In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

Summary

Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

Abstract

C'è molto da capire sull'insorgenza e la progressione delle malattie neurodegenerative, compresi i geni sottostanti responsabili. Lo screening genetico in avanti utilizzando mutageni chimici è una strategia utile per mappare i fenotipi mutanti ai geni tra la Drosophila e altri organismi modello che condividono le vie cellulari conservate con gli esseri umani. Se il gene mutato di interesse non è letale nelle fasi iniziali dello sviluppo delle mosche, è possibile eseguire un'analisi in aumento per esaminare gli indicatori fenotipici del funzionamento del cervello in diminuzione, come i bassi tassi di arrampicata. Successivamente, è possibile eseguire un'analisi istologica secondaria del tessuto cerebrale per verificare la funzione neuroprotettiva del gene segnando fenotipi di neurodegenerazione. Le strategie di mappatura genica includono la mappatura meiotica e di carenza che si basa su questi stessi assegni può essere seguita dal sequenziamento del DNA per identificare possibili cambiamenti nucleotidi nel gene di interesse.

Introduction

I neuroni sono per la maggior parte post-mitotici e incapaci di dividere^1,2. Nella maggior parte degli animali, esistono meccanismi neuroprotettivi per mantenere queste cellule per tutta la durata della vita dell'organismo, soprattutto in età avanzata quando i neuroni sono più vulnerabili ai danni. I geni alla base di questi meccanismi possono essere identificati in mutanti che presentano neurodegenerazione, un indicatore fenotipipico per la perdita di neuroprotezione, utilizzando un protocollo genetico in avanti. Gli schermi genetici in avanti che utilizzano mutageni chimici come il metaesonte etilare (EMS) o N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) sono particolarmente utili a causa delle mutazioni casuali che inducono, con conseguente un approccio intrinsecamente imparziale che ha fatto luce numerose funzioni geniche negli organismi del modello eucariotico^3,4,5 (al contrario, la mutagenesi a raggi X crea rotture del DNA e può provocare riarrangiamento piuttosto che mutazioni puntiformi⁶).

Il comune filo della frutta Drosophila melanogaster è un soggetto ideale per questi schermi grazie alla sua alta qualità, sequenza genomica ben annotata, la sua lunga storia come organismo modello con strumenti genetici altamente sviluppati, e più significativamente, la sua comune storia evolutiva con gli esseri umani^7,8. Un fattore limitante nell'applicabilità di questo protocollo è la letalità precoce causata dai geni mutati, che impedirebbe i test ai⁹anni . Tuttavia, per le mutazioni non letali, un saggio di arrampicata, che sfrutta il geotassi negativo, è un metodo semplice, anche se esteso, per quantificare il funzionamento motorio alterato¹⁰. Per mostrare una sufficiente reattività locomotoria, le mosche dipendono dalle funzioni neurali per determinare la direzione, percepire la sua posizione e coordinare il movimento. L'incapacità delle mosche di salire sufficientemente in risposta agli stimoli può quindi indicare difetti neurologici¹¹. Una volta identificato un particolare fenotipo dell'arrampicata difettosa, ulteriori test utilizzando uno schermo secondario come l'analisi istologica del tessuto cerebrale, possono essere utilizzati per identificare la neurodegenerazione nelle mosche difettose dell'arrampicata. La successiva mappatura genica può quindi essere utilizzata per rivelare la regione genomica sul cromosoma che porta il gene neuroprotettivo difettoso di interesse. Per restringere la regione cromosomica di interesse, è possibile eseguire la mappatura meiotica utilizzando linee di mosca mutanti che trasportano geni marcatori dominanti con posizioni note sul cromosoma. I geni marcatori fungono da punto di riferimento per la mutazione, poiché la frequenza di ricombinazione tra due loci fornisce una distanza misurabile che può essere utilizzata per mappare la posizione approssimativa di un gene. Infine, l'attraversamento delle linee mutanti con linee che trasportano carenze equilibrate sulla regione cromosomica meioticamente mappata crea un test di complemento in cui il gene di interesse può essere verificato se il suo fenotipo noto è espresso⁵. Le sequenze di nucleotidi polimorfici nel gene identificato, eventualmente risultanti in sequenze di amminoacidi alterate, possono essere valutate sequenziando il gene e confrontandolo con la sequenza del genoma della Drosophila. La successiva caratterizzazione del gene di interesse può includere test di ulteriori alleli mutanti, esperimenti di salvataggio delle mutazioni e l'esame di fenotipi aggiuntivi.

Protocol

1. Preparazione e invecchiamento delle mosche

1. Ottenere o generare⁶ una raccolta di mutanti Drosophila che verranno utilizzati per lo schermo genetico. Qui vengono utilizzate linee ENU-mutagenized mappate al secondo cromosoma e bilanciate rispetto al CyO.
2. Amplificate le linee di genotipo sperimentale in un'incubatrice fissata a 25 gradi centigradi, 12 h ciclo chiaro/scuro sul mezzo della farina di mais-melassa.
3. Raccogli circa 20 progenie omozionali tra 0-2 giorni di eclosione adulta da ogni genotipo sperimentale. Elimina i pregiudizi sessuali raccogliendo costantemente mosche maschili o femminili.
4. Età le mosche su melassa di farina di mais come desiderato a 29 gradi centigradi, capovolgendo le fiale ogni 2-3 giorni al fine di mantenere le mosche sul cibo fresco come invecchiano. Nella schermata qui presentata, le mosche sono state invecchiate per 10-12 giorni.
5. Assemblare una camera di prova di prova di prova di prova di arrampicata utilizzando due fiale e nastro come descritto in precedenza¹⁰. Le fiale devono essere collegate ad entrambe le estremità aperte. Utilizzare un righello per contrassegnare una linea di 5 cm su un'estremità della camera.

