Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

Summary

L'expression et la purification des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate sont décrites avec des exemples (expression dans E. coli, FPLC). Les protéines purifiées sont utilisées pour la cristallisation et la production d'anticorps et utilisées pour les analyses d'enzymes. Des essais photométriques sélectionnés sont présentés pour afficher la multifonctionnalité de FAHD1 comme oxaloacetate decarboxylase et hydrolase d'acylpyruvate.

Abstract

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) protéines contenant du domaine (FAHD) sont identifiés membres de la superfamille FAH dans les eucaryotes. Les enzymes de cette superfamille affichent généralement des fonctionnalités multiples, impliquant principalement des mécanismes d'hydrolase et de décarboxylase. Cet article présente une série de méthodes consécutives pour l'expression et la purification des protéines FAHD, principalement des orthologues de protéines FAHD 1 (FAHD1) parmi les espèces (humains, souris, nématodes, plantes, etc.). Les méthodes couvertes sont l'expression de protéine dans E.coli, la chromatographie d'affinité, la chromatographie d'échange d'ion, la filtration préparative et analytique de gel, la cristallisation, la diffraction de rayon X, et les essais photométriques. Protéines concentrées de niveaux élevés de pureté peut être utilisé pour la cristallisation ou la production d'anticorps. Les protéines de qualité similaire ou inférieure peuvent être utilisées dans des analyses enzymatiques ou utilisées comme antigènes dans les systèmes de détection (Western-Blot, ELISA). Dans la discussion de ce travail, les mécanismes enzymatiques identifiés de FAHD1 sont décrits pour décrire sa bi-fonctionnalité d'hydrolase et de decarboxylase plus en détail.

Introduction

Le fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)^1,2 superfamille d'enzymes décrit un groupe d'enzymes qui partagent le domaine CATalytique fah hautement conservé^{3,4,5,6 , 7 Annonces , 8 Annonces , 9} (en) ^{, 10}. Malgré leur centre catalytique commun, ces enzymes sont multifonctionnelles, et la plupart se trouvent dans les procaryotes, où elles sont utilisées pour décomposer les composés extraits de sources de carbone complexes³. Seulement trois membres de cette famille ont été identifiés dans les eucaryotes à ce jour: le nom donnant FAH², ainsi que FAH protéine contenant le domaine 1 (FAHD1)^{11,12,13,14 ,15} et FAH protéine contenant le domaine 2 (FAHD2). L'épuisement de FAHD1 a été associé à la respiration mitochondriale altérée^13,16 et associé à un type réversible de phénotype¹⁴ de sénescence cellulaire qui est lié au potentiel intermédiaire lacunes dans le système de transport d'électrons. La FAHD1 humaine et ses orthologues dans les systèmes modèles (souris, nématode, lignées de cellules cancéreuses, plantes, etc.), ainsi que certaines variantes de mutation ponctuelle, sont devenus des cibles médicamenteuses d'intérêt potentiel. Pour cette recherche, les protéines recombinantes à des niveaux élevés de pureté, ainsi que des informations sur les mécanismes catalytiques guidés par des structures cristallines et des anticorps sélectifs sont vitales.

Ce manuscrit décrit des méthodes pour l'expression de protéine de FAHD dans E.coli, chromatographie d'affinité, chromatographie d'échange d'ion, précipitation de sulfate d'ammonium, filtration préparative et analytique de gel, cristallisation, diffraction de rayon X, et essais photométriques. Le but des méthodes et des protocoles décrits ici est de fournir des conseils aux scientifiques travaillant dans divers domaines tels que la bactériologie, la biologie végétale, ainsi que les études animales et humaines, pour caractériser les membres de la superfamille FAH, y compris les membres non caractérisés de la superfamille s'ils deviennent pertinents dans un domaine particulier. Les protocoles décrits ici peuvent fournir un soutien précieux pour des projets visant à caractériser d'autres membres de la superfamille de la FAH procaryotique ou eucaryotique.

La raison d'être des méthodes décrites ici est le fait que pour la caractérisation des protéines mal décrites (en particulier, les enzymes métaboliques d'une pertinence physiologique inconnue), l'approche pour commencer avec des protéines recombinantes purifiées permet à la développement d'outils de recherche inestimables et de haute qualité tels que des préparations d'enzymes actives in vitro, des anticorps de haute qualité et des inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques pour certaines enzymes. Les méthodes décrites exigent la chromatographie liquide rapide de protéine (FPLC) et la cristallographie de rayon X. Des méthodes alternatives (p. ex., pour exprimer des protéines sans induction chimique, ou pour afficher la purification des protéines par centrifugation après traitement thermique suivi d'une chromatographie de dessalement et d'exclusion de la taille), peuvent être trouvées ailleurs¹⁷. Alors qu'un plus large éventail de méthodes est disponible pour l'expression et la purification des enzymes de superfamille FAH^2,7,9,17,18, ce travail se concentre sur l'expression et purification des protéines FAHD en particulier.

Dans la section de discussion de ce manuscrit, les mécanismes catalytiques identifiés pour la protéine FAHD1 (hydrolase, decarboxylase)¹⁵ sont décrits plus en détail, afin de démontrer le caractère chimique des réactions catalysées. Les données obtenues sur la base des travaux précédents^7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) impliquent une troisième activité de l'enzyme comme l'isomérase keto-enol.

Protocol

1. Expression des protéines FAHD dans E. coli compétent

1. Transformation de E. Coli avec vecteurs pour l'expression de la protéine FAHD
   REMARQUE : Les étapes abordées dans la section suivante sont résumées dans l'esquisse de la figure 1A,B. Le même protocole s'applique à toute protéine FAHD, y compris les variantes de point-mutant. De telles variantes peuvent être obtenues par l'intermédiaire des techniques de mutagénèse dirigée s'y ornonne et pcR¹⁹ (comme SOE PCR²⁰) à deux côtés de l'ADNc sauvage.
   
   Figure 1 : Amplification de E. coli compétent et induction de l'expression protéique.
   (A) Insertion du vecteur pET dans des bactéries BL21(DE3) pLysS E. coli compétentes, décrites à la section 1. (B) Protocole de choc thermique et placage de la bactérie E. coli transformée par l'E. coli, décrite à l'étape 1 du protocole. Les bactéries transformées sont plaquées sur des plaques d'agar LB avec des antibiotiques pour la sélection. (C) Amplification des bactéries E. coli transformées par l'EET, décrites à la section 1. Les colonies sont cueillies à partir d'une plaque d'agar LB et amplifiées dans un milieu nourrissant (LB ou NZCYM) jusqu'à ce que la densité bactérienne atteigne le seuil empirique de 0,4. (D) Induction de l'expression protéique par le système DE3-IPTG-pET, décrit à la section 1 et esquissé à la figure 2. La production de protéines est commencée par l'application du produit chimique IPTG. À la fin de la section 1, la granule bactérienne contenant la protéine est récoltée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
   1. Obtenir des bactéries BL21(DE3) compétentes et un vecteur d'expression pET (voir Tableau des matériaux). Choisissez de préférence un vecteur pET qui code également une étiquette decapture N-terminal Ou une balise de capture connexe pour plus de commodité afin de simplifier les étapes de purification suivantes.
   2. Obtenir l'ADNc de la protéine FAHD de choix et l'insérer dans le site de clonage actif du vecteur d'expression pET, entre les sites de promotrice T7 et T7, respectivement.
   3. Après l'amplification et la vérification réussies de plasmide [par le séquençage par un fournisseur commercial (les amorces T7 peuvent être employées avec le système de pET pour la convenance : promoteur de T7, amorce avant : TAATACGACTCACTATAGGG ; T7 terminateur, amorce inverse: GCTAGTTATGCTCAGCGG)], insérer 5 à 10 ng de plasmide dans 100 'L de BL21(DE3) compétent s'il y a des bactéries E. coli sur la glace. Ne pas aspirer de haut en bas, mais appuyez légèrement sur le tube avec afin de mélanger le contenu.
   4. Garder les bactéries sur la glace pendant 30 minutes, en tapant doucement sur le tube toutes les quelques minutes.
   5. Chauffer un appareil de chauffage ou un bain d'eau à 42 oC (exact). Mettez le tube contenant les bactéries dans l'appareil et gardez-les pendant 90 s (exact). Mettez-les sur la glace immédiatement (figure 1A).
   6. Après 5 à 10 minutes de glace, ajouter 600 oL de milieu NCZYM (voir Tableau des matériaux)et mettre le tube dans un incubateur de bactéries. Secouez le tube à vitesse moyenne orienté le long de la direction de secousse à 37 oC pendant 1 h.
   7. Plaque 200 l de la culture bactérienne sur une plaque LB-agar de 10 cm (voir Tableau des matériaux), contenant des antibiotiques de sélection de choix [p.p., un spécifique pour la résistance bl21 (DE3) pLysS (chloramphenicol), et un pour la résistance codé sur le vecteur pET (kanamycine ou ampicilline, figure 1B)).
   8. Culture de la bactérie sur la plaque LB-agar dans un incubateur bactérien à 37 oC pendant la nuit.
2. Expression des protéines FAHD par induction IPTG
   REMARQUE : Les premières étapes discutées dans la section suivante sont résumées comme une esquisse dans la figure 1C,D. Le système d'expression T7 par combinaison de la cassette bactérienne DE3 et du système vectoriel pET est résumé à la figure 2.
   
