Summary
我们提出了一个协议,使用前向遗传方法筛选在果蝇黑色素细胞中表现出神经退化的突变体。它结合了爬升测定、组织分析、基因映射和DNA测序,最终鉴定出与神经保护过程相关的新基因。
Abstract
关于神经退行性疾病的发病和进展,包括负责的基本基因,有许多需要了解。使用化学诱变剂进行前向基因筛选是一种有用的策略,用于将突变表型与果蝇和其他与人类共享保守细胞途径的模型生物体之间的基因进行映射。如果感兴趣的突变基因在苍蝇的早期发育阶段不是致命的,则可以进行爬升测定,以筛选大脑功能下降的样型指标,如低爬升率。随后,对脑组织进行二次组织学分析,通过评分神经变性表型来验证基因的神经保护功能。基因映射策略包括依赖这些相同测定的微量和缺陷映射,可以遵循DNA测序来识别感兴趣的基因中可能存在的核苷酸变化。
Introduction
神经元在大部分后是线粒体,不能分裂1,2。在大多数动物中,神经保护机制的存在,以维持这些细胞在整个生物体的整个寿命,特别是在老年时,神经元最容易受到损害。这些机制背后的基因可以在出现神经退化的突变体中识别,这是一种表型指标,用于神经保护的丧失,使用正向遗传方案。使用化学诱变剂(如乙酸甲酸酯 (EMS) 或 N-乙基-N-硝基苏雷亚 (ENU) 的正向基因筛网特别有用,因为它们诱发随机点突变,从而产生一种固有的不偏不倚的方法,揭示了真核模型生物体中的大量基因功能(相反,X射线诱变会产生DNA断裂,并可能导致重排而不是点突变6)。
常见的果蝇果蝇黑色素是这些屏幕的理想主题,因为它的高品质,有编号的基因组序列,其长期历史作为一个模型生物与高度发达的遗传工具,最重要的是,其共享进化史与人类7,8。该协议的适用性的一个限制因素是由突变的基因引起的早期杀伤力,这将阻止在9岁时的测试。然而,对于非致命突变,利用负地轴的爬升测定是一种简单的,虽然广泛的,量化受损的运动功能10的方法。为了表现出足够的运动反应性,苍蝇依靠神经功能来确定方向、感知其位置和协调运动。因此,苍蝇无法充分攀爬以响应刺激,这可能表明神经缺陷11。一旦发现特定的有缺陷的攀爬表型,使用辅助屏幕(如脑组织分析)进行进一步测试,可用于识别攀爬缺陷苍蝇的神经退化。随后的基因映射可用于揭示染色体上的基因组区域,该染色体携带感兴趣的有缺陷的神经保护基因。为了缩小感兴趣的染色体区域,可以使用携带具有染色体上已知位置的显性标记基因的突变飞线进行中度映射。标记基因作为突变的参考点,因为两个位点之间的重组频率提供了一个可测量的距离,可用于绘制基因的大致位置。最后,在感兴趣的染色体色谱区域上,用带有平衡缺陷的线穿过突变线,创建一个补充测试,其中,如果感兴趣的基因表示其已知的表型5,则可以验证该基因。识别基因中的多态核苷酸序列,可能导致氨基酸序列的改变,可以通过测序该基因并将其与果蝇基因组序列进行比较来评估。后续感兴趣的基因表征可以包括测试额外的突变等位基因,突变抢救实验和检查额外的表型。
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Protocol
1. 苍蝇的准备和老化
- 获取或生成6个将被用于基因筛选的果蝇突变体的集合。在这里,使用 ENU 诱变线映射到第二个染色体,并在CyO上平衡。
- 在25°C、12小时光/暗循环的培养箱中放大实验基因型系,在玉米粉-糖蜜培养基上。
- 从每个实验基因型中收集大约20个同源后代,在0-2天的成人环状之间。通过一贯收集雄性或雌性苍蝇来消除性别偏见。
- 在29°C下,按期望在玉米粉糖上使苍蝇老化,每2-3天翻转一次小瓶,以便随着苍蝇的老化,保持它们对新鲜食物的食用。在显示的屏幕上,苍蝇的老化时间为10-12天。
- 组装一个爬升检测室使用两个小瓶和磁带,如前面描述10。小瓶应在两端连接。使用标尺在造型室的一端标记 5 厘米的线条。
2. 议定书1:攀岩测定(改编自阿里等人10)
- 验证爬坡测定。在这项研究中,测试基于Ali等人先前描述的方法,使用Elav C155>UAS-TauR406W(显示较低的爬坡合格率)和Elav C155>UAS-GFP (控制)和ElavC155>UAS-mCherry(控制)苍蝇。
