn sekvensering af filer med ApE. Som reference, bruge en ApE fil, der indeholder genomisk konsensus sekvens af brat genet downloades i en fasta format fra flybase, eller en fil, der indeholder resultater for sekvens af genetiske baggrundskontrol (f. eks oprindeligt Mutagenicerede Drosophila linje).
- Gå til funktioner, og Juster derefter sekvenser. Brug computerens mus til at vælge alle sekvenser, du vil sammenligne. Husk at angive den referencesekvens, der bruges til denne justering i rullemenuen.
- Undersøg det sekvens afgrænsede område for nukleotidændringer i forhold til reference sekvensen. Hvis det ønskes, skal du gemme justeringen på computeren i. RTF-format ved at klikke på tekstog derefter på Gem.
Bemærk: Hvis der ikke blev identificeret nogen mutationer, ville DNA-sekvensering og analyse protokol blive gentaget med primere beregnet til at inkludere ikke-kodende områder af genet.
7. protokol 6: yderligere analyse af kandidat Genfunktionen
- Udfør rednings eksperimenter i Neuro Blaster for at afgøre, om genet brat er ansvarlig for neurodegeneration phenotype.
- Dobbelt balance a UAS-brat19 og en neuroblast-specifikke worniu-Gal4 (Wor-G4) bestande, der bærer konstrukterne på den tredje kromosom, samt 867-linjen, som er mutant for genet brat placeret på den anden Kromosom.
- Lav tre separate Kors ved at placere i tre forskellige fødevare-holdige hætteglas 5 hanner fra UAS-brat, Wor-G4 og 867 linjer og tilføje til hvert sæt af mænd 10-15 jomfru kvinder fra en linje bærer markører og balancere for den anden og tredje kromosomer (SP/CyO; Dr/Tm3, SB; BL_59967).
- Saml 10-15 jomfru hunner fra F1 af hvert kryds med følgende genotyper: +/CYO; UAS-brat/Tm3, SB, +/CYO; Wor-G4/Tm3, SB og 867/CYO; +/TM3, SB og 5 hanner af hver af følgende genotyper: +/SP; UAS-brat/Tm3, SB, +/SP; Wor-G4/Tm3, SB og 867/CYO; +/Dr.
- Kryds collelcted +/CYO; UAS-brat/Tm3, SB Virgin hunner til +/SP; UAS-brat/Tm3, SB mænd; i et separat hætteglas lav et andet kryds med +/CYO; Wor-G4/TM3, SB Virgin hunner til +/SP; Wor-G4/Tm3, SB hanner og derefter i et tredje hætteglas Cross 867/CYO; +/TM3, SB Virgin Females og 867/CYO; +/Dr mænd.
- Fra F1 af hvert af disse Kors, indsamle både hanner og hunner af følgende genotyper: SP/CyO; UAS-brat/Tm3, SB fra første kryds, SP/CYO; Wor-G4/Tm3, SB fra andet kryds og 867/CYO; Dr/Tm3, SB fra det andet Kors.
- Udfør en afsluttende krydsning mellem brødre og søstre indsamlet fra hver F1 afkom for at etablere permanente dobbelt afbalancerede bestande for alle tre linjer.
- Kombiner UAS-brat og Wor-G4 med 867 -mutationen.
- Indsamle tilstrækkeligt antal (~ 20-30 fluer) af Jomfru hunner fra 867/CyO; Dr/Tm3, SB dobbelt balanceret bestand til at udføre to Kors.
- Placer 10-15 jomfru hunner med ~ 5 hanner fra SP/CyO; UAS-brat/Tm3, SB (cross #1) og i et andet hætteglas 10-15 jomfru hunner med ~ 5 SP/CYO; Wor-G4/Tm3, SB mænd.
- Saml brødre og søstre fra F1 af hvert Kors med følgende genotyper: 867/CyO; UAS-brat/Tm3, SB fra cross #1 og 867/CYO; Wor-G4/Tm3, SB fra Cross #2. Brug indsamlet F1 afkom fra hvert Kors til at etablere permanente bestande ved at krydse brødre og søstre mellem dem.
Bemærk: Efter dette sidste trin, bestande for 867/CyO; Af UAS-brat/Tm3, SB og 867/CYO; Wor-G4/Tm3, SB skal genereres.
- Udføre redningsforsøget.