   Figure 2 : Le système dual de cassette/pET DE3 expliqué.
   (A) Le génome esquissé du vecteur pET a transformé la bactérie BL21(DE3) pLysS E. coli. Le génome bactérien indigène porte une cassette DE3 (voir panneau B), ainsi qu'un gène lac qui exprime constamment des unités de répresseur de lac. Le vecteur pET non indigène porte le gène protéique inséré entre un promoteur de polymérase T7 et une séquence de terminaison. Plus de détails dans le panneau B. (B) La cassette DE3 du génome bactérien indigène code l'information pour la polymérase T7 en termes d'un operon de polymère d'ARN de E. coli. Cette protéine, cependant, n'est pas exprimée parce que l'unité de répresseur de lac empêche la protéine de polymérase d'ARN de se lier. Par conséquent, aucune polymérase T7 n'est exprimée et aucune protéine exogène n'estexprimée. (C) L'application du produit chimique IPTG (Tableaudes matériaux) déforme la structure des unités de répresseur de lac et les empêche de se lier à la cassette DE3. En conséquence, la polymérase d'ARN peut maintenant se lier à la cassette, pour laquelle la polymérase T7 est exprimée, de même que la protéine exogène par la suite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
   1. Après la formation réussie d'une colonie, choisissez une seule colonie (sans aucune colonie satellite) et dispersez-la en 5 ml de NZCYM ou de lb-mesure avec des antibiotiques, choisis comme avant (étape 1.1.7). Culture dans l'incubateur bactérien à 37 oC du jour au lendemain (figure 1C).
   2. Après une croissance bactérienne réussie, amplifiez les bactéries en 250 ml, 500 ml, ou 1 L lots de milieu, selon la demande de quantité de protéines.
      1. Approprié au volume, appliquez des antibiotiques choisis comme fait dans l'étape 1.1.7 et ajoutez environ 1%-2% de la pré-culture bactérienne dense (c.-à-d., 2.5-5.0 mL à 250 mL volume de milieu, etc.). Prenez un échantillon à utiliser à l'étape 1.2.5 (1 ml ou plus) et vérifiez la densité optique (OD) à 600 nm. Bactéries de culture dans l'incubateur bactérien à 37 oC pour 2 à 3 h (figure1C).
   3. Après 2 à 3 h, prélever un échantillon pour l'analyse photométrique. Si l'OD à 600 nm a atteint 0,4, appliquez 200 M jusqu'à 1 mM isopropyl-D-thiogalactopyranosid (IPTG, voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : La valeur réelle est empirique pour chaque variante de mutation de protéine ou de point de FAHD, où 1 mM IPTG est le maximum qui devrait être appliqué. Cela induit l'expression des protéines (Figure 1D, Figure 2C).
   4. Après 3 à 5 heures de plus dans l'incubateur bactérien à 37 oC, l'expression des protéines est épuisée.
      REMARQUE : Consultez la section de discussion pour obtenir des commentaires sur le contrôle de la température. Plus de 5 h de secousses après l'induction n'est pas recommandé. Prenez un échantillon pour une utilisation à l'étape 1.2.5 (1 ml ou plus) et vérifiez la densité optique (OD) à 600 nm.
      1. Récolter le granule bactérien par centrifugation à 5 000 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et congeler le granule à -80 oC pour un stockage plus long ou à -20 oC pour un bref stockage (Figure 1D).
   5. Vérifier l'induction par l'intermédiaire des deux échantillons photométriques récupérés, qui sont étiquetés «-I » (avant l'induction) et « I » (après l'induction). Après la centrifugation et la résuspension de la granule bactérienne, analyser les deux échantillons par SDS-PAGE en chargeant la même quantité de protéines totales.
      REMARQUE : L'échantillon « I » doit présenter une bande solide associée au poids moléculaire de la protéine choisie, tandis que l'échantillon « I » ne doit pas contenir cette bande. Un faible niveau d'induction est un problème commun pour la production de protéines, mais le niveau de protéines exprimées est souvent suffisant pour les étapes suivantes. Un niveau d'induction élevé est un avantage mais n'est pas obligatoire.

2. Lysis des granulés bactériens et filtration des débris

1. Selon que la protéine choisie est sa-étiquetée ou non étiquetée, sélectionnez Ni-NTA en cours d'exécution tampon (Son-étiqueté, voir Tableau des matériaux) ou froid HIC tampon de fonctionnement (non étiqueté).
2. Pour chaque 250 ml de suspension bactérienne d'origine, appliquer 5 ml du tampon sélectionné sur le granule bactérien (5 ml pour 250 ml, 10 ml pour 500 ml, etc.). Ajouter 10 'L'-mercaptoéthanol par 5 ml de tampon appliqué. Utilisez une tuyauterie Pasteur de 10 ml pour forcer mécaniquement la pastille à la suspension en grattant et en piégrant (éviter la formation de bulles d'air pendant le tuyautrage). Finalement transférer toute la suspension dans un tube de 50 ml.
3. De préférence sonicate (6x pour 15 s à force moyenne) la suspension.
4. Centrifugeuse de 30 min à grande vitesse (10 000 x g) à 4 oC. Filtrer le supernatant consécutivement avec des unités de filtre (p. ex., 0,45 m, 0,22 m) sur la glace.
   REMARQUE : Selon l'étape précédente de centrifugation, la filtration directement par une petite taille de pores de filtre peut être fastidieuse et exige habituellement la préfiltration par une plus grande taille de pores. DNAse peut être ajouté pour de meilleurs résultats.
5. Conservez l'échantillon sur la glace et procédez immédiatement à l'article 3 ou à la 4e section, selon que la protéine est étiquetée ou non étiquetée.

3. Purification de sesprotéines FAHD étiquetées à l'aide de la chromatographie d'affinité Ni-NTA

REMARQUE : Les ions Ni^{2 sont} liés par l'acide nitrilotéritic (NTA) à une résine d'agarose qui est utilisée dans la chromatographie d'affinité (chromatographie d'ion métallique immobilisée, IMAC, figure 3A). Les étiquettes d'acide aminé de poly-histidine se lient fortement à ce Ni-chelate, et ses protéines marquées peuvent être séparées de la majorité des protéines restantes. Une alternative à la préparation décrite des colonnes Ni-NTA est d'utiliser des colonnes Ni-NTA préemballées et un système FPLC.

Figure 3 : Illustrations esquissées de types communs de chromatographie.
(A) La résine d'une colonne Ni-NTA. NTA détient des ions nickel bivalents qui sont utilisés en termes de chromatographie d'affinité d'ions métalliques immobilisés (IMAC). Les étiquettes de poly-histidine se lient de préférence à ce motif et peuvent être élucées par l'imidazole. (B) Le revêtement typique des particules de silice dans une chromatographie d'interaction hydrophobe à base de phényl (HIC-phényl). Les protéines hydrophobes interagissent avec le matériau de revêtement et sont retardées dans leur migration alors que d'autres ne le sont pas. (C) Le revêtement typique des particules de silice dans la chromatographie d'interaction ionique. Les protéines polarisées et chargées interagissent avec le matériau de revêtement et sont retardées dans leur migration alors que d'autres ne le sont pas. (D) La résine d'un gel de silice dans la chromatographie d'exclusion de taille (SEC). Sur la base de pores définis dans le matériau de silice, les protéines peuvent être séparées par leur taille (dans une première approximation correspondant à leur masse moléculaire). De petites protéines imprègnent le matériau poreux de colonne et sont retardées, tandis que de grandes protéines migrent plus rapidement autour des particules poreuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Procédez à partir de l'étape 2.5 (c.-à-d., la protéine est dans le tampon de fonctionnement Ni-NTA et filtrée par des unités de filtre de 0,22 m sur la glace).
2. Préparer une colonne de plastique ou de verre vide en lavant la colonne vide et en l'attachant à un dispositif de retenue stable. Choisissez la taille de la colonne en fonction du volume de la suspension protéique.
3. Pour chaque 10 ml de suspension protéique, appliquer 500 ll de boue d'agarose Ni-NTA dans la colonne (secouer fortement avant utilisation). Appliquer la boue lentement et dropwise sur le filtre inférieur de la colonne à l'aide d'une pipette. Laissez la colonne s'installer, ce qui prend quelques secondes.
4. Remplissez complètement la colonne de tampon de fonctionnement Ni-NTA, en veillant à ne pas perturber la résine d'agarose. Laissez passer le tampon par gravité. Le processus peut être accéléré en appliquant une pression du pouce sur le liquide (à l'aide d'un couvercle ou d'un gant et de la pression du pouce), mais prenez soin de ne pas déformer la résine d'agarose.
5. Appliquer la suspension protéinée. Comme avant, laissez l'échantillon passer par gravité. Il n'est pas recommandé d'accélérer cette étape à l'aide de la pression du pouce, car la liaison des protéines à la colonne est améliorée si le débit est faible. Recueillir le flux dans un tube (Tableau des matériaux).
6. Une fois l'échantillon passé, remplissez à nouveau toute la colonne avec le tampon d'exécution Ni-NTA. Veillez à ne pas perturber la résine d'agarose. Laissez l'échantillon passer par gravité, mais contrairement à l'étape précédente, il est recommandé d'accélérer le processus par la pression du pouce, car les contaminations potentielles en raison d'interactions non spécifiques peuvent être perturbées de cette façon. Recueillir la solution de lavage dans un tube. Répétez cette étape.
7. Placez une cuvette transparente UV sous la colonne et appliquez 1 ml de tampon d'élution Ni-NTA. Recueillir l'échantillon sans appliquer de pression de pouce à la résine.
8. Vérifiez la densité optique (OD) de l'échantillon à 280 nm contre un échantillon vierge (c.-à-d., tampon d'élution Ni-NTA). De façon optimale, l'échantillon affiche une OD supérieure à 2,5. Une OD inférieure à 0,5 indique qu'aucune quantité significative de protéines ne se trouve dans l'échantillon.
   REMARQUE : Comme indiqué dans la section de discussion, les concentrations de sel et d'imidazole du tampon d'élution peuvent devoir être adaptées pour chaque protéine FAHD individuellement.
9. Répétez les étapes 3.1.7 et 3.1.8 jusqu'à ce que l'OD tombe en dessous de 0,5. Mettre en commun tous les échantillons avec une OD plus élevée dans un tube sur glace.
10. Recommencez avec l'étape 3.1.4, en utilisant le flux à partir de l'étape 3.1.5 comme nouvelle entrée pour cette répétition de l'étape 3.1.5. Répétez ce processus jusqu'à ce que le premier échantillon prélevé à l'étape 3.1.6 affiche une OD inférieure à 0,5.
    REMARQUE : Comme indiqué dans la partie dépannage de la section de discussion, ses protéines étiquetées peuvent se lier insuffisamment à la résine Ni^2. Dans de tels cas, la répétition de cette étape ou de méthodes alternatives (p. ex., chromatographie d'échange d'ions) est nécessaire.
11. Prenez des échantillons de toutes les fractions intermédiaires pour l'analyse SDS-PAGE.
12. Les protéines FAHD dans le tampon d'élution Ni-NTA se précipitent lors de la congélation et de la décongélation. Par conséquent, dialysez la protéine contre un tampon différent (pendant la nuit sur la glace, en utilisant 1 L de TNT par 100 ml de tampon de dialyse). Utilisez un tampon à faible teneur en sel en fonction du type de chromatographie d'échange d'ions qui doit être effectuée après cette étape. Utilisez des tubes de cellulose courants avec une coupure de poids moléculaire typique de 14 kDa (Tableaudes matériaux).
13. Après la dialyse de la nuit, concentrez la protéine en utilisant des unités de filtre ultra-centrifugation. Effectuez l'analyse SDS-PAGE (12,5 % de gel courant, 4 % de gel d'empilage) pour vérifier la perte potentielle de protéines, l'élution insuffisante et la pureté des protéines en général. Si tout va bien, passez à l'article 5.

