Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59729
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 3, 3, 4, 1,2
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck Austria, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), University of Innsbruck Austria, 3Division of Genetic Epidemiology, Medical University of Innsbruck Austria, 4Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry, University of Vienna Austria

Summary

Udtryk og rensning af fumarylacetoacetat lav affinitet domæne-holdige proteiner er beskrevet med eksempler (udtryk i E. coli, fplc). Rensede proteiner bruges til krystallisering og antistof produktion og anvendes til enzym assays. Udvalgte fotometriske analyser er præsenteret for at vise multi-funktionaliteten af FAHD1 som oxaloacetat decarboxylase og acylpyruvate hydrolase.

Abstract

Fumarylacetoacetat lav affinitet (Fah) domæne-holdige proteiner (Fahd) er identificeret medlemmer af Fah superfamily i eukaryoter. Enzymer i denne super familie udviser generelt multifunktionalitet, der hovedsagelig involverer lav affinitet-og decarboxylase-mekanismer. Denne artikel præsenterer en række på hinanden følgende metoder til ekspression og rensning af FAHD-proteiner, hovedsagelig FAHD-protein 1 (FAHD1)-ortologer blandt arterne (mennesker, mus, nematoder, planter osv.). Dækkede metoder er protein udtryk i E. coli, Affinity kromatografi, ionbytningskromatografi, præparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, røntgen diffraktion og fotometriske assays. Koncentreret protein af høj renhedsgrad (> 98%) kan anvendes til krystallisering eller antistof produktion. Proteiner af tilsvarende eller ringere kvalitet kan anvendes i enzym analyser eller anvendes som antigener i detekteringssystemer (Western-blot, Elisa). I diskussionen af dette arbejde, de identificerede enzymatiske mekanismer af FAHD1 er skitseret for at beskrive sin lav affinitet og decarboxylase BI-funktionalitet i flere detaljer.

Introduction

Fumarylacetoacetat lav affinitet (Fah)1,2 superfamily af enzymer beskriver en gruppe af enzymer, der deler det meget bevaret katalytiske område3,4,5,6 , 7 af , 8 ud af , 9 ud af , 10. på trods af deres fælles katalytiske Center, er disse enzymer multi-funktionelle, og de fleste findes i prokaryoter, hvor de bruges til at nedbryde forbindelser hentet fra komplekse kulstofkilder3. Kun tre medlemmer af denne familie blev identificeret i eukaryoter indtil videre: navnet giver Fah2, samt Fah domæne-holdige protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 og Fah-domæne indeholdende protein 2 (FAHD2). Nedbrydningen af FAHD1 har været forbundet med svækket mitokondriel respiration13,16 og forbundet med en reversibel type cellulær senescens fænotype14 , der er forbundet med mellemliggende potentiel mangler i elektrontransport systemet. Human FAHD1 og dens ortologer i modelsystemer (mus, nematode, kræft cellelinjer, planter, osv.), samt udvalgte punkt mutation varianter, er blevet stoflig mål af potentiel interesse. Til denne forskning, rekombinant protein på høje niveauer af renhed, samt oplysninger om katalytiske mekanismer styret af krystal strukturer og selektive antistoffer er afgørende.

Dette manuskript beskriver metoder til FAHD-proteinekspression i E. coli, affinitet kromatografi, ionbytningskromatografi, ammoniumsulfat nedbør, præparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, røntgen diffraktion og fotometrisk assays. Formålet med de metoder og protokoller, der er beskrevet her, er at vejlede videnskabsfolk, der arbejder på forskellige områder, såsom bakteriologi, Plantebiologi samt dyre-og humane studier, til at karakterisere medlemmer af FAH-super familien, herunder ukarakteriserede super familiemedlemmer bør de blive relevante på et bestemt område. De protokoller, der beskrives her, kan give værdifuld støtte til projekter, der har til formål at karakterisere andre prokaryotiske eller eukaryotiske FAH-super familiemedlemmer.

Begrundelsen for de metoder, der er beskrevet her, er, at for karakterisering af dårligt beskrevne proteiner (især metaboliske enzymer af ukendt fysiologisk relevans) giver tilgangen til Start med rensede rekombinante proteiner mulighed for udvikling af uvurderlige forskningsværktøjer af høj kvalitet, såsom in vitro-aktive enzympræparater, antistoffer af høj kvalitet og potente og specifikke farmakologiske hæmmere for udvalgte enzymer. De beskrevne metoder kræver hurtig protein væskekromatografi (FPLC) og X-ray krystallografi. Andre metoder (f. eks. til at udtrykke protein uden kemisk induktion eller til at udvise protein rensning ved centrifugering efter varmebehandling, efterfulgt af afsaltning og størrelses udelukkelses kromatografi) kan findes andetsteds17. Mens et bredere spektrum af metoder er til rådighed for ekspression og rensning af Fah superfamily enzymer2,7,9,17,18, fokuserer dette arbejde på udtryk og især rensning af FAHD-proteiner.

I diskussionsafsnittet i dette manuskript er de katalytiske mekanismer, der er identificeret for FAHD1-proteinet (hydrolase, decarboxylase)15 , beskrevet mere detaljeret for at påvise den kemiske karakter af de katalyserede reaktioner. De data, der er indhentet på grundlag af tidligere arbejde7,15,18 (FBF: 6fog, PDB: 6foh), indebærer en tredje aktivitet af enzymet som keto-enol isomerase.