- 将苍蝇翻转到测试室,一次一行(不使用CO2麻醉),并允许它们恢复5分钟。如果测试是在不同日期进行的,则在一天的同一时间执行测定。在这项研究中,所有爬升测定在下午进行,以控制昼夜效应对运动12。
注:测试时避免将苍蝇暴露在阳光直射下;这将干扰他们的攀登能力。 - 强行将腔室(标记的侧下)敲击放置在固体表面上的鼠标垫上 3 次,以便所有苍蝇在底部开始测定。观察飞行运动在10的周期。
- 记录在此期间到达或通过 5 厘米线的苍蝇数量,以及测试的苍蝇总数。重复该协议,每次试用之间等待 1 分钟,每行至少进行 3 次试用。
注:在本研究中,每瓶含有2至19只苍蝇进行初始筛查(雄蝇),6至21只苍蝇接受跨线突变缺乏分析(第5.3节)。
3. 议定书2:选择果蝇菌株进行进一步分析
- 在 Microsoft Excel 或类似软件中输入爬升测定数据,并计算所有复制的爬坡率(百分比)。
-
使用R软件包13执行统计分析,以检测与所有线路的平均爬升百分比值有显著偏差的突变线。
- 读取为 R(.csv 或 .txt 文件,每个变量或因子有一列)和表示特定值的行)的数据文件。
注:在这里,男性(初始测定)和女性(第867行交叉到缺陷线)的数据作为两列输入到单独的 .xlsx 工作表中,其中列的行标识突变线,重复测定的次数,另一列在其中行表示每个复制的苍蝇小瓶的平均爬升成功(百分比)。 - 使用以下代码将数据读入 R:
马里<-read.csv("./男_init.csv")
femdef_lt;-read.csv("./fem_def_cross.csv")
注:路径目录中的"..."是用户计算机根目录中的绝对路径,需要由单个用户为其计算机的目录路径指定。 - 执行线性建模
- 使用 R 中的lm函数执行虚拟变量回归。对于突变线的初始分析,评估因子水平效应(突变线)对上升成功率的重要性与零均值中心响应变量(百分比成功)的大均值。
注:第 3.2.3.2 节中lm函数调用末尾的"-1"。删除截距,并允许我们根据百分比爬升合格率的零均值中心平均值测试所有因子水平。 - 使用 R摘要功能将结果打印到屏幕上:
马里卡·阿诺瓦·内特;-lm(规模(马里$P_成功)_马里$Mutant_line-1)
摘要(马里奥·阿诺娃) - 使用控制线(如果存在)作为基准,以测试因子级别效果,反对使用以下 R 代码:x_lt;-relevel(femdef_Mutant_line,ref="a867_plus")
femdef_anova_lt;-lm(femdef_P_成功_x)
摘要(费夫德·阿诺娃)
注:第一行代码对因子级别重新排序,以便负控制线成为基线截距,所有其他因素级别(突变线)都使用lm函数中的内置t检验进行测试。
- 使用 R 中的lm函数执行虚拟变量回归。对于突变线的初始分析,评估因子水平效应(突变线)对上升成功率的重要性与零均值中心响应变量(百分比成功)的大均值。
- 读取为 R(.csv 或 .txt 文件,每个变量或因子有一列)和表示特定值的行)的数据文件。
- 根据测试时的年龄,选择候选行的阈值。要确定阈值,使用已知突变体在所需年龄进行初步测试,与野生类型相比,具有神经退化和低爬升合格率,控制苍蝇10。
注:通过率低于50%可能适合10天苍蝇,因为之前报道的果蝇线过度表达人类神经退化相关的基因Tau在神经系统10。较老的苍蝇应该有一个更高的通过率阈值,因为他们预计将表现出减少的loco动,因此,增加神经退化。
4. 议定书3:公司学分析
- 戴上手套,在攀爬检测后用手术刀片切断苍蝇头,并使用画笔将其轻轻放入1mL的Carnoy的固定剂(6:3:1的100%EtOH:氯仿:冰川醋酸)在1.5 mL微型离心管O/N在4°C。确保磁头沉入固定溶液中。
- 第二天用 1 mL 70% EtOH 替换固定溶液,并将样品保持在 4°C,以便将来分析。
注:协议可能在此步骤中暂停。 - 将步骤 4.2 中的头放置。每张小生生磁带最多五个。立即将盒式磁带放入装有 70% EtOH 的容器中。在将容器运送到一个机构设施进行处理和石蜡嵌入头之前,将容器储存在 4°C。如果组织处理和嵌入设备可用,请按照步骤 4.4 操作。