2. Protocollo 1: Ansaggio dell'arrampicata (Adattato da Ali et al.¹⁰)

1. Convalidare il test di arrampicata. In questo studio, testare il test di arrampicata basato sulla metodologia precedentemente descritta da Ali et al.¹⁰, utilizzando Elav^C155>UAS-Tau^R406W (che presenta tassi di passaggio di salita più bassi) e Elav^C155>UAS-GFP ( e Elav^C155>UAS-mCherry (controllo) vola.
2. Capovolgere le mosche in una camera di prova, una linea alla volta (non utilizzare l'anestesia CO₂₎ e consentire loro di recuperare per 5 min. Se il test viene eseguito in giorni diversi, eseguire il test alla stessa ora del giorno. In questo studio, tutti i saggi di arrampicata sono stati eseguiti nel pomeriggio per controllare gli effetti circadiani sulla locomozione¹².
   NOT: Evitare di esporre le mosche alla luce solare diretta durante i test; questo interferirà con la loro capacità di salire.
3. Toccare con la punta la camera (contrassegnata lateralmente) su un mouse pad posizionato su una superficie solida 3 volte in modo che tutte le mosche inizino il saggio nella parte inferiore. Osservare la locomozione a mosca per un periodo di 10 s.
4. Registrare il numero di mosche che raggiungono o superano la linea di 5 cm entro questo periodo, così come il numero totale di mosche testate. Ripetere il protocollo, in attesa di 1 min tra ogni prova, per un minimo di 3 repliche di prova per linea.
   NOT: Nel presente studio, ogni fiala conteneva tra 2 e 19 mosche per lo screening iniziale (mosche maschili) e tra 6 e 21 mosche per l'analisi della carenza mutante di linee femminili incrociate (Sezione 5.3.).

3. Protocollo 2: Selezione dei ceppi di Drosophila per ulteriori analisi

1. Inserisci i dati di analisi in salita in Microsoft Excel o in un software simile e calcola la frequenza di passaggio per l'arrampicata su tutte le repliche come percentuale.
2. Eseguire analisi statistiche per rilevare linee mutanti che si discostano in modo significativo dal valore medio di arrampicata percentuale di tutte le linee utilizzando il pacchetto software R¹³.
   1. Leggere i file di dati curati per i file R (file con estensione csv o txt con una colonna per ogni variabile o fattore e le righe che rappresentano i valori specifici).
      NOT: Qui, i dati per i maschi (analisi iniziale) e le femmine (linea 867 attraversata per linee di carenza) sono stati inseriti in fogli .xlsx separati come due colonne, una in cui le righe della colonna identificano la linea mutante e quante volte il saggio è stato replicato e l'altro in cui le righe rappresentano il successo medio dell'arrampicata (in percentuale) per ogni fiala replicante delle mosche.
   2. Leggere i dati in R usando il codice seguente:Read the data into R using the following code:
      mali<-read.csv(".. /male_init.csv")
      femdef<-read.csv(".. /fem_def_cross.csv")
      NOT: Il ".." nelle directory path sono percorsi assoluti dalla directory radice del computer dell'utente e devono essere specificati dal singolo utente per i percorsi di directory del computer.
   3. Eseguire la modellazione lineare
      1. Eseguire la regressione variabile fittizia con la funzione lm in R. Per l'analisi iniziale delle linee mutanti, valuta il significato degli effetti a livello di fattore (linee mutanti) sulla percentuale di successo dell'arrampicata contro la grande media per una variabile di risposta centrata media zero (percentuale di successo).
         NOT: Il "-1" alla fine della chiamata di funzione lm nella sezione 3.2.3.2. rimuove l'intercetta e ci permette di testare tutti i livelli di fattore contro la media zero centrata tasso di percentuale di arrampicata tasso di passaggio.
      2. Stampare i risultati sullo schermo utilizzando la funzione di riepilogo R:
         mali_anova<-lm(scala(mali-Successo_P)
         summary(mali_anova)
      3. Utilizzare le righe di controllo (se presenti) come linea di base per testare gli effetti a livello di fattore rispetto all'utilizzo del seguente codice R: x<-relevel(femdef-Mutant_line, ref-a867_plus")
         femdef_anova<-lm(femdef'P_success'x)
         riepilogo(femdef_anova)
         NOT: La prima riga di codice riordina i livelli dei fattori in modo che la linea di controllo negativa diventi l'intercetta di base in cui vengono testati tutti gli altri livelli di fattore (linee mutanti) con i test tincorporati nella funzione lm.
3. Scegliere una soglia per le righe candidate in base all'età al momento del test. Per determinare la soglia, eseguire un test preliminare all'età desiderata utilizzando mutanti noti che mostrano neurodegenerazione e bassi tassi di passaggio di arrampicata rispetto al tipo selvaggio, il controllo vola¹⁰.
   NOT: Un tasso di superamento inferiore al 50% può essere appropriato per le mosche di 10 giorni, come riportato in precedenza per le linee della Drosophila che sovraesprimono il gene Tau correlato alla neurodegenerazione umana nel sistema nervoso¹⁰. Le mosche più vecchie dovrebbero avere una soglia di superamento più alta poiché si prevede che mostrino una ridotta locomozione, quindi, una maggiore neurodegenerazione.