Protocol

1. ekspression af FAHD-proteiner i kompetent E. coli

  1. Omdannelse af E. coli med vektorer for ekspression af Fahd-protein
    Bemærk: de trin, der diskuteres i det følgende afsnit, er opsummeret i skitsen i figur 1a, B. Samme protokol gælder for alle FAHD-proteiner, herunder point-mutante varianter. Sådanne varianter kan opnås via site-instrueret mutagenese og PCR-teknikker19 (såsom TOSIDET SOE PCR20) fra Wild-type cDNA.
    Figure 1
    Figur 1 : Amplifikation af kompetent E. coli og induktion af protein ekspression.
    (A) indsættelse af pET -vektoren i de kompetente BL21 (DE3) plyss E. coli -bakterier, der er beskrevet i afsnit 1. (B) varmechok protokol og plating af pET -transformerede E. coli -bakterier, der er beskrevet i trin 1 i protokollen. Transformerede bakterier er belagt på LB agar plader med antibiotika til udvælgelse. C) amplifikation af pET -transformerede E. coli -bakterier, beskrevet i punkt 1. Kolonier plukkes fra en LB-agar-plade og forstærkes i nærende medium (LB eller NZCYM), indtil bakterie tætheden nåede den empiriske tærskel på 0,4. (D) induktion af protein udtryk via DE3-iptg-pET -systemet, beskrevet i punkt 1 og skitseret i figur 2. Protein produktion startes ved anvendelse af den kemiske IPTG. I slutningen af punkt 1 høstes den bakterielle pille, der indeholder proteinet. Klik her for at se en større version af dette tal.
    1. Opnå kompetente BL21 (DE3) Plyss E. coli bakterier og en pET Expression vektor (Se tabel over materialer). Vælg fortrinsvis en pET-vektor, der også koder en N-Terminal hans-tag eller relaterede Capture tag for bekvemmelighed for at forenkle følgende rensningstrin.
    2. Anskaf cDNA af det foretrukne FAHD-protein, og Indsæt det i det aktive klonings sted for pET-udtryks vektoren, henholdsvis mellem T7-promotoren og T7-terminatorstederne.
    3. Efter vellykket plasmid amplifikation og verifikation [via sekvensering af en kommerciel leverandør (T7 primere kan anvendes med pET system for bekvemmelighed: T7 Promoter, Forward primer: taatacgactcactataggg; T7 Terminator, reverse primer: GCTAGTTATTGCTCAGCGG)], Indsæt 5 – 10 ng plasmid i 100 μL kompetent BL21 (DE3) Plyss E. coli bakterier på is. Må ikke Aspirer op og ned, men let tappe røret med for at blande indholdet.
    4. Opbevar bakterierne på is i 30 min., forsigtigt tappe røret hvert par minutter.
    5. Opvarm en varmeanordning eller et vandbad til 42 °C (eksakt). Anbring røret, der indeholder bakterierne, i apparatet og opbevar dem i 90 s (eksakt). Sæt dem på is med det samme (figur 1a).
    6. Efter 5 – 10 min på is tilsættes 600 μL NCZYM medium (Se tabel over materialer), og røret sættes i en bakterie-inkubator. Røret rystes med medium hastighed orienteret langs ryste retningen ved 37 °C i 1 time.
    7. Plade 200 μL af bakterie kulturen på en 10 cm LB-agar plade (Se tabel over materialer), indeholdende selektions antibiotika af valg [f. eks. en specifik for BL21 (DE3) plyss resistens (chloramphenicol), og en for resistens kodet på pET -vektoren (kanamycin eller ampicillin, figur 1b)].
    8. Kultur bakterierne på LB-agar-pladen i en bakteriel inkubator ved 37 °C natten over.
  2. Ekspression af FAHD-proteiner ved IPTG-induktion
    Bemærk: de første trin, der diskuteres i det følgende afsnit, opsummeres som en skitse i figur 1c, D. T7 Expression systemet via kombinationen af BAKTERIEN DE3 kassette og pET Vector system er opsummeret i figur 2.
    Figure 2
    Figur 2 : Den DE3 kassette/pET vektor Dual system forklaret.
    (A) det tegnede genom af pET Vector TRANSFORMEREDE BL21 (DE3) plyss E. coli bakterier. Det oprindelige bakterie genom bærer en DE3-kassette (Se panel B) samt et Lac-gen, der konstant udtrykker Lac-repræsentan-enheder. Den ikke-Native pET Vector bærerprotein genet indsat mellem en T7 polymerase promotor og terminatorsekvens. Flere detaljer i panel B. (b) DE3- kassetten til det oprindelige bakterie genom koder oplysningerne for T7 polymerase i form af en E. coli -RNA-polymerase-operon. Dette protein udtrykkes dog ikke, fordi Lac-repræsentan-enheden forhindrer, at RNA-polymeraseproteinet binder. Der udtrykkes derfor ingen T7 polymerase, og ingen eksogene proteiner udtrykkes. (C) anvendelse af den kemiske iptg (tabel over materialer) forvrider strukturen af Lac TetR enheder og forhindrer dem i at binde sig til DE3 kassette. Som et resultat, RNA polymerase kan nu binde til kassetten, som T7 polymerase udtrykkes, som er udefrakommende protein til sidst. Klik her for at se en større version af dette tal.
    1. Efter vellykket koloni dannelse, vælge en enkelt koloni (uden nogen satellit kolonier) og sprede det i 5 mL NZCYM eller LB medium med antibiotika, der er valgt som før (trin 1.1.7). Kultur i bakteriel inkubator ved 37 °C natten over (figur 1c).
    2. Efter vellykket bakteriel vækst, forstærke bakterierne i 250 mL, 500 mL, eller 1 L partier af medium, afhængigt af efterspørgslen af proteinmængde.
      1. Passende til volumen, anvende antibiotika valgt som udført i trin 1.1.7 og tilsæt omkring 1% – 2% af tætte bakterielle præ-kultur (dvs., 2,5 – 5,0 mL til 250 mL volumen af medium, etc.). Tag en prøve, der skal anvendes i trin 1.2.5 (1 mL eller mere), og kontroller den optiske tæthed (OD) ved 600 nm. Kultur bakterier i bakteriel inkubator ved 37 °C i 2 – 3 timer (figur 1c).
    3. Efter 2 – 3 h, tegne en prøve for fotometrisk analyse. Hvis OD ved 600 nm har nået 0,4, Påfør 200 μM op til 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, se tabel over materialer).
      Bemærk: den faktiske værdi er empirisk for hver enkelt FAHD-protein eller punkt Mutations variant, hvor 1 mM IPTG er det maksimum, der skal anvendes. Dette inducerer protein udtryk (figur 1d, figur 2c).
    4. Efter 3 – 5 flere timer i bakteriel inkubator ved 37 °C er protein udtrykket opbrugt.
      Bemærk: Se diskussionsafsnittet for kommentarer til temperaturstyring. Det frarådes at ryste efter induktion i mere end 5 timer. Tag en prøve til brug i trin 1.2.5 (1 mL eller mere), og kontroller den optiske tæthed (OD) ved 600 nm.
      1. Der høstes bakterie pellet ved centrifugering ved 5.000 x g i 5 min. kassér supernatanten og fryse pellet ved-80 °c ved længere opbevaring eller-20 °c til kort opbevaring (figur 1d).
    5. Kontroller induktion via de to udtagne fotometriske prøver, der er mærket "-I" (før induktion) og "+ I" (efter induktion). Efter centrifugering og opblanding af bakterie pellet, analysere de to prøver af SDS-Page ved at indlæse den samme mængde af det samlede protein.
      Bemærk: "+ I"-prøven skal vise et stærkt bånd, der er associeret med molekylvægten af det valgte protein, hvorimod "-I"-prøven ikke må indeholde dette bånd. Et lavt induktions niveau er et fælles problem for produktion af proteiner, men niveauet af udtrykt protein er ofte tilstrækkeligt til følgende trin. En høj induktion niveau er en fordel, men er ikke obligatorisk.

2. lysis af bakterie pellets og filtrering af snavs

  1. Afhængigt af om det valgte protein er hans-tagget eller ukodet, skal du vælge ni-NTA løbe buffer (hans-Tagged, se tabel over materialer) eller is-Cold HIC køre buffer (ukodet).
  2. For hver 250 mL af den originale bakterie suspension anvendes 5 mL af den valgte buffer til bakterie pillen (5 mL til 250 mL, 10 mL til 500 mL osv.). Der tilsættes 10 μL β-mercaptoethanol (β-ME) pr. 5 mL anvendt buffer. Brug en 10 mL Pasteur-pipet til mekanisk at tvinge pellet til suspension ved at ridse og pipette (undgå luftboble dannelse under pipettering). Til sidst overføres alle suspensioner til 1 50 mL rør.
  3. Helst sonikatat (6x for 15 s ved medium kraft) suspensionen.
  4. Der centrifugeres i 30 minutter ved høj hastighed (10.000 x g) ved 4 °c. Supernatanten filtreres efter hinanden med filterenheder (f. eks. 0,45 μm, 0,22 μm) på is.
    Bemærk: afhængigt af det foregående Centrifugerings trin kan filtrering direkte gennem en lille porestørrelse være kedelig og kræver sædvanligvis Forfiltrering gennem en større porestørrelse. DNAse kan tilføjes for bedre resultater.
  5. Opbevar prøven på is, og Fortsæt med det samme med enten afsnit 3 eller 4, afhængigt af om proteinet er hans-tagget eller ukodet.

3. rensning af hans-MÆRKEDE Fahd-proteiner ved hjælp af ni-NTA-affinitets kromatografi

Bemærk: ni2 + ioner er bundet via nitrilotrieddikesyre (NTA) til en agrose harpiks, der anvendes i affinitets kromatografi (immobiliseret METALIONKROMATOGRAFI, iMac, figur 3a). Poly-histidine aminosyre Tags binder stærkt til denne ni-Chelat, og hans-mærkede proteiner kan adskilles fra de fleste af de resterende proteiner. Et alternativ til den beskrevne forberedelse af ni-NTA kolonner er ved hjælp af færdigpakkede ni-NTA kolonner og et FPLC system.