4. Purification des protéines FAHD non étiquetées par chromatographie hydrophobe d'interaction (HIC)

REMARQUE : Les groupes de phényles sur la surface de revêtement d'un gel de silice dans une colonne HIC pour FPLC (Figure 3B) permettent la séparation des protéines selon le caractère hydrophobe. Les étapes décrites doivent être effectuées avec un système FPLC équipé d'une colonne HIC-phényl de 5 ml. Les colonnes peuvent être lavées avec 1 M NaOH pour être réutilisées pour différentes protéines. Cependant, les colonnes autrefois utilisées pour un type de protéine FAHD doivent être réutilisées uniquement pour ce type de protéine.

1. Précipitations de sulfate d'ammonium (AS)
   1. Procédez à partir de l'étape 2.5. La protéine est dans la glace-froid HIC en cours d'exécution tampon (Tableau des matériaux).
   2. Évaluer le volume de la solution de protéines préparée précisément au microlitre (V_initial). Ajouter lentement et à la baisse la solution AS pré-refroidie, jusqu'à ce qu'une saturation AS de 35 % soit atteinte : V_AS ajouté ' V_initial ' 0.538. Remuer délicatement la solution pendant 30 min. Centrifugeuse pendant 15 min à grande vitesse (10 000 x g) à 4 oC.
   3. Filtrer le supernatant à l'aide d'une unité de filtre de 0,22 m sur la glace. En option, prélever un échantillon pour l'analyse SDS-PAGE : diluer 1:4 et chauffer immédiatement à 95 oC pendant 5 min, sinon l'échantillon se bosse. L'échantillon peut être congelé à ce point (-20 oC) afin de procéder à un autre jour.
2. FPLC à l'aide d'une colonne HIC
   1. Configurer le système FPLC et réquilibrer une colonne HIC-phényl de 5mL avec 5 volumes de colonnes (CV) de 20% EtOH (en H₂O) suivi de 5 CV de H₂O.
   2. Mélanger 260 mL de tampon de fonctionnement HIC (exact) avec 140 mL de tampon de fonctionnement HIC AS (exact). Il en résulte une solution AS de 35 % de volume. Vérifier le pH (7.0); c'est le tampon A. Buffer B est de 250 ml de tampon en cours d'exécution. Ajouter 1 mM DTT aux deux tampons A et B, puis les garder sur la glace.
   3. Équilibrez la colonne avec 8 ml de tampon A, 8 ml de tampon B et 8 ml de tampon A dans cette séquence. Appliquer l'échantillon préparé à l'étape 4.1 du protocole. Laver avec le tampon A, jusqu'à ce que l'absorption optique de base à 280 nm atteigne 1000 à 500 mAU.
   4. Appliquer un mélange de tampons A et B, de sorte que la concentration de S est de 33 % (w/v). Laver avec 1 CV, résultant en un plateau dans le chromatogramme. Configurer un gradient de tampon B (jusqu'à 100% tampon B au fil du temps): 1,5 ml de tampon B en 3,8 min (c.-à-d., tampon B de 5,7% avec 1% b/mL de pente). Lorsque le signal UV à 280 nm augmente, commencez à recueillir la fraction et placez-la sur la glace immédiatement.
   5. En fin de compte, lavez la colonne avec le tampon B. Prenez des échantillons de toutes les fractions pour l'analyse SDS-PAGE. Congeler tous les échantillons à l'aide d'azote liquide et les conserver à -80 oC.
   6. Effectuer l'analyse SDS-PAGE (et western blot), pour détecter la protéine FAHD dans les fractions recueillies. Les fractions qui contiennent la protéine sont mises en commun et appliquées à une purification plus poussée, comme indiqué dans les étapes du protocole suivante. Laver la colonne avec H₂O et 20% EtOH (en H₂O).

5. Purification des protéines FAHD par l'intermédiaire de la chromatographie d'échange d'ion

REMARQUE : Les molécules dont les groupes fonctionnels chargés sont liées à une colonne de particules de silice pour le FPLC (figure 3C). Cela permet la différenciation des protéines en fonction de leur caractère ionique, comme la charge de surface. Les étapes décrites doivent être effectuées avec une machine FPLC et le savoir-faire associé, respectivement. La méthode décrite est la même pour la chromatographie d'échange cationique ou anionique, mais les tampons à utiliser sont légèrement différents.

1. Choisissez le système de chromatographie d'échange cationique ou anionique. Ce choix est empirique et peut varier entre les protéines FAHD. De façon optimale, les deux méthodes peuvent être utilisées consécutivement.
2. Configurer le système FPLC et laver la colonne avec 5 CV de 20% EtOH (en H₂O), suivi de 5 CV de H₂O. Equilibrate la colonne avec 1 CV de tampon à faible teneur en sel, tampon à haute teneur en sel, et encore une fois tampon de faible teneur en sel dans cette séquence.
3. Appliquer l'échantillon (dialysé contre le tampon de sel faible correct à partir de l'étape 3.1.11) sur la colonne. Recueillir le flux à travers. Laver la colonne pour 1 CV avec un tampon de sel faible.
4. Configuration d'une élution de gradient : tampon de 100 % de haute teneur en sel en 30 min à un débit de 1 ml/min, ou 60 min à un débit de 0,5 ml/min. Ceci peut être re-sélectionné sur la base d'un chromatogramme FPLC déjà connu, afin d'optimiser la purification. Recueillir toutes les fractions de pointe.
   REMARQUE : Les conditions de sel élevé peuvent varier entre les protéines FAHD, comme indiqué dans la section de discussion.
5. Une fois le gradient terminé, exécutez avec un tampon à haute teneur en sel jusqu'à ce qu'aucun pic ne soit détecté sur la plage de 1 CV (collecter les fractions).
6. Prélever des échantillons de toutes les fractions collectées et effectuer l'analyse SDS-PAGE (12,5 % de gel en cours d'exécution, 4 % de gel d'empilement). Congeler les échantillons individuels dans de l'azote liquide et les stocker à -80 oC.
7. Une fois l'analyse SDS-PAGE terminée, mettez en commun les échantillons contenant la protéine FAHD et jetez les autres. En option, concentrez la protéine à l'aide d'unités de filtre ultra centrifugation.
8. Appliquer 1 ml de 25 % de SDS dans 0,5 M NaOH (ou d'autres détergents) pour nettoyer la colonne. Laver la colonne avec H₂O et 20% EtOH (en H₂O).
9. Optionnellement, répétez la section 5 avec la colonne alternative (chromatographie d'échange cationique ou anionique). La protéine obtenue à partir de cette méthode est suffisamment pure pour effectuer des tests d'activité de base ou peut être utilisée dans les essais de dépistage pour la cristallographie. Pour les demandes avancées, procédez à l'article 6.

