Summary
Nós apresentamos um protocolo usando uma aproximação genética para a frente à tela para os mutantes que exibem a neurodegeneração no melanogaster de Drosophila. Incorpora um ensaio de escalada, uma análise da histologia, um mapeamento do gene e um sequenciamento do ADN para identificar finalmente genes novos relativos ao processo de neuroprotection.
Abstract
Há muito a entender sobre o aparecimento e progressão de doenças neurodegenerativas, incluindo os genes subjacentes responsáveis. A triagem genética direta usando mutagénicos químicos é uma estratégia útil para mapear fenótipos mutantes para genes entre a Drosophila e outros organismos modelo que compartilham vias celulares conservadas com seres humanos. Se o gene mutado de interesse não é letal em estágios iniciais de desenvolvimento de moscas, um ensaio de escalada pode ser conduzido para a tela para os indicadores fenotípicos de funcionamento do cérebro diminuído, tais como baixas taxas de escalada. Subseqüentemente, a análise histológica secundária do tecido de cérebro pode ser executada a fim verificar a função neuroprotetor do gene marcando phenotypes do neurodegeneração. As estratégias de mapeamento do gene incluem o mapeamento meiótico e de deficiência que dependem desses mesmos ensaios podem ser seguidos por sequenciamento de DNA para identificar possíveis alterações de nucleotídeo no gene de interesse.
Introduction
Os neurônios são para a maior parte pós-mitótico e incapaz de dividir1,2. Na maioria dos animais, existem mecanismos neuroprotetores para manter essas células ao longo da vida útil do organismo, especialmente na velhice, quando os neurônios são mais vulneráveis a danos. Genes subjacentes a esses mecanismos podem ser identificados em mutantes exibindo neurodegeneração, um indicador fenotípico para a perda de neuroproteção, usando um protocolo genético para a frente. As telas genéticas da frente usando mutagénicos químicos tais como o Methanesulfonate do Ethyl (EMS) ou N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU) são particular úteis devido às mutações de ponto aleatórias que induzem, tendo por resultado uma aproximação inerentemente imparcial que derramou a luz sobre funções numerosas do gene em organismos modelo eucarióticas3,4,5 (no contraste, o mutagênese do raio X cria rupturas do ADN e pode conduzir ao rearranjo um pouco do que mutações do ponto6).
A mosca de fruto comum Drosophila melanogaster é um assunto ideal para estas telas devido à sua alta qualidade, seqüência de genoma bem anotado, sua longa história como um organismo modelo com ferramentas genéticas altamente desenvolvidas, e mais significativamente, sua compartilhada história evolucionária com seres humanos7,8. Um fator limitante na aplicabilidade deste protocolo é a letalidade precoce causada pelos genes mutados, o que evitaria o teste na velhice9. No entanto, para mutações não letais, um ensaio de escalada, que aproveita os geotaxis negativos, é um método simples, embora extenso, de quantificar o funcionamento do motor prejudicada10. Para expor a suficiente reatividade locomotora, as moscas dependem das funções neurais para determinar a direção, sentir sua posição e coordenar o movimento. A incapacidade de moscas para escalar suficientemente em resposta a estímulos pode, portanto, indicar defeitos neurológicos11. Uma vez que um phenotype de escalada defeituoso particular é identificado, uns testes mais adicionais usando uma tela secundária tal como a análise histológica do tecido de cérebro, podem ser usados para identificar a neurodegeneração em moscas de escalada-defeituosas. O traço subseqüente do gene pode então ser usado para revelar a região genomic no cromossoma que carreg o gene neuroprotetor defeituoso do interesse. Para restringir a região cromossômica de interesse, o mapeamento meiótico usando linhas de mosca mutante que transportam genes de marcadores dominantes com locais conhecidos no cromossomo pode ser realizado. Os genes do marcador servem como um ponto de referência para a mutação como a freqüência do recombinação entre dois loci fornece uma distância mensurável que possa ser usada para mapear a posição aproximada de um gene. Finalmente, cruzar as linhas do mutante com as linhas que carregam deficiências equilibradas na região cromossomática meioticamente mapeada de interesse cria um teste da complementação em que o gene do interesse pode ser verificado se seu phenotype conhecido é expressado5. Sequências de nucleotídeo polimorfónicos no gene identificado, possivelmente resultando em sequências de aminoácidos alteradas, podem ser avaliadas por sequenciamento do gene e comparando-a com a seqüência do genoma da Drosophila . A caracterização subseqüente do gene do interesse pode incluir o teste de alelos adicionais do mutante, de experiências do salvamento da mutação e da examinação de phenotypes adicionais.
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Protocol
1. preparação e envelhecimento das moscas
- Obter ou gerar6 uma coleção de mutantes de Drosophila que será usado para a tela genética. Aqui, as linhas ENU-mutagenized mapeadas ao segundo cromossoma e balançadas sobre o CYO são usadas.
- Amplificar as linhagens experimentais de genótipos em uma incubadora definida a 25 ° c, 12 h de ciclo claro/escuro no meio de farinha de milho-melaço.
- Colete cerca de 20 progên homozygous entre 0-2 dias da eclosão adulta de cada genótipo experimental. Elimine a polarização do sexo consistentemente coletando moscas masculinas ou fêmeas.
- Age as moscas no meio da farinha de milho-melaço como desejado em 29 ° c, lanç os frascos a cada 2-3 dias a fim manter as moscas no alimento fresco como envelhecem. Na tela apresentada aqui, as moscas eram envelhecidas por 10-12 dias.