- 将头嵌入石蜡中进行微托姆切片:
- 按照表 1中显示的顺序操作自动组织处理机的程序设置,以脱水、清除和渗透石蜡的头部。
- 使用石蜡在 60°C 下加热的石蜡,将样品转移到金属基模中,使用石蜡嵌入站安装盒。
- 使用精细的钳子将头部(朝上朝顶的前后方向)定向到基模中,以便在切片后正确可视化脑组织。这可以通过在60°C下重新加热石蜡,并在必要时重新定位头部来实现。
注:金属模具可以由一次性基础模具取代。 - 将盒放在相应基础模具的顶部,然后轻轻地将这些盒移到石蜡嵌入站 (4 °C) 的冷藏侧。等待,直到块硬化之前,从站中删除它。
- 将模具与盒式分离,将模具从盒中分离,从而拆下模具的块。
- 修剪每个石蜡块之前的切片,以尽量减少将切片的表面。
- 将微体设置为切割每个块的 5 μm 部分。
- 将含有组织的切片石蜡带放入加热水浴(35°C)中,最长5分钟。
- 将多利盐水涂层滑块浸入加热水浴中(有助于保持组织),使用木材施用器将切片带放在滑轨上。让幻灯片在室温下干燥 O/N。
- 使用滑轨加热器在 63°C 下加热幻灯片 15 分钟。
- 将幻灯片放在滑轨染色架上,并按照以下步骤将血氧林和欧辛 (H&E) 染色置于烟罩下。
- 将机架置于组织选择(无毒替代二甲苯,这有助于从样品中取出石蜡)5分钟。
- 将机架转移到装满"组织选择"的容器中 5 分钟。
- 将机架转移到装有 100% EtOH 1 的容器中 5 分钟。
- 将机架转移到装有 100% EtOH 2 的容器中 5 分钟。
- 将机架转移到装有 95% EtOH 的容器中 3 分钟。
- 将机架转移到装有 70% EtOH 的容器中 3 分钟。
- 将机架转移到装有蒸馏 H2O 的容器中 5 分钟。
- 将机架转移到装满哈里斯血氧林的容器中 2-5 分钟。
- 将机架从血氧林溶液中取下,并将其置于自来水下 10 分钟。
- 通过做一个短的灌篮,将机架转移到装满蒸馏水的容器中。
- 将机架转移到装有 Eosin 的容器中 1-2 分钟。
- 通过做一个短的扣篮,在装有95%EtOH的容器中转移机架。
- 将机架转移到装有 95% EtOH 的容器中 5 分钟。
- 将机架转移到装有 100% EtOH 的容器中 5 分钟。
- 将机架转移到装有 100% EtOH 的容器中 5 分钟。
- 将机架在装有"组织选择"(或 X二烯)的容器中传输 5-10 分钟,直到安装所有滑轨。
- 安装滑轨和盖玻片(24 mm x 60 mm 尺寸)。使用钳子,将幻灯片从"组织选择"或"二甲苯"溶液中拉出,并在其顶部制作一个薄带的安装介质。轻轻地将盖玻片放在顶部,尽量避免形成气泡。
- 在分析之前,让安装式滑轨上的安装介质硬化烟气罩下的 O/N。
- 在室温下将彩色幻灯片存放在盒子里。
- 在光学显微镜下以 20 倍的放大倍数查看幻灯片上的所有序列部分,从而量化神经退化。检查整个大脑,对连续三节中出现的空穴的大小和数量进行定性记录。
- 使用配备成像软件的光学显微镜,获取大约中脑中具有代表性的大脑部分的图像。
5. 协议4:隐性混体表型的基因映射
- 越过候选线到野生类型类州(BL= 9517)或其他野生类型或同种菌株(例如,俄勒冈R(BL= 2376),w 1118 (BL=5905) 或yw (BL= 6599),以确定表型是否占主导地位或隐性。
注:此步骤的结果将指导映射的后续步骤。如果表型是隐性的,则可以执行缺陷映射。- 使用画笔,通过在含有食物的瓶CO2- 麻醉苍蝇的突变的兴趣线(5雄)和广州S线(10-15处女)做十字架。将小瓶置于25°C。
- 收集异体F1后代和重复攀登和动物学实验。
- 将所得结果与控制线和同源突变体进行比较。如果异体突变体表现出与野生型苍蝇相似的表型,则隐性表型的良好指示是。
- 使用wgSp-1 J1 L1引脚1/CyO (BL_3227) 或已知相关显性标记的等效应变,执行微量映射以粗略估计突变在第二条染色体上的位置细胞学位置。在这种情况下,突变以前已知位于第二个染色体上。