Figure 3
Figur 3 : Skitsede illustrationer af almindelige typer kromatografi.
(A) harpiks af en ni-NTA kolonne. NTA indeholder bivalente nikkel ioner, der anvendes i form af immobiliseret metalion-affinitet kromatografi (IMAC). Poly-histidine Tags binder fortrinsvis til dette motiv og kan elupes af imidazol. B) den typiske belægning af silica-partikler i en phenyl-baseret Hydrofobisk interaktions kromatografi (HIC-phenyl). Hydrofobe proteiner interagerer med belægningen materiale og er forsinket i deres migration, mens andre ikke er. C) den typiske belægning af silica-partikler i ionisk interaktions kromatografi. Polariserede og ladede proteiner interagerer med belægningsmaterialet og forsinkes i deres migration, mens andre ikke er. D) harpiks af silicagel i størrelses-udelukkelses kromatografi (SEC). Baseret på definerede porer i silica materiale, kan proteiner adskilles af deres størrelse (i en første tilnærmelse svarende til deres molekylære masse). Små proteiner gennemsyrer porøse kolonne materiale og er retarderet, mens store proteiner migrerer hurtigere omkring porøse partikler. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Fortsæt fra trin 2,5 (dvs. proteinet er i ni-NTA løbe buffer og filtreret med 0,22 μm filterenheder på is).
  2. Der tilberedes en tom plastik-eller glaskolonne ved at vaske den tomme kolonne og fastgøre den til en stabil holder. Vælg kolonnens størrelse, afhængigt af mængden af protein suspensionen.
  3. For hver 10 mL protein suspension anvendes 500 μL af ni-NTA agopstået gylle i kolonnen (omrystes kraftigt før brug). Opslæmningen anvendes langsomt og dråbevis på kolonnens bund filter ved hjælp af en pipette. Lad kolonnen bosætte sig, hvilket tager et par sekunder.
  4. Fyld søjlen helt med ni-NTA løbe buffer, der sikrer ikke at forstyrre agopstået harpiks. Lad bufferen løbe gennem tyngdekraften. Processen kan fremskyndes ved at anvende tommelfinger Tryk på væsken (ved hjælp af et låg eller handske og tommelfinger tryk), men pas på ikke at forvrænge den agopstået harpiks.
  5. Anvend protein suspensionen. Som før, lad prøven køre gennem tyngdekraften. Det anbefales ikke at accelerere dette trin med tommelfinger tryk, da binding af proteiner til kolonnen forstærkes, hvis strømningshastigheden er lav. Saml gennemstrømningen i et rør (tabel over materialer).
  6. Når prøven er passeret, skal du fylde hele kolonnen igen med ni-NTA-løbe bufferen. Pas på ikke at forstyrre den agopstået harpiks. Lad prøven løbe gennem tyngdekraften, men i modsætning til det foregående trin anbefales det at accelerere processen via tommelfinger tryk, da potentielle forureninger på grund af uspecifikke interaktioner kan blive forstyrret på denne måde. Saml Vaskeopløsningen i et rør. Gentag dette trin.
  7. Anbring en UV-transparent kuvette under søjlen, og Anvend 1 mL ni-NTA-elutions buffer. Indsaml prøven uden at påføre harpiksen et tommelfinger tryk.
  8. Prøvens optiske tæthed (OD) kontrolleres ved 280 Nm mod en blindprøve (dvs. en ni-NTA-eluering-buffer). Optimalt viser prøven en OD på mere end 2,5. En OD under 0,5 angiver, at der ikke er nogen signifikant mængde protein i prøven.
    Bemærk: som beskrevet i diskussionsafsnittet kan salt-og imidazolkoncentrationerne i elutions bufferen være tilpasset hver enkelt FAHD-protein individuelt.
  9. Gentag trin 3.1.7 og 3.1.8, indtil OD falder til under 0,5. Pool alle prøver med højere OD i et rør på is.
  10. Start forfra med trin 3.1.4 ved at bruge gennemstrømningen fra trin 3.1.5 som nyt input til denne gentagelse af trin 3.1.5. Gentag denne proces, indtil den første prøve, der er indsamlet i trin 3.1.6, viser en OD under 0,5.
    Bemærk: som beskrevet i fejlfindingsdelen af diskussionsafsnittet kan hans-mærkede proteiner ikke binde tilstrækkeligt til ni2 +-harpiks. I sådanne tilfælde er gentagelse af dette trin eller alternative metoder (f. eks. ionbytningskromatografi) påkrævet.
  11. Tag prøver af alle mellem fraktioner til SDS-PAGE-analyse.
  12. FAHD-proteiner i ni-NTA-eluering-buffer vil udfælde ved frysning og optøning. Derfor, dialyze proteinet mod en anden buffer (natten på is, ved hjælp af 1 μL DTT pr 100 mL dialyse buffer). Brug lavsalt buffer baseret på hvilken type ionbytningskromatografi der skal udføres efter dette trin. Brug almindelige cellulose slanger med en typisk molekylvægt afskæring af 14 kDa (tabel over materialer).
  13. Efter natten dialyse, kan du eventuelt koncentrere proteinet ved hjælp af ultra-Centrifugerings filterenheder. Udfør SDS-PAGE analyse (12,5% kørende gel, 4% stabling gel) for at kontrollere for potentielt tab af protein, utilstrækkelig eluering, og protein renhed i almindelighed. Hvis alt er fint, gå videre til afsnit 5.

4. rensning af ukodede FAHD-proteiner via Hydrofobisk interaktions kromatografi (HIC)

Bemærk: phenyl-grupper på overfladebelægningen af en silicagel i en HIC-kolonne for FPLC (figur 3b) muliggør adskillelse af proteiner i henhold til hydrofobe karakter. De beskrevne trin skal udføres med et FPLC-system, der er udstyret med en 5 mL HIC-phenyl-kolonne. Kolonnerne kan vaskes med 1 M NaOH for at blive genanvendt til forskellige proteiner. Dog bør kolonner, der engang blev brugt til én type FAHD-protein, genbruges til denne type protein.

  1. Udfældning af ammonium sulfat (AS)
    1. Fortsæt fra trin 2,5. Proteinet er i is-koldt HIC køre buffer (Table of Materials).
    2. Vurder mængden af den tilberedte protein opløsning nøjagtigt til mikroliter (VInitial). Langsomt og drop-Wise tilføje forkølet HIC kører buffer som løsning, indtil en 35 volumen-% som mætning er nået: Vsom tilføjet = vInitial * 0,538. Opløsningen omrystes forsigtigt i 30 min. der centrifugeres i 15 min. ved høj hastighed (≥ 10.000 x g) ved 4 °c.
    3. Supernatanten filtreres ved hjælp af en 0,22 μm filterenhed på is. Du kan også udtage en prøve til SDS-PAGE-analyse: fortyndet 1:4 og opvarmes straks ved 95 °C i 5 minutter, ellers vil prøven klumper. Prøven kan fryses på dette punkt (-20 °C) for at fortsætte en anden dag.
  2. FPLC ved hjælp af en HIC-kolonne
    1. Opsæt FPLC-systemet, og Ækvilibrer en 5mL HIC-phenyl-kolonne med 5 kolonne volumener (CV) på 20% EtOH (i H2o) efterfulgt af 5 CV af h2o.
    2. Bland 260 mL HIC løbe buffer (eksakt) med 140 mL HIC køre buffer AS (eksakt). Dette resulterer i en 35 volumen-% AS løsning. Kontroller pH-værdien (7,0); Dette er buffer A. buffer B er 250 mL af køre bufferen. Tilsæt 1 mM DTT til både buffere A og B, og hold dem derefter på is.
    3. Kolonnen ækvilibreres med 8 ml buffer A, 8 mL buffer B og 8 mL buffer A i denne sekvens. Anvend eksemplet, der er forberedt i protokol trin 4,1. Vask med buffer A, indtil den optiske absorption ved baseline ved 280 Nm når 1000 – 500 mAU.
    4. Anvend en blanding af buffere A og B, således at koncentrationen af som er 33% (w/v). Vask med 1 CV, hvilket resulterer i et plateau i kromatogrammet. Opret en gradient af buffer B (op til 100% buffer B over tid): 1,5 mL buffer B i 3,8 min (dvs. 5,7% buffer B med 1% B/mL hældning). Når UV-signalet ved 280 Nm stiger, begynde at indsamle brøken og placere den på is med det samme.
    5. I sidste ende skal du vaske kolonnen med buffer B. Tag prøver af alle fraktioner til SDS-PAGE analyse. Frys alle prøver med flydende nitrogen, og opbevar dem ved-80 °C.
    6. Udfør SDS-PAGE (og Western blot) analyse for at detektere FAHD-proteinet i de indsamlede fraktioner. Fraktioner, der indeholder proteinet, samles og anvendes til yderligere rensning, som skitseret i følgende protokol trin. Kolonnen vaskes med H2o og 20% EtOH (i h2o).

5. rensning af FAHD-proteiner via ionbytningskromatografi

Bemærk: molekyler med ladede funktionelle grupper bindes til en silica-partikel kolonne for FPLC (figur 3c). Dette muliggør differentieringen af proteiner efter deres Ioniske karakter, såsom overflade ladning. De beskrevne trin skal udføres med henholdsvis en FPLC-maskine og tilhørende knowhow. Den beskrevne metode er den samme for enten kationisk eller anionisk udvekslings kromatografi, men de buffere, der skal anvendes, er lidt forskellige.

  1. Vælg det kationiske eller anioniske udvekslings kromatografi system. Dette valg er empirisk og kan variere blandt FAHD-proteiner. Optimalt kan begge metoder bruges fortløbende.
  2. Opsæt FPLC systemet og vask kolonnen med 5 CV på 20% EtOH (i H2o), efterfulgt af 5 CV af h2o. ækvilibrere kolonnen med 1 CV af lavsalt buffer, høj-salt buffer, og igen lav-salt buffer i denne sekvens.
  3. Anvend prøven (dialyseret mod den korrekte lave salt buffer fra trin 3.1.11) på kolonnen. Saml gennemstrømningen. Vask kolonnen for 1 CV med lav salt buffer.
  4. Opsætning af en gradient elution: 100% høj-salt buffer i 30 min ved en strømningshastighed på 1 mL/min, eller 60 min ved en strømningshastighed på 0,5 mL/min. Dette kan genvælges på basis af et allerede kendt FPLC-kromatogram for at optimere rensningen. Saml alle spids fraktioner.
    Bemærk: høje salt forhold kan variere blandt FAHD-proteiner, som beskrevet i diskussionsafsnittet.
  5. Efter gradienten er færdig, skal du køre med høj-salt buffer indtil der ikke flere toppe er detekteret i intervallet 1 CV (indsamle brøker).
  6. Udtage prøver af alle indsamlede fraktioner og udføre SDS-PAGE analyse (12,5% kørende gel, 4% stabling gel). De enkelte prøver fastfryses i flydende kvælstof og opbevares ved-80 °C.
  7. Når SDS-PAGE-analysen er gennemført, skal du samleprøverne, der indeholder FAHD-proteinet, og kassere de andre. Du kan eventuelt koncentrere proteinet ved hjælp af ultra-Centrifugerings filterenheder.
  8. Påfør 1 mL 25% SDS i 0,5 M NaOH (eller andre rengøringsmidler) for at rense kolonnen. Kolonnen vaskes med H2o og 20% EtOH (i h2o).
  9. Du kan eventuelt gentage afsnit 5 med den alternative kolonne (kationisk eller anionisk udvekslings kromatografi). Proteinet opnået ved denne metode er tilstrækkelig ren til at udføre grundlæggende aktivitet analyser eller kan anvendes i screening analyser for krystallografi. For avancerede applikationer, Fortsæt med afsnit 6.