- Montar uma câmara de ensaio de escalada usando dois frascos e fita como descrito anteriormente10. Os frascos devem ser conectados em ambas as extremidades abertas. Use uma régua para marcar uma linha de 5 cm em uma extremidade da câmara.
2. Protocolo 1: ensaio de escalada (adaptado de ali et al.10)
- Valide o ensaio de escalada. Neste estudo, teste o ensaio de escalada baseado na metodologia descrita anteriormente por ali et al.10, utilizando elavC155≫ UAS-TauR406W (exibindo taxas de passagem de escalada inferiores) e ELAVC155> UAS-GFP ( controle) e ELAVC155> UAS-mcherry (controle) voa.
- Vire as moscas em uma câmara de teste, uma linha de cada vez (não use anestesia CO2 ) e permitir que eles se recuperem por 5 min. Se o teste for feito em dias diferentes, realize o ensaio ao mesmo tempo do dia. Neste estudo, todos os ensaios de escalada foram realizados à tarde para controlar os efeitos circadianos na locomoção12.
Nota: Evite expor as moscas à luz solar direta ao testar; Isso vai interferir com a sua capacidade de escalar. - Forçosamente bata a câmara (lado marcado para baixo) em uma almofada de rato coloc em uma superfície contínua 3 vezes assim que todas as moscas começam o ensaio na parte inferior. Observe a locomoção da mosca durante um período de 10 s.
- Registre o número de moscas que atingem ou passam a linha de 5 cm dentro deste tempo, bem como o número total de moscas testadas. Repita o protocolo, aguardando 1 min entre cada teste, para um mínimo de 3 repetições de avaliação por linha.
Nota: No presente estudo, cada frasco continha entre 2 e 19 moscas para a triagem inicial (moscas masculinas) e entre 6 e 21 moscas para a análise de deficiência mutante de linhagens femininas cruzadas (seção 5,3.).
3. protocolo 2: seleção de cepas de Drosophila para análise posterior
- Insira os dados de teste de escalada no Microsoft Excel ou software semelhante e calcule a taxa de passagem de escalada para cada linha em todas as repetições como uma porcentagem.
-
Realize análises estatísticas para detectar linhas mutantes que se desviam significativamente do valor percentual médio de escalada de todas as linhas usando o pacote de software R13.
- Ler em arquivos de dados com curadoria para R (arquivos. csv ou. txt com uma coluna para cada variável ou fator, e linhas que representam os valores específicos).
Nota: Aqui, os dados para machos (ensaio inicial) e fêmeas (linha 867 cruzou-se às linhas da deficiência) foram introduzidos em folhas separadas de. xlsx como duas colunas, uma onde as fileiras da coluna identificam a linha do mutante e quantas vezes o ensaio foi replicado e o outro onde as fileiras representam o sucesso médio de escalada (em percentagem) para cada frasco de repetição de moscas. - Leia os dados em R usando o seguinte código:
Mali <-Read. csv (".. /male_init.csv ")
femdef <-Read. csv (".. /fem_def_cross.csv ")
Nota: O ".." nos diretórios de caminho são caminhos absolutos do diretório raiz do computador do usuário e precisaria ser especificado pelo usuário individual para os caminhos de diretório do seu computador. - Executar modelagem linear
- Execute a regressão variável fictícia com a função LM em R. Para a análise inicial de linhas mutantes, avalie o significado dos efeitos de nível de fator (linhas mutantes) em porcentagem de sucesso de escalada contra a média grande para uma variável de resposta centralizada média zero (porcentagem de sucesso).
Nota: O "-1" no final da chamada de função LM na seção 3.2.3.2. Remove o intercepto e nos permite testar todos os níveis de fator contra a média média centralizada de zero de porcentagem de taxa de passagem de escalada. - Imprima os resultados na tela usando a função R Summary :
mali_anova <-LM (escala (Mali $ P_Success) ~ Mali $ Mutant_line-1)
Resumo (mali_anova) - Use as linhas de controle (se houver) como a linha de base para testar os efeitos de nível de fator contra o uso do seguinte código R: x <-relevel (femdef $ Mutant_line, ref = "a867_plus")
femdef_anova <-LM (femdef $ P_success ~ x)
Resumo (femdef_anova)
Nota: A primeira linha de código reordena os níveis de fator para que a linha de controle negativo se torne a interceptação de linha de base à qual todos os outros níveis de fator (linhas mutantes) são testados com os testes tinternos na função LM .
- Execute a regressão variável fictícia com a função LM em R. Para a análise inicial de linhas mutantes, avalie o significado dos efeitos de nível de fator (linhas mutantes) em porcentagem de sucesso de escalada contra a média grande para uma variável de resposta centralizada média zero (porcentagem de sucesso).
- Ler em arquivos de dados com curadoria para R (arquivos. csv ou. txt com uma coluna para cada variável ou fator, e linhas que representam os valores específicos).
- Escolha um limite para linhas candidatas dependendo da idade no momento do teste. Para determinar o limiar, realize um teste preliminar na idade desejada usando mutantes conhecidos que exibem neurodegeneração e baixas taxas de passagem de escalada em comparação com o tipo selvagem, controle voa10.
Nota: Uma taxa de passagem abaixo de 50% pode ser apropriada para 10 dias-velho voa como relatado previamente para linhas da Drosophila que overexpressando o gene neurodegeneração-relacionado humano Tau no sistema nervoso10. As moscas mais velhas devem ter um limiar mais elevado da taxa de passagem desde que são esperados expor a locomoção diminuída, assim, neurodegeneração aumentada.