- 使用画笔,通过在含有食物的瓶CO2- 麻醉苍蝇的突变的兴趣线(5雄性)和wg Sp-1 J1 L2引脚1/CyO线(10女性)做十字架。将小瓶置于25°C。
注:这个十字架的目标是产生携带染色体的异体女性,新的突变和标记染色体,这将在梅氏病6,14期间重组。女性F1后代是选择而不是男性,因为重组不会发生在男性。 - 收集至少15个处女雌性后代携带染色体与新的突变和标记染色体,并交叉他们到5男性从一个平衡线,携带另一个可见的显性标记(例如,CyO/snaSco (BL_2555) 或等价物)。
- 在步骤5.2.2中收集携带Sco或CyO的异体雄性后代,以及可能重新组合的染色体。并单独将它们与携带突变染色体的种群中的处女交配。
- 从步骤 5.2.3 中描述的最终十字中收集后代。和年龄的苍蝇在29°C(在这项研究中苍蝇的年龄为10-14天)。
- 收集头部,执行协议 3 中描述的组织学分析,并查看带有大脑部分的幻灯片,以确定步骤 4.11 中描述的神经病理学程度。组织学分析是执行的,而不是运动分析,由于表型,可能会影响爬升测定,如Jammed(J),导致流体积聚在机翼15。
- 使用画笔,通过在含有食物的瓶CO2- 麻醉苍蝇的突变的兴趣线(5雄性)和wg Sp-1 J1 L2引脚1/CyO线(10女性)做十字架。将小瓶置于25°C。
- 对染色体的狭窄区域执行缺陷映射,使用爬升测定来优化隐性突变的位置。每个缺陷线都有染色体不同区域的删除,允许它们用于补充测试。
- 从跨越在微量映射中确定的区域的巨大缺陷开始,然后通过使用较小的缺陷可以进一步缩小这些缺陷。如果缺陷分析导致多个候选基因,建议使用RNA干扰(RNAi)储存来靶向它们。
- 第二染色体(本研究中的DK2L)的果蝇缺乏试剂盒16的交叉线,并寻找兴趣表型的不补充(在本研究中:爬升8.5%的通过率,对应于同源飞行从线867用作正控制)。
- 如第 4 节(协议 3)所述,使用组织学验证确认神经退化表型。
6. 第5号议定书:DNA测序和分析
注:请记住,ENU诱变引入点突变11。
- 设计向前和反向引物序列,在brat基因的外向编码区域两侧,通过感兴趣的区域的聚合酶链反应(PCR)进行扩增(对于867线,3,247 bp大小的DNA片段被扩增测序17。
-
从一只苍蝇中提取DNA18 :
- 在含有50μL挤压缓冲液(10mM Tris-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25 mM NACl和200 μg/mL蛋白酶K)的0.5 mL微型离心管中轻轻挤压苍蝇;每次使用前必须从冷冻液中稀释酶)。
- 在37°C下孵育30分钟
- 将管置于 95°C 2 分钟,使蛋白酶 K 停用。
注:提取的DNA可在4°C下储存数月。
- 使用高保真DNA Taq聚合酶(本研究中使用的试剂和热循环条件分别显示在表 2和表 3中)执行 PCR 反应,遵守制造商的说明,并在 1 上运行 PCR 产品% 抗氧化糖凝胶含有Invitrogen SYBR安全DNA凝胶染色,这是溴化Ethidium的无毒替代品。
- 使用手术刀从凝胶中去除正确尺寸的带,并使用向导 SV 凝胶和 PCR 清理系统 (Promega) 或等效套件净化 PCR 产品,遵守制造商的说明。
- 设计用于DNA测序的正向和反向引物,以便尽可能覆盖整个感兴趣的区域。从上一步对凝胶纯化的DNA进行测序,以识别点突变。自动荧光桑格测序的高精度可达 700 bp。
注:Ex Taq 聚合酶 (TaKaRa) 可用于从高达 20 kb 大小的基因组 DNA 模板中扩增 PCR 产品。 -
使用A质粒编辑器(ApE,由M.Wayne Davis)或类似软件分析获得的DNA序列,通过对齐它们并将其与参考菌株同一基因组区域测序后获得的序列进行比较(例如,最初被诱变行)。
- 使用 ApE 打开排序文件。作为参考,使用包含从Flybase以FASTA格式下载的brat基因的基因组共识序列的ApE文件,或包含遗传背景控制序列结果的文件(例如,最初诱变的果蝇行)。