6. rensning af FAHD-proteiner via størrelse-udelukkelses kromatografi (SEC)

Bemærk: porøse partikler i en silicagel-kolonne til FPLC muliggør differentieringen af proteiner efter molekyle størrelse, såsom Hydrodynamisk radius (figur 3D). De beskrevne trin skal udføres med et FPLC-system ved hjælp af SEC-kolonner.

  1. Vælg en SEC kolonne, afhængig af molekylevægten af forureninger stadig til stede, som påvist via SDS-PAGE og sølvfarvning. Den skitserede metode egner sig til begge kolonner. Kolonnen vaskes natten over med 400 ml H2O og ligevægt med SEC-løbe buffer. Det anbefales at skrive et program til FPLC-systemet for at automatisere dette trin.
  2. Tilsæt 1 mM DTT til 300 mL sek løbe buffer og sæt den på is. Dette er den kørende buffer. Anvend 60 mL af denne buffer på kolonnen.
  3. Der centrifugeres i protein prøven (10.000 x g i 10 min) for at fjerne eventuelle mikroudfældning. Anvend supernatanten på kolonnen. Det anbefales generelt at filtrere supernatanten før FPLC.
  4. Anvend løbe bufferen på kolonnen, indtil alt protein elupes. Alle toppe opsamles i fraktioner af passende volumen (f. eks. 2 mL). Tag prøver til SDS-PAGE og fryse alle fraktioner ved hjælp af flydende nitrogen. Opbevar de frosne fraktioner ved-80 °C.
  5. Efter SDS-PAGE (og Western blot) analyse, indsamle og samle alle fraktioner, der indeholder FAHD protein. Sølvfarvning anbefales at detektere mindre forureninger, der stadig kan være til stede.
  6. Brug ultra-Centrifugerings filterenheder for at koncentrere proteinet. Selvom det ikke er obligatorisk for FAHD-proteiner, anbefales det generelt at afsaltning (f. eks. ved dialyse) for enzym analyser og krystallisering.
  7. Gentag trin 6.3 – 6.6 flere gange med forskellige strømningshastigheder og saltkoncentrationer (empirisk) for at forbedre renheden af FAHD-proteinet. Kolonnen vaskes natten over med H2o og 20% EtOH (i h2o).

7. grundlæggende Fahd-aktivitet analyser med substrater oxaloacetat og acetylpyruvate

Bemærk: Fahd-protein 1 (FAHD1) viser aktivitet af oxaloacetat decarboxylase (ODX) og acylpyruvate lav affinitet (APH). Dette er beskrevet mere detaljeret i diskussionsafsnittet. På grund af destabilisering ved keto-enol tautomerisering i vandig opløsning (dvs. enolisering), henfalder oxaloacetat af sig selv over tid (Auto-decarboxylering) som en funktion af cofaktor koncentration og ph. På omkring en pH-værdi på 7 og temperatur på 25 °c, denne effekt er ikke dramatisk, men analyser skal afblændes til at tage højde for både Auto-decarboxylering og enzym koncentration. Pipette Rings ordningen er beskrevet i figur 4a. Generelt anbefales det at bruge velkalibrerede pipetter til denne analyse, da det er ret følsomt over for mindre pipette Rings fejl.

Figure 4
Figur 4 : Skitseret pipette Rings ordning for enzym-assays.
(A) et skitseret pipetteringssystem for basis substrat baserede Fahd-protein enzym-assays. Substrat blank:-S/-E; substrat prøve: + S/-E; enzym blank:-S/+ E; enzym prøve: + S/+ E (S: substrat, E: enzym). Se protokol trin 7 for at få flere oplysninger. (B) et skitseret pipetteringssystem til vurdering af Michaelis-Menten kinetik af Fahd-protein. Substrat blank:-S/-E; substrat prøve: + S/-E; enzym blank:-S/+ E; enzym prøve: + S/+ E (S: substrat, E: enzym). Se afsnit 8 i protokollen for yderligere oplysninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Start en mikroplade læser og ækvilibrere i 30 min ved 25 °C. Opsæt et program til aflæsning af 12 brønde (som skitseret i figur 4a) ved 255 nm. Det anbefales at bruge 25 multiple udlæsninger med 5 MS tid forsinkelse. Indstil en cyklus til at måle 15x hver 2 min (30 min i alt).
  2. Som standard forberedes en enzym analyse buffer (Se tabel over materialer) med 1 mm mgcl2 ved pH 7,4. Variant FAHD-proteiner kan kræve forskellige cofaktorer eller pH-niveauer. Mg2 + og MN2 + er kendte cofaktorer for FAHD13,11,12,21.
  3. Opret en 1 μg/μL protein opløsning, fortynder med enzym assay buffer (tabel med materialer).
  4. Der opsættes 1 mL 20 mM opløsning af et substrat, der skal testes (indtil videre er identificerede substrater af FAHD-proteiner opført andetsteds3) i enzym analyse buffer.
  5. I henhold til pipette Rings ordningen, der er vist i figur 4a, forberedes enzymet blankt og prøve brønde: pipet 90 μl enzym analyse buffer (tabel over materialer) i brøndene med 5 μl (5 μg) enzym opløsning.
  6. I henhold til pipette Rings ordningen, der er vist i figur 4a, forberedes substratet blankt og prøve brønde: pipet 95 μl enzym analyse buffer i brøndene.
  7. Lige før målingen anvendes 5 μL enzym analyse buffer i de seks blanke brønde. Der anvendes 5 μL af 20 mM substratopløsningen på prøve brøndene. Det anbefales at bruge en multikanalpipette.
  8. Brug en multikanalpipette med 50 μL-indstillinger til forsigtigt at blande alle brønde. Start med de tomme felter og Fortsæt med prøve brøndene. Vær omhyggelig med ikke at skabe bobler. Sæt pladen i en mikroplade læser og mål hver brønd ved 255 nm (som beskrevet i trin 7,1).
  9. Udføre analysen i et regneark. Kopiér de rå data fra fotometret til et regneark, og Skriv alle indstillinger (dvs. al dokumentation) i et andet ark. Gennemsnitlige data for de tre brønde i hver af de fire præparater. Fratræk den tomme fra eksemplet. Beregn også standardafvigelser, og sum afvigelserne af blank og stikprøve.
  10. Plot disse data (y: optisk tæthed, x: tid i min). Der skal vises en eksponentielt faldende kurve. Afhængig af den type substrat, der anvendes, kan der observeres en Initial stigning inden for de første 10 minutter, hvorefter signalet falder. Dette tilskrives keto-enol tautomerisering af substratet, som skitseret i flere detaljer i diskussionen afsnit.
  11. Dividerer de optiske signal data over tid med den maksimale værdi af plottet for at skalere dataene ned i intervallet [0,1] (et eksempel findes i figur 5a). Identificer kurvens lineære område, begyndende ved det oprindelige fald, og Beregn den negative hældning (1/min).
  12. Tidsforløbet for faldet i OD er associeret med substratet via dets indledende koncentration: 100 nmol/brønd * hældning. Ved hjælp af den vurderede proteinkoncentration c0 beregnes den specifikke aktivitet: 100 nmol/brønd * hældning * 1/c0. Ved at udtrykke c0 i μg/Well udtrykkes den specifikke aktivitet, der beregnes på denne måde, ved hjælp af enheden nmol/min/μg, hvilket svarer til μmol/min/mg.

8. vurdering af FAHD-proteiners Michaelis-Menten kinetik

Bemærk: vurdering af Michaelis-Menten kinetik af FAHD-proteiner er kedelig, da den specifikke protein aktivitet er afhængig af både den relative protein-substratkoncentration og fysiske volumen, hvor reaktionen finder sted. Der skal etableres Steady-State kinetik for at opnå pålidelige resultater. En afprøvet protokol på en 96 godt UV transparent plade er skitseret i følgende trin. Hvert skridt skal udføres med stor omhu, da mindre fejl normalt ødelægger eksperimentet. Det anbefales at mestre de analyser, der er skitseret i afsnit 7, før du forsøger den mere komplicerede analyse, der er beskrevet nedenfor.