4. protocolo 3: análise histológica
- Vestindo luvas, cortar cabeças de mosca com uma lâmina cirúrgica após o ensaio de escalada e usar um pincel para delicadamente colocá-los em 1 mL de fixador de Carnoy (6:3:1 de 100% EtOH: clorofórmio: ácido acético glacial) em um micro tubo de centrífuga de 1,5 mL O/N a 4 ° c. Certifique-se que as cabeças afundam na solução fixador.
- Substitua a solução fixativa no dia seguinte com 1 mL de 70% de EtOH e mantenha as amostras ainda a 4 ° c para análise futura.
Nota: O protocolo pode ser pausado nesta etapa. - Coloque as cabeças da etapa 4,2. a um máximo de cinco por gaveta de microbiópsia. Coloque imediatamente as fitas em um recipiente preenchido com 70% EtOH. Armazene o recipiente a 4 ° c antes do envio para uma instalação de histologia para processamento e incorporação de parafina das cabeças. Se o equipamento para processamento e incorporação de tecidos estiver disponível, siga a etapa 4,4.
- Incorporar as cabeças em parafina para o corte do micrótomo:
- Siga as configurações do programa para uma máquina de processamento de tecidos automatizada na ordem apresentada na tabela 1 para desidratar, limpar e se infiltrar com parafina as cabeças.
- Transfira as amostras em moldes de base de metal que se encaixam na gaveta usando parafina aquecida a 60 ° c usando uma estação de incorporação de parafina.
- Oriente as cabeças (orientação antero-posterior voltada para a parte superior) no molde de base usando fórceps fino para permitir a visualização adequada do tecido cerebral após a seccionamento. Isto pode ser feito reaquecendo a parafina em 60 ° c e reposicionando as cabeças se necessário.
Nota: Os moldes do metal podem ser substituídos por moldes de base descartáveis. - Posicione a gaveta na parte superior do molde de base correspondente e mova-as suavemente para o lado refrigerado da estação de incorporação de parafina (4 ° c). Aguarde até que o bloco endurece antes de removê-lo da estação.
- Remova o formulário do bloco o molde delicadamente dissociando o molde da gaveta.
- Aparar cada bloco de parafina antes de seccionamento para minimizar a superfície que será seccionada.
- Ajuste o micrótomo para cortar secções de 5 μm de cada bloco.
- Coloque a fita de parafina seccionada contendo o tecido num banho de água aquecido (35 ° c) durante um máximo de 5 min.
- Mergulhe uma lâmina revestida de poli-lisina (ajuda a reter o tecido) no banho de água aquecido, colocando a fita seccionada na corrediça usando aplicadores de madeira. Deixe o ar das corrediças secar o/N na temperatura ambiente.
- Aqueça as lâminas durante 15 min a 63 ° c usando um aquecedor de slides.
- Coloque as lâminas em um rack de coloração de slides e mancha com hematoxilina e eosina (H & E) uma capa de fumaça, respeitando os seguintes passos.
- Coloque o rack em Histochoice (substituição não-tóxica de xileno, que ajuda a remover a parafina da amostra) por 5 min.
- Transfira a cremalheira em um recipiente enchido com o Histochoice por 5 minutos.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com 100% EtOH 1 por 5 min.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com 100% EtOH 2 por 5 min.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com 95% EtOH por 3 min.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com 70% EtOH por 3 min.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com H2o destilada por 5 min.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com Harris hematoxylin por 2-5 min.
- Leve o rack para fora da solução de hematoxilina e coloque-o água corrente da torneira por 10 min.
- Transfira a cremalheira em um recipiente enchido com a água destilada fazendo um dunk curto.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com eosina por 1-2 min.
- Transfira a cremalheira em um recipiente enchido com o EtOH 95% fazendo um dunk curto.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com 95% EtOH por 5 min.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com 100% EtOH por 5 min.
- Transfira o rack em um recipiente preenchido com 100% EtOH por 5 min.
- Transfira a cremalheira em um recipiente enchido com o Histochoice (ou o xylene) para 5-10 minutos até que todas as corrediças estejam montadas.
- Monte o slide e a lamínula (24 mm x 60 mm de tamanho). Usando fórceps, retire o slide da solução de Histochoice ou xileno e faça uma fina faixa de suporte de montagem na parte superior do mesmo. Coloque suavemente a lamínula na parte superior, tentando evitar a formação de bolhas.
- Deixe o meio de montagem em corrediças montadas endurecer O/N a capa das emanações antes da análise.
- Armazene corrediças manchadas em uma caixa na temperatura ambiente.
- Quantificar a neurodegeneração, observando todas as seções seriais no slide em 20x ampliação um microscópio de luz. Examine todo o cérebro, tomando nota qualitativa de tamanho e número de vacúolos que aparecem em três seções consecutivas.
- Obtenha imagens de seções representativas do cérebro em aproximadamente meados de-cérebro usando um microscópio claro equipado com o software da imagem latente.
5. protocolo 4: mapeamento genético do fenótipo Mmutante recessivo
- Outcross a linha candidata a um tipo selvagem cantons (BL_ 9517) ou um outro tipo selvagem ou estirpe isogenized (por exemplo, oregonr (BL_ 2376), w1118 (BL_5905) ou YW (BL_ 6599) para determinar se o phenotype é dominante ou Recessivo.
Nota: os resultados desta etapa orientarão as próximas etapas do mapeamento. Se o phenotype é recessive, a seguir o mapeamento da deficiência pode ser executado.- Usando um pincel, faça uma cruz, colocando em um frasco contendo alimentos CO2-anestesiados moscas da linha de interesse mutante (5 machos) e da linha cantons (10-15 fêmeas virgens). Coloque o frasco a 25 ° c.