- 转到"工具",然后对齐序列。使用计算机的鼠标,选择要比较的所有序列。请记住在拖放菜单中指示用于此对齐的参考序列。
- 与参考序列相比,检查序列区域的核苷酸变化。如果需要,单击"文本",将计算机上的对齐方式以 .rtf格式保存,然后保存。
注:如果没有发现突变,DNA测序和分析协议将重复与引源设计,包括基因的非编码区域。
7. 协议6:候选基因功能的进一步分析
- 在神经细胞中执行抢救实验,以确定基因小子是否负责神经退化表型。
- 双平衡UAS-brat19和神经细胞特异性worniu-Gal4 (wor-G4 ) 股票携带结构在第三染色体上,以及867线,这是突变的基因布列位于第二染色体。
- 制作三个独立的十字架,将三个不同的含食物小瓶5男性从UAS-Brat,wor-G4和867线,并添加到每组男性10-15处女从线携带标记和平衡器为第二和第三染色体(Sp/CyO;博士/Tm3,sb;BL_59967)。
- 从每个十字架的F1收集10-15名处女,具有以下基因型: +/CyO;UAS-brat/Tm3,sb, +/CyO; wor-G4/Tm3, sb和867/CyO; +/Tm3, sb和 5 男性,每个以下基因型: +/Sp;UAS-brat/Tm3,sb,+/Sp;wor-G4/Tm3、sb和867/CyO;+/博士。
- 交叉交错+/CyO;UAS-brat/Tm3,sb处女到+/Sp;UAS-brat/Tm3,sb男性;在单独的小瓶中与 +/CyO 进行第二个十字;wor-G4 /Tm3,sb处女到+/Sp;wor-G4/Tm3,sb雄性,然后在第三瓶中交叉867/CyO;\/Tm3,sb处女和867/CyO;+/博士男性。
- 从这些十字架的F1中,收集以下基因型的男性和女性:Sp/CyO;UAS-brat/Tm3,从第一个十字,Sp/CyO;wor-G4/Tm3,从第二个十字和867/CyO;博士/Tm3,从第二个十字架上
- 执行从每个 F1 后代收集的兄弟姐妹之间的最后交叉,为所有三个线建立永久的双平衡库存。
- 将UAS-brat和wor-G4与867突变相结合。
- 从867/CyO收集足够数量的处女(+20-30苍蝇); Dr/Tm3,sb双平衡股票执行两个交叉。
- 放置 10-15 处女与 +5 男性从Sp/CyO;UAS-brat/Tm3,sb(交叉#1)和第二瓶10-15处女与+5 Sp/CyO;wor-G4/Tm3,sb雄性。
- 收集兄弟姐妹从每个十字架的F1与以下基因型:867/CyO;UAS-brat/Tm3,从交叉#1和867/CyO;wor-G4/Tm3,从交叉#2。使用从每个十字架收集的F1后代,通过跨越兄弟姐妹之间建立永久股票。
注:按照最后一步,股票为867/CyO;应生成 UAS-brat/Tm3、sb和867/CyO;wor-G4/Tm3,sb。
- 执行救援实验。
- 从867/CyO收集15-20名处女;wor-G4/Tm3,sb股票,从股票867/CyO中交叉到5-10只雄性;UAS-brat/Tm3,sb.作为对照,从867/CyO交叉+15-20处女;wor-G4/Tm3,sb和+15-20处女从867/CyO;UAS-brat/Tm3,仅867/CyO线。
注:867只苍蝇携带温度敏感等位基因,救援十字应在29°C下进行。 - 通过仔细选择标记的平衡器从每个十字架上收集以下 F1后代:867/867;wor-G4/UAS-brat(救援)、867/867;wor-G4/+(控制)和867/867;UAS-brat/+ (控制)。
- 苍蝇在29°C时按要求年龄,使用第4节(协议3)中描述的协议对大脑进行组织学分析,以寻找神经退化。
- 从867/CyO收集15-20名处女;wor-G4/Tm3,sb股票,从股票867/CyO中交叉到5-10只雄性;UAS-brat/Tm3,sb.作为对照,从867/CyO交叉+15-20处女;wor-G4/Tm3,sb和+15-20处女从867/CyO;UAS-brat/Tm3,仅867/CyO线。
