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Genetics

विवो फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर में उपन्यास न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान करने के लिए

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59720
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alabama, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

हम ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टरमें न्यूरोडिजेनरेशन का प्रदर्शन करने वाले म्यूटेंट के लिए स्क्रीन के लिए एक आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं . यह एक चढ़ाई परख, ऊतक विज्ञान विश्लेषण, जीन मानचित्रण और डीएनए अनुक्रमण अंततः neuroprotection की प्रक्रिया से संबंधित उपन्यास जीन की पहचान शामिल है.

Abstract

वहाँ की शुरुआत और neurodegenerative रोगों की प्रगति के बारे में समझने के लिए बहुत कुछ है, जिम्मेदार अंतर्निहित जीन सहित. आगे आनुवंशिक स्क्रीनिंग रासायनिक mutagens का उपयोग कर Drosophila और अन्य मॉडल जीवों है कि मानव के साथ संरक्षित सेलुलर रास्ते साझा के बीच जीन के लिए उत्परिवर्ती phenotypes मानचित्रण के लिए एक उपयोगी रणनीति है. यदि ब्याज का उत्परिवर्तित जीन मक्खियों के प्रारंभिक विकास के चरणों में घातक नहीं है, एक चढ़ाई परख कम चढ़ाई दरों के रूप में कम मस्तिष्क कामकाज के phenotypic संकेतकों के लिए स्क्रीन करने के लिए आयोजित किया जा सकता है. बाद में, मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यमिक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण किया जा सकता है ताकि neurodegeneration phenotypes स्कोरिंग द्वारा जीन के न्यूरोप्रोटेक्टिव समारोह सत्यापित करने के लिए. जीन मानचित्रण रणनीतियों meiotic और कमी मानचित्रण है कि इन एक ही परख पर भरोसा डीएनए अनुक्रमण द्वारा पीछा किया जा सकता है ब्याज के जीन में संभव न्यूक्लिओटाइड परिवर्तन की पहचान शामिल हैं.

Introduction

तंत्रिकाएं माइटोटिक के बाद के अधिकांश भाग के लिए हैं और1,2को विभाजित करने में असमर्थ हैं। ज्यादातर जानवरों में, न्यूरोप्रोटेक्टिव तंत्र जीव की उम्र भर में इन कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए मौजूद हैं, विशेष रूप से बुढ़ापे में जब न्यूरॉन्स सबसे नुकसान की चपेट में हैं. इन तंत्र अंतर्निहित जीन neurodegeneration का प्रदर्शन म्यूटेंट में पहचाना जा सकता है, neuroprotection के नुकसान के लिए एक phenotypic सूचक, एक आगे आनुवंशिक प्रोटोकॉल का उपयोग कर. एथिल मेथेनसल्फोनेट (ईएमएस) या एन-एथिल-एन-नाइटोसौरिया (ईएनयू) जैसे रासायनिक म्यूटेजेन्स का उपयोग करने वाली फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन विशेष रूप से यादृच्छिक बिंदु उत्परिवर्तनों के कारण उपयोगी होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप स्वाभाविक रूप से निष्पक्ष दृष्टिकोण होता है जिसके परिणामस्वरूप प्रकाश डाला जाता है। यूकैरियोटिक मॉडल जीवों3,4,5 ( इसके विपरीत, एक्स-रे मटजनन में कई जीन कार्य डीएनए ब्रेक बनाता है और बिंदु उत्परिवर्तन6के बजाय पुनर्व्यवस्थित हो सकता है।

आम फल मक्खी Drosophila melanogaster अपनी उच्च गुणवत्ता के कारण इन स्क्रीन के लिए एक आदर्श विषय है, अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम अनुक्रम, अत्यधिक विकसित आनुवंशिक उपकरणों के साथ एक मॉडल जीव के रूप में अपने लंबे इतिहास, और सबसे महत्वपूर्ण, इसके साझा मानव के साथ विकास का इतिहास7,8. इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता में एक सीमित कारक उत्परिवर्तित जीनों के कारण जल्दी घातक है, जो9साल की उम्र में परीक्षण को रोक देगा। हालांकि, गैर घातक उत्परिवर्तनों के लिए, एक चढ़ाई परख, जो नकारात्मक geotaxis का लाभ लेता है, एक सरल है, हालांकि व्यापक, बिगड़ा मोटर कामकाज10की मात्रा निर्धारित करने की विधि. पर्याप्त चलन प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के लिए, मक्खियों दिशा निर्धारित करने के लिए तंत्रिका कार्यों पर निर्भर करते हैं, अपनी स्थिति भावना, और आंदोलन समन्वय. इसलिए उत्तेजनाओं के प्रत्युत्तर में मक्खियों की पर्याप्त रूप से चढ़ने में असमर्थता तंत्रिका संबंधी दोषोंकोइंगित कर सकती है . एक बार एक विशेष दोषपूर्ण चढ़ाई phenotype की पहचान की है, आगे मस्तिष्क ऊतक के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के रूप में एक माध्यमिक स्क्रीन का उपयोग कर परीक्षण, चढ़ाई दोषपूर्ण मक्खियों में neurodegeneration की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बाद में जीन मानचित्रण तो ब्याज की दोषपूर्ण न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन ले गुणसूत्र पर जीनोमिक क्षेत्र प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ब्याज के गुणसूत्र क्षेत्र को संकीर्ण करने के लिए, गुणसूत्र पर ज्ञात स्थानों के साथ प्रमुख मार्कर जीन ले जाने उत्परिवर्ती मक्खी लाइनों का उपयोग कर meiotic मानचित्रण किया जा सकता है। मार्कर जीन उत्परिवर्तन के लिए एक संदर्भ बिंदु के रूप में सेवा के रूप में दो loci के बीच पुनर्संयोजन की आवृत्ति एक औसत दर्जे की दूरी है कि एक जीन के अनुमानित स्थान नक्शा इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करता है. अंत में, ब्याज के meiotically मैप गुणसूत्र क्षेत्र पर संतुलित कमियों को ले जाने लाइनों के साथ उत्परिवर्ती लाइनों को पार एक पूरक परीक्षण जिसमें ब्याज की जीन सत्यापित किया जा सकता है अगर इसके ज्ञात phenotype व्यक्त किया जाता है बनाता है5. पहचान जीन में बहुरूपी न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम, संभवतः एक बदल एमिनो एसिड दृश्यों में जिसके परिणामस्वरूप, जीन अनुक्रमण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और यह Drosophila जीनोम अनुक्रम के लिए तुलना. ब्याज के जीन के बाद विशेषता अतिरिक्त उत्परिवर्ती alleles के परीक्षण शामिल कर सकते हैं, उत्परिवर्तन बचाव प्रयोगों और अतिरिक्त phenotypes की परीक्षा.

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Protocol

1. तैयारी और मक्खी की उम्र बढ़ने

  1. प्राप्त करें या आनुवंशिक स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि Drosophila म्यूटेंट का एक संग्रह6 उत्पन्न करते हैं। यहाँ, ईएनयू-म्यूटाजेनीकृत लाइनों का उपयोग दूसरे गुणसूत्र के लिए मैप किया जाता है और CyO पर संतुलित किया जाता है।
  2. कॉर्नमील-मोलेस माध्यम पर 25 डिग्री सेल्सियस, 12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र पर सेट इनक्यूबेटर में प्रयोगात्मक जीनोटाइप लाइनों को बढ़ाना।
  3. प्रत्येक प्रयोगात्मक जीनोटाइप से वयस्क eclosion के 0-2 दिनों के बीच लगभग 20 समयुग्मज संतति लीजिए। लगातार या तो पुरुष या महिला मक्खियों का संग्रह करके सेक्स पूर्वाग्रह को हटा दें।
  4. उम्र cornmeal-molasses माध्यम पर मक्खियों के रूप में 29 डिग्री सेल्सियस में वांछित, शीशियों हर 2-3 दिनों flipping क्रम में ताजा भोजन पर मक्खियों को बनाए रखने के रूप में वे उम्र. यहाँ प्रस्तुत स्क्रीन में, मक्खियों 10-12 दिनों के लिए आयु वर्ग के थे.
  5. एक चढ़ाई परख परीक्षण कक्ष इकट्ठा दो शीशियों और टेप का उपयोग कर के रूप में पहले वर्णित10. शीशियों दोनों खुले सिरों पर जोड़ा जाना चाहिए. कक्ष के एक छोर पर 5 सेमी रेखा चिह्नित करने के लिए मापनी का उपयोग करें.