- Colete a progêia de F1 heterozygous e repita experimentos de escalada e histologia.
- Comparar os resultados obtidos apenas com a linha de controle e com os mutantes homozygous. Uma boa indicação do phenotype recessive será se os mutantes heterozygous exibem fenótipos similares como o tipo selvagem voa.
- Realize o mapeamento meiótico para estimar aproximadamente a localização da mutação no segundo cromossomo usando o WGSP-1 J1 L2 PIN1/CYO (BL_3227) ou uma cepa equivalente com marcadores dominantes associados em conhecidos Localização citológica. Neste caso, a mutação foi conhecida previamente para ser ficada situada no segundo cromossoma.
- Usando um pincel, fazer uma cruz, colocando em um frasco contendo alimentos CO2-anestesiados moscas da linha de interesse mutante (5 machos) e o WGSP-1 J1 L2 pinos1/linha CYO (10 fêmeas). Coloque o frasco a 25 ° c.
Nota: O objetivo desta cruz é gerar fêmeas heterozygous que carreg o cromossoma com a mutação nova e o cromossoma do marcador, que recombinar durante o meiose6,14. Fêmeas F1 progênie são escolhidos em vez de machos desde recombinação não ocorre em machos. - Colete pelo menos 15 descendentes fêmeas virgens carregando o cromossomo com a nova mutação e o cromossomo marcador e cruze-os para 5 machos de uma linha equilibrada que transporta outro marcador dominante visível (por exemplo, CYO/SNASCO (BL_2555) ou equivalente).
- Colete o progênie masculino heterozygous que carreg o SCO ou o CYO e o cromossoma potencial recombined da Cruz na etapa 5.2.2. e acasalam-nas individualmente a fêmeas virgens do estoque que carreg o cromossoma mutado.
- Colete a progêia da Cruz final descrita na etapa 5.2.3. e a idade as moscas em 29 ° c (neste estudo as moscas eram envelhecidas por 10-14 dias).
- Colete cabeças, execute a análise da histologia como descrito no protocolo 3 e olhe as corrediças com seções do cérebro para determinar o grau de neuropatologia como descrito em etapa 4,11. A análise histológica é realizada em vez da análise de locomoção devido a fenótipos que podem afetar o ensaio de escalada, como atolado (J), o que provoca acúmulo de fluido nas asas15.
- Usando um pincel, fazer uma cruz, colocando em um frasco contendo alimentos CO2-anestesiados moscas da linha de interesse mutante (5 machos) e o WGSP-1 J1 L2 pinos1/linha CYO (10 fêmeas). Coloque o frasco a 25 ° c.
- Realize o mapeamento da deficiência na região estreitada do cromossoma para refinar a posição da mutação recessive usando o ensaio de escalada. Cada linha de deficiência tem um apagamento da região diferente dos cromossomas, permitindo que sejam usados para o teste da complementação.
- Comece com grandes deficiências que abrangem a região identificada no mapeamento meiótico, que pode ser ainda mais reduzida pelo uso de deficiências menores. Se a análise de deficiência resulta em mais de um gene candidato, recomenda-se o uso de estoques de interferência de RNA (RNAi) para direcioná-los.
- Linhas transversais do jogo16 da deficiência de Drosophila para o segundo cromossoma (DK2L neste estudo) e procuram a não-complementação do phenotype do interesse (neste estudo: a taxa de escalada da passagem de 8,5% que corresponde à taxa da passagem de moscas homozygous da linha 867 usadas como o controle positivo).
- Confirme o fenótipo de neurodegeneração usando a verificação de histologia, conforme descrito na seção 4 (protocolo 3).
6. protocolo 5: sequenciamento e análise de DNA
Nota: Tenha em mente que a mutagenese ENU introduz mutações pontuais11.
- Projete seqüências da primeira demão para diante e reversa que flanqueam a região do exon-Coding do gene do Brat para a amplificação pela reacção em cadeia do POLYMERASE (PCR) da região do interesse (no caso da linha 867 um fragmento do ADN do tamanho de 3.247 BP é amplificado para seqüenciamento17).
-
Extraia o DNA de uma única mosca18 :
- Squish delicadamente a mosca em um micro tubo do centrifugador de 0,5 mL que contem 50 μL do amortecedor de squishing (10 milímetros de pH de Tris-Cl 8,2, de 1 milímetro de EDTA, de 25 milímetros NaCl, e de 200 μg/mL proteinase K; a enzima tem que ser diluída fresca de um estoque congelado antes de cada uso) usando uma ponta do Pipet
- Incubar por 30 min a 37 ° c
- Desactive a proteinase K colocando o tubo a 95 ° c durante 2 min.
Nota: O DNA extraído pode ser armazenado a 4 ° c durante vários meses.
- Realize a reação de PCR usando um DNA Taq polymerase de alta fidelidade (os reagentes e as condições de ciclagem térmicas usados neste estudo estão mostrados na tabela 2 e na tabela 3, respectivamente) respeitando as instruções do fabricante e executar o produto da PCR em um 1 % gel de agarose contendo Invitrogen SYBR seguro DNA gel Stain, que é uma alternativa não-tóxica de brometo de ethidium.
- Extirpar a banda do tamanho correto do gel com um bisturi e purificar o produto PCR usando o Wizard SV gel e PCR Clean-up System (Promega) ou kit equivalente, respeitando as instruções do fabricante.
- Projete primers para diante e reverso que serão usados para arranjar em seqüência do ADN a fim cobrir a região inteira do interesse, se possível. Sequencia o DNA purificado em gel da etapa anterior para identificar mutações pontuais. A exatidão elevada no sequenciamento fluorescente automatizado de Sanger podia ser conseguida para até 700 BP.