4. Protocollo 3: Analisi dell'istologia

1. Indossare guanti, tagliare le teste a mosca con una lama chirurgica seguendo il saggio di arrampicata e utilizzare un pennello per metterli delicatamente in 1 mL del fissativo di Carnoy (6:3:1 di 100% EtOH: cloroformio: acido acetico glaciale) in un tubo di micro centrifuga da 1,5 ml O/N a 4 gradi centigradi. Assicurarsi che le teste affondino nella soluzione fissativa.
2. Sostituire la soluzione fissativa il giorno successivo con 1 mL del 70% di EtOH e mantenere i campioni ancora a 4 gradi centigradi per le analisi future.
   NOT: Il protocollo può essere sospeso in questo passaggio.
3. Posizionare le testine dal punto 4.2. un massimo di cinque per cassetta microbiosa. Posizionare immediatamente le cassette in un contenitore riempito con il 70% di EtOH. Conservare il contenitore a 4 gradi centigradi prima della spedizione in un impianto di istologia per l'elaborazione e l'incorporamento della paraffina delle testine. Se sono disponibili apparecchiature per l'elaborazione e l'incorporamento dei tessuti, seguire il passaggio 4.4.
4. Incorporare le testine in paraffina per la sezionazione microtoma:
   1. Seguire le impostazioni del programma per una macchina automatizzata per l'elaborazione dei tessuti nell'ordine presentato nella Tabella 1 per disidratare, pulire e infiltrarsi con paraffina le testine.
   2. Trasferire i campioni in stampi di base metallici che si adattano alla cassetta utilizzando la paraffina riscaldata a 60 gradi utilizzando una stazione di incorporamento di paraffina.
   3. Orientare le teste (orientamento antero-posteriore rivolto verso la parte superiore) nello stampo di base utilizzando pinze sottili per consentire una corretta visualizzazione del tessuto cerebrale dopo la sezione. Questo può essere fatto riscaldando la paraffina a 60 gradi centigradi e riposizionando le testine, se necessario.
      NOT: Gli stampi metallici possono essere sostituiti da stampi di base usa e getta.
   4. Posizionare la cassetta sulla parte superiore dello stampo di base corrispondente e spostarle delicatamente sul lato refrigerato della stazione di incorporamento della paraffina (4 gradi centigradi). Attendere che il blocco si indurisce prima di rimuoverlo dalla stazione.
   5. Rimuovere il blocco formare lo stampo dissociando delicatamente lo stampo dalla cassetta.
5. Tagliare ogni blocco di paraffina prima della sezionamento per ridurre al minimo la superficie che verrà sezionata.
6. Impostare il microtoma per tagliare 5 sezioni m di ciascun blocco.
7. Posizionare il nastro di paraffina sezionato contenente il tessuto in un bagno d'acqua riscaldata (35 gradi centigradi) per un massimo di 5 min.
8. Immergere un vetrino rivestito in poli-lysina (aiuta a trattenere il tessuto) nel bagno d'acqua riscaldata, posizionando il nastro sezionato sul vetrino utilizzando applicatori di legno. Lasciare asciugare l'aria dello scivolo o/N a temperatura ambiente.
9. Riscaldare i vetrini per 15 minuti a 63 gradi centigradi utilizzando uno scaldavele.
10. Posizionare i vetrini su un rack di colorazione scivoloe e macchia con ematossilina e eosina (H&E) sotto un cappuccio fuma rispettando i seguenti passaggi.
    1. Posizionare il rack in Histochoice (sostituzione non tossica di Xylene, che aiuta a rimuovere la paraffina dal campione) per 5 min.
    2. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Histochoice per 5 min.
    3. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH 1 per 5 min.
    4. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH 2 per 5 min.
    5. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 95% EtOH per 3 min.
    6. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 70% EtOH per 3 min.
    7. Trasferire il rack in un contenitore riempito con Distilled H₂O per 5 min.
    8. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Harris Hematoxylin per 2-5 min.
    9. Estrarre il rack dalla soluzione Hematoxylin e metterlo sotto l'acqua corrente del rubinetto per 10 min.
    10. Trasferire il rack in un contenitore riempito con acqua distillata facendo una breve macchia.
    11. Trasferire il rack in un contenitore riempito con Eosin per 1-2 min.
    12. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 95% EtOH facendo una breve dunk.
    13. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 95% EtOH per 5 min.
    14. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH per 5 min.
    15. Trasferire il rack in un contenitore riempito con 100% EtOH per 5 min.
    16. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Histochoice (o Xylene) per 5-10 min fino a quando tutti gli scivoli sono montati.
    17. Montare il vetrino e la vela (24 mm x 60 mm di dimensione). Utilizzando pinze, estrarre lo scivolo dalla soluzione Histochoice o Xylene e fare una sottile striscia di supporto di montaggio sulla parte superiore di esso. Posizionare delicatamente la coverslip sulla parte superiore, cercando di evitare la formazione di bolle.
    18. Lasciare che il supporto di montaggio sui vetrini montati indurisci O/N sotto il cofano del fumi prima dell'analisi.
    19. Conservare i vetrini macchiati in una scatola a temperatura ambiente.
11. Quantifica la neurodegenerazione osservando tutte le sezioni seriali sulla diapositiva all'ingrandimento 20x al microscopio luminoso. Esaminare l'intero cervello, prendendo nota qualitativa delle dimensioni e il numero di vacuoli che appaiono in tre sezioni consecutive.
12. Ottenere immagini di sezioni cerebrali rappresentative a circa il cervello medio utilizzando un microscopio luminoso dotato di software di imaging.