2. प्रोटोकॉल 1: चढ़ाई परख (अली एट अल से adapted10)

  1. चढ़ाई परख को मान्य करें। इस अध्ययन में, अली एट अल10द्वारा पहले वर्णित पद्धति के आधार पर चढ़ाई परख का परीक्षण, ElavC155और UAS-TauR406W का उपयोग कर (कम चढ़ाई पास दरों को रोकना) और ElavC155और UAS-GFP ( नियंत्रण) और ElavC155और UAS-mChery (नियंत्रण) मक्खियों.
  2. एक परीक्षण कक्ष में मक्खियों फ्लिप, एक समय में एक पंक्ति (सीओ2 संज्ञाहरण का उपयोग नहीं करते) और उन्हें 5 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. यदि परीक्षण अलग-अलग दिनों में किया जाता है, तो दिन के एक ही समय में परख करें। इस अध्ययन में, सभी चढ़ाई परख दोपहर में प्रदर्शन किया गया चलन12पर circadian प्रभाव के लिए नियंत्रण .
    नोट: परीक्षण करते समय सूर्य के प्रकाश को सीधे करने के लिए मक्खियों को उजागर करने से बचें; यह उनके चढ़ाई करने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप करेगा.
  3. जबरन एक ठोस सतह पर रखा एक माउस पैड पर कक्ष (चिह्नित पक्ष नीचे) नल 3 बार तो सभी मक्खियों तल पर परख शुरू करते हैं. 10 s की अवधि में मक्खी चलन का निरीक्षण करें।
  4. इस समय के भीतर 5 सेमी लाइन तक पहुँचने या पास करने वाली मक्खियों की संख्या रिकॉर्ड करें, साथ ही परीक्षण की गई मक्खियों की कुल संख्या रिकॉर्ड करें। प्रोटोकॉल दोहराएँ, प्रत्येक परीक्षण के बीच 1 मिनट इंतज़ार कर, 3 परीक्षण प्रति पंक्ति प्रतिकृति की एक न्यूनतम के लिए.
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, प्रत्येक शीशी के बीच निहित 2 और 19 प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए मक्खियों (पुरुष मक्खियों) और के बीच 6 और 21 पार महिला लाइनों के उत्परिवर्ती कमी विश्लेषण के लिए मक्खियों (धारा 5.3.).

3. प्रोटोकॉल 2: आगे विश्लेषण के लिए Drosophila तनाव का चयन

  1. Microsoft Excel या इसी प्रकार के सॉफ्टवेयर में चढ़ाई परख डेटा दर्ज करें और एक प्रतिशत के रूप में सभी प्रतिकृतिपर पर प्रत्येक पंक्ति के लिए चढ़ाई पास दर की गणना करें।
  2. आर सॉफ्टवेयर पैकेज13का उपयोग कर सभी लाइनों के मतलब चढ़ाई प्रतिशत मूल्य से काफी विचलित उत्परिवर्ती लाइनों का पता लगाने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं।
    1. R (.csv या .txt फ़ाइलों के लिए प्रत्येक चर या कारक के लिए स्तंभ वाली और विशिष्ट मानों का प्रतिनिधित्व करने वाली पंक्तियाँ) के लिए क्यूरेट की गई डेटा फ़ाइलों में पढ़ें.
      नोट: यहाँ, पुरुषों के लिए डेटा (प्रारंभिक परख) और महिलाओं (लाइन 867 की कमी लाइनों को पार) दो कॉलम के रूप में अलग .xlsx शीट में दर्ज किए गए थे, एक जहां स्तंभ की पंक्तियाँ उत्परिवर्ती लाइन की पहचान और कितनी बार परख दोहराया गया था और अन्य जहां पंक्तियाँ मतलब चढ़ाई सफलता का प्रतिनिधित्व करते हैं (एक प्रतिशत के रूप में) मक्खियों के प्रत्येक प्रतिकृति शीशी के लिए.
    2. निम्न कोड का उपयोग करR में डेटा पढ़ें:
      mali;lt;-read.csv(". /male]init.csv")
      femdef;lt;-read.csv(". /fem[def]cross.csv")
      नोट: ".." पथ निर्देशिका में उपयोगकर्ता के कंप्यूटर की रूट निर्देशिका से पूर्ण पथ हैं और उनके कंप्यूटर की निर्देशिका पथ के लिए अलग-अलग उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट करने की आवश्यकता होगी।
    3. रैखिक मॉडलिंग प्रदर्शन
      1. R में lm फ़ंक्शन के साथ डमी चर प्रतिगमन निष्पादित करें। उत्परिवर्ती लाइनों के प्रारंभिक विश्लेषण के लिए, एक शून्य मतलब केंद्रित प्रतिक्रिया चर (प्रतिशत सफलता) के लिए भव्य मतलब के खिलाफ प्रतिशत चढ़ाई सफलता पर कारक स्तर प्रभाव (म्यूटेंट लाइनों) के महत्व का मूल्यांकन.
        नोट: "-1" lm फ़ंक्शन कॉल के अंत में अनुभाग 3.2.3.2 में. अवरोधन को हटा देता है और हमें प्रतिशत चढ़ाई पास दर के शून्य मतलब केंद्रित मतलब के खिलाफ सभी कारक स्तर का परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है.
      2. R सारांश फ़ंक्शन का उपयोग करके स्क्रीन पर परिणाम मुद्रित करें:
        mali[anova]lt;-lm(scale(mali[P]सफलता)]mali$Mutant]line -1)
        सारांश (mali$anova)
      3. निम्न R कोड का उपयोग करने के विरुद्ध कारक स्तर प्रभावों का परीक्षण करने के लिए आधार रेखा के रूप में नियंत्रण रेखाओं (यदि वर्तमान) का उपयोग करें: x/lt;-relevel(femdef[Mutant]line, ref]"a867]plus")
        femdef[anova]lt;-lm(femdef[P]सफलता]x)
        सारांश (फेमडेफ-एनोवा)
        नोट: कोड की पहली पंक्ति कारक स्तर reorders ताकि नकारात्मक नियंत्रण लाइन आधार रेखा अवरोधन जो करने के लिए अन्य सभी कारक स्तर (म्यूटेंट लाइनों) के खिलाफ lm समारोह में निर्मित टी-परीक्षण के साथ परीक्षण कर रहे हैं हो जाता है.
  3. परीक्षण के समय आयु के आधार पर उम्मीदवार रेखाओं के लिए एक सीमा चुनें. सीमा निर्धारित करने के लिए, ज्ञात म्यूटेंट है कि जंगली प्रकार की तुलना में neurodegeneration और कम चढ़ाई पास दर प्रदर्शन का उपयोग कर वांछित उम्र में एक प्रारंभिक परीक्षण प्रदर्शन, नियंत्रण मक्खियों10.
    नोट: 50% से नीचे एक गुजर दर 10 दिन पुरानी मक्खियों के लिए उपयुक्त हो सकता है के रूप में पहले Drosophila लाइनों के लिए सूचित तंत्रिका तंत्र में मानव neurodegeneration से संबंधित जीन ताऊ overexpressing10. पुराने मक्खियों एक उच्च गुजर दर सीमा होनी चाहिए क्योंकि वे कम चलन प्रदर्शन की उम्मीद कर रहे हैं, इस प्रकार, neurodegeneration में वृद्धि हुई.