Nota: O polymerase ex Taq (TaKaRa) pode ser usado para amplificar produtos do PCR dos moldes genomic do ADN até 20 KB do tamanho. -
Analise as sequências de DNA obtidas usando o editor de plasmídeo (ApE, de M. Wayne Davis) ou software similar alinhando-os e comparando-os com as sequências obtidas após o sequenciamento da mesma região genômica de uma cepa de referência (por exemplo, originalmente mutagenizada linha).
- Abra arquivos de seqüenciamento com ApE. Como referência, use um arquivo ApE contendo a seqüência de consenso genômica do gene Brat baixado em um formato FASTA de FlyBase, ou um arquivo contendo resultados para a seqüência de controle genético de fundo (por exemplo, originalmente mutagenized Drosophila linha).
- Vá para ferramentase, em seguida, alinhar sequências. Usando o mouse do computador, selecione todas as seqüências para comparar. Lembre-se de indicar a sequência de referência usada para esse alinhamento no menu suspenso.
- Inspecione a região seqüenciada para alterações de nucleotídeo em comparação com a sequência de referência. Se desejar, salve o alinhamento no computador no formato. rtf clicando em textoe em salvar.
Nota: Se nenhuma mutação foi identificada, o protocolo do sequenciamento e da análise do ADN seria repetido com os primers projetados incluir regiões da não-codificação do gene.
7. protocolo 6: análise adicional da função do gene candidato
- Realize experimentos de resgate em neuroblastos para determinar se o moleque do gene é responsável pelo fenótipo da neurodegeneração.
- Equilíbrio duplo um UAS-Brat19 e um neuroblast-specific worniu-Gal4 (wor-G4) estoques carregando os construtos no terceiro cromossomo, bem como a linha 867, que é mutante para o gene Brat localizado na segunda Cromossomo.
- Faça três cruzes separadas, colocando em três diferentes frascos contendo alimentos 5 machos de UAS-Brat, wor-G4 e 867 linhas e adicionar a cada conjunto de machos 10-15 fêmeas virgens de uma linha carregando marcadores e balanceadores para o segundo e terceiro cromossomas (SP/CyO; Dr/Tm3, SB; BL_59967).
- Colete 10-15 fêmeas virgens da F1 de cada cruzamento com os seguintes genótipos: +/CYO; UAS-Brat/Tm3, SB, +/CYO; wor-G4/Tm3, SB e 867/CYO; +/TM3, SB e 5 machos de cada um dos seguintes genótipos: +/SP; UAS-Brat/Tm3, SB, +/SP; wor-G4/Tm3, SB e 867/CYO; +/Dr.
- Cross collelcted +/CYO; UAS-Brat/Tm3, SB fêmeas virgens a +/SP; UAS-Brat/Tm3, SB machos; em um frasco separado fazer uma segunda Cruz com +/CYO; wor-G4/TM3, SB fêmeas virgens para +/SP; wor-G4/Tm3, SB machos e, em seguida, em um terceiro frasco Cross 867/CYO; +/TM3, SB fêmeas virgens e 867/CYO; +/Dr machos.
- A partir da F1 de cada uma dessas cruzes, coletar machos e fêmeas dos seguintes genótipos: SP/CyO; UAS-Brat/Tm3, SB da primeira cruz, SP/CYO; wor-G4/Tm3, SB da segunda Cruz e 867/CYO; Dr/Tm3, SB da segunda Cruz.
- Realize um cruzamento final entre irmãos e irmãs coletados de cada progênios F1 para estabelecer estoques equilibrados duplos permanentes para todas as três linhas.
- Combine UAS-Brat e wor-G4 com a mutação 867 .
- Colete número suficiente (~ 20-30 moscas) de fêmeas virgens do 867/CYO; Dr/Tm3, SB duplo equilíbrio de ações para executar duas cruzes.
- Coloque 10-15 fêmeas virgens com ~ 5 machos do SP/CYO; UAS-Brat/Tm3, SB (cross #1) e em um segundo frasco 10-15 fêmeas virgens com ~ 5 SP/CYO; wor-G4/Tm3, SB machos.
- Colete irmãos e irmãs da F1 de cada cruz com os seguintes genótipos: 867/CyO; UAS-Brat/Tm3, SB da cruz #1 e 867/CYO; wor-G4/Tm3, SB da Cruz #2. Use a progêia F1 coletada de cada cruz para estabelecer estoques permanentes cruzando irmãos e irmãs entre eles.
Nota: Na sequência desta etapa final, os estoques para 867/CyO; UAS-Brat/Tm3, SB e 867/CYO; wor-G4/Tm3, SB deve ser gerada.
- Realize o experimento de resgate.
- Colete ~ 15-20 fêmeas virgens do 867/CYO; wor-G4/Tm3, estoque do SB e cruze-os a 5-10 machos do estoque 867/CYO; UAS-Brat/Tm3, SB. Como o controle, Cruz ~ 15-20 fêmeas virgens do 867/CYO; wor-G4/Tm3, SB e ~ 15-20 fêmeas virgens do 867/CYO; UAS-Brat/Tm3, linha do SB à linha 867/CYO sozinho.
Nota: 867 moscas carregam um alelo sensível à temperatura do pirralho e a Cruz de resgate deve ser realizada a 29 ° c. - Colete a seguinte progêia F1 de cada cruz selecionando cuidadosamente balanceadores marcados afastado: 867/867; wor-G4/UAS-Brat (resgate), 867/867; wor-G4/+ (controle) e 867/867; UAS-Brat/+ (controle).