5. Protocollo 4: Mappatura genica del fenotipo mmutante recessivo

1. Superare la linea candidata verso un tipo selvaggio CantonS (BL_ 9517) o un altro tipo selvaggio o ceppo isogenato (ad esempio, OregonR (BL_ 2376), w¹¹¹⁸ (BL_5905) o yw (BL_ 6599) per determinare se il fenotipo è dominante o Recessivo.
   NOTA: i risultati di questo passaggio guideranno i passaggi successivi della mappatura. Se il fenotipo è recessivo, è possibile eseguire la mappatura della carenza.
   1. Utilizzando un pennello, fare una croce mettendo in una fiala contenente cibo CO₂-anestesizzato mosche della linea di interesse mutante (5 maschi) e la linea CantonS (10-15 femmine vergini). Posizionare la fiala a 25 gradi centigradi.
   2. Raccogli la progenie eterozigola di F1 e ripeti l'arrampicata e gli esperimenti di istologia.
   3. Confronta i risultati ottenuti con la sola linea di controllo e con i mutanti omozifuti. Una buona indicazione del fenotipo recessivo sarà se i mutanti eterozie presentano fenotipi simili a quelli delle mosche di tipo selvatico.
2. Eseguire la mappatura meiotica per stimare approssimativamente la posizione della mutazione sul secondo cromosoma utilizzando il wg^Sp-1 J^{1 L 2} Pin¹/CyO (BL_3227) o un ceppo equivalente con marcatori dominanti associati a noti posizione citologica. In questo caso, la mutazione era precedentemente nota per essere situata sul secondo cromosoma.
   1. Utilizzando un pennello, fare una croce mettendo in una fiala contenente cibo CO₂-anestesizzato mosche della linea di interesse mutante (5 maschi) e il wg^Sp-1 J^{1 L 2} Pin¹/CyO linea (10 femmine). Posizionare la fiala a 25 gradi centigradi.
      NOT: L'obiettivo di questa croce è quello di generare femmine eterozie che portano il cromosoma con la nuova mutazione e il cromosoma marcatore, che si ricombinano durante la meiosi^6,14. La progenie femminile di F1 viene scelta piuttosto che i maschi poiché la ricombinazione non avviene nei maschi.
   2. Raccogliere almeno 15 progenie femminile vergine che trasportano il cromosoma con la nuova mutazione e il cromosoma marcatore e attraversarli a 5 maschi da una linea equilibrata che porta un altro marcatore dominante visibile (ad esempio, CyO/sna^Sco (BL_2555) o equivalente).
   3. Raccogliere la progenie maschile etetozia portando sia Sco o CyO e il cromosoma potenzialmente ricombinato dalla croce nel passo 5.2.2. e accoppiarli individualmente alle femmine vergini dello stock portando il cromosoma mutato.
   4. Raccogliere la progenie dalla croce finale descritta nel passaggio 5.2.3. e l'età delle mosche a 29 gradi centigradi (in questo studio le mosche sono state invecchiate per 10-14 giorni).
   5. Raccogliere teste, eseguire l'analisi istologica come descritto nel Protocollo 3 e guardare le diapositive con sezioni cerebrali per determinare il grado di neuropatologia come descritto al passaggio 4.11. L'analisi istologia viene eseguita piuttosto che l'analisi della locomozione a causa di fenotipi che possono influenzare l'analisi dell'arrampicata, come Jammed (J), che provoca l'accumulo di liquidi nelle ali¹⁵.
3. Eseguire la mappatura delle carenze sulla regione ristretta del cromosoma per affinare la posizione della mutazione recessiva utilizzando il saggio di arrampicata. Ogni linea di carenza ha una cancellazione di diverse regioni dei cromosomi, permettendo loro di essere utilizzati per i test di completamento.
   1. Iniziare con grandi carenze che attraversano la regione identificata nella mappatura meiotica, che può poi essere ulteriormente ridotta dall'uso di carenze più piccole. Se l'analisi della carenza si traduce in più di un gene candidato, si raccomanda l'uso di stock di interferenza dell'RNA (RNAi) per indirizzarli.
   2. Le linee incrociate del kit di carenza della Drosophila ¹⁶ per il secondo cromosoma (DK2L in questo studio) e cercano il non complemento del fenotipo di interesse (in questo studio: tasso di passaggio di arrampicata dell'8,5% che corrisponde al tasso di passaggio mosche omoygous dalla linea 867 usato come controllo positivo).
   3. Confermare il fenotipo della neurodegenerazione utilizzando la verifica istologica come descritto nella Sezione 4 (Protocollo 3).

6. Protocollo 5: Sequenziamento e analisi del DNA

NOT: Tenete a mente che la mutagenesi ENU introduce mutazioni puntiformi¹¹.

1. Progettare sequenze di primer in avanti e inverse che fiancheggiano la regione di codifica esone del gene brat per l'amplificazione da parte della reazione a catena Polimerasi (PCR) della regione di interesse (nel caso della linea 867 un frammento di DNA delle dimensioni di 3.247 bp è amplificato per sequenziamento¹⁷).
2. Estrarre il DNA da una singola mosca¹⁸ :
   1. Schiaccia delicatamente la mosca in un tubo di centrifuga di 0,5 mL contenente 50.L di tampone di squishing (10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl e 200 g/mL Proteinase K; l'enzima deve essere diluito fresco da uno stock congelato prima di ogni utilizzo) utilizzando una punta di traino o P200.
   2. Incubare per 30 min a 37 gradi centigradi
   3. Disattivare la Proteinasi K posizionando il tubo a 95 gradi centigradi per 2 min.
      NOT: Il DNA estratto può essere conservato a 4 gradi centigradi per diversi mesi.
3. Eseguire la reazione PCR utilizzando un DNA ad alta fedeltà Taq Polymerase (reagenti e condizioni di ciclo termico utilizzate in questo studio sono riportati rispettivamente nella tabella 2 e nella tabella3) rispettando le istruzioni del produttore ed eseguire il prodotto PCR su un % gel di agarose contenente Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain, che è un'alternativa non tossica del bromuro di Ethidium.
4. Accisa la banda della dimensione corretta dal gel con un bisturi e purifica il prodotto PCR utilizzando il Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System (Promega) o kit equivalente, rispettando le istruzioni del produttore.
5. Progettare primer in avanti e inretro che verranno utilizzati per il sequenziamento del DNA al fine di coprire l'intera regione di interesse, se possibile. Sequenziare il DNA purificato dal gel dal passaggio precedente per identificare le mutazioni puntiformi. Alta precisione nel sequenziamento fluorescente automatizzato Sanger potrebbe essere raggiunto fino a 700 bp.
   NOT: Il polimerasi Ex Taq (TaKaRa) può essere utilizzato per amplificare i prodotti PCR da modelli di DNA genomico fino a 20 kb di dimensioni.
6. Analizzare le sequenze di DNA ottenute utilizzando l'A plasmid Editor (ApE, di M. Wayne Davis) o software simili allineandoli e confrontandoli con le sequenze ottenute a seguito del sequenziamento della stessa regione genomica di un ceppo di riferimento (ad esempio, originariamente mutagenizzato linea).
   1. Aprire i file di sequenziamento con ApE. Come riferimento, utilizzare un file ApE contenente la sequenza genomica di consenso del gene moccioso scaricato in un formato FASTA da Flybase, o un file contenente i risultati per la sequenza di controllo genetico del background (ad esempio, Drosophila originariamente mutagenizzata linea).
   2. Passare a Strumenti, quindi Allinea sequenze. Utilizzando il mouse del computer, selezionare tutte le sequenze da confrontare. Ricordarsi di indicare la sequenza di riferimento utilizzata per questo allineamento nel menu a discesa.
   3. Esaminare l'area in sequenza per le modifiche nucleotidiche rispetto alla sequenza di riferimento. Se lo si desidera, salvare l'allineamento sul computer in formato RTF facendo clic su Testo, quindi su Salva.
      NOT: Se non venissero identificate mutazioni, il protocollo di sequenziamento e analisi del DNA verrebbe ripetuto con i primer progettati per includere regioni non codificanti del gene.