4. प्रोटोकॉल 3: ऊतक विज्ञान विश्लेषण

  1. दस्ताने पहने हुए, चढ़ाई परख के बाद एक शल्य ब्लेड के साथ मक्खी सिर तोड़ और धीरे उन्हें Carnoy के fixative के 1 एमएल में जगह करने के लिए एक paintbrush का उपयोग करें (6:3: 100% EtOH के: क्लोरोफॉर्म: हिमनदीय एसिटिक एसिड) एक 1.5 एमएल माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब ओ / सुनिश्चित करें कि सिर स्थिर समाधान में सिंक.
  2. फिक्सेटिव समाधान 70% EtOH के 1 एमएल के साथ अगले दिन बदलें और भविष्य के विश्लेषण के लिए अभी भी 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने बनाए रखें।
    नोट: प्रोटोकॉल इस चरण पर रोका जा सकता है।
  3. चरण 4.2 से सिर रखें. माइक्रोबायोप्सी कैसेट प्रति पांच की एक अधिकतम पर. तुरंत 70% EtOH से भरा एक कंटेनर में कैसेट जगह है. सिर के प्रसंस्करण और पैराफिन embedding के लिए एक ऊतक विज्ञान सुविधा के लिए शिपिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर कंटेनर स्टोर. ऊतक प्रसंस्करण और embedding के लिए उपकरण उपलब्ध है, तो चरण 4.4 का पालन करें।
  4. माइक्रोटोम सेक्शनिंग के लिए पैराफिन में सिर एम्बेड करें:
    1. एक स्वचालित ऊतक प्रसंस्करण मशीन के लिए कार्यक्रम सेटिंग्स का पालन करें तालिका 1 में प्रस्तुत करने के लिए निर्जलित, स्पष्ट और सिर के साथ पैराफिन के साथ घुसपैठ.
    2. नमूनों को धातु बेस मोल्डमें स्थानांतरित करें जो कैसेट को 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके एक पैराफिन एम्बेडिंग स्टेशन का उपयोग करके फिट करते हैं।
    3. अनुभाग के बाद मस्तिष्क के ऊतकों के उचित दृश्य की अनुमति देने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करके आधार मोल्ड में सिर (शीर्ष का सामना करना पड़ रहा पूर्वार्तक अभिविन्यास) ओरिएंट करें। यह 60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन को पुन: गर्म करके और यदि आवश्यक हो तो सिर की स्थिति बदलकर किया जा सकता है।
      नोट: धातु मोल्ड डिस्पोजेबल आधार मोल्ड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    4. इसी आधार मोल्ड के शीर्ष पर कैसेट स्थिति और धीरे पैराफिन embedding स्टेशन (4 डिग्री सेल्सियस) के फ्रिज की ओर करने के लिए इन ले जाएँ। स्टेशन से इसे हटाने से पहले ब्लॉक hardens जब तक प्रतीक्षा करें।
    5. कैसेट से मोल्ड को धीरे से अलग करके ब्लॉक फॉर्म को हटा दें।
  5. प्रत्येक पैराफिन ब्लॉक पूर्व अनुभागिंग ट्रिम सतह है कि काट दिया जाएगा कम से कम करने के लिए।
  6. प्रत्येक ब्लॉक के 5 डिग्री मीटर खंडों को काटने के लिए माइक्रोटोम सेट करें।
  7. एक गर्म पानी स्नान में ऊतक युक्त अनुभागीय पैराफिन रिबन रखें (35 डिग्री सेल्सियस) अधिकतम 5 मिनट के लिए।
  8. गर्म पानी के स्नान में एक पॉली-lysine लेपित स्लाइड विसर्जित कर दिया (ऊतक बनाए रखने में मदद करता है), लकड़ी applicators का उपयोग कर स्लाइड पर अनुभाग रिबन रखकर। स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर हवा सूखी ओ/
  9. एक स्लाइड गर्म का उपयोग कर 63 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्लाइड गर्मी।
  10. निम्नलिखित चरणों का सम्मान करके एक धूआं हुड के तहत हेमेटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ एक स्लाइड धुंधला रैक और दाग पर स्लाइड रखें।
    1. Histochoice में रैक प्लेस (Xylene के गैर विषैले प्रतिस्थापन, जो नमूने से पैराफिन को दूर करने में मदद करता है) 5 मिनट के लिए.
    2. 5 मिनट के लिए Histochoice से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    3. 5 मिनट के लिए 100% EtOH 1 से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    4. 5 मिनट के लिए 100% EtOH 2 से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    5. 3 मिनट के लिए 95% EtOH से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    6. 3 मिनट के लिए 70% EtOH से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    7. 5 मिनट के लिए Distilled एच2हे से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण।
    8. 2-5 मिनट के लिए हैरिस Hematoxylin से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    9. Hematoxylin समाधान से बाहर रैक ले लो और यह 10 मिनट के लिए चल नल के पानी के नीचे जगह है.
    10. एक छोटी डंक करके आसुत पानी से भरा कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    11. 1-2 मिनट के लिए Eosin से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    12. एक छोटी डंक कररही 95% EtOH के साथ भरा कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    13. 5 मिनट के लिए 95% EtOH से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    14. 5 मिनट के लिए 100% EtOH से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    15. 5 मिनट के लिए 100% EtOH से भरा एक कंटेनर में रैक स्थानांतरण.
    16. सभी स्लाइड ्स्ड माउंट किए जाने तक 5-10 मिनट के लिए हिस्टोपसंद (या Xylene) से भरे कंटेनर में रैक को स्थानांतरित करें।
    17. स्लाइड और कवरस्लिप (24 मिमी x 60 मिमी आकार) माउंट करें। संदंश का उपयोग करके, स्लाइड को हिस्टोपसंद या Xylene समाधान से बाहर ले जाएँ और इसके शीर्ष पर बढ़ते माध्यम की एक पतली पट्टी बनाएं। बुलबुले के गठन से बचने की कोशिश कर तेहुएऊपर कवरस्लिप रखें।
    18. बढ़ते माध्यम को माउंटेड स्लाइड्स पर विश्लेषण से पहले धूआं हुड के तहत कठोर ओ/
    19. कमरे के तापमान पर एक बॉक्स में दाग स्लाइड स्टोर.
  11. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत 20x आवर्धन पर स्लाइड पर सभी धारावाहिक वर्गों को देखकर neurodegeneration मात्रा. पूरे मस्तिष्क की जांच, आकार और धानी की संख्या है कि लगातार तीन वर्गों में दिखाई देते हैं की गुणात्मक ध्यान दे रही है.
  12. इमेजिंग सॉफ्टवेयर से लैस एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लगभग मध्य मस्तिष्क पर प्रतिनिधि मस्तिष्क वर्गों की छवियों को प्राप्त करें.