6. Purification des protéines FAHD par chromatographie de taille-exclusion (SEC)

REMARQUE : Les particules poreuses dans une colonne de gel de silice pour FPLC permettent la différenciation des protéines selon la taille moléculaire, comme le rayon hydrodynamique (figure3D). Les étapes décrites doivent être effectuées avec un système FPLC, à l'aide de colonnes SEC.

1. Choisissez une colonne SEC, dépendante du poids moléculaire des contaminations encore présentes, tel que détecté via SDS-PAGE et la coloration argentée. La méthode décrite convient aux deux colonnes. Laver la colonne pendant la nuit avec 400 mL de H₂O et équilibrer avec SEC running buffer. Il est recommandé d'écrire un programme pour le système FPLC pour automatiser cette étape.
2. Ajouter 1 mM DTT à 300 mL de tampon de fonctionnement SEC et le mettre sur la glace. C'est le tampon en cours d'exécution. Appliquer 60 ml de ce tampon sur la colonne.
3. Centrifuger l'échantillon de protéines (10 000 x g pendant 10 min) pour éliminer toute micro-précipitation. Appliquer le supernatant sur la colonne. Il est généralement recommandé de filtrer le supernatant avant FPLC.
4. Appliquer le tampon courant sur la colonne jusqu'à ce que toutes les protéines soient élucées. Recueillir tous les pics en fractions de volume approprié (p. ex., 2 ml). Prélever des échantillons pour SDS-PAGE et congeler toutes les fractions à l'aide d'azote liquide. Conserver les fractions congelées à -80 oC.
5. Après l'analyse SDS-PAGE (et western blot), collectez et mettez en commun toutes les fractions contenant la protéine FAHD. La coloration argentée est recommandée pour détecter les contaminations mineures qui peuvent encore être présentes.
6. Utilisez des unités de filtre ultra-centrifugation pour concentrer la protéine. Bien qu'il ne soit pas obligatoire pour les protéines FAHD, en général, une étape de dessalement (par exemple, par dialyse) est recommandée pour les analyses d'enzymes et la cristallisation.
7. Répéter les étapes 6,3 à 6,6 plusieurs fois avec des débits et des concentrations de sel différents (empiriques) afin d'améliorer la pureté de la protéine FAHD. Laver la colonne pendant la nuit avec H₂O et 20% EtOH (en H₂O).

7. Tests d'activité DE base FAHD avec des substrats oxaloacetate et acétylpyruvate

REMARQUE : La protéine FAHD 1 (FAHD1) affiche l'activité de l'oxaloacetate decarboxylase (ODx) et de l'hydrolase d'acylpyruvate (ApH). Ceci est décrit plus en détail dans la section de discussion. En raison de la déstabilisation par la tautomerisation de keto-enol dans la solution aqueuse (c.-à-d., l'éolisation), l'oxaloacattate se désintègre par lui-même au fil du temps (auto-décarboxylation) en fonction de la concentration cofactorielle et du pH. À environ un pH de 7 et une température de 25 oC, cet effet n'est pas dramatique, mais les tests doivent être effacés pour tenir compte à la fois de l'auto-décarboxylation et de la concentration en zymatique. Le schéma de tuyauterie est décrit à la figure 4A. En général, il est recommandé d'utiliser des pipettes bien calibrées pour cet avertissement, car il est très sensible aux erreurs mineures de pipetage.

Figure 4 : Schéma de pipetage esquissé pour les analyses d'enzymes.
(A) Un schéma de pipetage esquissé pour les analyses d'enzymes FAHD à base de substrat. Substrat blanc: -S/-E; échantillon de substrat : S/-E; blanc enzymatique: -S/E; échantillon d'enzymes : S/E (S : substrat, E : enzyme). Voir l'étape 7 du protocole pour plus de détails. (B) Un schéma de pipetage esquissé pour évaluer la cinétique Michaelis-Menten de la protéine FAHD. Substrat blanc: -S/-E; échantillon de substrat : S/-E; blanc enzymatique: -S/E; échantillon d'enzymes : S/E (S : substrat, E : enzyme). Voir la section 8 du protocole pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Démarrer un lecteur de microplaques et d'équilibrer pendant 30 min à 25 oC. Mettre en place un programme de lecture de 12 puits (tel qu'indiqué à la figure 4A) à 255 nm. Il est recommandé d'utiliser 25 lectures multiples avec un délai de 5 ms. Configurer un cycle pour mesurer 15fois toutes les 2 min (30 min au total).
2. Par défaut, préparer un tampon d'analyse enzymatique (voir Tableau des matériaux) avec 1 mM MgCl₂ au pH 7,4. Les protéines fahD variables peuvent nécessiter différents niveaux de cofacteurs ou de pH. Mg^{2 et} Mn 2 sont^des cofacteurs connus pour FAHD1^3,11,12,21.
3. Créer une solution de protéines de 1 g/L, diluant avec un tampon d'analyse enzymatique (Tableau des matériaux).
4. Mettre en place 1 ml de 20 mM solution d'un substrat à tester (jusqu'à présent les substrats identifiés de protéines FAHD sont répertoriés ailleurs³) dans le tampon d'analyse enzymatique.
5. Selon le schéma de pipetting affiché dans la figure 4A, préparer l'enzyme vierge et les puits d'échantillon: pipet 90 'L de tampon d'analyse enzymatique (Tableau des matériaux) dans les puits avec 5 l (5 'g) de solution enzymatique.
6. Selon le schéma de pipetage affiché dans la figure 4A, préparer le substrat vide et les puits d'échantillon: pipet 95 'L de tampon d'essai enzymatique dans les puits.
7. Juste avant de mesurer, appliquer 5 ll de tampon d'essai enzymatique dans les six puits vierges. Appliquer 5 ll de la solution de substrat de 20 mM sur les puits d'échantillon. Il est recommandé d'utiliser une pipette multicanal.
8. Utilisez une pipette multicanal à des réglages de 50 l pour mélanger délicatement tous les puits. Commencez par les blancs et procédez avec les puits d'échantillon. Veillez à ne pas créer de bulles. Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques et mesurez chaque puits à 255 nm (comme indiqué à l'étape 7.1).
9. Effectuez l'analyse dans une feuille de calcul. Copiez les données brutes du photomètre dans une feuille de calcul et écrivez tous les paramètres (c.-à-d. toute la documentation) dans une autre feuille. Moyenne des données des trois puits de chacune des quatre préparations. Soustrayez le blanc de l'échantillon. Calculez également les écarts types et résumez les écarts de blanc et d'échantillon.
10. Tracer ces données (y: densité optique, x: temps en min). Une courbe décroissante de façon exponentielle doit être affichée. Selon le type de substrat utilisé, une augmentation initiale dans les 10 premières minutes peut être observée, après quoi le signal diminue. Ceci est attribué à la tautomerisation céto-enol du substrat, comme décrit plus en détail dans la section de discussion.
11. Divisez les données de signal optique au fil du temps par la valeur maximale de la parcelle, afin de les réduire dans la plage [0, 1] (un exemple est fourni dans la figure 5A). Identifiez la plage linéaire de la courbe, en commençant par la diminution initiale, et calculez la pente négative (1/min).
12. Le cours temporel de la diminution de l'OD est associé au substrat par sa concentration initiale : 100 nmol/puits de pente. En utilisant la concentration de protéines évaluée c_0, l'activité spécifique est calculée : 100 nmol/puits de pente à 1/c₀. Exprimant c₀ en g/puits, l'activité spécifique calculée de cette façon est exprimée à l'aide de l'unité nmol/min/g, qui est égale à l'amol/min/mg.

8. Évaluation de la cinétique Michaelis-Menten des protéines FAHD

REMARQUE : L'évaluation de la cinétique Michaelis-Menten des protéines FAHD est fastidieuse, car l'activité protéique spécifique dépend à la fois de la concentration relative de protéines-substrats et du volume physique dans lequel la réaction a lieu. La cinétique à l'état stable doit être établie afin d'obtenir des résultats fiables. Un protocole testé sur une plaque transparente UV de 96 puits est décrit dans les étapes suivantes. Chaque étape doit être effectuée avec beaucoup de soin, car les erreurs mineures gâchent habituellement l'expérience. Il est recommandé de maîtriser les essais décrits à l'article 7 avant de tenter l'analyse plus compliquée décrite ci-dessous.