7. Protocollo 6: Ulteriore analisi della funzione genica candidata

1. Eseguire esperimenti di salvataggio nei neuroblasti per determinare se il brat genico è responsabile del fenotipo della neurodegenerazione.
   1. Doppio equilibrio di uno stock UAS-brat¹⁹ e di uno stesso worniu-Gal4 (wor-G4 ) specifico del neuroblast (wor-G4) che trasportano i costrutti sul terzo cromosoma, così come la linea 867, che è mutante per il brat gene situato sul secondo cromosoma m.
      1. Fare tre croci separate mettendo in tre diverse fiale contenenti cibo 5 maschi da UAS-Brat, wor-G4 e 867 linee e aggiungere ad ogni set di maschi 10-15 femmine vergine da una linea che trasporta marcatori e bilanciatori per il secondo e terzo cromosoma (Sp/CyO; Dr/Tm3,sb; BL_59967).
      2. Raccogliere 10-15 femmine vergini dalla F1 di ogni croce con i seguenti genotipi: UAS-brat/Tm3,sb, /CyO; wor-G4/Tm3,sb e 867/CyO;/Tm3,sb di ciascuno dei seguenti genotipi: UAS-brat/Tm3,sb, s/Sp; wor-G4/Tm3,sb e 867/CyO;
      3. Cross collelcted : /CyO; UAS-brat/Tm3,sb femmine vergini a s/Sp; UAS-brat/Tm3,maschi sb; in una fiala separata fare una seconda croce con s/CyO; wor-G4 /Tm3,sb femmine vergini a "/Sp; wor-G4/Tm3,sb maschi e poi in una terza fiala cross 867/CyO;/Tm3,sb femmine vergine e 867/CyO;
      4. Dalla F1 di ciascuna di queste croci, raccogliere sia maschi che femmine dei seguenti genotipi: Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb dalla prima croce, Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb dalla seconda croce e 867/CyO; Dottor/Tm3, sb dalla seconda croce.
      5. Esegui un incrocio finale tra fratelli e sorelle raccolti da ogni progenie di F1 per stabilire azioni permanenti a doppio equilibrio per tutte e tre le linee.
   2. Combina UAS-brat e wor-G4 con la mutazione 867.
      1. Raccogliere un numero sufficiente (20-30 mosche) di femmine vergini dell'867/CyO; Dr/Tm3,sb doppia azione bilanciata per eseguire due croci.
      2. Mettere 10-15 femmine vergini con 5 maschi dell'Sp/CyO; UAS-brat/Tm3,sb (#1 incrociata) e in una seconda fiala 10-15 femmine vergine con 5 Dollari Sp/CyO; wor-G4/Tm3,sb maschi.
      3. Raccogliere fratelli e sorelle dalla F1 di ogni croce con i seguenti genotipi: 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb da cross #1 e 867/CyO;wor-G4/Tm3,sb da cross #2. Usa la progenie di F1 raccolta da ogni croce per stabilire scorte permanenti incrociando fratelli e sorelle tra di loro.
         NOT: A seguito di questa fase finale, le scorte per 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb e 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb deve essere generato.
   3. Eseguire l'esperimento di salvataggio.
      1. Raccogliere 15-20 femmine vergini dal 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb stock e attraversarli a 5-10 maschi dal magazzino 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb. Come controllo, attraversare le femmine vergini da 867-20 femmine dalla 867/CyO; wor-G4/Tm3,sb e 15-20 femmine vergini dal 867/CyO; UAS-brat/Tm3,sb linea alla linea 867/CyO da solo.
         NOT: 867 mosche trasportano un allele sensibile alla temperatura di moccioso e la croce di salvataggio deve essere eseguita a 29 gradi centigradi.
      2. Raccogliere la seguente progenie F1 da ogni croce selezionando con attenzione i bilanciatori contrassegnati: 867/867; wor-G4/UAS-brat (salvataggio), 867/867; wor-G4 / (controllo) e 867/867; UAS-brat / (controllo).
      3. Età le mosche come desiderato a 29 gradi centigradi ed eseguire l'analisi istologica sul cervello per cercare la neurodegenerazione utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 4 (Protocollo 3).
2. Esegui analisi dipendenti dall'età della neurodegenerazione in 867 mutanti.
   1. Raccogliere 867;pcna-GFP e yw tramite moscerini di controllo, che trasportano un gene reporter (pcna-GFP) e sono vitali a 25 oC e mostrano sia una maggiore penetrazione che una maggiore espressività del fenotipo della neurodegenerazione rispetto a 867 da solo in questo temperatura¹⁷.
   2. Età delle mosche fino a 5, 15 e 25 come descritto nella Sezione 1.4 ed eseguire successive analisi istologiche seguendo il protocollo nella Sezione 4 (Protocollo 3).