5. प्रोटोकॉल 4: Recessive Mmutant Phenotype के जीन मानचित्रण

  1. एक जंगली प्रकार CantonS (BL ] 9517) या किसी अन्य जंगली प्रकार या आइसोजेनाइज्ड तनाव (उदा., OregonR (BL$ 2376), w1118 (BL$5905) या yw (BL ] 6599) के लिए उम्मीदवार लाइन के बाहर निर्धारित करने के लिए कि phenotype प्रमुख है या अप्रभावी.
    नोट:     इस चरण से परिणाम मैपिंग के अगले चरणों का मार्गदर्शन करेंगे। यदि फीनोटाइप अप्रभावी है, तो कमी मानचित्रण किया जा सकता है।
    1. एक तूलिका का उपयोग करना, ब्याज के उत्परिवर्ती लाइन (5 पुरुषों) और कैंटनएस लाइन (10-15 कुंवारी महिलाओं) के एक खाद्य युक्त शीशी सीओ2- esthetized मक्खियों में रखकर एक क्रॉस करना। शीशी को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. विषमयुग्मज F1 संतति लीजिए और चढ़ाई और ऊतक विज्ञान प्रयोगों को दोहराएँ।
    3. प्राप्त परिणामों की तुलना अकेले नियंत्रण रेखा के लिए और समयुग्मज उत्परिवर्ती करने के लिए करें। अप्रभावी फीनोटाइप का एक अच्छा संकेत होगा यदि विषमयुग्मज उत्परिवर्ती जंगली प्रकार मक्खियों के रूप में समान फीनोटाइप प्रदर्शित करते हैं।
  2. wgSp-1 J1 L2 Pin1/CyO (BL$3227) या ज्ञात पर संबद्ध प्रमुख मार्करों के साथ एक बराबर तनाव का उपयोग कर दूसरे गुणसूत्र पर उत्परिवर्तन के स्थान का अनुमान लगाने के लिए meiotic मानचित्रण प्रदर्शन साइटोलॉजिकल स्थान. इस मामले में, उत्परिवर्तन पहले दूसरे गुणसूत्र पर स्थित होने के लिए जाना जाता था।
    1. एक तूलिका का उपयोग करना, एक खाद्य युक्त शीशी सीओ2में रखकर एक क्रॉस करें - ब्याज की उत्परिवर्ती लाइन (5 पुरुषों) और wgSp-1 J1 L2 पिन1/CyO लाइन (10 महिलाओं) के उत्परिवर्ती मक्खियों। शीशी को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: इस क्रॉस का लक्ष्य विषमयुग्मज महिलाओं को नए उत्परिवर्तन और मार्कर गुणसूत्र के साथ गुणसूत्र ले जाने के लिए उत्पन्न करना है, जो मध्यांतर के दौरान पुन: संयोजन करेंगे6,14. महिला F1 संतान पुरुषों के बजाय चुना जाता है के बाद से पुनर्संयोजन पुरुषों में नहीं होता है.
    2. नए उत्परिवर्तन और मार्कर गुणसूत्र के साथ गुणसूत्र ले जाने के कम से कम 15 कुंवारी महिला संतान ले लीजिए और उन्हें पार करने के लिए 5 पुरुषों के लिए एक संतुलित लाइन है कि एक और दिखाई प्रमुख मार्कर किया जाता है से (जैसे, CyO/snaSco (BL $2555) या बराबर)।
    3. विषमयुग्मज पुरुष संतति को या तो स्कॉ या साइओ तथा चरण 5.2.2 में क्रूस से संभावित पुन: संयोजित गुणसूत्र ले लीजिए। और व्यक्तिगत रूप से उन्हें उत्परिवर्तित गुणसूत्र ले जाने के शेयर से कुंवारी महिलाओं के लिए दोस्त.
    4. चरण 5.2.3 में वर्णित अंतिम क्रॉस से संतति लीजिए। और उम्र 29 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों (इस अध्ययन में मक्खियों 10-14 दिनों के लिए आयु वर्ग के थे)।
    5. सिर लीजिए, प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में ऊतक विज्ञान विश्लेषण प्रदर्शन और मस्तिष्क वर्गों के साथ स्लाइड पर देखने के लिए न्यूरोपैथोलॉजी की डिग्री के रूप में चरण 4.11 में वर्णित निर्धारित. ऊतक विज्ञान विश्लेषण phenotypes है कि चढ़ाई परख को प्रभावित कर सकता है के कारण चलन विश्लेषण के बजाय किया जाता है, जैसे जाम (जे), जो पंखों में तरल पदार्थ buildup का कारण बनताहै 15.
  3. चढ़ाई परख का उपयोग कर अप्रभावी उत्परिवर्तन के स्थान को परिष्कृत करने के लिए गुणसूत्र के संकीर्ण क्षेत्र पर कमी मानचित्रण प्रदर्शन करते हैं। प्रत्येक कमी लाइन गुणसूत्रों के विभिन्न क्षेत्र के विलोपन है, उन्हें पूरक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है.
    1. बड़ी कमियों के साथ शुरू करें जो मीओटिक मैपिंग में पहचाने गए क्षेत्र का विस्तार करते हैं, जिसे छोटी कमियों के उपयोग से और कम किया जा सकता है। यदि कमी विश्लेषण एक से अधिक उम्मीदवार जीन में परिणाम, आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) शेयरों के उपयोग के लिए उन्हें लक्षित करने की सिफारिश कर रहे हैं.
    2. Drosophila कमी किट से क्रॉस लाइनों16 दूसरे गुणसूत्र के लिए (DK2L इस अध्ययन में) और ब्याज के phenotype के गैर-पूरक के लिए देखो (इस अध्ययन में: चढ़ाई पास दर 8.5% जो की पास दर से मेल खाती है लाइन 867 से समयुग्मज मक्खियों सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया).
    3. खंड 4 (प्रोटोकॉल 3) में वर्णित के रूप में ऊतक सत्यापन का उपयोग कर neurodegeneration phenotype की पुष्टि करें.

6. प्रोटोकॉल 5: डीएनए अनुक्रमण और विश्लेषण

नोट: ध्यान रखें कि ENU mutagenesis बिंदु उत्परिवर्तन11परिचय .

  1. डिजाइन आगे और रिवर्स प्राइमर दृश्यों ब्याज के क्षेत्र के पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा प्रवर्धन के लिए ब्रैट जीन के exon-कोडिंग क्षेत्र flanking (लाइन 867 के मामले में 3,247 बीपी के आकार का एक डीएनए टुकड़ा के लिए परिलक्षित होता है अनुक्रमण17)
  2. एक मक्खी से डीएनए निकालें18 :
    1. धीरे से एक 0.5 एमएल माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मक्खी स्क्विश िंग बफर (10 एमएम ट्राइस-सीएल पीएच 8.2, 1 एमएम एडीटीए, 25 एमएम NaCl, और 200 डिग्री/
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट
    3. 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रखकर प्रोटीनाज K को निष्क्रिय करें।
      नोट: निकाले गए डीएनए कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. निर्माता के निर्देशों का सम्मान करके और एक 1 पर पीसीआर उत्पाद चलाने के द्वारा एक उच्च निष्ठा डीएनए Tak Polymerase (अभिकरण और थर्मल साइकिल चालन की स्थिति इस अध्ययन में इस्तेमाल किया तालिका 2 और तालिका 3, क्रमशः) में दिखाए जाते हैं का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन % agarose जेल जिसमें Invitrogen SYBR सुरक्षित डीएनए जेल दाग है, जो एथिडियम ब्रोमाइड का एक गैर विषैले विकल्प है.
  4. एक स्केलपेल के साथ जेल से सही आकार के बैंड उत्पाद निकालना और निर्माता के निर्देशों का सम्मान करके, जादूगर एसवी जेल और पीसीआर क्लीन-अप सिस्टम (Promega) या समकक्ष किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद को शुद्ध।
  5. आगे डिजाइन और रिवर्स प्राइमर कि डीएनए अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा क्रम में ब्याज के पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए, यदि संभव हो तो. बिंदु उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए पिछले चरण से जेल-शुद्ध डीएनए अनुक्रम। स्वचालित फ्लोरोसेंट Sanger अनुक्रमण में उच्च सटीकता अप करने के लिए 700 बीपी के लिए प्राप्त किया जा सकता है.
    नोट: पूर्व Tak polymerase (TaKaRa) आकार के 20 kb अप करने के लिए जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट्स से पीसीआर उत्पादों बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. उन्हें aligning द्वारा एक प्लाज्मिड संपादक (एपीई, एम वेन डेविस) या इसी तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त डीएनए दृश्यों का विश्लेषण और एक संदर्भ तनाव के एक ही जीनोमिक क्षेत्र के अनुक्रमण के बाद प्राप्त दृश्यों के लिए उनकी तुलना (उदा., मूल रूप से mutagenized लाइन)।
    1. ApE के साथ अनुक्रमण फ़ाइलें खोलें। संदर्भ के रूप में, Flybase से एक फास्टा प्रारूप में डाउनलोड brat जीन के जीनोमिक आम सहमति अनुक्रम युक्त एक ApE फ़ाइल का उपयोग करें, या आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण के अनुक्रम के लिए परिणाम युक्त एक फ़ाइल (उदाहरण के लिए, मूल रूप से mutagenized Drosophila लाइन)।
    2. उपकरणपर जाएँ, फिर दृश्यों को संरेखितकरें. कंप्यूटर के माउस का उपयोग करके, तुलना करने के लिए सभी दृश्यों का चयन करें. ड्रॉप मेनू में इस संरेखण के लिए उपयोग किए गए संदर्भ अनुक्रम को इंगित करना याद रखें.
    3. संदर्भ अनुक्रम के साथ तुलना में न्यूक्लिओटाइड परिवर्तन के लिए अनुक्रम क्षेत्र का निरीक्षण करें। यदि वांछित हो, तो पाठपर क्लिक करके कंप्यूटर पर संरेखण को .rtf स्वरूप में सहेजें, फिर सहेजें.
      नोट: यदि कोई उत्परिवर्तनों की पहचान की गई, डीएनए अनुक्रमण और विश्लेषण प्रोटोकॉल जीन के गैर-कोडिंग क्षेत्रों को शामिल करने के लिए डिज़ाइन प्राइमर के साथ दोहराया जाएगा.