Figure 5 : Résultats exemplaires des analyses d'enzymes.
(A) Une courbe exemplaire d'absorption UV obtenue pour les essais de base d'enzymes FAHD à base de substrat (normalisés dans la gamme de 0 à 1) avec déviation standard. Le rapport de densité optique (OD) [OD(t)/OD(0)] à un moment donné t [OD(t)] est normalisé à l'OD initial [t - 0; OD(0)]. Voir la section 7 du protocole pour plus de détails. (B) Cinétique michaelis-Menten exemplaire de la protéine FAHD1 humaine avec déviation standard. Voir la section 8 du protocole pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Démarrer un lecteur de microplaques et d'équilibrer pendant 30 min à 25 oC. Mettre en place un programme de lecture de 72 puits (tel qu'indiqué à la figure 4B)à 255 nm. Il est recommandé d'utiliser 25 lectures multiples avec un délai de 5 ms. Mettre en place un cycle pour mesurer 15x par 2 min (30 min au total).
2. Effectuer les étapes 7.2 et 7.3. Ensuite, configurez 1 ml de solution de substrat de 100 mM dans un tampon d'essai enzymatique.
3. Préparer les dilutions de la solution de substrat dans un tampon d'essai enzymatique : 40 mM, 20 mm, 10 mm, 6 mm, 4 mm, 2 mm. L'essai est effectué avec des concentrations d'enzymes/substrats en couple (« ajustés »). Pour cela, préparez les dilutions suivantes de la solution enzymatique dans un tampon d'essai enzymatique : 0,5 g/L, 0,4 g/L, 2,5 g/L, 2 g/L, 1,5 g/L, 1 g/L, 1 g/L.
4. Dans tous les puits représentés dans la figure 4B appliquer 180 L de tampon d'essai enzymatique. Appliquer 10 ll de tampon d'essai enzymatique dans tous les puits pour le substrat (blanc et échantillon). Appliquer 10 L de la série de dilution stéinée préparée dans les puits pour l'enzyme (blanc et échantillon). Appliquer 10 ll de tampon d'essai d'enzyme dans tous les puits pour les puits pour le blanc de substrat et le blanc d'enzyme.
5. Juste avant de mesurer, appliquer 10 ll de la série de dilution du substrat préparé dans les puits pour l'échantillon de substrat et l'échantillon d'enzymes.
6. Utilisez une pipette multicanal à des réglages de 50 l pour mélanger délicatement tous les puits, en commençant par les blancs, en procédant aux puits d'échantillon. Veillez à ne pas créer de bulles.
7. Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques et mesurez chaque puits à 255 nm, tel que décrit à l'étape 8.1. Effectuez l'analyse dans une feuille de calcul. Copiez les données brutes du photomètre dans une feuille de calcul, écrivez tous les paramètres (c.-à-d. toute la documentation) dans une autre feuille.
8. Effectuer une analyse individuelle des données par point dans la série de dilution, telle qu'elle est décrite dans les étapes 7.11. à 7,14. Finalement, obtenir toutes les activités spécifiques et la parcelle contre la concentration initiale de substrat: 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM.
9. Afficher tous les points de données avec des écarts types individuels. Informatique Michaelis-Menten cinétique via le montage de courbe non linéaire, ou via l'analyse Lineweaver-Burk. Il peut être nécessaire de remesurer les points individuels et d'adapter les ratios de paires protéines/substrats-concentration individuels dans les étapes 8.5 et 8.6. Le diagramme de Michaelis-Menten pour fahD1 humain est fourni dans la figure 5B.

9. Cristallisation des protéines FAHD

REMARQUE : La cristallisation des protéines FAHD (FAHD1 humaine décrite précédemment¹⁵) peut être réalisée par la méthode de diffusion de vapeur de chute suspendue dans un format de 24 puits (figure 6A). Un protocole étape par étape sur la cristallisation de fahD1 humain utilisant cette technique est présenté en dessous de¹⁵. Une description plus détaillée est fournie dans la section de discussion.

Figure 6 : Cristallisation des protéines FAHD.
(A) Plaques de cristallisation dans l'empreinte Standard 24 ou 96 puits SBS. Voir la section 9 pour plus de détails. (B) Processus de configuration de la plaque de base dans la cristallisation des protéines FAHD. Ce chiffre est redessiné avec la permission²³. Voir la section 9 pour plus de détails. (C) Cristaux FAHD1 humains et motifs de diffraction correspondants (petits inserts). L'espacement de treillis le plus proche est indiqué dans les inserts comme mesure de la qualité de diffraction des cristaux. Des nombres plus faibles indiquent une résolution plus élevée et donc des données plus informatives. Voir la section 9 du protocole pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Assurez-vous que la protéine est dialysée contre le tampon de fonctionnement SEC. La protéine FAHD1 devrait être disponible à des concentrations élevées (2 à 5 mg/mL). À des concentrations plus faibles, la protéine peut ne pas se cristalliser en raison du manque de nucléation spontanée.
2. Préparer 20 ml de la solution du réservoir pour la cristallisation. Faire trois solutions de stock, en utilisant de l'eau distillée ou déionisée comme solvant : 1 M Na-HEPES (minimum 25 ml, ajusté au pH 7,5), 50 % (w/v) polyéthylène glycol 4000 (PEG4k) (minimum 65 ml) et 1 M MgCl₂ (10 ml).
3. Configuration d'une grille de 4 x 6 (24 au total) différents tubes de 15 ml. Étiquetez-les en fonction des positions correspondantes sur la plaque (p. ex., rangée (A, B, C, D) vscolonne (1-6) comme « A1 », « B5 », « D6 », etc. ). Pipette 1 ml de 1 M Na-HEPES dans chaque tube.
4. Pipette 1 ml de 50 % (w/v) PEG4k dans la rangée A des tubes, 2 mL dans la rangée B, 3 ml dans la rangée C, et 4 mL dans la rangée D. Pipette 100 'L de 1 M MgCl₂ dans la colonne 1 des tubes, 250 'L dans la colonne 2 , 500 l dans la colonne 3, 1,0 mL dans la colonne 4, 1,5 ml dans la colonne 5, et 2,0 mL dans la colonne 6.
5. Remplissez tous les tubes jusqu'à un volume de 10 ml d'eau distillée ou déionisée, où l'échelle des tubes est suffisamment précise.
6. Retirez l'échantillon humain de protéines FAHD1 (5 mg/mL) du réfrigérateur (ou de la glace) et faites une rotation à une vitesse maximale avec une centrifugeuse de table à 4 oC pendant au moins 10 min. Si la co-cristallisation avec l'oxalate est souhaitée, ajouter l'oxalate à partir d'une solution de stock de sorte que l'échantillon de protéines contienne une concentration finale d'oxalate de 2 mM. Appliquer 1 mM DTT et conserver sur la glace.
7. Pendant ce temps, déballez une plaque de cristallisation de 24 puits, idéalement à l'intérieur d'une pièce à température contrôlée à 18 oC. Distribuer une fine couche d'huile de paraffine sur la jante sur chaque puits de la plaque de puits 24 à l'aide d'une fine tige de verre ou de plastique. Ajouter 800 l des cocktails de cristallisation préparés (A1 à D6) dans chaque puits correspondant de la plaque de cristallisation.
8. Placer les feuilles de couverture fraîches de 22 mm sur une surface propre. Évitez de contaminer les glissades de couverture avec de la saleté ou de la poussière. Si nécessaire, retirer les débris du couvercle à l'aide d'air comprimé ou d'un vaporisateur de duster.
9. Une fois la centrifugation terminée, évitez de secouer l'échantillon de protéines afin que les agrégats et les débris filés au fond du tube ne flottent plus. Dans les étapes suivantes, pipette de l'échantillon de protéines juste en dessous de la surface de la solution afin d'éviter de remuer les agrégats et les dépôts du fond.
10. Pour chaque puits (voir Figure 6B) pipette 1 -L de solution protéinée sur le centre d'un bordereau de couverture et ajoutez 1 l du cocktail réservoir respectif à la gouttelette de protéines, en évitant les bulles. Tournez le bordereau à l'envers et placez-le sur le dessus du puits de sorte que l'huile scelle le puits avec le couvercle hermétique à l'air. Répéter l'opération jusqu'à ce que la plaque de 24 puits soit terminée.
11. Conserver la plaque à 18 oC et observer les gouttes selon un horaire progressif à l'arme à l'eau avec un microscope approprié. Les cristaux FAHD1 humains apparaissent habituellement du jour au lendemain (voir la figure 6C).

Representative Results

Commençant par un vecteur de clonage préparé et acheté BL21(DE3) pLysS E. coli, le plasmide est inséré dans la bactérie par le choc thermique ou toute autre méthode appropriée (Figure 1). Après une courte période d'amplification, les bactéries transformées sont plaquées sur des plaques d'agar LB, afin de croître du jour au lendemain. Les plaques à ce stade peuvent sembler différentes, selon une variété de sources d'erreurs potentielles. Les plaques peuvent être vides (c.-à-d. pas de colonies), complètement envahies par des bactéries, ou quelque chose entre les deux, respectivement. Deux exemples de plaques d'agar LB après transformation optimale et non optimale sont décrits dans la figure 7A. Trop de colonies bactériennes indiquent soit qu'un trop grand nombre de bactéries ont été plaquées (probablement) ou que les antibiotiques utilisés peuvent être expirés (peu probable). Trop peu de colonies bactériennes peuvent indiquer que soit pas assez de plasmide a été utilisé pour la transformation (utiliser plus la prochaine fois) ou que trop d'antibiotiques ont été utilisés pour sélectionner les bactéries. Dans tous les cas, si des colonies sont présentes, elles devraient être fines, car l'utilisation de deux antibiotiques sélectifs implique une chance plutôt insignifiante de bactéries non transformées de se développer. Aucune colonie n'indique toutefois que les bactéries ont perdu leur compétence en matière de transformation (en raison d'un mauvais stockage ou d'un mauvais stockage sur de plus longues périodes, d'un gel et d'un dégel répétitifs, etc.), le choc thermique n'a pas été couronné de succès (pas d'apport plasmique ou bactérien mort par trop de chaleur), le vecteur de clonage est corrompu, ou par erreur un mauvais ensemble d'antibiotiques sélectifs a été utilisé (vérifier le gène de résistance sur le vecteur plasmide).