Representative Results

In questo aertico, presentiamo i passi utilizzati per identificare il tumore del cervello genico (brat) come svolgere un ruolo nel mantenimento dell'integrità neuronale (ad esempio, neuroprotezione) nelle mosche adulte¹⁷; una metodologia che può essere utilizzata per identificare i geni coinvolti nella neuroprotezione. Abbiamo usato un approccio genetico in avanti (la strategia è delineata nella Figura 1A) per esaminare una raccolta di mosche chimicamente mutagenizzate utilizzando un saggio di arrampicata (l'apparato utilizzato per questo saggio è mostrato nella Figura 1B). Tra le 235 linee omozygose, circa il 37% delle linee testate presentava un tasso di passaggio di arrampicata inferiore al 50% se testato all'età di 10-12 giorni (Figura 1C). Il 58% delle linee testate mostrava un comportamento di arrampicata significativamente diverso quando la loro percentuale di superamento dell'arrampicata (CPR) è stata confrontata con il valore percentuale medio di arrampicata di tutte le linee testate utilizzando ANOVA unidirezionale (Figura 1D). Il successivo schermo istologico su 51 delle linee che mostravano il tasso di passaggio di arrampicata più basso ha rivelato che 29 di queste linee mostravano l'aspetto visibile dei fori nel neuropil cerebrale (che vanno da lievi a gravi) indicativi della neurodegenerazione²⁰ ( figura 2). Tra le linee che mostrano il comportamento di arrampicata difettoso e la neurodegenerazione severa, scegliamo di mappare la mutazione alla base del fenotipo nella linea 867 (0% CPR e valore P : 1.36e-14 basata su ANOVA di sola andata). Il fenotipo della neurodegenerazione in 867 mosche è recessivo perché il cervello di mosche eterozino 867 che sono state incrociate a un ceppo di tipo selvaggio sono paragonabili a questi controlli (Figura 3A). Utilizzando l'istologia, la mappatura meiotica collocava la mutazione nei luoghi citologici 31-51, tra i marcatori fenotipici J (Jammed) e L (Lobo) sul secondo cromosoma della Drosophila. Utilizzando il saggio di arrampicata, la mappatura delle carenze tra le posizioni citologiche 31 e 51 con linee del kit di carenza di Drosophila per il cromosoma 2L (DK2L)¹⁶ ha mappato la mutazione in una regione che comprende 118 geni (Figura 3B; in cui 867/z funge da controllo per l'analisi statistica). L'esame del fenotipo cerebrale di 867 mutanti incrociati a ulteriori linee di carenza (Figura 3C) ha confermato che la mutazione è contenuta in una regione del genoma che include il bratgenico . Un elenco completo di tutti i geni aggiuntivi contenuti in queste eliminazioni può essere trovato in Flybase facendo clic sul link associato al segmento eliminato (ad esempio, per Df(2L)ED1272 il segmento eliminato è 37C5-38A2). Sulla base di osservazioni precedenti che i mutanti mocciosi hanno cellule supernumerarie nel loro cervello²¹, un fenotipo osservato anche in 867 mutanti, brat è stato selezionato per l'analisi del sequenziamento del DNA. Il sequenziamento del gene moccioso contenente la regione di codifica esonia identificata ha identificato il cambiamento del nucleotide G/A nella posizione 37.739 del gene (Figura 4A), portando alla variazione della glicina all'acido glutammico (G/E) nella posizione 470 della proteina Brat¹⁷ (Figura 4B). Esperimenti di salvataggio confermano che Brat svolge un ruolo neuroprotettivo, come la sovraespressione del gene funzionale nella linea 867 sopprime il fenotipo di neurodegenerazione (Figura 5A). Inoltre, il fenotipo in 867 mutanti peggiora nel tempo, suggerendo che il marmocchio svolge un ruolo dipendente dall'età nella neuroprotezione¹⁷ (Figura 5B).

Figura 1 : Screening genetico avanzato per identificare nuovi geni neuroprotettivi. (A) Strategia dello schermo. (B) Arrampicata sudetto di prova apparato. (C) Risultati di test per i maschi provenienti da 235 linee omozigole ENU-mutagenizzate. Il grafico a torta rappresenta le proporzioni delle linee di volo testate che rientrano in 4 gruppi di percentuali di passaggi di arrampicata: 0% , 1-20% , 21-50% e 51-100% . (D) Risultati dell'analisi statistica ANOVA a 1 modo in cui le linee mutanti sono state confrontate con il valore medio percentuale di arrampicata di tutte le linee testate. Rappresentato è il numero di due categorie di valori P: P < 0,05 (modifica significativa) e P > 0,05 (modifiche non significative).

Figura 2 : Schermo istologico secondario. Le sezioni del mid brain con macchie H&E che illustrano, da sinistra a destra, nessuna neurodegenerazione, neurodegenerazione lieve e neurodegenerazione confermata. Un totale di 51 linee omozive sono state testate dalla istologia dopo l'identificazione dei candidati utilizzando il test di arrampicata. Le frecce indicano i fori nel cervello indicativi della neurodegenerazione. La regione cerchiata dalle linee tratteggiate mostra la grave neurodegenazione osservata nella linea 867.