Figure 5
Figur 5 : Eksemplariske resultater af enzym-assays.
(A) en eksemplarisk UV absorptions kurve opnået for grundlæggende substrat-baserede Fahd protein enzym analyser (normaliseret i intervallet 0 til 1) med standardafvigelse. Forholdet mellem optisk tæthed (OD) [OD (t)/OD (0)] på et givent tidspunkt t [OD (t)] normaliseret til den oprindelige OD [t = 0; OD (0)]. Se afsnit 7 i protokollen for yderligere oplysninger. (B) eksemplariske Michaelis-Menten kinetik af humant FAHD1-protein med standardafvigelse. Se afsnit 8 i protokollen for yderligere oplysninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Start en mikroplade læser og Ækvilibrer i 30 min ved 25 °C. Opsætning af et program til aflæsning af 72 brønde (som skitseret i figur 4b) ved 255 nm. Det anbefales at bruge 25 multiple udlæsninger med en 5 MS tid forsinkelse. Indstil en cyklus til at måle 15x hver 2 min (30 min i alt).
  2. Udfør trin 7,2 og 7,3. Sæt derefter 1 mL 100 mM substratopløsning i enzym analyse buffer.
  3. Der tilberedes fortyndinger af substratopløsningen i enzym analyse buffer: 40 mM, 20 mM, 10 mM, 6 mM, 4 mM, 2 mM. Analysen udføres med parvis ("justeret") enzym/substrat-koncentrationer. Til dette skal du tilberede følgende fortyndinger af enzymopløsningen i enzym analyse buffer: 0,5 μg/μL, 0,4 μg/μL, 2,5 μg/μL, 2 μg/μL, 1,5 μg/μL, 1 μg/μL.
  4. I alle brønde, der er afbildet i figur 4b , anvendes 180 μl enzym analyse buffer. Der anvendes 10 μL enzym analyse buffer i alle brønde til substratet (blank og prøve). Der anvendes 10 μL af den fremstillede protein fortyndings serie i brøndene for enzymet (blind og prøve). Der anvendes 10 μL enzym analyse buffer i alle brønde til brønde til underlaget, og enzymet er blankt.
  5. Lige før målingen anvendes 10 μL af den forberedte substrat fortyndings serie i brøndene til substrat prøven og enzym prøven.
  6. Brug en multikanalpipette med 50 μL-indstillinger til forsigtigt at blande alle brønde, begyndende med emnerne, og gå til prøve brøndene. Vær omhyggelig med ikke at skabe bobler.
  7. Sæt pladen i en mikroplade læser og mål hver brønd ved 255 nm, som beskrevet i trin 8,1. Udføre analysen i et regneark. Kopiér de rå data fra fotometret til et regneark, Skriv alle indstillinger (dvs. al dokumentation) i et andet ark.
  8. Udfør individuel dataanalyse pr. punkt i fortyndings serien som beskrevet i trin 7,11. til 7,14. Til sidst, få alle specifikke aktiviteter og plot mod den indledende substratkoncentration: 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM.
  9. Vis alle datapunkter med individuelle standardafvigelser. Computer Michaelis-Menten kinetik via ikke-lineær kurve montering eller via lineweaver-Burk-analyse. Det kan være nødvendigt at remåle individuelle punkter, og at tilpasse individuelle protein-koncentration/substrat-koncentration par nøgletal i trin 8,5 og 8,6. Michaelis-Menten-diagrammet for human FAHD1 er angivet i figur 5b.

9. krystallisering af FAHD-proteiner

Bemærk: krystalliseringen af FAHD-proteiner (Human FAHD1, der er beskrevet tidligere15) kan opnås ved den hængende drop-damp diffusions metode i et 24-brønd format (figur 6a). En trin-for-trin protokol om krystallisering af human FAHD1 ved hjælp af denne teknik er præsenteret nedenfor15. En mere detaljeret beskrivelse findes i diskussionsafsnittet.

Figure 6
Figur 6 : Krystallisering af FAHD-proteiner.
(A) krystalliserings plader i standard 24 brønd eller 96 godt SBS-fodaftryk. Se afsnit 9 for yderligere oplysninger. (B) den grundlæggende plade opsætningsproces i krystallisering af Fahd-proteiner. Dette tal er gentegnet med tilladelse23. Se afsnit 9 for yderligere oplysninger. C) humane FAHD1 krystaller og tilsvarende diffraktion mønstre (små skær). Den nærmeste gitterafstand er angivet i indsatserne som et mål for diffraktion kvalitet af krystallerne. Lavere tal indikerer højere opløsning og dermed mere informative data. Se afsnit 9 i protokollen for yderligere oplysninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Sørg for, at proteinet er dialyseret mod SEC kører buffer. FAHD1-proteinet skal være tilgængeligt ved høje koncentrationer (2 – 5 mg/mL). Ved lavere koncentrationer kan proteinet ikke krystalatisere på grund af manglende spontan nukleation.
  2. Forbered ≥ 20 mL af reservoir opløsningen til krystallisering. Der fremstiller tre stamopløsninger med destilleret eller afioniseret vand som opløsningsmiddel: 1 M na-HEPES (mindst 25 mL, justeret til pH 7,5), 50% (w/v) polyethylenglycol 4000 (PEG4k) (minimum 65 mL) og 1 M MgCl2 (10 ml).
  3. Opsæt et gitter med 4 x 6 (24 i alt) forskellige 15 mL rør. Mærk dem i overensstemmelse med de tilsvarende positioner på pladen (f. eks. række (A, B, C, D) vs. kolonne (1-6) som "a1", "B5", "D6" osv.). Der afpipetteres 1 mL 1 M na-HEPES i hvert rør.
  4. Der afpipetteres 1 mL af 50% (w/v) PEG4k i række A af rørene, 2 mL i række B, 3 mL i række C og 4 mL i række D. pipette 100 μL af 1 M MgCl2 ind i kolonne 1 i rørene, 250 μl i kolonne 2 , 500 μL i kolonne 3, 1,0 mL i kolonne 4, 1,5 mL i kolonne 5 og 2,0 mL i kolonne 6.
  5. Alle rør fyldes op til 10 mL volumen med destilleret eller afioniseret vand, hvor skalaen på rørene er tilstrækkelig nøjagtig.
  6. Tag den humane FAHD1-protein prøve (~ 5 mg/mL) fra køleskabet (eller fra is), og spin ned ved maksimal hastighed med en bordplade centrifuge ved 4 °C i mindst 10 min. Hvis der ønskes Co-krystallisering med oxalat, tilsættes oxalat fra en stamopløsning, således at protein prøven indeholder en endelig oxalatkoncentration på 2 mM. Påfør 1 mM DTT og opbevar på is.
  7. I mellemtiden udpakning en 24 brønd krystalliserings plade, ideelt inde i et temperaturkontrolleret rum ved 18 °C. Fordel et tyndt lag paraffinolie på fælgen oven på hver brønd af 24 brønd pladen ved hjælp af en tynd glas eller plastik stang. Der tilsættes 800 μL af de tilberedte krystalliserings cocktails (a1 til D6) i hver tilsvarende brønd af krystalliserings pladen.
  8. Anbring nye 22 mm dæksedler på en ren overflade. Undgå at kontaminere dæksedlerne med snavs eller støv. Hvis det er nødvendigt, fjernes snavs fra Cover sedlen med trykluft eller en Duster spray.
  9. Når centrifugeringen er gennemført, skal du undgå at ryste protein prøven, så de opspundet-ned aggregater og snavs i bunden af røret ikke flyder op igen. I de følgende trin skal pipette fra protein prøven lige under opløsningens overflade for at undgå omrøring af aggregater og aflejringer fra bunden.
  10. For hver brønd (Se fig. 6b) pipette 1 μl protein opløsning på midten af en cover seddel, og der tilsættes 1 μl af den respektive reservoir cocktail til protein dråben, så der undgås bobler. Vend dæksedlen på hovedet, og anbring den på toppen af brønden, så olien forsegler brønden med dæksedlen lufttæt. Gentag indtil 24 brønd pladen er færdig.
  11. Opbevar pladen ved 18 °C og Observer dråberne på en progressiv tidsplan med et korrekt mikroskop. Humane FAHD1 krystaller vises normalt natten over (Se figur 6c).

Representative Results

Begyndende med en forberedt kloning vektor og købt BL21 (DE3) Plyss E. coli, plasmid er indsat i bakterierne via varmechok eller enhver passende alternativ metode (figur 1). Efter en kort periode med forstærkning, er de transformerede bakterier belagt med LB agar plader, for at vokse natten over. Plader på dette tidspunkt kan se anderledes ud, afhængigt af en række potentielle fejlkilder. Pladerne kan være tomme (dvs. ingen kolonier), helt overgroet af bakterier, eller noget i mellem, hhv. To eksempler på LB-agar-plader efter optimal og ikke-optimal transformation er afbildet i figur 7a. For mange bakteriekolonier indikerer enten, at for mange bakterier blev belagt (sandsynligvis), eller at de antibiotika i brug kan være udløbet (usandsynligt). For få bakterielle kolonier kan indikere, at enten ikke nok plasmid blev brugt til omdannelsen (brug mere næste gang), eller at for meget antibiotika blev brugt til at vælge bakterier. Under alle omstændigheder, hvis kolonier er til stede, bør de være fint, som ved hjælp af to selektive antibiotika indebærer en temmelig ubetydelig chance for utransformerede bakterier til at vokse. Ingen kolonier overhovedet, indikerer dog, at enten bakterierne mistede deres transformation kompetence (på grund af forkert opbevaring eller opbevaring over længere perioder, gentagne fryse-og optøning, osv.), var varmechok ikke vellykket (ingen plasmid optagelse eller bakteriel døden ved for meget varme), klonings vektoren er beskadiget, eller ved en fejltagelse blev der anvendt et forkert sæt selektive antibiotika (Kontroller resistens genet på plasmid-vektoren).