- 双平衡UAS-brat19和神经细胞特异性worniu-Gal4 (wor-G4 ) 股票携带结构在第三染色体上,以及867线,这是突变的基因布列位于第二染色体。
- 对867名突变体的神经变性进行年龄相关分析。
- 收集867;pcna-GFP和yw控制苍蝇,携带报告基因(pcna-GFP),在25°C下可行,并且比仅867就表现出更高的渗透力和更高的神经代表型表达性温度17.
- 如第 1.4 节所述,苍蝇的年龄高达 5、15 和 25 岁,并遵循第 4 节(协议 3)中的协议进行后续组织学分析。
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Representative Results
在此分析中,我们介绍了用于识别基因脑肿瘤(brat)的步骤,这些步骤在维持成年苍蝇17的神经元完整性(例如神经保护)方面起着作用;一种可用于识别神经保护中涉及的基因的方法。我们使用一种正向遗传方法(该策略如图1A中概述)使用爬升测定筛选化学诱变苍蝇的集合(用于此测定的仪器如图1B所示)。在235条同源线中,约37%的被测线在10-12天测试时表现出低于50%的爬升合格率(图1C)。58% 的被测线路表现出明显不同的爬升行为,当其百分比爬升通过率 (CPR) 相比,所有测试线的平均爬升百分比值使用单向 ANOVA (图 1D)。随后,在51条显示最低爬坡合格率的线路上,组织学屏幕显示,其中29条线显示,大脑神经孔(从轻度到严重)有明显出现,指示神经退化20( 图 2.在显示有缺陷的攀爬行为和严重神经退化的线条中,我们选择绘制第 867 行(0% CPR 和 P 值 = 1.36e-14 基于单向方差分析)中表型基础的突变。867 苍蝇的神经退化表型是隐性的 , 因为已经越过野生型菌株的 867 苍蝇的大脑与这些对照组相当 (图 3A ) 。使用组织学,在31-51细胞学位置,在第二个果蝇染色体上的型型标记J(Jammed)和L(Lobe)之间,将突变定位在细胞学位置。 使用爬升测定法,细胞学位置31和51之间的缺陷映射与来自2L(DK2L)16的果蝇缺乏工具包的线绘制了包含118个基因的区域的突变(图3B;其中 867/* 用作统计分析的控制)。检查867个突变体跨越到额外的缺陷线(图3C)的大脑表型证实,突变包含在基因组的一个区域,其中包括基因brat。通过单击与已删除段关联的链接(例如,对于 Df(2L)ED1272,删除的段为 37C5-38A2),可以在 Flybase 中找到这些删除中包含的所有附加基因的完整列表。根据先前的观察结果,小突变体在大脑中有超数细胞21,一种表型也观察到在867个突变体,布图被选择进行DNA测序分析。包含外置编码区的brat基因的Sanger测序在基因位置37,739处识别G/A核苷酸变化(图4A),导致甘氨酸到谷氨酸(G/E)在Brat蛋白17位置470处发生变化(图4B)救援实验证实,布拉特起着神经保护作用,因为867线中功能基因的过度表达抑制了神经退化表型(图5A)。此外,867个突变体的表型随着时间的推移而恶化,这表明小巴在神经保护17中起着年龄依赖作用(图5B)。
图 1:前向基因筛选,识别新的神经保护基因。(A) 屏幕策略.(B) 攀爬检测测试仪器.(C) 235个同源ENU-诱变线的男性的爬升检测结果。饼图代表测试飞行线的比例,分为4组爬升率:0%,1-20%,21-50%,和51-100%。(D) 结果来自 1 路方差分析统计分析,其中突变线与所有测试线的平均爬升百分比值进行比较。表示的是两个 P 值类别的数字:P < 0.05(显著变化)和 P > 0.05(不显著变化)。
图 2:二级活动学屏幕。H&E 染色的中脑部分说明,从左到右,没有神经退化,轻度神经退化,和确认神经退化。在使用攀爬测定法识别候选者后,共有51条同源线被动物学重新测试。箭头表示大脑中指示神经退化的孔。由虚线环绕的区域显示了第 867 行中观察到的严重神经退化。