7. प्रोटोकॉल 6: उम्मीदवार जीन समारोह के आगे विश्लेषण

  1. यह निर्धारित करने के लिए neuroblasts में बचाव प्रयोगों को निष्पादित करें कि क्या जीन ब्रैट neurodegeneration phenotype के लिए जिम्मेदार है.
    1. डबल संतुलन एक UAS-brat19 और एक neuroblast-विशिष्ट worniu-Gal4 (wor-G4) तीसरे गुणसूत्र पर निर्माण ले जाने के शेयरों, साथ ही 867 लाइन है, जो जीन brat के लिए उत्परिवर्ती है दूसरे पर स्थित गुणसूत्र.
      1. तीन अलग अलग खाद्य युक्त शीशियों में रखकर तीन अलग-अलग पार बनाओ 5 UAS-Bratसे पुरुषों, wor-G4 और 867 लाइनों और पुरुषों के प्रत्येक सेट करने के लिए जोड़ें 10-15 कुंवारी महिलाओं के एक लाइन ले जाने मार्करों और दूसरे के लिए balancers से और तीसरा गुणसूत्र(Sp/CyO; डॉ/Tm3,sb; बीएलजेड 59967) .
      2. निम्नलिखित जीनोटाइप के साथ प्रत्येक क्रॉस के F1 से 10-15 कुंवारी महिलाओं को लीजिए: +/CyO; UAS-brat/Tm3,sb, +/CyO; wor-G4/Tm3,sb और 867/CyO;+/Tm3,sb और निम्न में से प्रत्येक जीनोटाइप के 5 पुरुष: +/Sp; UAS-brat/Tm3,sb, +/Sp; wor-G4/Tm3,sb और 867/CyO; +/Dr.
      3. क्रॉस कॉलेक् ट +/साइओ; UAS-brat/Tm3,sb कुंवारी महिलाओं को +/ UAS-brat/Tm3,sb पुरुषों; एक अलग शीशी में +/CyO; wor-G4 /Tm3,sb कुंवारी महिलाओं के साथ +/Sp; wor-G4/Tm3,sb पुरुषों और फिर एक तीसरी शीशी पार 867/CyO; + /Tm3,sb कुंवारी महिलाओं और 867/CyO; +/Dr पुरुषों के साथ एक दूसरे पार करते हैं।
      4. इन पारों में से प्रत्येक के F1 से, निम्नलिखित जीनोटाइप के नर और महिलादोनों को एकत्रित करें: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3, पहले पार से एस बी, Sp/CyO; wor-G4/Tm3, दूसरे पार से एस बी और 867/ Dr/Tm3, दूसरे पार से एस बी.
      5. सभी तीन लाइनों के लिए स्थायी डबल संतुलित स्टॉक स्थापित करने के लिए प्रत्येक F1 संतान से एकत्र भाइयों और बहनों के बीच एक अंतिम पार प्रदर्शन करते हैं।
    2. 867 उत्परिवर्तन के साथ UAS-brat और wor-G4 का मिश्रण.
      1. 867/CyO से कुंवारी महिलाओं की पर्याप्त संख्या ($20-30 मक्खियों) लीजिए; Dr/Tm3,sb डबल संतुलित स्टॉक दो पार प्रदर्शन करने के लिए।
      2. Sp/CyO से $ 5 पुरुषों के साथ 10-15 कुंवारी महिलाओं प्लेस; UAS-brat/Tm3,sb (#1 पार) और एक दूसरी शीशी में 10-15 कुंवारी महिलाओं के साथ $5 Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb पुरुषों.
      3. निम्नलिखित जीनोटाइप के साथ प्रत्येक पार के F1 से भाइयों और बहनों को ले लीजिए: 867/ UAS-brat/Tm3, क्रॉस #1 से एस बी और 867/CyO;wor-G4/Tm3, क्रॉस #2 से। उन दोनों के बीच भाइयों और बहनों को पार करके स्थायी स्टॉक स्थापित करने के लिए प्रत्येक क्रॉस से एकत्र F1 संतान का उपयोग करें।
        नोट: इस अंतिम चरण के बाद, 867/CyO के लिए स्टॉक; UAS-brat/Tm3,sb और 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb उत्पन्न किया जाना चाहिए।
    3. बचाव प्रयोग करें।
      1. 867/CyO से 15-20 कुंवारी महिलाओं को इकट्ठा; wor-G4/Tm3,sb स्टॉक और उन्हें पार करने के लिए 5-10 पुरुषों के शेयर से 867/ UAS-brat/Tm3,sb| नियंत्रण के रूप में, 867/CyO से 15-20 कुंवारी महिलाओं को पार; wor-G4/Tm3, sb और $ 15-20 कुंवारी महिलाओं से 867/ UAS-brat/Tm3, अकेले 867/CyO लाइन के लिए एस बी लाइन।
        नोट: 867 मक्खियों ब्रैट के तापमान के प्रति संवेदनशील एलील ले और बचाव पार 29 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।
      2. 867/867; wor-G4/UAS-brat (rescue), 867/867; wor-G4/+ (नियंत्रण) और 867/867 का चयन करके प्रत्येक क्रॉस से निम्नलिखित F1 संतति लीजिए; UAS-brat/+ (नियंत्रण).
      3. उम्र मक्खियों के रूप में 29 डिग्री सेल्सियस में वांछित और मस्तिष्क पर ऊतक विज्ञान विश्लेषण करने के लिए धारा 4 (प्रोटोकॉल 3) में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके neurodegeneration के लिए देखो.
  2. 867 म्यूटेंट में neurodegeneration की उम्र पर निर्भर विश्लेषण प्रदर्शन.
    1. लीजिए 867;pcna-GFP और yw नियंत्रण मक्खियों, जो एक रिपोर्टर जीन ले (pcna-GFP ) और 25 डिग्री सेल्सियस पर व्यवहार्य हैं और दोनों उच्च penetrance और neurodegeneration phenotype के उच्च expressivity प्रदर्शन से 867 अकेले इस पर तापमान17|
    2. आयु 5, 15 और 25 तक उड़जाती है जैसा कि अनुभाग 1.4 में वर्णित है और धारा 4 (प्रोटोकॉल 3) में प्रोटोकॉल का पालन करके बाद में ऊतक विज्ञान विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस एर्टिकल में, हम वयस्क मक्खियोंमेंन्यूरोनल अखंडता (जैसे, न्यूरोप्रोटटट) के रखरखाव में भूमिका निभाने के रूप में जीन ब्रेन ट्यूमर (ब्रैट) की पहचान करने के लिए उपयोग किए गए चरणों को प्रस्तुत करते हैं; एक पद्धति जिसका उपयोग तंत्रिका सुरक्षा में शामिल जीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. हमने एक अग्र आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग किया (रणनीति चित्र 1कमें उल्लिखित है ) एक चढ़ाई परख का उपयोग करके रासायनिक म्यूटेजेनीकृत मक्खियों के संग्रह के माध्यम से स्क्रीन करने के लिए (इस परख के लिए प्रयुक्त उपकरण चित्र 1खमें दिखाया गया है )। 235 समयुग्मज लाइनों में, लगभग 37% परीक्षणित रेखाओं में 10-12 दिनों की आयु में परीक्षण किए जाने पर 50% से नीचे एक क्लाइम्बिंग पास दर प्रदर्शित की गई (चित्र 1C)। परीक्षण लाइनों के 58% काफी अलग चढ़ाई व्यवहार का प्रदर्शन किया जब उनके प्रतिशत चढ़ाई पास दर (सीपीआर) एक तरह से ANOVA का उपयोग कर सभी परीक्षण लाइनों का मतलब चढ़ाई प्रतिशत मूल्य की तुलना में किया गया था (चित्र 1D). सबसे कम चढ़ाई पास दर का प्रदर्शन लाइनों के 51 पर बाद में हिस्टोलॉजिकल स्क्रीन से पता चला कि इन लाइनों के 29 मस्तिष्क neuropil में छेद की दिखाई उपस्थिति से पता चला (हल्के से गंभीर करने के लिए) neurodegeneration का संकेत20 ( चित्र 2) दोषपूर्ण चढ़ाई व्यवहार और गंभीर neurodegeneration दिखा लाइनों के अलावा, हम एक तरह ANOVA के आधार पर लाइन 867 (0% सीपीआर और पी मूल्य] 1.36e-14 में phenotype अंतर्निहित उत्परिवर्तन नक्शा करने के लिए चुनते हैं. 867 मक्खियों में न्यूरोडिजेनरेशन फीनोटाइप अप्रभावी होता है क्योंकि विषमयुग्मज 867 मक्खियों के मस्तिष्क जो जंगली प्रकार के तनाव से बाहर हो गए हैं, नियंत्रणों के इन (चित्र3क) के बराबर हैं। ऊतक विज्ञान का उपयोग करते हुए, meiotic मानचित्रण 31-51 साइटोलॉजिकल स्थानों में उत्परिवर्तन स्थित, phenotypic मार्करों जम्मू के बीच (जाम) और एल (लोब) दूसरे Drosophila गुणसूत्र पर. चढ़ाई परख का उपयोग करते हुए, साइटोलॉजिकल स्थानों के बीच कमी मानचित्रण 31 और 51 गुणसूत्र 2L (DK2L) के लिए Drosophila कमी किट से लाइनों के साथ16 118 जीन शामिल क्षेत्र में उत्परिवर्तन मैप (चित्र 3B; जहां 867/+ सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करता है) 867 उत्परिवर्तीओं के मस्तिष्क फीनोटाइप की जांच करने से अतिरिक्त कमी रेखाओं (चित्र 3 ब्) ने इस बात की पुष्टि की कि उत्परिवर्तन जीनोम के किसी क्षेत्र में होता है जिसमें जीन ब्रेटशामिल होता है . इन विलोपन के भीतर निहित सभी अतिरिक्त जीन की एक पूरी सूची Flybase में हटाए गए खंड के साथ जुड़े लिंक पर क्लिक करके पाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, Df(2L) ED1272 के लिए नष्ट कर दिया खंड 37C5-38A2 है. पिछले टिप्पणियों के आधार पर कि brat म्यूटेंट उनके दिमाग में अधिसंख्य कोशिकाओं है21, एक phenotype भी 867 म्यूटेंट में मनाया, brat डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए चुना गया था. एक्सॉन-कोडिंग क्षेत्र से युक्त ब्रैट जीन का संगर अनुक्रमण जिसमें पहचान की गई जी/ए न्यूक्लिओटाइड परिवर्तन की स्थिति 37,739 जीन की स्थिति पर होती है (चित्र 4क), जिसके कारण ब्रैट प्रोटीन 17 की स्थिति 470 पर ग्लाइसिन की चमक बढ़ जाती है। (चित्र 4ख) बचाव प्रयोगों से इस बात की पुष्टि होती है कि ब्रैट एक न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका निभाता है, क्योंकि 867 रेखा में कार्यात्मक जीन का अतिअभिव्यक्ति न्यूरोडिजेनरेशन फीनोटाइप को दबाती है (चित्र 5क)। इसके अलावा, 867 म्यूटेंट में phenotype समय के साथ खराब हो जाती है, सुझाव है कि brat neuroprotection17 में एक उम्र पर निर्भर भूमिका निभाता है (चित्र 5B).