Figure 7
Figur 7 : Repræsentative resultater for bakterie transformation og iMac.
A) repræsentative lb-agar-plader med TRANSFORMEREDE BL21 (DE3) E. colifremstillet ved følgende protokol trin 1,1. Venstre: en plade med godt fordelte kolonier (positivt eksempel). Til højre: en plade med kun en enkelt koloni (negativt eksempel). Hvide cirkler markerer gode kolonier. Den røde cirkel markerer kolonier, der vokser for tæt på hinanden og ikke bør plukkes, så længe isolerede kolonier er tilgængelige. (B) en 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af en række induktions kontroller ("-" indikerer før iptg induktion; "+" indikerer efter IPTG induktion, før pellet høst), justeret til lige store mængder af det samlede protein. Dette er beskrevet i trin 1,2. (C) en eksemplarisk 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af ni-NTA rensning af hans-mærkede FAHD1 protein. Dette er beskrevet i protokollens afsnit 3. Affinitets kromatografi giver protein af høj renhed (> 70%, sort pil), men der observeres også flere små forureninger (røde pile). Disse forureninger består af ikke-FAHD-proteiner, der binder sig til kolonnen, og fra proteiner, der binder sig til FAHD-proteinet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Validerede kolonier udvælges og plukkes. Efter amplifikation i nærende medium, protein udtryk udløses ved anvendelse af den kemiske IPTG. Den bakterielle pellet, der indeholder det udtrykte protein i milligram mængder høstes, og udtrykket er verificeret via SDS-PAGE (Se for eksempel figur 7b). Nogle problemer kan opstå under denne ellers simple proces. Første, nogle proteiner form inklusion organer, fordi de tilsyneladende eller anden måde forstyrre den naturlige metabolisme af værten bakterier. Dette blev observeret for nogle punktmutationer af menneskelige FAHD1 og FAHD2. I sådanne tilfælde kan andre udtryks systemer som insekt celler være mere hensigtsmæssige og bør overvejes. Efter høst af en pellet fra insekt celler, for eksempel, rensning af proteinerne følger de samme trin som beskrevet i denne protokol. For det andet, DE3-pET system er undertiden fundet at være "utætte" (dvs., protein er allerede udtrykt til en vis grad før iptg induktion). Den potentielle årsag til dette er ikke godt forstået, men det kan bidrage til at udtrykke proteinet langsomt natten over i et koldt rum inkubator. For det tredje udtrykkes intet protein. Dette er sandsynligvis den værst tænkelige scenario, da det sandsynligvis indikerer en beskadiget plasmid vektor og dermed tilrådeligt at sekvens plasmid.

Hvis et hans-tag blev brugt til at tagge proteinet, er affinitets kromatografi med ni-NTA agopstået en nem og billig fangstmetode, der eliminerer størstedelen af kontamineringer (figur 7c). Lignende metoder findes for andre tag systemer (f. eks STREP-II). Hvis der ikke er anvendt nogen mærkning, kan en kombination af ammoniumsulfat nedbør og efterfølgende hydrofob-udvekslings kromatografi også adskille proteinet fra størstedelen af andre proteiner (figur 8a). Ved at sammenligne de to metoder (figur 7c vs. figur 8a) kan ni-NTA-metodernes OVERLEGENHED imidlertid PÅVISES ved SDS-Page-analyse. Det tilrådes derfor at bruge hans-mærkede protein.

Figure 8
Figur 8 : Repræsentative resultater for FPLC-eksperimenter (HIC, ion Exchange, SEK).
(A) en typisk kromatogram og 12,5% acrylamid SDS-side analyse af HIC-phenyl-kromatografi efter ammoniumsulfat (AS) udfældning af UKODET FAHD1 protein, som beskrevet i afsnit 4 i protokollen. Den grønne linje afspejler den graduering af buffer B, der ikke indeholder AS. I løbet af processen som er gradvist vaskes ud fra systemet. Sammenligning af dette panel til figur 7c viser kraften i ni-NTA Affinity kromatografi sammenlignet med HIC-phenyl metoden, og fordelen ved at bruge en hans-tag system til protein rensning. (B) et eksemplarisk kromatogram og 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af kationisk bytnings kromatografi af hans-mærkede Fahd efter ni-NTA rensning. Ved hjælp af en salt gradient adskilles den anvendte prøve i individuelle proteiner. (C) et eksemplarisk kromatogram og 12,5% acrylamid SDS-Page analyse af G75 size udelukkelse kromatografi af hans-mærkede Fahd efter kationisk bytnings kromatografi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Efter hinanden adskilles proteinet yderligere fra rester af kontaminering ved kation/anionbytnings kromatografi (Se f. eks. figur 8b), fulgt af størrelses-udelukkelses kromatografi (Se f. eks. figur 8c). Det tilrådes at oprette en indledende rensningsstrategi i denne rækkefølge; disse kolonner bør dog anvendes i kombination, efterfølgende og i variation, indtil proteinet er tilstrækkeligt rent.

Simple aktivitets analyser, for at teste for "ja eller nej" beslutninger om aktive substrater og/eller cofactors, kan udføres med hans-mærkede proteiner efter ni-NTA rensning, eller umærkede proteiner efter ionbytnings søjlen. Specifikke aktiviteter og kinetiske konstanter skal bestemmes med protein af højeste renhed. Krystallisering kan forsøges med proteiner efter ionbytnings søjlen, men kvaliteten af krystaller er næsten altid korrelerer med protein renhed. Polyklonale antistoffer kan rejses mod proteiner på et hvilket som helst tidspunkt i rensnings protokollen. men her kvaliteten også korrelerer med protein renhed.

Discussion

Vigtige trin

FAHD-proteiner er meget følsomme over for saltkoncentrationer. Ved lave NaCl koncentrationer kan proteinerne udfælde ved optøning, men de kan normalt rekonstitueres fuldt ud ved højere saltkoncentrationer. Det vil være, hvis et FAHD-protein udfældes af en eller anden grund, kan det blive genvundet eller genfoldet med højere saltkoncentrationer (> 300 μM). Nogle mere hydrofobe proteiner kan dog ikke genanvendes (f. eks. Human FAHD2), men rengøringsmidler såsom CHAPS (maks. 1%) eller glycerol (10%) kan bruges til at holde dem i stabil opløsning. Under alle omstændigheder anbefales chok-frysning ved hjælp af flydende kvælstof og opbevaring ved-80 °C, da det er en blid og langsom proces med optøning.

Nogle uventede problemer kan opstå under ni-NTA rensning i trin 3.1.10. Af note, en højere OD i den anden indsamlede prøve end i den første prøve indikerer en for stor mængde af agopstået harpiks (tage en note og bruge mindre harpiks i det næste eksperiment). Også, den agopstået harpiks selv fører til et OD signal ved 280 Nm (dvs., afbrydelse af agopstået harpiks seng vil give kunstige signaler). I tvivlstilfælde tilrådes det at anvende andre metoder som en Bradford-eller BSA-analyse til at bestemme proteinkoncentrationen.

I enzymatiske assays, der er tre kritiske aspekter, der skal overvejes. For det første er det afgørende at vurdere proteinkoncentrationen for at opnå de korrekte specifikke aktiviteter. Graden af renhed af proteinet påvirker resultatet og skal anslås. I tilfælde af mærket protein skal massen af tagdelen beregnes, og den specifikke aktivitet skal korrigeres tilsvarende. For simple analyser, der er beskrevet i afsnit 7 i protokollen, er ni-NTA renhed tilstrækkelig til at skelne mellem aktive og inaktive substrater, cofactors, osv. I tilfælde af mere komplekse Michaelis-Menten-kinetik skal alle reaktant-og substrat koncentrationer bestemmes korrekt. Især ved brug af oxaloacetat (som Auto-decarboxylater over tid) skal den enzymatiske del af reaktionen korrigeres for auto-decarboxylering (under forudsætning af, at begge reaktioner forekommer samtidigt). Indledende ændringer i det optiske densitets signal, der er adresseret til keto-enol tautomerisering af substratet, skal overvejes. For det tredje skal koncentrationerne og mængderne justeres. En reaktion med definerede koncentrationer af enzym og substrat kan give forskellige resultater afhængig af analysens volumen. Hvis der er for meget enzym per brønd, kan adhæsion af væsken i virkeligheden bias resultatet.