图 3:神经保护基因的鉴定布拉特使用爬升测定进行以下缺陷映射。(A) 显示的是 H&E 染色的中脑部分的代表性图像,有 18-20 天前的 w1118 (控制),杂音 867 (867/+) 和同源867突变苍蝇。(B) 缺陷线 Df(2L)ED1272 (BL_24116) 不能补充基于爬坡测定的 867 突变表型(黑色直方图)。组织学验证表明,Df(2L)ED1272线不能补充867神经退化表型,而Df(2L)ED1315(BL=9269)则不补充。图形表示每条线 5 次爬坡试验的均值和标准偏差。星号表示基于单向方差分析的显著性,其中每条线的平均爬升百分比值与线867/+(绿色直方图)的平均爬升百分比值进行比较。• P < 0.05, = P < 0.01 和 +P < 0.001。(C) 其他缺乏线的原理表示,按组织学显示867表型的不补充。这个数字已由Loewen等人第17次修改;在知识共享归因 4.0 国际许可证下发表的文章。
图 4: 点突变布拉特基因导致Brat蛋白的线圈域中的氨基酸变化。(A. 用于编码区域扩增和测序的brat基因模型和引源.(B)小球位点的DNA测序可识别核苷酸变化,导致Brat蛋白的线圈域中氨基酸的变化。这个数字已由Loewen等人第17次修改;在知识共享归因 4.0 国际许可证下发表的文章。
图 5: 进一步分析布拉特突变体确认其神经保护作用果蝇。(A) 使用 Gal-4>UAS 系统22,功能性小球基因的神经细胞特异性表达可挽救 867 个突变体中的神经退化表型。(B) 在867名携带报告基因pcna-GFP的突变体中观察到年龄依赖性神经退化。bratchs对应于第 867 行中的bt等位基因的名称,该名称被命名为奶酪头(chs )。图中展示的有代表性的H&E染色的yw(控制)和同源性胸腺的中脑部分;指定年龄的pcna-GFP苍蝇。 这个数字已由Loewen等人第17次修改;在知识共享归因 4.0 国际许可证下发表的文章。
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| 5 | : 15 | 37 °C | 打开/打开 | 100% EtOH |
| 6 | : 15 | 37 °C | 打开/打开 | 100% EtOH |
| 7 | : 15 | 37 °C | 打开/打开 | 100% EtOH |
| 8 | : 15 | 37 °C | 打开/打开 | 二甲苯 |
| 9 | : 15 | 37 °C | 打开/打开 | 二甲苯 |
| 10 | : 15 | 37 °C | 打开/打开 | 二甲苯 |
| 11 | : 30 | 58 °C | 打开/打开 | 石蜡 |
| 12 | : 15 | 58 °C | 打开/打开 | 石蜡 |
| 13 | 关闭 | 58 °C | 关闭 | 石蜡 |
| 14 | : 15 | 58 °C | 打开/打开 | 石蜡 |
表 1:自动组织处理器的建议程序设置。此处列出的步骤可与用于固定头的自动组织处理器一起使用。
| 试剂 | 体积 (μL) |
| 10 倍 ExTaq 缓冲器(Mg2+加) (20 mM) | 2.5 |
| 正向底漆 (10 μM) | 2.5 |
| 反向底漆 (10 μM) | 2.5 |
| 2.5 mM dNTP | 2 |
| 模板DNA | 2 |
| 塔卡拉 Ex Tq (5 U/μL) | 0.25 |
| 无核酸酶水 | 13.25 |
| 总体积 | 25 |
表 2:用于 PCR 反应的试剂。在PCR反应中使用的试剂和相应的体积,以放大小编码区域。
| 步 | 温度 | 时间 |
| 35 个周期 | 95 °C | 15 s |
| 55 °C | 45 s | |
| 72 °C | 3 分钟 10 秒 | |
| 保持 | 4 °C | ∞ |
表 3:用于 PCR 的热循环条件。此处列出的步骤可用于使用表2所示的反应混合物对热循环器进行编程。
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Discussion