- Age as moscas como desejado a 29 ° c e realizar a análise histológica em cérebros para procurar neurodegeneração usando o protocolo descrito na seção 4 (protocolo 3).
- Colete ~ 15-20 fêmeas virgens do 867/CYO; wor-G4/Tm3, estoque do SB e cruze-os a 5-10 machos do estoque 867/CYO; UAS-Brat/Tm3, SB. Como o controle, Cruz ~ 15-20 fêmeas virgens do 867/CYO; wor-G4/Tm3, SB e ~ 15-20 fêmeas virgens do 867/CYO; UAS-Brat/Tm3, linha do SB à linha 867/CYO sozinho.
- Equilíbrio duplo um UAS-Brat19 e um neuroblast-specific worniu-Gal4 (wor-G4) estoques carregando os construtos no terceiro cromossomo, bem como a linha 867, que é mutante para o gene Brat localizado na segunda Cromossomo.
- Realize a análise dependente da idade da neurodegeneração em 867 mutantes.
- Colete 867; as moscas do controle de PCNA-GFP e de YW , que carregam um gene do repórter (PCNA-GFP) e são viáveis em 25 ° c e exibem uma penetrância mais elevada e uma expressividade mais elevada do phenotype da neurodegeneração do que 867 sozinho neste temperatura17.
- A idade das moscas até 5, 15 e 25, conforme descrito na seção 1,4 e realizar a análise de histologia subseqüente, seguindo o protocolo na seção 4 (protocolo 3).
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Representative Results
Neste aerículo, apresentamos os passos utilizados para identificar o tumor cerebral do gene (Brat) como desempenhar um papel na manutenção da integridade neuronal (por exemplo, neuroproteção) em moscas adultas17; uma metodologia que pode ser usada para identificar genes envolvidos na neuroproteção. Utilizamos uma abordagem genética prospecta (a estratégia é delineada na Figura 1a) para a tela através de uma coleção de moscas quimicamente mutagenizadas usando um ensaio de escalada (o aparelho utilizado para este ensaio é mostrado na Figura 1b). Entre 235 linhas homozygous, aproximadamente 37% de linhas testadas exibiram uma taxa de escalada da passagem abaixo de 50% quando testado na idade de 10-12 dias (Figura 1C). 58% das linhas testadas exibiram comportamento de escalada significativamente diferente quando sua taxa de passagem por cento de escalada (RCP) foi comparada com o valor percentual médio de escalada de todas as linhas testadas usando ANOVA One-Way (Figura 1D). A tela histológica subseqüente em 51 das linhas que exibem a mais baixa taxa de escalada da passagem revelou que 29 destas linhas mostraram a aparência visível dos furos no neurópilo do cérebro (que varia de suave a severo) indicativo do neurodegeneração20 ( Figura 2). Entre as linhas que mostram o comportamento de escalada defeituoso e a neurodegeneração severa, nós escolhemos mapear a mutação que subjacente o phenotype na linha 867 (CPR de 0% e valor de P = 1.36 e-14 baseado na ANOVA One-Way). O fenótipo de neurodegeneração em 867 moscas é recessivo porque os cérebros de 867 moscas heterozygous que foram ultrapassados para uma estirpe tipo selvagem são comparáveis a estes de controles (Figura 3a). Usando a histologia, o mapeamento meiótico situated a mutação nos 31-51 locais citológicos, entre os marcadores fenotípicos J (atolado) e L (lóbulo) no segundo cromossoma da Drosophila . Usando o ensaio de escalada, o mapeamento de deficiência entre os locais citológicos 31 e 51 com linhas do kit de deficiência de Drosophila para o cromossomo 2L (DK2L)16 mapeou a mutação em uma região que abrange 118 genes (Figura 3B; onde 867/+ serve como controle para a análise estatística). Examinando o phenotype do cérebro de 867 mutantes cruzados às linhas adicionais da deficiência (Figura 3C) confirmou que a mutação está contida em uma região do genoma que inclua o Bratdo gene. Uma lista completa de todos os genes adicionais contidos nessas eliminações pode ser encontrada no FlyBase clicando no link associado ao segmento excluído (por exemplo, para DF (2L) ED1272 o segmento excluído é 37C5-38A2). Baseado em observações precedentes que os mutantes do Brat têm pilhas supernumerary em seus cérebros21, um phenotype igualmente observado em 867 mutantes, Brat foi selecionado para a análise de sequenciamento do ADN. O sequenciamento de Sanger do gene Brat contendo a região de codificação de exon identificou a alteração do nucleotídeo G/a na posição 37.739 do gene (figura 4a), levando à alteração da glicina para o ácido glutâmico (G/E) na posição 470 da proteína Brat17 (Figura 4B). Experimentos de resgate confirmam que o Brat desempenha um papel neuroprotetor, pois a superexpressão do gene funcional na linha 867 suprime o fenótipo da neurodegeneração (Figura 5a). Além disso, o fenótipo em 867 mutantes piora ao longo do tempo, sugerindo que o Brat desempenha um papel dependente da idade na neuroproteção17 (Figura 5b).
Figura 1 : Encaminhar a tela genética para identificar novos genes neuroprotetores. (A) estratégia de tela. (B) instrumento de escalada do teste do ensaio. (C) resultados do ensaio de escalada para machos de 235 linhas homozygous de ENU-mutagenized. O gráfico de pizza representa as proporções das linhas de voo testadas que caem em 4 grupos de taxas de passagem de escalada: 0%, 1-20%, 21-50% e 51-100%. (D) resultados da análise estatística ANOVA de 1 via na qual as linhagens mutantes foram comparadas com o valor médio de escalada de todas as linhas testadas. Representado é o número de duas categorias de valor P: P < 0, 5 (alteração significativa) e P > 0, 5 (alteração não significativa).