Figure 1
चित्र 1 : आगे आनुवंशिक स्क्रीन उपन्यास न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान करने के लिए. (एक) स्क्रीन रणनीति. (बी) चढ़ाई परख परीक्षण उपकरण. (ग) चढ़ाई परख 235 समयुग्मज ENU-mutagenized लाइनों से पुरुषों के लिए परिणाम. पाई चार्ट परीक्षण मक्खी लाइनों है कि चढ़ाई पास दर के 4 समूहों में आते हैं के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है: 0% , 1-20% , 21-50% , और 51-100% . (घ) 1 तरह से ANOVA सांख्यिकीय विश्लेषण से परिणाम जिसमें उत्परिवर्ती लाइनों सभी परीक्षण लाइनों के मतलब चढ़ाई प्रतिशत मूल्य की तुलना में थे. प्रतिनिधित्व किया है दो P मान श्रेणियों के लिए संख्या है: P और lt; 0.05 (महत्वपूर्ण परिवर्तन) और P और gt; 0.05 (महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं).

Figure 2
चित्र 2 : माध्यमिक ऊतक विज्ञान स्क्रीन. एच एंड ई दाग मध्य मस्तिष्क वर्गों illustrating, बाएँ से दाएँ, कोई neurodegeneration, हल्के neurodegeneration, और पुष्टि की neurodegeneration. चढ़ाई परख का उपयोग कर उम्मीदवारों की पहचान के बाद ऊतक विज्ञान द्वारा कुल 51 समयुग्मज लाइनों retested किया गया. तीर मस्तिष्क में छेद से संकेत मिलता है neurodegeneration का संकेत. डॉटेड लाइनों द्वारा घेरे क्षेत्र लाइन 867 में मनाया गंभीर neurodegenration से पता चलता है।

Figure 3
चित्र 3 : न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान ब्रैट निम्नलिखित कमी मानचित्रण चढ़ाई परख का उपयोग कर. (ए ) दिखाया गया है एच एंड ई के प्रतिनिधि चित्र हैं 18-20 दिन पुराने w1118 (नियंत्रण), विषमयुग्मज 867 (867/+) और समयुग्मज 867 उत्परिवर्ती मक्खियों के मध्य मस्तिष्क वर्गों. (ख) कमी लाइन Df(2L)ED1272 (BL$24116) चढ़ाई परख के आधार पर 867 उत्परिवर्ती phenotype (काला हिस्टोग्राम) पूरक नहीं है. ऊतकीय सत्यापन से पता चलता है कि Df(2L)ED1272 लाइन 867 neurodegeneration phenotype पूरक नहीं है, जबकि Df(2L)ED1315 (BL $9269) करता है. ग्राफी प्रत्येक पंक्ति के लिए 5 चढ़ाई परीक्षणों के माध्य और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। तारांकन एक-तरफा ANOVA के आधार पर महत्व का संकेत देते हैं, जिसमें प्रत्येक पंक्ति के माध्य चढ़ाई प्रतिशत मूल्य की तुलना में रेखा 867/+ (हरी हिस्टोग्राम) के औसत चढ़ाई प्रतिशत मूल्य की तुलना में किया गया था। * पी एंड टी एल टी; 0.05, * * पी एंड एलटी; 0.01 और * * पी एंड एलटी; 0.001। (ग) ऊतक विज्ञान द्वारा 867 फीनोटाइप का अपूरित न होने के प्रमाण को दर्शाने वाली अतिरिक्त कमी रेखाओं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा Loewen एट अल से संशोधित किया गया है17; क्रिएटिव कॉमन्स रोपण 4.0 अंतर्राष्ट्रीय लाइसेंस के तहत प्रकाशित एक लेख.