果蝇的向前基因筛选是识别不同生物过程所涉及的基因的有效方法,包括年龄依赖性神经保护5,23,24,25.使用这种策略,我们成功地鉴定了布拉特为一种新的神经保护基因17。
该协议的一个关键步骤涉及组织学分析的头部的正确方向(如第 4.4.3 节所述)。此外,用于中导映射的线的标记不应干扰新突变的表型(在本研究中:神经退化)。我们建议进行初步测试,以确认所选标记不会导致自身神经退化。例如,Jammed (J)导致机翼水泡,可能干扰攀爬,淀粉样蛋白前体蛋白 (APP) 过度表达苍蝇也起泡翅膀26。Lobe (L)会导致眼睛尺寸的缩小;然而,我们并没有观察到中央脑退化,这个标记可以用来绘制中央脑神经退化图。针和斯特诺复式(Sp)也适合使用,因为携带这些标记的苍蝇的大脑与野生类型控制的大脑相当。
苍蝇向前遗传方法的一个缺点是将DNA区域缩小到感兴趣的基因3,5所需的时间长度。使用改进的映射策略27以及下一代测序技术28的可用性,应能更容易地识别与感兴趣的表型相关的突变。前向基因屏幕可能是劳动密集型的。例如,直接用于大脑神经退化的成体学确认,仅需要相当长的时间。然而,这种方法在哺乳动物模型中将更加困难和昂贵,不一定允许广泛的基因研究。化学诱变筛是有利的,因为点突变的识别可以提供有关受影响基因产品功能的关键信息。在Brat蛋白的保守域(图4B)中,一个点突变的识别说明了这种TRIM-NHL蛋白的线圈域在神经保护18中的重要性。攀爬测定,测量运动行为,当然是有利的,允许快速测试大量的苍蝇在流动性的缺陷,也经常出现在人类神经退化25。这种测定也可以在另一个屏幕设置中执行,例如可用于识别神经保护基因的全基因组体内RNA干扰(RNAi)屏幕。尽管在本研究中,我们把测试室底部和通过线之间的距离从8厘米10缩短到5厘米,以设定更严格的通过率,但低爬升率并没有反映大量线路的神经退化。神经退化可能在行为缺陷出现后变得明显,这意味着苍蝇可能需要在出现空穴来之前老化更长时间。另一种可能性是,我们在某些行中观察到的运动缺陷不是由于神经功能缺陷,而是由于肌肉无力或苍蝇更普遍的不适合。此外,我们可能缺少潜在的候选人,其中攀爬缺陷不会在年轻时(例如,10天大)表现出来,而是在晚年变得突出。这种筛选策略当然可以应用于识别年龄依赖基因,从而消除与神经发育的潜在缺陷相关的基因。这里提出的协议可以根据候选线包含神经保护中涉及突变基因的所需概率进行调整。直接降低通过率阈值是实现相同结果的另一种方法。从理论上讲,这些候选者将表现出更大的神经退化,这可以在确认和映射期间节省时间和资源。
一般来说,该协议描述了一种直接的方法来筛选神经退化,并随后识别神经保护基因候选者。这种遗传方法并不限于此处描述的行为和组织学测定,还可用于筛选其他表型,如温度敏感 (ts) 麻痹、卵子产卵或生育表型,仅举几个。例如,果蝇-麻痹突变体已知会丰富神经退化29,并可能成为识别神经保护基因的另一个来源。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们特别感谢巴里·加内茨基博士,他在实验室里进行了基因筛选,允许识别和鉴定小布作为神经保护基因。我们感谢史蒂文·罗比诺博士提供本文中介绍的基因屏幕中使用的ENU诱变苍蝇的集合。我们感谢Ganetzky实验室的成员,格雷斯·博克霍夫-福尔克博士和大卫·瓦萨曼博士在整个项目期间进行有益的讨论,何玲玲和鲍勃·克雷伯提供了技术援助,池田Aki博士在威斯康星大学和金·莱基博士和阿拉巴马大学光学分析设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is 20x |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24 mm x 60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 |
References
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