Figure 7 : Résultats représentatifs pour la transformation des bactéries et l'IMAC.
(A) Plaques d'agar LB représentatives avec BL21(DE3) E. colitransformé, obtenue en suivant l'étape 1.1 du protocole. Gauche : Une plaque avec des colonies bien réparties (exemple positif). Droite : Une plaque avec une seule colonie (exemple négatif). Les cercles blancs marquent les bonnes colonies. Le cercle rouge marque les colonies qui grandissent trop près les unes des autres et ne doivent pas être cueillies tant que des colonies isolées sont disponibles. (B) Une analyse SDS-PAGE de 12,5 % d'acrylamide d'une série de contrôles d'induction (« -» indique avant l'induction de l'IPTG; « » indique après l'induction de l'IPTG, avant la récolte des granulés), ajusté à des quantités égales de protéines totales. Ceci est décrit à l'étape 1.2. (C) Une analyse exemplaire de 12,5% d'acrylamide SDS-PAGE de la purification de Ni-NTA de saprotéine FAHD1 marquée. Ceci est décrit à la section 3 du protocole. La chromatographie d'affinité donne des protéines de haute pureté (-gt;70%, flèche noire), cependant, plusieurs petites contaminations sont également observées (flèches rouges). Ces contaminations se composent de protéines non-FAHD qui se lient à la colonne, et de protéines qui se lient à la protéine FAHD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les colonies validées sont sélectionnées et cueillies. Après amplification dans le milieu nourrissant, l'expression de protéine est déclenchée par l'application de l'IPTG chimique. La granule bactérienne contenant la protéine exprimée en quantités milligrammes est récoltée, et l'expression est vérifiée via SDS-PAGE (voir par exemple Figure 7B). Certains problèmes peuvent se produire au cours de ce processus autrement simple. Tout d'abord, certaines protéines forment des corps d'inclusion, parce qu'ils semblent en quelque sorte interférer avec le métabolisme naturel des bactéries hôtes. Ceci a été observé pour quelques mutations ponctuelles de FAHD1 humain et de FAHD2. Dans de tels cas, d'autres systèmes d'expression comme les cellules d'insectes peuvent être plus appropriés et devraient être considérés. Après la récolte d'une pastille à partir de cellules d'insectes, par exemple, la purification des protéines suit les mêmes étapes que décrites dans ce protocole. Deuxièmement, le système DE3-pET est parfois jugé « fuyant » (c.-à-d. que les protéines sont déjà exprimées dans une certaine mesure avant l'induction de l'IPTG). La raison potentielle de ceci n'est pas bien comprise, mais elle peut aider à exprimer la protéine lentement pendant la nuit dans un incubateur de chambre froide. Troisièmement, aucune protéine n'est exprimée. C'est probablement le pire scénario, car il indique probablement un vecteur plasmide corrompu et donc conseillé de séquencer le plasmide.

Si un His-tag a été utilisé pour marquer la protéine, chromatographie d'affinité avec Ni-NTA agarose est une méthode de capture facile et bon marché éliminant la majorité des contaminations (Figure 7C). Des méthodes similaires existent pour d'autres systèmes d'étiquettes (p. ex., STREP-II). Si aucune étiquette n'a été utilisée, une combinaison de précipitations de sulfate d'ammonium et de chromatographie hydrophobe consécutive d'échange peut également séparer la protéine de la majorité des autres protéines (figure 8A). Toutefois, la comparaison des deux méthodes (figure7C vs figure 8A),la supériorité des méthodes Ni-NTA peut être démontrée par l'analyse SDS-PAGE. L'utilisation de saprotéine étiquetée est donc conseillée.

Figure 8 : Résultats représentatifs des expériences FPLC (HIC, échange d'ions, SEC).
(A) Un chromatogramme typique et 12,5% analyse sDS-PAGE d'acrylamide-PAGE de chromatographie HIC-phényl après précipitation de sulfate d'ammonium (AS) de la protéine FAHD1 non étiquetée, comme décrit dans la section 4 du protocole. La ligne verte reflète le gradient de tampon B qui ne contient pas as. Pendant le processus AS est progressivement lavé du système. La comparaison de ce panneau à la figure 7C montre la puissance de la chromatographie d'affinité Ni-NTA par rapport à la méthode HIC-phényl, et l'avantage d'utiliser un système His-tag pour la purification des protéines. (B) Un chromatogramme exemplaire et 12,5% analyse acrylamide SDS-PAGE de la chromatographie d'échange cationic de son-marqué FAHD suivant la purification de Ni-NTA. À l'aide d'un gradient de sel, l'échantillon appliqué est séparé en protéines individuelles. (C) Un chromatogramme exemplaire et 12,5% analyse sDS-PAGE d'acrylamide-PAGE de chromatographie d'exclusion de taille de G75 de sonFAHD marqué suivant la chromatographie d'échange cationic. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Consécutivement, la protéine est encore séparée des contaminations restantes par chromatographie d'échange de cation/anion (par exemple, voir Figure 8B), suivie de la chromatographie d'exclusion de taille (par exemple, voir Figure 8C). Il est conseillé de mettre en place une stratégie initiale de purification dans cet ordre; cependant, ces colonnes doivent être utilisées en combinaison, par la suite et dans la variation, jusqu'à ce que la protéine soit suffisamment pure.

Des analyses d'activité simples, afin de tester les décisions « oui ou non » sur les substrats actifs et/ou les cofacteurs, peuvent être effectuées avec sesprotéines étiquetées après la purification de Ni-NTA, ou des protéines non étiquetées après la colonne d'échange ionique. Les activités spécifiques et les constantes cinétiques doivent être déterminées avec des protéines de la plus haute pureté. La cristallisation peut être tentée avec des protéines après la colonne d'échange ionique, mais la qualité des cristaux est presque toujours en corrélation avec la pureté des protéines. Les anticorps polyclonales peuvent être soulevés contre les protéines à n'importe quel stade du protocole de purification; cependant, ici la qualité est également en corrélation avec la pureté des protéines.

Discussion

Étapes critiques

Les protéines FAHD sont très sensibles aux concentrations de sel. À de faibles concentrations de NaCl, les protéines peuvent se précipiter lors de la décongélation, mais elles peuvent généralement être entièrement reconstituées à des concentrations plus élevées de sel. C'est-à-dire que si une protéine FAHD se précipite pour une raison quelconque, elle peut être récupérée ou repliée avec des concentrations plus élevées de sel (à 300 m). Cependant, certaines protéines plus hydrophobes ne peuvent pas être récupérées (par exemple, les FAHD2 humains), mais des détergents comme le CHAPS (maximum 1%) ou glycérol (10%) peuvent être utilisés pour les maintenir dans une solution stable. Dans tous les cas, il est recommandé de congeler les chocs à l'aide d'azote liquide et de stocker à -80 oC, car il s'agit d'un processus de décongélation doux et lent.

Certains problèmes inattendus peuvent se produire pendant la purification Ni-NTA dans l'étape 3.1.10. Il convient de noter qu'une OD plus élevée dans le deuxième échantillon prélevé que dans le premier échantillon indique un volume trop élevé de résine d'agarose (prenez une note et utilisez moins de résine dans la prochaine expérience). En outre, la résine d'agarose elle-même conduit à un signal oD à 280 nm (c.-à-d., la perturbation du lit de résine d'agarose donnera des signaux artificiels). En cas de doute, il est conseillé d'utiliser d'autres méthodes comme un analyse Bradford ou BSA pour déterminer les concentrations de protéines.

Dans les essais enzymatiques, il y a trois aspects critiques à considérer. Tout d'abord, l'évaluation de la concentration en protéines est essentielle pour obtenir les activités spécifiques correctes. Le niveau de pureté de la protéine influence le résultat et doit être estimé. En cas de protéine étiquetée, la masse de la partie d'étiquette doit être calculere, et l'activité spécifique doit être corrigée en conséquence. Pour les essais simples décrits à la section 7 du protocole, la pureté Ni-NTA est suffisante pour distinguer les substrats actifs et inactifs, les cofacteurs, etc. Dans le cas de la cinétique Michaelis-Menten plus complexe, toutes les concentrations de réactifs et de substrats doivent être correctement déterminées. Surtout lors de l'utilisation de l'oxaloacée (qui auto-décarboxylates au fil du temps) la partie enzymatique de la réaction doit être corrigée pour l'auto-décarboxylation (en supposant que les deux réactions se produisent simultanément). Les changements initiaux dans le signal de densité optique adressé à la tautomerisation de keto-enol du substrat doivent être considérés. Troisièmement, les concentrations et les volumes doivent être ajustés. Une réaction avec des concentrations définies d'enzymes et de substrats peut donner des résultats différents dépendant du volume d'essai. S'il y a trop d'enzyme par puits, l'adhérence du liquide peut en fait biaiser le résultat.