Figura 3 : Identificazione del gene neuroprotettivo marmocchio seguendo la mappatura della carenza utilizzando il saggio di arrampicata. (A) Sono mostrate immagini rappresentative di sezioni cerebrali di 18-20 giorni di età pari a ¹¹¹⁸ (Controllo), eterozigo867 (867/ )e 867 mosche mutanti omozygous. (B) La linea di carenza Df(2L)ED1272 (BL_24116) non completa il fenotipo mutante 867 (istogramma nero) basato sul saggio di arrampicata. La verifica istologica mostra che la linea Df(2L)ED1272 non completa il fenotipo della neurodegenerazione 867, mentre Df(2L)ED1315 (BL_9269) lo fa. Il grafico rappresenta la media e la deviazione standard di 5 prove di arrampicata per ogni linea. Gli asterischi indicano un significato basato su ANOVA unidirezionale, in cui il valore medio percentuale di arrampicata di ogni linea è stato confrontato con il valore medio percentuale di arrampicata della linea 867 / s (istogramma verde). - P < 0,05, P < 0,01 e .P < 0,001. (C) Rappresentazione schematica di linee di carenza aggiuntive che mostrano il non complemento del fenotipo 867 per istologia. Questa cifra è stata modificata da Loewen et al.¹⁷; un articolo pubblicato sotto la Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Figura 4 : Mutazione del punto marmocchio il gene porta ad un cambiamento di amminoacido nel dominio Coiled-coil della proteina Brat. (A) modello genico moscolno e primer utilizzati per l'amplificazione e il sequenziamento della regione di codifica. (B) Il sequenziamento del DNA della locus delle maccole identifica un cambiamento nucleotide che porta a un cambiamento di aminoacido nel dominio Coiled Coil della proteina Brat. Questa cifra è stata modificata da Loewen et al.¹⁷; un articolo pubblicato sotto la Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Figura 5 : Ulteriori analisi marmocchio mutanti conferma il suo ruolo neuroprotettivo in Drosophila. (A) Utilizzando il sistema Gal-4>UAS²² , l'espressione specifica del gene brano funzionale salva il fenotipo della neurodegenerazione in 867 mutanti. (B) La neurodegenerazione dipendente dall'età è osservata in 867 mutanti che trasportano un reporter genico pcna-GFP. brat^chs corrisponde al nome dell'allele moccioso in linea 867, che è stato chiamato cheesehead (chs). Mostrate sono rappresentative sezioni midbrain H&E-colorato di yw (controllo) e omozygous brat^chs; mosche pcna-GFP delle età indicate. Questa cifra è stata modificata da Loewen et al.¹⁷; un articolo pubblicato sotto la Creative Commons Attribution 4.0 International License.

stazione	ora	temperatura	Vuoto/Pressione	soluzione
1 : il nome del	NESSUN AVVIO RAPIDO RITARDO
2 Il nome del sistema	via	via	via
3 (COM del nome	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	80%EtOH
4 DEL psu'	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	95% EtOH
5 Del numero 3(	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	100% EtOH
6 È possibile:	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	100% EtOH
7 (in questo stato	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	100% EtOH
8 (IN vio	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	Xylene
9 (in vie	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	Xylene
10 del sistema	: 15 anni	37 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	Xylene
11 Del sistema di	: 30	58 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	cherosene
12 mila	: 15 anni	58 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	cherosene
13 del sistema	via	58 gradi centigradi	via	cherosene
14 Del sistema	: 15 anni	58 gradi centigradi	ATTIVATO/ACCESO	cherosene

Tabella 1: Impostazioni di programma consigliate per il processore tissutale automatizzato. I passaggi nell'ordine elencato qui possono essere utilizzati con un processore di tessuto automatizzato per teste fisse.

Reagente	Volume (L)
10x Buffer ExTaq (Mg2 o più) (20 mM)	2.5 24,5
Primer in avanti (10 M)	2.5 24,5
Primer inverso (10 M)	2.5 24,5
2,5 mM dNTP	2 Il nome del sistema
Modello DNA	2 Il nome del sistema
TaKaRa Ex Tq (5 U/L)	0,25
Acqua priva di nucle	Ore 13.25
Volume totale	25 mi lato

Tabella 2: Reagenti utilizzati per la reazione PCR. Reagenti e rispettivi volumi utilizzati nella reazione PCR per amplificare la regione di codifica dei mocciosi.

passo	temperatura	ora
35 cicli	95 gradi centigradi	15 s
	55 gradi centigradi	45 s
	72 gradi centigradi	3 min 10 s
tenere	4 gradi centigradi	∞

Tabella 3: Condizioni di ciclismo termico utilizzate per la PCR. I passaggi nell'ordine qui elencato possono essere utilizzati per programmare un ciclore termico utilizzando il mix di reazione mostrato nella Tabella2.

Discussion

Gli schermi genetici in avanti nella Drosophila sono stati un approccio efficace per identificare i geni coinvolti in diversi processi biologici, tra cui la neuroprotezione dipendente dall'età^{5,23,24, 25}. Utilizzando questa strategia, siamo riusciti a identificare il moccioso come un nuovo gene neuroprotettivo¹⁷.

Un passaggio critico in questo protocollo riguarda il corretto orientamento delle teste (come descritto nella Sezione 4.4.3.) per l'analisi istologica. Inoltre, i marcatori della linea utilizzata per la mappatura meiotica non dovrebbero interferire con il fenotipo della nuova mutazione (in questo studio: neurodegenerazione). Abbiamo raccomandato un test iniziale per confermare che i marcatori scelti non causano neurodegenerazione propria. Ad esempio, Jammed (J) provoca vesciche alari che potrebbero interferire con l'arrampicata, come nel caso delle mosche amiloide precursori della proteina (APP) che hanno anche ali vesciche²⁶. Lobo (L) porta a una riduzione delle dimensioni degli occhi; tuttavia, non osserviamo la degenerazione centrale del cervello e questo marcatore può essere utilizzato per mappare la neurodegenerazione centrale del cervello. Pin e Sternoplural (Sp) sono anche appropriati da usare, poiché il cervello delle mosche che trasportano questi marcatori è paragonabile ai cervelli di controlli di tipo selvaggio.