Til vurdering af Michaelis-Menten kinetik anbefales det at udføre indledende eksperimenter i 100 μL, 200 μL og 300 μL batcher for at finde den optimale kombination. Lignende aspekter gælder for forholdet mellem enzym-substrat koncentrationer for kinetiske assays. For meget enzym pr. substrat eller for meget substrat pr. enzym sætter systemet uden for den lineære Steady-State Michaelis-serie. Indledende eksperimenter er nødvendige for at optimere disse betingelser. Eksemplarisk justering for human FAHD1 (Wild-type) protein er fastsat i afsnit 8, hvilket resulterer i kinetiske diagrammer (som præsenteret i figur 5b, for eksempel).

Til krystallisering pipettes en dråbe protein opløsning i midten af en dækglas og blandes med en dråbe af krystalliserings cocktail, som sædvanligvis består af en buffer (f. eks., Tris-HCl, Hepes) og en fælg (f. eks. polyethylenglycol, ammonium sulfat). En dråbe af inhibitor opløsning til co-krystallisering (såsom oxalat i denne protokol) kan eventuelt anvendes. Den dækglas er derefter placeret på hovedet over en brønd af reservoir indeholder krystalliserings cocktail, forsegling brønden lufttæt ved hjælp af fugemasse olie (figur 6b). Ideelt set sker der ingen nedbør inden for faldet i begyndelsen af eksperimentet, hvilket betyder, at proteinet forbliver i opløsning. Da den udfældnede koncentration i reservoiret er højere end i faldet, begynder faldet at miste vand ved fordampning i atmosfæren af brønden, indtil ligevægt med reservoiret er nået. Diffusion af vand ind i reservoiret forårsager en langsom volumen reduktion af faldet, som igen forårsager en stigning i både protein og udfældsindig koncentration i dråbe. Hvis protein opløsningen når den krævede tilstand af super mætning og dermed meta stabilitet, kan spontan Nukleering efterfulgt af krystalvækst forekomme. At nå den overmættede tilstand er en nødvendig, men ikke tilstrækkelig betingelse for krystallisering. Krystallisering af proteiner har brug for begge, gunstige termodynamiske og kinetiske forhold, og i høj grad afhænger af de uforudsigelige egenskaber af proteinet, der skal krystalliseres22.

Ændringer og fejlfinding

Ekspression af protein i E. coli kan være ineffektivt. Varierende IPTG-koncentrationer, udtryks temperatur og amplifikationstid, såsom rumtemperatur i flere timer eller i koldt rum natten over, kan være nødvendigt at blive testet for hvert nyt protein for at finde optimale betingelser. Udfældning af protein i inklusions kroppe observeres sommetider for mere hydrofobe FAHD-proteiner. I sådanne tilfælde anbefales protein udtryk i andre modelsystemer såsom insekt celler, da inklusions organerne er mindre tilbøjelige til at danne26.

Da FAHD-proteiner er følsomme over for salt-og cofaktor koncentrationer samt pH, kan rensnings strategier for forskellige homologer, ortologer og punkt Mutations varianter variere i individuelle indstillinger. De beskrevne rensningsmetoder er udviklet til Wild-type menneske og mus FAHD1 protein. Koncentrationer af kemikalier, såsom NaCl og imidazol, samt pH, kan være nødvendigt at tilpasse for individuelle proteiner med et andet isoelektrisk punkt (pI). Bemærk også, at ikke alle hans-mærkede proteiner kan binde godt til en ni-NTA harpiks. Hvis proteinbindingen til ni-NTA-søjlen er ineffektiv, kan tilpassede koncentrationer af NaCl og imidazol samt varierende pH-forhold i ni-NTA-løbe bufferen bidrage til at forbedre kvaliteten af resultatet. Hvis det ikke er, kan det også føre til en vellykket rensningsstrategi at springe ni-NTA-trinnet over og fortsætte til trinnet for ionbytningskromatografi. Hvis et protein binder sig til ni-NTA-søjlen, men ikke kan elupes fra søjlen, kan tilsætning af nogle mM EDTA hjælpe med at forstyrre ni2 +- komplekset.

Med hensyn til processen med krystallisering skal det forstås, at selvorganisering af store og komplekse proteinmolekyler i et regulært periodisk gitter er en iboende usandsynlig proces, der er stærkt afhængig af svære at kontrollere kinetiske parametre. Selv små ændringer i den opsætning, der anvendes til krystallisering kan dramatisk ændre resultatet og ingen krystaller vil danne. Protein renhed er generelt af afgørende betydning. Som en tommelfingerregel bør en stærkt overbelastet SDS-PAGE gel ikke vise andre bands. Den sekvens, som trinnene udføres i, kan også påvirke resultatet. Som et eksempel, for at sikre reproducerbarhed, er det ofte nødvendigt at holde pipette Rings sekvensen den samme, derefter først tilføje proteinet, og endelig tilføje udfældnings middel til krystalliserings dråbe (eller omvendt). Uanset hvilken metode, der anvendes, bør det holdes det samme, når de forsøger at reproducere eller opskalering eksperimenter. Hvis der ikke observeres krystaller efter denne protokol, kan den kemiske bundfældning, pH, Dråbestørrelse og forholdet mellem protein og bundfald varieres i små intervaller. Tålmodighed og konsekvente observationer af dråberne er af dyd.

Bemærkninger til katalytiske mekanismer af FAHD1

De præsenterede metoder er udviklet specifikt for at opnå FAHD1 proteiner af høj kvalitet. Dette gav mulighed for vækst af FAHD1 krystaller samt konstruktion af krystaller, der indeholder FAHD1 kompleks bundet til en inhibitor (oxalat, PDB: 6fog). Røntgen strukturerne giver en 3D-arkitektur af enzymets katalytiske hulrum. Disse resultater etablerer en omfattende beskrivelse af rester, der potentielt er vigtige for katalysatoren af dette spændende enzym. FAHD1 blev først beskrevet for at kunne Cleave acylpyruvater (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11. Senere blev det konstateret, at FAHD1 også fungerer som en decarboxylase af oxaloacetat12. Selv om substrater acylpyruvat og oxaloacetat er forskellige kemiske dele, de kemiske omdannelser deler mekanisk den strategiske spaltning af en fælles enkelt C3-c4 obligation, energisk lettet, hvis C3 -C4 obligations orbitaler forbliver ortogonale til π-orbitaler af C2-carbonyl15. En sådan konformation muliggør resonans stabilisering af C3-carbanion forbigående dannet under spaltnings processen. FAHD1 substrater (oxaloacetat og acylpyruvates) er fleksible molekyler og kan eksistere i tautomeric (keto-enol) samt C2-hydrerede former (figur 9a). Ligevægten mellem de forskellige arter bestemmes hovedsagelig af karakteren af den anvendte buffer sammensætning, pH og tilstedeværelsen af metalioner. I det følgende diskuterer vi hypotetiske mekanistiske scenarier inspireret af analyse af røntgen krystal strukturer, der afslørede det katalytiske centrum af FAHD1.

Figure 9
Figur 9 : Nærmere oplysninger om den foreslåede katalysator for human FAHD1.
(A) oxaloacetat findes i krystallinsk tilstand samt i neutral opløsning, hovedsagelig i Z-enol-form24. Men under fysiologiske pH-betingelser 2-keto form er den fremherskende repræsentation25. B) kemisk skitse af hFAHD1 hulrum15 med mg-bundet oxaloacetat (venstre) og acylpyruvat (højre, med R1 som organisk hvile; den røde pil angiver et nukleofile anfald af det tilstødende stabiliserede vandmolekyle) (Se diskussionen). (C) sammenligning af begunstigede konformationer for C3-C4 spaltning i decarboxylase (b til c) og lav affinitet (b ' til C) mekanisme af FAHD1: begge processer resulterer i mg-complexed pyruvate-enolat (Se diskussion). Mellemprodukter b og b ' forventes at blive stabiliseret med Q109, som skitseret i panel B (Se diskussion). Klik her for at se en større version af dette tal.