- Saml ~ 15-20 Virgin hunner fra 867/CYO; Wor-G4/Tm3, SB Stock og krydse dem til 5-10 mænd fra bestanden 867/CYO; UAS-brat/Tm3, SB. Som kontrol, krydse ~ 15-20 jomfru kvinder fra 867/CYO; Wor-G4/Tm3, SB og ~ 15-20 Virgin hunner fra 867/CYO; UAS-brat/Tm3, SB- linje til 867/CYO -linjen alene.
Bemærk: 867 fluer bærer en temperaturfølsom allel af brat , og rednings korset skal udføres ved 29 °c. - Saml følgende F1 afkom fra hvert Kors ved omhyggeligt at vælge væk markerede balancere: 867/867; Wor-G4/UAS-brat (redning), 867/867; Wor-G4/+ (kontrol) og 867/867; UAS-brat/+ (kontrol).
- De fluer som ønskes ved 29 °C og udføre histologi analyse på hjerner til at lede efter neurodegeneration ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i afsnit 4 (protokol 3).
- Saml ~ 15-20 Virgin hunner fra 867/CYO; Wor-G4/Tm3, SB Stock og krydse dem til 5-10 mænd fra bestanden 867/CYO; UAS-brat/Tm3, SB. Som kontrol, krydse ~ 15-20 jomfru kvinder fra 867/CYO; Wor-G4/Tm3, SB og ~ 15-20 Virgin hunner fra 867/CYO; UAS-brat/Tm3, SB- linje til 867/CYO -linjen alene.
- Dobbelt balance a UAS-brat19 og en neuroblast-specifikke worniu-Gal4 (Wor-G4) bestande, der bærer konstrukterne på den tredje kromosom, samt 867-linjen, som er mutant for genet brat placeret på den anden Kromosom.
- Udfør aldersafhængig analyse af neurodegeneration i 867 mutanter.
- Saml 867; pcna-GFP- og YW -kontrol fluer, som bærer et reporter-gen (pcna-gfp) og er levedygtige ved 25 °c og udviser både højere penetrans og højere ekspressivitet af neurodegeneration-Fænotypen end 867 alene på dette temperatur17.
- De flyver op til 5, 15 og 25 som beskrevet i afsnit 1,4 og udfører efterfølgende histologi analyse ved at følge protokollen i afsnit 4 (protokol 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne aertikel præsenterer vi de trin, der anvendes til at identificere genet hjernen tumor (brat) som spiller en rolle i vedligeholdelsen af neuronal integritet (f. eks, neuroprotection) i voksne fluer17; en metode, der kan bruges til at identificere gener involveret i neuroprotection. Vi brugte en fremadrettet genetisk tilgang (strategien er skitseret i figur 1a) til at screene gennem en samling af kemisk mutagenicerede fluer ved hjælp af en klatring assay (det apparatur, der anvendes til denne analyse er vist i figur 1b). Blandt 235 homozygot linjer udviste ca. 37% af de testede linjer en klatrings hastighed under 50%, når de blev testet i en alder af 10-12 dage (figur 1c). 58% af de testede linjer udviste markant forskellige klatring adfærd, når deres procent klatring pass rate (CPR) blev sammenlignet med den gennemsnitlige klatring procentværdi af alle testede linjer ved hjælp af envejs ANOVA (figur 1d). Efterfølgende histologiske skærm på 51 af linjerne udviser den laveste klatring pass hastighed afslørede, at 29 af disse linjer viste synlige udseende af huller i hjernen neuropil (spænder fra mild til svær) indikation af neurodegeneration20 ( Figur 2). Blandt de linjer, der viser defekt klatring adfærd og svær neurodegeneration, vælger vi at kort den mutation underliggende fænotype i linje 867 (0% CPR og P værdi = 1.36 e-14 baseret på envejs ANOVA). Neurodegeneration fænotype i 867 fluer er recessiv, fordi hjernen af heterozygot 867 fluer, der er blevet overkrydset til en vildtype stamme er sammenlignelige med disse af kontrol (figur 3a). Ved hjælp af histologi, meiotisk kortlægning ligger mutationen i de 31-51 cytologiske steder, mellem fænotypiske markører J (fastklemt) og L (lap) på den anden Drosophila kromosom. Ved hjælp af klatring analyse, mangel kortlægning mellem cytologiske steder 31 og 51 med linjer fra Drosophila mangel kit til kromosom 2L (DK2L)16 kortlagt mutationen i en region, der omfatter 118 gener (figur 3b; hvor 867/+ fungerer som kontrol for den statistiske analyse). Undersøgelse af hjernens fænotype af 867 mutanter krydsede til yderligere mangel linjer (figur 3c) bekræftede, at mutationen er indeholdt i en region af genomet, der omfatter genet brat. En komplet liste over alle yderligere gener indeholdt i disse sletninger kan findes i flybase ved at klikke på linket i forbindelse med det slettede segment (f. eks. for DF (2L) ED1272 det slettede segment er 