Figura 2 : Tela secundária da histologia. H & E-manchado seções do meados de-cérebro que ilustram, da esquerda para a direita, nenhuma neurodegeneração, neurodegeneração suave, e neurodegeneração confirmada. Um total de 51 linhas homozygous foi retestado pela histologia após a identificação dos candidatos que usam o ensaio de escalada. As setas indicam os furos no cérebro indicativos de neurodegeneração. A região circundada pelas linhas pontilhadas mostra a neurodegenração severa observada na linha 867.
Figura 3 : Identificação do gene neuroprotetor pirralho seguinte mapeamento da deficiência usando o ensaio de escalada. (A) mostrados são imagens representativas de H & e-corados meados-cérebro seções de 18-20 dias de idade w1118 (controle), heterozygous 867 (867/+) e homozygous 867 mutante moscas. (B) a linha de deficiência DF (2L) ED1272 (BL_24116) não complementa o fenótipo mutante 867 (histograma preto) baseado no ensaio de escalada. A verificação histológica mostra que a linha DF (2L) ED1272 não complementa o fenótipo da neurodegeneração 867, enquanto o DF (2L) ED1315 (BL_9269) faz. O gráfico representa o desvio médio e padrão de 5 ensaios de escalada para cada linha. Asteriscos indicam significância com base na ANOVA One-Way, em que o valor médio de escalada percentual de cada linha foi comparado com o valor médio de escalada percentual da linha 867/+ (histograma verde). * P < 0, 5, * * P < 0, 1 e * * * P < 0, 1. (C) representação esquemática de linhas de deficiência adicionais mostrando não complementação do fenótipo 867 pela histologia. Este número foi modificado de Loewen et al.17; artigo publicado a licença Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figura 4 : Mutação de ponto no pirralho gene conduz a uma mudança do ácido aminado no domínio coiled-coil da proteína do Brat. (A) modelo e primers do gene do Brat usados para a amplificação e arranjar em seqüência da região da codificação. (B) o sequenciamento de DNA do locus do pirralho identifica uma mudança de nucleotídeo que leva a uma mudança de aminoácidos no domínio da bobina coiled da proteína Brat. Este número foi modificado de Loewen et al.17; artigo publicado a licença Creative Commons Attribution 4,0 International License.
Figura 5 : Análise mais aprofundada de pirralho mutantes confirma o seu papel neuroprotector A Drosophila. (A) usando o sistema de GAL-4 > UAS22 , a expressão neuroblast-específica do gene funcional do Brat resgata o phenotype do neurodegeneração em 867 mutantes. (B) a neurodegeneração dependente da idade é observada em 867 mutantes portadores de um gene repórter PCNA-GFP. o BratCHS corresponde ao nome do alelo do Brat na linha 867, que foi nomeado cheesehead (CHS). São mostradas seções representativas do midbrain H & E-manchadas de YW (controle) e pirralho homozigrato CHS; PCNA-GFP moscas das idades indicadas. Este número foi modificado de Loewen et al.17; artigo publicado a licença Creative Commons Attribution 4,0 International License.
| Estação | Tempo | Temperatura | Vácuo/pressão | Solução |
| 1 | NENHUM ATRASO-INÍCIO RÁPIDO | |||
| 2 | FORA | FORA | FORA | |
| 3 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | 80% EtOH |
| 4 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | 95% EtOH |
| 5 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | 100% EtOH |
| 6 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | 100% EtOH |
| 7 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | 100% EtOH |
| 8 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | Xilenos |
| 9 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | Xilenos |
| 10 | : 15 anos | 37 ° c | LIGAR/LIGAR | Xilenos |
| 11 | : 30 anos | 58 ° c | LIGAR/LIGAR | Parafina |
| 12 | : 15 anos | 58 ° c | LIGAR/LIGAR | Parafina |
| 13 | FORA | 58 ° c | FORA | Parafina |
| 14 | : 15 anos | 58 ° c | LIGAR/LIGAR | Parafina |
Tabela 1: Configurações recomendadas do programa para o processador de tecidos automatizado. As etapas na ordem alistadas aqui podem ser usadas com um processador automatizado do tecido para cabeças fixas.
| Reagente | Volume (μL) |
| 10x ExTaq buffer (mg2 + Plus) (20 mm) | 2,5 |
| Primer dianteiro (10 μM) | 2,5 |
| Primer reverso (10 μM) | 2,5 |
| 2,5 mM dNTPs | 2 |
| Modelo de DNA | 2 |
| TaKaRa ex TQ (5 U/μL) | 0,25 |
| Água nuclease-livre | 13,25 |
| Volume total | 25 |
Tabela 2: Reagentes utilizados para reação de PCR. Reagentes e respectivos volumes utilizados na reação de PCR para amplificar a região de codificação de pirralho.
| Passo | Temperatura | Tempo |
| 35 ciclos | 95 ° c | 15 de s |
| 55 ° c | 45 s | |
| 72 ° c | 3 min 10 s | |
| Segurar | 4 ° c | ∞ |
Tabela 3: Condições térmicas de ciclagem usadas para PCR. As etapas na ordem listada aqui podem ser usadas para programar um Thermal cycler usando a mistura da reação mostrada na tabela2.