Uno svantaggio della metodologia genetica avanzata nei moscerini è la durata necessaria per restringere le regioni del DNA al gene di interesse^3,5. L'uso di strategie di mappatura migliorate²⁷ insieme alla disponibilità di tecnologie di sequenziamento di prossima generazione ²⁸ dovrebbe consentire un'identificazione ancora più facile delle mutazioni associate ai fenotipi di interesse. Gli schermi genetici in avanti possono richiedere molto lavoro. Per esempio, la conferma istologica, che dice direttamente per la neurodegenerazione nel cervello, da sola richiede una notevole quantità di tempo. Tuttavia, questo approccio sarà molto più difficile e costoso da eseguire in modelli di mammiferi, non necessariamente permettendo studi genetici approfonditi. Gli schermi di mutagenesi chimica sono vantaggiosi perché l'identificazione delle mutazioni puntiformi potrebbe fornire informazioni critiche sulla funzione dei prodotti dei geni colpiti. L'identificazione di una mutazione a punti che causa un cambiamento di amminoacido in un dominio conservato della proteina Brat (Figura 4B) illustra l'importanza del dominio a bobina di questa proteina TRIM-NHL nella neuroprotezione¹⁸. Il test di arrampicata, che misura il comportamento locomotore, è certamente vantaggioso consentendo un rapido test di un gran numero di mosche per difetti di mobilità, spesso osservati anche nella neurodegenerazione umana²⁵. Questo test potrebbe essere eseguito anche in un altro ambiente dello schermo, come lo screening di interferenza dell'RNA in vivo (RNAi) a livello di genoma che potrebbe essere utilizzato per identificare i geni neuroprotettivi. Anche se abbiamo diminuito la distanza tra la parte inferiore della camera di prova e la linea di passaggio da 8 cm¹⁰ a 5 cm per impostare una velocità di passaggio più rigorosa nel presente studio, bassi tassi di arrampicata non hanno mirror neurodegenerazione per un gran numero di linee. La neurodegenerazione può diventare evidente dopo l'insorgenza di difetti comportamentali, il che significa che le mosche potrebbero avere bisogno di essere invecchiate più a lungo prima che compaiano vacuoli. Un'altra possibilità è che i difetti locomotori che osserviamo in alcune linee non siano dovuti al funzionamento neurologico difettoso, ma piuttosto alla debolezza muscolare o all'incapacità più generale delle mosche. Inoltre, è possibile che ci manchino potenziali candidati, in cui i difetti di arrampicata non si manifestano in età più giovane (ad esempio, 10 giorni fa) ma piuttosto diventino prominenti più tardi nella vita. Questa strategia di screening potrebbe certamente essere applicata per identificare i geni dipendenti dall'età, eliminando così i geni associati a potenziali difetti dello sviluppo neurale. Il protocollo qui presentato può essere regolato a seconda della probabilità desiderata che le linee candidate contengano il gene mutato coinvolto nella neuroprotezione. Abbassare direttamente la soglia della velocità di passaggio è un altro mezzo per ottenere lo stesso risultato. Questi candidati mostrerebbero teoricamente una maggiore neurodegenerazione, che potrebbe risparmiare tempo e risorse durante la conferma e la mappatura.

In generale, il protocollo descrive un modo semplice per controllare la neurodegenerazione e successivamente identificare i candidati genici neuroprotettivi. Questo approccio genetico non si limita al comportamento e ai saggi istologici qui descritti, e può anche essere usato per lo screening di altri fenotipi come la paralisi sensibile alla temperatura (ts), la deposizione delle uova o i fenotipi di fertilità, solo per citarne alcuni. Per esempio, i mutanti Drosophila ts-paralitici sono noti per essere arricchiti per la neurodegenerazione²⁹ e potrebbero rappresentare una fonte aggiuntiva per l'identificazione dei geni neuroprotettivi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Major equipment
Fume hood for histology
Light Microscope	Nikon	Eclipe E100	Preferred objective for imaging is 20x
Imaging software	Nikon
Microscope Camera	Nikon
Thermal cycler	Eppendorf
Fly pushing and climbing assay
VWR® Drosophila Vial, Narrow	VWR	75813-160
VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape	VWR	89097-912
Standard mouse pad
Stereoscope	Motic		Model SMZ-168
CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad)	Genesee Scientific	54-104, 59-121, 59-172	Doesn’t iinclude CO2 tank
Fine-Tip Brushes	SOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila Incubator	VWR	89510-750
Gene mapping
CantonS	Bloomington Drosophila Stock Center	9517
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	5905
yw	Bloomington Drosophila Stock Center	6599
Drosophila line used for recombination mapping	Bloomington Drosophila Stock Center	3227	Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco]	Bloomington Drosophila Stock Center	2555	Drosophila balancer line used for recombination mapping
Deficiency Kit for chromosome 2L	Bloomington Drosophila Stock Center	DK2L	Cook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%)	Thermo Fischer Scientific	A4094
Chloroform	Thermo Fischer Scientific	C298-500
Glacial Acetic Acid	Thermo Fischer Scientific	A38-500
Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL	Thermo Fischer Scientific	05-408-129
Histochoice clearing agent 1x	VWR Life Sciences	97060-934
Harris Hematoxylin	VWR	95057-858
Eosin	VWR	95057-848
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium	Thermo Scientific™ 4112	22-110-610	CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus	Azer Scientific
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545M	Dimensions: 24 mm x 60 mm
Traceable timer	VWR
Slide Warmer	Barnstead International		model no. 26025
Slide tray and racks	DWK Life Sciences		Rack to hold 20 slides
Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps	Fisherbrand	10-316A
Kimwipes™	Kimberly-Clark™ Professional
6 inch Puritan applicators	Hardwood Products Company, Guilford, Maine	807-12
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
Tupperware or glass containers for histology liquids			16 + 1 for running water
High Profile Coated Microtome Blades	VWR	95057-834
Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L	Corning™
Beaker			Or other container for ice water and cassettes
Tissue Bath	Precision Scientific Company	66630
Microtome	Leica Biosystems
Molecular analysis
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282
Ex Taq DNA polymerase	TaKaRa		5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain	Invitrogen™
UltraPure™ Agarose	Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder	Invitrogen™
ApE-A plasmid Editor software			Available for free download
Statistical analysis
R software package
Further analysis
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]	Bloomington Drosophila Stock Center	59967