37C5-38A2). Baseret på tidligere observationer, at brat mutanter har overtallige celler i deres hjerner21, en fænotype også observeret i 867 mutanter, brat blev udvalgt til DNA-sekvensering analyse. Sanger sekvens af brat genet indeholdende exon-kodning region identificeret g/A nucleotid ændring på position 37.739 af genet (figur 4a), fører til glycin til glutaminsyre (G/E) ændring på position 470 af brat protein17 (Figur 4b). Rednings eksperimenter bekræfter, at brat spiller en neuroprotektive rolle, da overekspression af det funktionelle gen i 867-linjen undertrykker neurodegeneration-Fænotypen (figur 5a). Desuden, fænotype i 867 mutanter forværres over tid, tyder på, at brat spiller en aldersafhængig rolle i neuroprotection17 (figur 5b).
Figur 1 : Fremad genetisk skærm for at identificere nye neuroprotektive gener. (A) skærm strategi. B) udstyr til afprøvning af klatring. C) testresultater for mænd fra 235 HOMOZYGOT ENU-mutagenicerede linjer. Cirkeldiagram repræsenterer proportionerne af testede flyve linjer, der falder i 4 grupper af klatring pass satser: 0%, 1-20%, 21-50%, og 51-100%. D) resultater fra 1-vejs ANOVA statistisk analyse, hvor mutant linjer blev sammenlignet med den gennemsnitlige klat procentværdi af alle testede linjer. Repræsenteret er tallet for to P-værdi kategorier: P < 0,05 (væsentlig ændring) og P > 0,05 (ikke signifikant ændring).
Figur 2 : Sekundær histologi skærm. H & E-farvede Mid-hjerne sektioner, der illustrerer, fra venstre mod højre, ingen neurodegeneration, mild neurodegeneration, og bekræftet neurodegeneration. I alt 51 homozygot linjer blev genoptestet af histologi efter identifikation af kandidater ved hjælp af klatring assay. Pilene angiver hullerne i hjernen, som indikerer neurodegeneration. Den region, som er cirklet af de stiplede linjer, viser den svære neurodegenration, som er observeret i linje 867.
Figur 3 : Identifikation af det neuroprotektive gen brat efter mangel kortlægning ved hjælp af klatring assay. (A) vist er repræsentative billeder af H & E-farvede Mid-Brain sektioner af 18-20 dage gamle w1118 (kontrol), heterozygot 867 (867/+) og homozygot 867 mutant fluer. B) mangel linjen DF (2l) ED1272 (BL_24116) supplerer ikke 867 mutant fænotype (sort histogram) baseret på klatre analysen. Histologisk verifikation viser, at DF (2L) ED1272 linje ikke supplerer 867 neurodegeneration phenotype, mens DF (2L) ED1315 (BL_9269) gør. Graf repræsenterer middel og standardafvigelse på 5 klatring forsøg for hver linje. Asterisker indikerer signifikans baseret på en-vejs ANOVA, hvor den gennemsnitlige klatring procentværdi af hver linje blev sammenlignet med den gennemsnitlige klatring procentværdi af linje 867/+ (grønne histogram). * P < 0,05, * * P < 0,01 og * * * P < 0,001. C) skematisk gengivelse af supplerende mangel linjer, der viser, at den 867 fænotype ikke supplerer hinanden ved histologi. Dette tal er blevet ændret fra Loewen et al.17; en artikel offentliggjort under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figur 4 : Punkt mutation i brat gen fører til en aminosyre ændring i den coiled-Coil domæne af brat protein. A) brat genmodel og primere, der anvendes til forstærkning og sekventering af kodnings området. (B) DNA-sekvensering af brat locus identificerer en nukleotid ændring, der fører til en aminosyre ændring i den coiled Coil domæne af brat protein. Dette tal er blevet ændret fra Loewen et al.17; en artikel offentliggjort under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figur 5 : Yderligere analyse af brat mutanter bekræfter sin neuroprotektive rolle i Drosophila. A) anvendelse af gal-4 > UAS system22 , neuroblast-specifik ekspression af det funktionelle brat gen redder neurodegeneration fænotype i 867 mutanter. (B) aldersbetinget neurodegeneration observeres i 867 mutanter, der bærer en reporter gen PCNA-gfp. bratCHS svarer til navnet på brat allelen i linje 867, der blev navngive cheesehead (CHS). Vist er repræsentative H & E-farvede hjernen sektioner af YW (kontrol) og homozygot bratCHS; pcna-gfp fluer af de angivne aldre. Dette tal er blevet ændret fra Loewen et al.17; en artikel offentliggjort under Creative Commons Attribution 4,0 International License.