Figure 4
चित्र 4 : बिंदु उत्परिवर्तन में ब्रैट जीन ब्रैट प्रोटीन के कुंडल-कोइल डोमेन में एमिनो एसिड परिवर्तन की ओर जाता है। (ए) कोडन क्षेत्र के प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए प्रयोग किए जाने वाले ब्रैट जीन मॉडल और प्राइमर। (बी) ब्रैट टिड्डी का डीएनए अनुक्रमण एक न्यूक्लिओटाइड परिवर्तन की पहचान करता है जो ब्रैट प्रोटीन के कुंडल कुंडल डोमेन में एमिनो एसिड परिवर्तन की ओर जाता है। यह आंकड़ा Loewen एट अल से संशोधित किया गया है17; क्रिएटिव कॉमन्स रोपण 4.0 अंतर्राष्ट्रीय लाइसेंस के तहत प्रकाशित एक लेख.

Figure 5
चित्र 5 : के आगे विश्लेषण ब्रैट उत्परिवर्ती में अपनी न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका की पुष्टि Drosophila| (क) गैल-4 और यूएएस प्रणाली22 का उपयोग करते हुए, कार्यात्मक ब्रैट जीन की न्यूरोब्लास्ट-विशिष्ट अभिव्यक्ति 867 म्यूटेंट में न्यूरोडिजेनरेशन फीनोटाइप को बचाती है। (ख) आयु पर निर्भर तंत्रिकाजनन 867 उत्परिवर्ती में देखा जाता है जिसमें एक रिपोर्टर जीन पीसीए-जीएफपीहोता है . ब्रैटchs लाइन 867 में brat allele के नाम से मेल खाती है, जो चीज़हेड (chs) नाम दिया गया था . दिखाया गया प्रतिनिधि एच एंड ई दाग yw (नियंत्रण) और समयुग्मज brat chs के midbrain वर्गों रहे हैं; pcna-GFP संकेत उम्र की मक्खियों. यह आंकड़ा Loewen एट अल से संशोधित किया गया है17; क्रिएटिव कॉमन्स रोपण 4.0 अंतर्राष्ट्रीय लाइसेंस के तहत प्रकाशित एक लेख.

स्टेशन समय तापमान वैक्यूम/दबाव समाधान
1 कोई देरी-त्वरित प्रारंभ नहीं
२ बंद बंद बंद
3 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON 80%ETOH
4 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON 95% EtOH
5 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON 100% EtOH
6 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON 100% EtOH
7 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON 100% EtOH
8 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON Xylenes
9 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON Xylenes
10 : 15 37 डिग्री सेल्सियस ON/ON Xylenes
11 : 30 58 डिग्री सेल्सियस ON/ON पैराफिन
12 : 15 58 डिग्री सेल्सियस ON/ON पैराफिन
13 बंद 58 डिग्री सेल्सियस बंद पैराफिन
14 : 15 58 डिग्री सेल्सियस ON/ON पैराफिन

तालिका 1: स्वचालित ऊतक प्रोसेसर के लिए अनुशंसित प्रोग्राम सेटिंग्स. यहाँ सूचीबद्ध क्रम में कदम निश्चित सिर के लिए एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

अभिकर्मक वॉल्यूम ($L)
10x ExTak बफर (Mg2+ plus) (20 m) 2.5
फॉरवर्ड प्राइमर (10 डिग्री सेल्सियस) 2.5
रिवर्स प्राइमर (10 डिग्री सेल्सियस) 2.5
2.5 एमएम डीएनटीपी २
टेम्पलेट डीएनए २
TaKaRa पूर्व टीक्यू (5 यू / 0.25
न्यूक्लेस-मुक्त पानी 13.25
कुल मात्रा 25

तालिका 2: पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों। ब्रैट-कोडिंग क्षेत्र को बढ़ाना करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया में प्रयुक्त अभिकर्मक ों और संबंधित संस्करणों।

चरण तापमान समय
35 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस 15 एस
55 डिग्री सेल्सियस 45 एस
72 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट 10 s
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस ∞

तालिका 3: पीसीआर के लिए इस्तेमाल थर्मल साइकिलिंग की स्थिति। यहाँ सूचीबद्ध क्रम में दिए गए चरणों का प्रयोग सारणी2में दर्शाए गए अभिक्रिया मिश्रण का प्रयोग करके तापीय चक्रक को प्रोग्राम करने के लिए किया जा सकता है।

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Discussion

Drosophila में फॉरवर्ड आनुवंशिक स्क्रीन उम्र पर निर्भर neuroprotection5,23,24सहित विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में शामिल जीन की पहचान करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण रहा है, 25. इस रणनीति का उपयोग करते हुए, हम एक उपन्यास न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन17के रूप में ब्रैट की पहचान करने में सफल रहे .

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम ऊतक विज्ञान विश्लेषण के लिए सिर के उचित अभिविन्यास शामिल है (जैसा कि धारा 4.4.3 में वर्णित है.) इसके अतिरिक्त, meiotic मानचित्रण के लिए इस्तेमाल लाइन के मार्करों नए उत्परिवर्तन के phenotype के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए (इस अध्ययन में: neurodegeneration). हम एक प्रारंभिक परीक्षण की पुष्टि करने के लिए कि चुना मार्करों अपने स्वयं के neurodegeneration कारण नहीं की सिफारिश की. उदाहरण के लिए, Jammed (जे) पंख फफोले कि संभवतः चढ़ाई के साथ हस्तक्षेप कर सकता है का कारण बनता है के रूप में amyloid अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) के लिए मामला है - overexpressing मक्खियों कि भी फफोले पंख26है . लोब (एल) आंखों के आकार में कमी की ओर जाता है; हालांकि, हम केंद्रीय मस्तिष्क अध: पतन का निरीक्षण नहीं करते हैं और इस मार्कर केंद्रीय मस्तिष्क neurodegeneration नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पिन और Sternoplural (एसपी) भी उपयोग करने के लिए उपयुक्त हैं, इन मार्करों ले जाने मक्खियों के दिमाग जंगली प्रकार नियंत्रण के दिमाग के लिए तुलनीय हैं के रूप में.