Pour évaluer la cinétique Michaelis-Menten, il est recommandé d'effectuer des expériences initiales dans 100 lots de L, 200 l et 300 l afin de trouver la combinaison optimale. Des aspects similaires s'appliquent au rapport des concentrations d'enzymes-substrats pour les essais cinétiques. Trop d'enzymes par substrat ou trop de substrat par enzyme mettent le système en dehors de la gamme linéaire michaelis à l'état stable. Des expériences initiales sont nécessaires pour optimiser ces conditions. Un ajustement exemplaire pour les protéines humaines FAHD1 (de type sauvage) est fourni à la section 8, ce qui donne des diagrammes cinétiques (tels que présentés à la figure 5B,par exemple).

Pour la cristallisation, une gouttelette de solution protéique est pipetted au centre d'un coverslip et mélangé avec une gouttelette de cocktail de cristallisation, qui est généralement composé d'un tampon (par exemple, Tris-HCl, HEPES) et un précipité (par exemple, polyéthylène glycol, ammonium sulfate). Une gouttelette de solution inhibitrice pour la co-cristallisation (comme l'oxalate dans ce protocole) peut être appliquée en option. Le bordereau est ensuite placé à l'envers au-dessus d'un puits de réservoir contenant un cocktail de cristallisation, scellant le puits à l'air serré à l'aide d'huile de scellant (Figure 6B). Idéalement, aucune précipitation ne se produit à l'intérieur de la goutte au début de l'expérience, ce qui signifie que la protéine reste en solution. Étant donné que la concentration précipitée dans le réservoir est plus élevée que dans la goutte, la goutte commence à perdre de l'eau par évaporation dans l'atmosphère du puits jusqu'à ce que l'équilibre avec le réservoir soit atteint. La diffusion de l'eau dans le réservoir provoque une diminution lente du volume de la baisse qui provoque à son tour une augmentation des deux, la concentration de protéines et de précipitation dans la baisse. Si la solution protéique atteint l'état requis de super-saturation et donc de méta-stabilité, la nucléation spontanée suivie d'une croissance cristalline peut se produire. Atteindre l'état sursaturé est une condition nécessaire mais pas suffisante pour la cristallisation. La cristallisation des protéines a besoin à la fois, des conditions thermodynamiques et cinétiques favorables, et dépend fortement des propriétés imprévisibles de la protéine à cristalliser²².

Modifications et dépannage

L'expression des protéines dans E. coli peut être inefficace. Les concentrations variables d'IPTG, la température d'expression et le temps d'amplification, comme la température ambiante pendant plusieurs heures ou dans la chambre froide pendant la nuit, peuvent devoir être testées pour chaque nouvelle protéine afin de trouver des conditions optimales. Des précipitations de protéines dans les organismes d'inclusion sont parfois observées pour des protéines FAHD plus hydrophobes. Dans de tels cas, l'expression des protéines dans d'autres systèmes modèles tels que les cellules d'insectes est recommandée, car les organismes d'inclusion sont moins susceptibles de former²⁶.

Comme les protéines FAHD sont sensibles au sel et aux concentrations de cofactor, ainsi qu'au pH, les stratégies de purification pour différents homologues, orthologues et variantes de mutation ponctuelle peuvent différer selon les milieux individuels. Les méthodes de purification décrites sont développées pour la protéine FAHD1 humaine et souris de type sauvage. Les concentrations de produits chimiques, comme le NaCl et l'imidazole, ainsi que le pH, peuvent devoir être adaptées pour des protéines individuelles avec un point isoélectrique différent (pI). Il convient également de noter que toutes les protéines his-étiquetées ne peuvent pas bien se lier à une résine Ni-NTA. Si la liaison protéique à la colonne Ni-NTA est inefficace, des concentrations adaptées de NaCl et d'imidazole, ainsi que des conditions de pH variables dans le tampon de fonctionnement Ni-NTA peuvent aider à améliorer la qualité des résultats. Si ce n'est pas le cas, sauter l'étape Ni-NTA et passer à l'étape de la chromatographie d'échange ionique peut également conduire à une stratégie de purification réussie. Si une protéine se lie à la colonne Ni-NTA mais ne peut pas être éludée de la colonne, l'ajout d'un certain mM EDTA peut aider à perturber le complexe Ni^2.

En ce qui concerne le processus de cristallisation, il faut comprendre que l'auto-organisation de molécules protéiques grandes et complexes en un réseau périodique régulier est un processus intrinsèquement improbable qui dépend fortement des paramètres cinétiques difficiles à contrôler. Même de petits changements dans la configuration utilisée pour la cristallisation peuvent modifier considérablement le résultat et aucun cristal ne se formera. La pureté des protéines est généralement d'une importance primordiale. En règle générale, un gel SDS-PAGE fortement surchargé ne devrait pas montrer d'autres bandes. En outre, la séquence dans laquelle les étapes sont exécutées peut affecter le résultat. Par exemple, pour assurer la reproductibilité, il est souvent nécessaire de garder la séquence de pipetage la même, puis d'abord ajouter la protéine, et enfin ajouter précipitamment à la gouttelette de cristallisation (ou vice versa). Quelle que soit la méthode utilisée, elle doit être maintenue la même lorsque vous essayez de reproduire ou d'étendre les expériences. Si aucun cristal n'est observé après ce protocole, la composition précipitée chimique, le pH, la taille de goutte, et le rapport protéine-précipité peuvent être variés par petites incréments. La patience et les observations cohérentes des gouttes sont de vertu.

Remarques aux mécanismes catalytiques de FAHD1

Les méthodes présentées ont été développées spécifiquement pour obtenir des protéines FAHD1 de haute qualité. Ceci a permis la croissance des cristaux de FAHD1 aussi bien que l'ingénierie des cristaux contenant FAHD1 complexes à un inhibiteur (oxalate, PDB:6FOG). Les structures de rayons X fournissent une architecture 3D de la cavité catalytique de l'enzyme. Ces résultats établissent une description complète des résidus potentiellement importants pour les mécanismes catalytiques de cette enzyme intrigante. FAHD1 a d'abord été décrit pour être capable de couper les acylpyruvates (acétylpyruvate, fumarylpyruvate)¹¹. Plus tard, il a été constaté que FAHD1 fonctionne aussi comme une décarboxylase d'oxaloacetate¹². Bien que les substrats acylpyruvate et oxaloacetate soient différents moieties chimiques, les transformations chimiques partagent mécaniquement le clivage stratégique d'une liaison commune C³-C^4, énergiquement facilitée si le C³ -C⁴ orbitales de liaison restent orthogonales aux orbitales de c²-carbonyl¹⁵. Une telle conformation permet la stabilisation de résonance du C³-carbanion transitoirement formé pendant le processus de clivage. Les substrats FAHD1 (oxaloacératate et acylpyruvates) sont des molécules flexibles et peuvent exister dans le tautomérique (céto-enol) ainsi que sous des formes hydratées C²(figure 9A). Les équilibres entre les différentes espèces sont déterminés principalement par la nature de la composition tampon utilisée, le pH et la présence d'ions métalliques. Dans ce qui suit, nous discutons des scénarios mécanistes hypothétiques inspirés de l'analyse des structures cristallines de rayon X qui ont révélé le centre catalytique de FAHD1.

Figure 9 : Détails sur le mécanisme catalytique proposé de fahD1 humain.
(A) Oxaloacetate existe dans l'état cristallin ainsi que dans la solution neutre principalement dans la forme Z-enol²⁴. Cependant, dans des conditions physiologiques de pH, la forme 2-keto est la représentation prédominante²⁵. (B) Croquis chimique de la cavité hFAHD1¹⁵ avec de l'oxaloacéette liée à Mg (à gauche) et de l'acylpyruvate (à droite, avec R¹ comme repos organique; la flèche rouge dénote une attaque nucléophile de la molécule d'eau stabilisée adjacente) (voir discussion). (C) Comparaison des conformations favorisées pour le clivage C³-C⁴ en decarboxylase (b à c) et en hydrolase (b' à c) mécanisme de FAHD1 : les deux processus donnent lieu à un pyruvate-enolate complexe mg (voir discussion). On s'attend à ce que les intermédiaires b et b' soient stabilisés d'ici le Q109, tel qu'il est esquissé dans le panel B (voir discussion). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

L'activité Decarboxylase de FAHD1

Oxaloacetate existe dans l'état cristallin ainsi que dans la solution neutre principalement sous la forme Z-enol²⁴. Mais il a été démontré que dans des conditions physiologiques de pH (conditions tamponaute au pH 7.4) la forme 2-keto est la représentation prédominante de l'oxaloacétat²⁵ (figure 9A), et que l'éolisation n'est pas une condition préalable à la décarboxylation²⁷ . A noter que les ions Mg² n'ont aucune influence sur le rapport entre l'espèce d'oxaloacée à un pH de 7,4 ou moins²⁸. La transposition de la forme de keto d'oxaloactate dans le centre catalytique de FAHD1 (guidé par l'oxalate lié dans l'enzyme complexe (PDB : 6FOG¹⁵)) a indiqué le résidu Q109 comme régulateur conformationnel de l'oxaloacetate^{lié 15.} Comme indiqué dans un autre article¹⁵, liaison d'hydrogène au groupe carbamoyl de Q109 stabilise une conformation d'oxaloacée résultant de la rotation autour de la liaison C²-C³ (Figure 9B, panneau gauche). En conséquence de cette rotation, la liaison C 3-C⁴ (à cencouper) adopte une disposition orthogonale proche par rapport aux orbitales de la C²-carbonyl (Figure 9C). Le dioxyde de carbone peut être libéré. Le produit principal de ce processus serait résonance stabilisée Mg-enolate de pyruvate. Il est connu d'après les enquêtes des complexes oxaloacetate-Mg que l'enolate forme le complexe le plus stable^28,29. En supposant une stabilité comparable pour un enolate-complexe enolate Mg-pyruvate, le cofactor de FAHD1 pourrait être bloqué, mais les résidus de lysine K123 peuvent protonate le pyruvate-enolate dans un équilibre pour interdire la perte du cofactor¹⁵.