| Station | Tid | Temperatur | Vakuum/tryk | Løsning |
| 1 | INGEN FORSINKELSE-HURTIG START | |||
| 2 | Ud | Ud | Ud | |
| 3 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 80% EtOH |
| 4 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 95% EtOH |
| 5 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 100% EtOH |
| 6 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 100% EtOH |
| 7 | : 15 | 37 °C | ON/ON | 100% EtOH |
| 8 | : 15 | 37 °C | ON/ON | Xylener |
| 9 | : 15 | 37 °C | ON/ON | Xylener |
| 10 | : 15 | 37 °C | ON/ON | Xylener |
| 11 | : 30 | 58 °C | ON/ON | Paraffin |
| 12 | : 15 | 58 °C | ON/ON | Paraffin |
| 13 | Ud | 58 °C | Ud | Paraffin |
| 14 | : 15 | 58 °C | ON/ON | Paraffin |
Tabel 1: Anbefalede programindstillinger for automatiseret vævs processor. Trinnene i den rækkefølge, der er angivet her, kan bruges sammen med en automatiseret vævs processor til faste hoveder.
| Reagens | Volumen (μL) |
| 10x ExTaq buffer (mg2 + plus) (20 mm) | 2,5 |
| Fremad primer (10 μM) | 2,5 |
| Omvendt primer (10 μM) | 2,5 |
| 2,5 mM dNTPs | 2 |
| Template DNA | 2 |
| TaKaRa ex tq (5 e/μL) | 0,25 |
| Nuklease frit vand | 13,25 |
| Samlet mængde | 25 |
Tabel 2: Reagenser, der anvendes til PCR-reaktion. Reagenser og respektive volumener, der anvendes i PCR-reaktionen, til at forstærke bratkodnings området.
| Trin | Temperatur | Tid |
| 35 cyklusser | 95 °C | 15 s |
| 55 °C | 45 s | |
| 72 °C | 3 min 10 s | |
| Holde | 4 °C | ∞ |
Tabel 3: Termiske cykelforhold, der anvendes til PCR. Trinene i den rækkefølge, der er anført her, kan bruges til at programmere en termisk variator ved hjælp af reaktionsblandingen vist i tabel2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremad genetiske skærme i Drosophila har været en effektiv metode til at identificere gener, der er involveret i forskellige biologiske processer, herunder aldersbetinget neuroprotection5,23,24, 25. ved hjælp af denne strategi, vi havde succes med at identificere brat som en roman neuroprotektive gen17.
Et kritisk trin i denne protokol indebærer korrekt orientering af hoveder (som beskrevet i afsnit 4.4.3.) for histologi analyse. Desuden bør markører for den linje, der anvendes til meiotisk kortlægning ikke forstyrre Fænotypen af den nye mutation (i dette studie: neurodegeneration). Vi anbefalede en indledende test for at bekræfte, at de valgte markører ikke forårsager neurodegeneration af deres egne. For eksempel, fast klemte (J) forårsager vinge vabler, der muligvis kan forstyrre klatring, som det er tilfældet for amyloid forløber protein (app)-overekspression fluer, der også har blister vinger26. Lobe (L) fører til reduktion i øjen størrelse; vi observerer dog ikke central hjernens degeneration, og denne markør kan bruges til at kort holde central hjernens neurodegeneration. PIN og Sternoplural (SP) er også passende at bruge, som hjerner af fluer transporterer disse markører er sammenlignelige med hjerner af vilde type kontroller.