मक्खियों में आगे की आनुवंशिक पद्धति का एक नुकसान यह है कि डीएनए के क्षेत्रों को ब्याज3,5के लिए संकीर्ण करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई है . बेहतर मानचित्रण रणनीतियों का उपयोग27 अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की उपलब्धता के साथ 28 ब्याज की phenotypes के साथ जुड़े उत्परिवर्तनों की भी आसान पहचान की अनुमति चाहिए. फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन श्रम-प्रधान हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, ऊतक विज्ञान पुष्टि, जो मस्तिष्क में neurodegeneration के लिए सीधे assays, अकेले समय की एक काफी राशि की आवश्यकता है. हालांकि, इस दृष्टिकोण और अधिक कठिन और स्तनधारी मॉडल में प्रदर्शन करने के लिए महंगा हो जाएगा, जरूरी नहीं कि व्यापक आनुवंशिक अध्ययन की अनुमति. रासायनिक mutagenesis स्क्रीन फायदेमंद हैं क्योंकि बिंदु उत्परिवर्तनों की पहचान प्रभावित जीन 'उत्पादों के समारोह के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है. ब्रैट प्रोटीन के संरक्षित डोमेन में एमिनो अम्ल परिवर्तन के कारण बिंदु उत्परिवर्तन की पहचान , तंत्रिका संरक्षण18में इस TRIM-NHL प्रोटीन के कुंडल-कोइल डोमेन के महत्व को दर्शाती है . चढ़ाई परख, जो चलन व्यवहार के उपाय निश्चित रूप से गतिशीलता में दोष के लिए मक्खियों की बड़ी संख्या के तेजी से परीक्षण की अनुमति देकर फायदेमंद है, यह भी अक्सर मानव neurodegeneration25में देखा . यह परख भी इस तरह के vivo आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) स्क्रीन है कि न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में जीनोम चौड़ा के रूप में एक और स्क्रीन सेटिंग में प्रदर्शन किया जा सकता है. हालांकि हम परीक्षण कक्ष के नीचे और 8 सेमीसे 5 सेमी से गुजर लाइन के बीच की दूरी में कमी के लिए वर्तमान अध्ययन में एक सख्त गुजर दर निर्धारित करने के लिए, कम चढ़ाई दरलाइनों की बड़ी संख्या के लिए neurodegeneration दर्पण नहीं था. Neurodegeneration व्यवहार दोषों की शुरुआत के बाद स्पष्ट हो सकता है, जिसका अर्थ है कि मक्खियों को लंबे समय तक धानी दिखाई देने से पहले आयु वर्ग के लिए आवश्यकता हो सकती है. एक और संभावना यह है कि चलन दोष हम कुछ लाइनों में निरीक्षण दोषपूर्ण न्यूरोलॉजिकल कामकाज के कारण नहीं बल्कि मांसपेशियों में कमजोरी या मक्खियों के अधिक सामान्य अयोग्यता के कारण कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, यह संभव है कि हम संभावित उम्मीदवारों को याद कर रहे हैं, जिसमें चढ़ाई दोष कम उम्र में प्रकट नहीं होते हैं (जैसे, 10 दिन पुराने) बल्कि जीवन में बाद में प्रमुख हो जाते हैं। इस स्क्रीनिंग रणनीति निश्चित रूप से उम्र पर निर्भर जीन की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है, इस प्रकार तंत्रिका विकास के संभावित दोषों के साथ जुड़े जीन को नष्ट करने. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल उम्मीदवार लाइनों की वांछित संभावना के आधार पर समायोजित किया जा सकता है neuroprotection में शामिल उत्परिवर्तित जीन को शामिल करने के लिए. पासिंग दर सीमा को सीधे कम करना एक ही परिणाम प्राप्त करने का एक और साधन है। इन उम्मीदवारों सैद्धांतिक रूप से अधिक से अधिक neurodegeneration, जो पुष्टि और मानचित्रण के दौरान समय और संसाधनों की बचत कर सकता प्रदर्शन करेंगे.

सामान्य में, प्रोटोकॉल neurodegeneration के लिए स्क्रीन करने के लिए एक सीधा तरीका का वर्णन करता है और बाद में न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन उम्मीदवारों की पहचान. इस आनुवंशिक दृष्टिकोण व्यवहार और हिस्टोलॉजिकल यहाँ वर्णित परख तक ही सीमित नहीं है, और भी तापमान के प्रति संवेदनशील (टीएस) पक्षाघात, अंडे बिछाने या प्रजनन phenotypes जैसे अन्य phenotypes के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बस कुछ हवाला देते हैं. उदाहरण के लिए, Drosophila ts-paralytic उत्परिवर्ती neurodegeneration29 के लिए समृद्ध किया जा करने के लिए जाना जाता है और न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान के लिए एक अतिरिक्त स्रोत का प्रतिनिधित्व कर सकता है.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम विशेष रूप से डॉ बैरी Ganetzky के लिए आभारी हैं, जो प्रयोगशाला में आनुवंशिक स्क्रीन किया गया था, पहचान और एक न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन के रूप में brat की विशेषता की अनुमति. हम कृपया इस लेख में प्रस्तुत आनुवंशिक स्क्रीन में इस्तेमाल किया ENU-mutagenized मक्खियों का संग्रह प्रदान करने के लिए डॉ स्टीवन Robinow धन्यवाद. हम इस परियोजना की अवधि के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए Ganetzky प्रयोगशाला, Drs. Grace Boekhoff-Falk और डेविड Wassarman के सदस्यों को धन्यवाद, लिंग हो और बॉब Kreber तकनीकी सहायता के लिए, डॉ Aki Ikeda पर अपने microtome सुविधा के उपयोग के लिए विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय और डॉ किम Lackey और अलबामा विश्वविद्यालय में ऑप्टिकल विश्लेषण सुविधा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major equipment
Fume hood for histology
Light Microscope Nikon Eclipe E100 Preferred objective for imaging is 20x
Imaging software Nikon
Microscope Camera Nikon
Thermal cycler Eppendorf
Fly pushing and climbing assay
VWR® Drosophila Vial, Narrow VWR 75813-160
VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-912
Standard mouse pad
Stereoscope Motic Model SMZ-168
CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) Genesee Scientific 54-104, 59-121, 59-172 Doesn’t iinclude CO2 tank
Fine-Tip Brushes SOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila Incubator VWR 89510-750
Gene mapping
CantonS Bloomington Drosophila Stock Center 9517
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 5905
yw  Bloomington Drosophila Stock Center 6599
Drosophila line used for recombination mapping Bloomington Drosophila Stock Center 3227 Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco]  Bloomington Drosophila Stock Center 2555 Drosophila balancer line used for recombination mapping
Deficiency Kit for chromosome 2L Bloomington Drosophila Stock Center DK2L Cook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%) Thermo Fischer Scientific A4094
Chloroform Thermo Fischer Scientific C298-500
Glacial Acetic Acid Thermo Fischer Scientific A38-500
Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Thermo Fischer Scientific 05-408-129
Histochoice clearing agent 1x VWR Life Sciences 97060-934
Harris Hematoxylin VWR 95057-858
Eosin VWR 95057-848
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium Thermo Scientific™ 4112 22-110-610 CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus Azer Scientific
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545M Dimensions: 24 mm x 60 mm
Traceable timer VWR
Slide Warmer Barnstead International model no. 26025
Slide tray and racks DWK Life Sciences Rack to hold 20 slides
Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps Fisherbrand 10-316A
Kimwipes™ Kimberly-Clark™ Professional 
6 inch Puritan applicators Hardwood Products Company, Guilford, Maine 807-12
VWR® Razor Blades VWR 55411-050
Tupperware or glass containers for histology liquids 16 + 1 for running water
High Profile Coated Microtome Blades VWR 95057-834
Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L Corning™
Beaker Or other container for ice water and cassettes
Tissue Bath Precision Scientific Company 66630
Microtome Leica Biosystems
Molecular analysis
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Ex Taq DNA polymerase TaKaRa 5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain   Invitrogen™
UltraPure™ Agarose  Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder  Invitrogen™
ApE-A plasmid Editor software Available for free download
Statistical analysis
R software package
Further analysis
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center 59967

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References

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जेनेटिक्स अंक 149 Drosophila मेलेनोगैस्टर,neurodegeneration आगे आनुवंशिक स्क्रीन चढ़ाई परख ऊतक विज्ञान जीन मानचित्रण डीएनए अनुक्रमण
विवो फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में <em>ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर</em> में उपन्यास न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान करने के लिए
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Gevedon, O., Bolus, H., Lye, S. H., Schmitz, K., Fuentes-González, J., Hatchell, K., Bley, L., Pienaar, J., Loewen, C., Chtarbanova, S. In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59720, doi:10.3791/59720 (2019).

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