L'interprétation donnée suggère pyruvate enol comme intermédiaire distinct dans la fonction catalytique ODx de FAHD1. À cette étape du modèle hypothétique, les données expérimentales ne fournissent aucune indication supplémentaire quant aux raisons pour lesquelles le couvercle fermé devrait s'ouvrir pour libérer le produit. Il peut être déduit, cependant, que le mécanisme proposé ressemble à une inhibition enzymatique par le produit: La structure cristalline révèle une molécule d'eau conservée tenue dans l'orientation directionnelle vers le centre catalytique FAHD1 par les résidus H30 et E33 présentés dans un hélice courte¹⁵, qui est induite sur la liaison ligand et la fermeture du couvercle. Si l'enol primaire reste en équilibre avec l'enolate, l'enolate stabilisé par résonance pourrait être étanchépour par la molécule d'eau. L'hydroxyle qui en résulterait serait capable de déplacer le pyruvate du cofactor Mg sur lequel le couvercle s'ouvrirait. Enfin, le centre catalytique serait restauré dans l'environnement mitochondrial. Dans ce scénario hypothétique, la molécule d'eau de cavité fonctionnerait comme acide, respectivement.

Activité Hydrolase de FAHD1

L'activité hydrolase d'une enzyme nécessite implicitement la formation intermédiaire d'un nucléophile hydroxyl. Ce mécanisme est généralement trouvé en combinaison avec l'activité catalytique acide-base. L'état transitoire de la réaction doit être préparé par le contrôle conformationnel par les chaînes latérales critiques d'acide aminé dans la cavité. Par analogie avec la discussion de la fonction decarboxylase, l'acylpyruvate lié aux enzymes sous forme de 2-keto sera mis sous contrôle conformationnel par la liaison de l'hydrogène de l'oxygène 4-carbonyl au Q109 (Figure9B, panneau droit). La structure cristalline de FAHD1 lié à l'oxalate (PDB:6FOG) révèle une molécule d'eau conservée maintenue en orientation directionnelle vers le centre catalytique FAHD1 par les résidus H30 et E33 présentés dans une courte hélice¹⁵. Le dyade E33-H30 est compétent pour déprotonate l'eau positionnée directionnelle et l'hydroxyle qui en résulte est idéal pour attaquer le 4-carbonyle d'acylpyruvate présenté sous contrôle conformationnel par Q109¹⁵.

Il convient de noter qu'un mécanisme similaire a été proposé pour fah¹⁸. L'attaque par le nucléophile hydroxyl devrait donner lieu à une espèce d'oxyanion, qui est stabilisée sur le clivage de liaison C³-C⁴ contrôlé par orbitale (figure9C). Dans ce modèle,la rotation des liaisons C 3-C⁴ (figure9C)se produit après l'attaque nucléophile par l'hydroxyle formé indiqué à la figure 9B (c.-à-d. qu'elle prépare l'acylpyruvate pour le clivage de liaison). Les principaux produits seraient l'acide acétique et l'enolate mg-pyruvate. Dans ce scénario hypothétique, l'acide acétique pourrait étancher l'enol à pyruvate et par la suite aider le déplacement du produit. Au-dessus d'un pH de 7,5 et en présence d'ions Mg, les acylpyruvates existent dans un équilibre entre les formes céto- et enol, ce dernier en légère préférence³⁰. Très probablement les deux formes sont capables de se lier au cofactor de FAHD1 sous la fermeture ultérieure du couvercle. Le traitement des substrats d'acylpyruvate enolique par l'enzyme est entravé en raison de la structure plate de la forme enol. Leclivage C 3-C⁴ entraînerait une carbanion vinyle sans stabilisation de résonance.

Par conséquent, nous proposons une étape catalytique de kétonisation pour préparer l'attaque du nucléophile d'hydroxyle sur le carbonyle d'acyl. Ce processus de kétonérisation, cependant, exigerait le contrôle sur des transpositions de proton par des résidus de FAHD1, qui attribueraient une activité inhérente d'isomerase à FAHD1. Il est rapporté que l'acidité de l'hydrogène enol mg-lié révèle une augmentation de dix mille fois par rapport à la forme non complexe²⁸. Une déprotonation de la forme enol liée mg serait faisable par K123 non-protonated. La déprotonation du K123 peut être assistée par le carboxylate de D102. Un réseau de liaison d'hydrogène formé par les résidus D102-K47-K123 pourrait fonctionner comme le relais de protons nécessaire dans le centre catalytique de FAHD1¹⁵. Un enolate intermédiaire de telle formation pourrait alors être étanchéparé par une triade E33-H30-H₂0 sous la kétonisation du substrat¹⁵. La forme de 2-keto viendrait sous le contrôle conformationnel de Q109, et l'hydroxyle concomitante formé attaquerait le carbonyle d'acyl. La discussion résumée implique un contrôle de FAHD1 au sujet d'une molécule d'eau pour passer d'acide à la base par l'interaction des résidus de cavité-formation.

Applications futures ou orientations de la méthode

Les applications futures des méthodes décrites ici sont nombreuses. Une pléthore de membres procaryotes de la superfamille FAH attend toujours la caractérisation fonctionnelle. Même les informations disponibles sur les activités catalytiques des membres connus de la superfamille FAH sont rares et, dans la plupart des cas, basées sur des hypothèses théoriques plutôt que des données expérimentales. L'application des méthodes décrites ici pour les membres procaryotes de superfamille de FAH dépend des intérêts spécifiques de recherche dans la bactériologie. D'autre part, la démonstration récente que les membres eucaryotes de la superfamille FAH jouent un rôle essentiel dans divers compartiments cellulaires (p. ex., cytosol vs mitochondries) souligne la nécessité de mieux caractériser ces protéines (dont trois ont été identifié jusqu'ici), en particulier parce que les données actuelles suggèrent que quelques protéines non caractérisées peuvent effectuer des fonctions différentes dans le contexte de la biologie mitochondrique, de la recherche de vieillissement, et de la recherche de cancer. Il est proposé que la caractérisation moléculaire et physiologique complète de ces membres eucaryotes de superfamille de FAH puisse fournir un aperçu important dans les principaux domaines de la recherche contemporaine dans le secteur biomédical. D'autres recherches sur les mécanismes de FAHD1 (et les enzymes connexes) sont nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la bifonctionnalité de FAHD1, qui n'est pas encore entièrement clarifiée. D'autres études avec des mutants FAHD1, des enquêtes rmnales et des études structurelles sur les complexes inhibiteurs peuvent aider à résoudre les véritables scénarios mécanistes pour lesquels FAHD1 semble être compétent. En outre, la conception assistée par ordinateur d'imitations enol capable de se lier au Mg-cofactor finira par conduire à de puissants inhibiteurs de FAHD1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21(DE3) pLysS competent E. coli	Promega	L1195	High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors	MERCK	-	http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units	MERCK	SLHP033NS	Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units	MERCK	SLGP033RS	Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL	VWR	525-1042	microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon	VWR	734-0451	centrifugal tubes
50 mL Falcon	VWR	734-0448	centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	30622-758	VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro	VWR	47727-024	UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	ROTH	2316	chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole	ROTH	X998	chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns	Bio-Rad	-	http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa	Sigma-Aldrich	Z706345	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units	Sigma-Aldrich	Z677108	centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid	Sigma-Aldrich	O4126	TCA metabolite
sodium oxlalate	Sigma-Aldrich	71800	a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9277	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose	Thermo-Fischer	R90101	a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate	Thermo-Fischer	8404	UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo-Fischer	26616	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system	GE Healthcare Life Sciences	-	using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column	GE Healthcare Life Sciences	-	https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	-	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL	GE Healthcare Life Sciences	-	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75)	GE Healthcare Life Sciences	-	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200)	GE Healthcare Life Sciences	-	https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader	TECAN Life Sciences	-	https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	-	custom synthesis
benzoylpyruvate	MoleculeCrafting.HuGs e.U.	-	custom synthesis
VDX™ plate (24 wells)	Hampton	HR3-142	24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil	Hampton	HR3-411	used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm)	Karl Hecht KG	14043	coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium	self-prepared	-	a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium	self-prepared	-	a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates	self-prepared	-	autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer	self-prepared	-	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer	self-prepared	-	20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer	self-prepared	-	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS	self-prepared	-	HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer	self-prepared	-	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer	self-prepared	-	44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer	self-prepared	-	20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer	self-prepared	-	20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer	self-prepared	-	15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer	self-prepared	-	50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2
protein crystallization buffer	self-prepared	-	G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization	self-prepared	-	100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2