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Discussion
As telas genéticas para diante em Drosophila têm sido uma abordagem eficaz para identificar genes envolvidos em diferentes processos biológicos, incluindo a neuroproteção dependente da idade5,23,24, 25. using esta estratégia, nós éramos bem sucedidos em identificar o Brat como um gene neuroprotetor novo17.
Um passo crítico neste protocolo envolve a orientação adequada das cabeças (conforme descrito na seção 4.4.3.) para a análise histológica. Adicionalmente, os marcadores da linha utilizada para o mapeamento meiótico não devem interferir no fenótipo da nova mutação (neste estudo: neurodegeneração). Nós recomendamos um teste inicial para confirmar que os marcadores escolhidos não causam a neurodegeneração do seus próprios. Por exemplo, atolado (J) provoca bolhas de asa que poderiam possivelmente interferir com a escalada como é o caso para a proteína precursor amiloide (app)-sobreexpressando moscas que também têm asas empoladas26. Lóbulo (L) conduz à redução no tamanho do olho; no entanto, não observamos a degeneração cerebral central e este marcador pode ser usado para mapear a neurodegeneração cerebral central. PIN e sternoplural (SP) também são apropriadas para usar, como cérebros de moscas carregando esses marcadores são comparáveis aos cérebros de controles de tipo selvagem.
Uma desvantagem da metodologia genética para a frente em moscas é o período de tempo necessário para estreitar as regiões de DNA para o gene de interesse3,5. O uso de estratégias de mapeamento melhoradas27 juntamente com a disponibilidade de tecnologias de sequenciamento de próxima geração 28 deve permitir ainda mais fácil identificação de mutações associadas com fenótipos de interesse. Telas genéticas para a frente podem ser trabalhoso. Por exemplo, a confirmação da histologia, que os ensaios diretamente para a neurodegeneração no cérebro, sozinho exige uma quantidade de tempo considerável. No entanto, essa abordagem será muito mais difícil e dispendiosa de se realizar em modelos de mamíferos, não necessariamente permitindo extensos estudos genéticos. As telas químicas da mutagenese são vantajosas porque a identificação de mutações de ponto poderia fornecer a informação crítica sobre a função de produtos dos genes afetados. A identificação de uma mutação de ponto que causa uma mudança do ácido aminado em um domínio conservado da proteína do Brat (Figura 4B) ilustra a importância do domínio da bobinagem-bobina desta proteína de Trim-NHL na neuroproteção18. O ensaio de escalada, que mede o comportamento locomotor, é certamente vantajoso, permitindo o teste rápido de um grande número de moscas para defeitos de mobilidade, também muitas vezes visto na neurodegeneração humana25. Este ensaio também pode ser realizado em outro cenário de tela, como a tela de interferência de RNA in vivo (RNAi) em todo o genoma que pode ser usada para identificar genes neuroprotetores. Embora diminuímos a distância entre a parte inferior da câmara de teste e a linha de passagem de 8 cm10 a 5 cm para definir uma taxa de passagem mais rigorosa no presente estudo, as baixas taxas de escalada não espelham a neurodegeneração para um grande número de linhas. A neurodegeneração pode tornar-se aparente após o início de defeitos comportamentais, significando que as moscas podem precisar de ser envelhecidas por mais tempo antes que os vacúolos apareçam. Outra possibilidade é que os defeitos locomotores que observamos em certas linhas não sejam devidos ao funcionamento neurológico defeituoso, mas sim à fraqueza muscular ou à inadequação mais geral das moscas. Além disso, é possível que estamos faltando potenciais candidatos, em que os defeitos de escalada não se manifestam em idade mais jovem (por exemplo, 10 dias de idade), mas sim tornar-se proeminente mais tarde na vida. Esta estratégia de triagem poderia certamente ser aplicada para identificar genes dependentes da idade, eliminando assim os genes associados a potenciais defeitos do desenvolvimento neural. O protocolo aqui apresentado pode ser ajustado dependendo da probabilidade desejada de linhas candidatas para conter o gene mutado envolvido na neuroproteção. Abaixar o limiar de taxa de passagem diretamente é outro meio de alcançar o mesmo resultado. Estes candidatos teoricamente exibem maior neurodegeneração, o que poderia economizar tempo e recursos durante a confirmação e mapeamento.
Em geral, o protocolo descreve uma maneira direta de tela para a neurodegeneração e, posteriormente, identificar candidatos a genes neuroprotetores. Esta aproximação genética não é limitada ao comportamento e aos ensaios histológicos descritos aqui, e pode igualmente ser usado para telar para outros fenótipos como a paralisia temperatura-sensível (dos TS), a colocação do ovo ou os fenótipos da fertilidade, apenas para citar alguns. Por exemplo, os mutantes de Drosophila TS-paralítico são sabidos para ser enriquecidos para a neurodegeneração29 e poderiam representar uma fonte adicional para a identificação de genes neuroprotetor.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Estamos particularmente gratos ao Dr. Barry Ganetzky, no laboratório de quem a tela genética foi realizada, permitindo a identificação e caracterização do pirralho como um gene neuroprotetor. Agradecemos ao Dr. Steven Robinow por gentilmente fornecer a coleção de ENU-mutagenized moscas usadas na tela genética apresentada neste artigo. Agradecemos aos membros do laboratório Ganetzky, Drs. Grace Boekhoff-Falk e David Wassarman para discussões úteis durante toda a duração deste projeto, Ling Ling Ho e Bob Kreber para assistência técnica, Dr. aki Ikeda para o uso de sua instalação de micrótomo no Universidade de Wisconsin e Dr. Kim Lackey e a instalação óptica da análise na Universidade de Alabama.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
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