En ulempe ved den fremad genetiske metode i fluer er længden af den tid, der kræves for at indsnævre regioner af DNA til det gene af interesse3,5. Brugen af forbedrede kortlægning strategier27 sammen med tilgængeligheden af næste generation sekvensering teknologier 28 bør tillade endnu lettere identifikation af mutationer forbundet med fænotyper af interesse. Fremad genetiske skærme kan være arbejdskraftintensive. For eksempel, histologi bekræftelse, som assays direkte for neurodegeneration i hjernen, alene kræver en betydelig mængde tid. Denne fremgangsmåde vil imidlertid være langt vanskeligere og dyrere at udføre i pattedyrs modeller, hvilket ikke nødvendigvis giver mulighed for omfattende genetiske undersøgelser. Kemiske mutagenicese skærme er fordelagtige, fordi identifikationen af punktmutationer kan give kritiske oplysninger om funktionen af de berørte gener ' produkter. Identifikationen af en punkt mutation, der forårsager en aminosyre ændring i et bevaret domæne af brat proteinet (figur 4b) illustrerer vigtigheden af det coiled-Coil domæne af dette trim-NHL-protein i neuroprotection18. Klatring assay, som måler bevægelsesadfærd, er helt sikkert fordelagtigt ved at tillade hurtig testning af et stort antal fluer for defekter i mobilitet, også ofte set i menneskelig neurodegeneration25. Denne analyse kan også udføres i en anden skærmindstilling såsom genom-Wide in vivo RNA interferens (RNAi) skærm, der kunne bruges til at identificere neuroprotektive gener. Selv om vi faldt afstanden mellem bunden af testkammeret og den forbipasserende linje fra 8 cm10 til 5 cm for at sætte en strengere forbipasserende sats i den nuværende undersøgelse, lav klatring satser ikke spejl neurodegeneration for et stort antal linjer. Neurodegeneration kan blive tydelig efter fremkomsten af adfærdsmæssige defekter, hvilket betyder, at fluer muligvis skal ældes i længere tid, før vakuoler vises. En anden mulighed er, at bevægeapparatet defekter vi observere i visse linjer er ikke på grund af defekte neurologiske funktion, men snarere at muskelsvaghed eller mere generel uegnethed af fluer. Derudover er det muligt, at vi mangler potentielle kandidater, hvor klatring defekter ikke manifesterer sig i yngre alder (f. eks 10 dage gamle), men snarere blive fremtrædende senere i livet. Denne screening strategi kunne helt sikkert anvendes til at identificere aldersafhængige gener og dermed eliminere gener, der er forbundet med potentielle defekter i neurale udvikling. Den protokol, der præsenteres her, kan justeres afhængigt af den ønskede sandsynlighed for, at kandidat linjer indeholder det muterede gen, der er involveret i neuroprotection. Et andet middel til at opnå samme resultat er at sænke tærsklen for grænsepassage direkte. Disse kandidater ville teoretisk udvise større neurodegeneration, hvilket kunne spare tid og ressourcer under bekræftelse og kortlægning.
Generelt beskriver protokollen en enkel måde at screene for neurodegeneration og efterfølgende identificere neurobeskyttende genkandidater. Denne genetiske tilgang er ikke begrænset til den opførsel og histologiske assays beskrevet her, og kan også bruges til at screene for andre fænotyper som temperaturfølsomme (TS) lammelse, æglægning eller fertilitet fænotyper, bare for at citere et par stykker. For eksempel, Drosophila TS-paralytiske mutanter er kendt for at være beriget til neurodegeneration29 og kunne repræsentere en ekstra kilde til identifikation af neuroprotektive gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er især taknemmelig for Dr. Barry Ganetzky, i who's Lab den genetiske skærm blev udført, gør det muligt at identificere og karakterisering af brat som en neuroprotektive gen. Vi takker Dr. Steven Robinow for venligt at give indsamlingen af ENU-mutagenicerede fluer, der anvendes i den genetiske skærm præsenteret i denne artikel. Vi takker medlemmerne af Ganetzky Lab, DRs. Grace Boekhoff-Falk og David Wassarman for nyttige diskussioner under hele projektets varighed, ling ling Ho og Bob Kreber for teknisk assistance, Dr. Aki Ikeda for brug af hans mikrotome facilitet på University of Wisconsin og Dr. Kim Lackey og den optiske analyse facilitet ved University of Alabama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , Foundation for Statistical Computing. (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).