Decarboxylase-aktiviteten af FAHD1

Oxaloacetat findes i krystallinsk tilstand såvel som i neutral opløsning hovedsageligt i Z-enol-form24. Men det blev påvist, at under fysiologiske pH-betingelser (buffer betingelser ved pH 7,4) er 2-keto-formen den fremherskende repræsentation af oxaloacetat25 (figur 9a), og at enolisering ikke er en forudsætning for decarboxylering27 . Af note, mg2 + ioner har ingen indflydelse på forholdet mellem oxaloacetat arter ved en pH-værdi på 7,4 eller under28. Gennemførelsen af oxaloacetat keto-formen i det katalytiske centrum af FAHD1 (styret af det bundne oxalat i det kompleks bundet enzym (FBF: 6fog15)) afslørede rester Q109 som en konformationel regulator af den bundne oxaloacetat15. Som skitseret i en anden artikel15, stabiliserer hydrogen binding til carbamoylfosfatsyntetaseaktivatorer-gruppen af Q109 en oxaloacetat-konformation som følge af rotation omkring C2-C3 Bond (figur 9b, venstre panel). Som en konsekvens af denne rotation, C3-C4 Bond (der skal kløvet) vedtager en nær ortogononal disposition i forhold til π-orbitaler af c2-carbonyl (figur 9c). Kuldioxid kan frigives. Det primære produkt af denne proces ville være resonans stabiliseret mg-enolat af pyruvate. Det er kendt fra undersøgelser af oxaloacetat-mg komplekser, at enolate danner den mest stabile kompleks28,29. Hvis man antager en sammenlignelig stabilitet for en mg-pyruvat enolatkompleks, kan cofaktor of FAHD1 blokeres, men lysinrest K123 kan protonere pyruvat-enolat i en ligevægt for at forbyde tab af cofaktor15.

Den givne fortolkning antyder pyruvat enol som et særskilt mellemprodukt i katalytisk ODX-funktion af FAHD1. På dette trin i den hypotetiske model giver eksperimentelle data ikke yderligere oplysninger om, hvorfor det lukkede låg skal åbnes for at frigive produktet. Det kan dog udledes, at den foreslåede mekanisme ligner en enzym hæmning af produktet: Krystalstrukturen afslører et bevaret vandmolekyle, der holdes i retningsbestemt retning mod FAHD1 katalysatoren af rester H30 og E33 præsenteret i en kort Helix15, som induceres på ligand binding og låg lukning. Hvis den primære enol ville bo i en ligevægt med enolate, den resonans stabiliseret enolate kunne slukkes for pyruvat af vand molekylet. Den resulterende hydroxyl ville være i stand til at fortrænge pyruvatet fra den mg-cofactor, hvorpå låget ville åbne. Endelig vil den katalytiske Center blive genoprettet i mitokondriel miljø. I denne hypotetiske scenario, hulrum vand molekyle ville fungere som en syre, hhv.

Hydrolase aktivitet af FAHD1

Hydrolase aktivitet af et enzym kræver implicit den mellemliggende dannelse af en hydroxyl nucleophile. Denne mekanisme findes sædvanligvis i kombination med syre-base katalytisk aktivitet. Den midlertidige tilstand af reaktionen skal forberedes via konformationel kontrol af kritiske aminosyre sidekæder i hulrummet. Analogt med drøftelsen af decarboxylase-funktionen vil enzymbundet acylpyruvate i 2-keto-form blive sat under konformationel kontrol ved hydrogen binding af 4-carbonyl oxygen til Q109 (figur 9b, højre panel). Krystalstrukturen af oxalatbundet FAHD1 (PDB: 6FOG) afslører et bevaret vandmolekyle, der holdes i retningsbestemt retning mod det FAHD1 katalytiske Center af rester H30 og E33 præsenteret i en kort Helix15. E33-H30 DYAD er kompetent til at deprotonere det retningsbestemt placerede vand, og den resulterende hydroxyl er i ideel disposition til at angribe 4-carbonyl af acylpyruvate præsenteret under konformational kontrol af Q10915.

Der er blevet foreslået en lignende mekanisme for FAH18. Angreb fra hydroxyl nukleofil forventes at resultere i en oxyanion arter, der er stabiliseret på orbital kontrolleret C3-C4 Bond spaltning (figur 9c). I denne model sker C3-c4 Bond rotation (figur 9c) efter det nukleofile angreb af den dannede hydroxyl, der er angivet i figur 9b (dvs. det forbereder acylpyruvate for obligationen spaltning). De primære produkter ville være eddikesyre og mg-pyruvate enolat. I dette hypotetiske scenarie kunne eddikesyren slukke for enol til pyruvat og efterfølgende hjælpe med at forrevne produktet. Over en pH-værdi på 7,5 og ved tilstedeværelse af mg-ioner findes acylpyruvater i ligevægt mellem keto-og enol-former, sidstnævnte i mindre præference30. Sandsynligvis begge former er i stand til at binde til cofaktor af FAHD1 under efterfølgende låg lukning. Behandling af enolic acylpyruvate substrater af enzymet hæmmes på grund af den flade struktur af enol-form. C3-C4 spaltning ville resultere i en vinylic carbanion uden resonans stabilisering.

Derfor foreslår vi et katalytisk ketonisation trin til at forberede angreb af hydroxyl nukleofil på acyl carbonyl. Denne proces af ketonisation, dog, ville kræve kontrol over proton transpositioner af FAHD1 rester, som ville tillægge en iboende isomerase aktivitet til FAHD1. Det er rapporteret, at surhedsgraden af mg-bundet enol hydrogen afslører en 10000-fold stigning i forhold til un-complexed form28. En Deprotoneringsligevægten af mg bundet enol-form ville være muligt ved un-protonated K123. Deprotonation af K123 kan bistås af carboxylatet af D102. Et brint bindings netværk dannet af rester D102-K47-K123 kunne fungere som det nødvendige proton relæ i det katalytiske centrum af FAHD115. En sådan formet intermediær enolat kunne derefter slukkes med en E33-H30-H20 Triad under ketonisation af substratet15. 2-keto form ville komme under konformationel kontrol af Q109, og den samtidig dannede hydroxyl ville angribe acyl carbonyl. Den opsummerede diskussion indebærer en kontrol af FAHD1 om et vand molekyle til at skifte mellem syre og base gennem samspil af hulrum-danner rester.

Fremtidige anvendelser eller retninger af metoden

Fremtidige anvendelser af de metoder, der er beskrevet her er talrige. Et væld af prokaryotiske medlemmer af FAH-super familien venter stadig på funktionel karakterisering. Selv de tilgængelige oplysninger om de katalytiske aktiviteter hos kendte FAH-super familiemedlemmer er knappe og er i de fleste tilfælde baseret på teoretiske antagelser snarere end eksperimentelle data. Anvendelse af de metoder, der er beskrevet her for prokaryote Fah super familiemedlemmer afhænger af de specifikke forskningsinteresser i bakteriologi. På den anden side, den nylige demonstration, at eukaryote Fah super familiemedlemmer spiller væsentlige roller i forskellige cellulære rum (f. eks cytosol vs. mitokondrier) fremhæver behovet for bedre at karakterisere disse proteiner (tre af dem er blevet identificeret indtil videre), især fordi de aktuelle data antyder, at nogle ukarakteriserede proteiner kan udføre forskellige funktioner i forbindelse med mitokondriel biologi, aldrende forskning og kræftforskning. Det foreslås, at den fulde molekylære og fysiologiske karakterisering af disse eukaryote Fah super familiemedlemmer kan give vigtig indsigt i store områder af moderne forskning i den biomedicinske sektor. Mere forskning i mekanismerne i FAHD1 (og relaterede enzymer) er nødvendige for bedre at forstå mekanismerne bag bi-funktionaliteten af FAHD1, som stadig ikke er helt afklaret. Yderligere undersøgelser med FAHD1 mutanter, NMR-undersøgelser, og strukturelle undersøgelser af inhibitor komplekser kan bidrage til at løse de sande mekanistiske scenarier, som FAHD1 synes at være kompetent. Desuden, computer-aided design af enol efterligner stand til at binde til mg-cofactor i sidste ende vil føre til potente hæmmere af FAHD1.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre og ikke erklære nogen konkurrerende finansielle interesser. H. G. er CEOCSO på MoleculeCrafting. HuGs i Europa og leverede acylpyruvates til dette studie via brugerdefineret syntese. Arbejdet i P. J. D. 's laboratorium blev støttet af den østrigske videnskabs fond (FWF): projektnummer P 31582-B26. Publikations gebyrerne for dette manuskript er delvis blevet dækket af den østrigske videnskabs fond (FWF) underprojekt nummer P 31582-B26. A. N. og B. R. støttes af den østrigske videnskabs fond (FWF) underprojekt P28395-B26.

Acknowledgments

Forfatterne er meget taknemmelige for ekspert teknisk assistance fra Annabella Pittl og pilot metodeudvikling af Haymo Pircher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) pLysS competent E. coli Promega L1195 High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors MERCK - http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon VWR 734-0448 centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 30622-758 VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 47727-024 UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ROTH 2316 chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole ROTH X998 chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns Bio-Rad - http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin Sigma-Aldrich 60615 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin Sigma-Aldrich A1593 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa Sigma-Aldrich Z706345 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units Sigma-Aldrich Z677108 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid Sigma-Aldrich O4126 TCA metabolite
sodium oxlalate Sigma-Aldrich 71800 a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma-Aldrich D9277 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose Thermo-Fischer R90101 a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader TECAN Life Sciences - https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
benzoylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
VDX™ plate (24 wells) Hampton HR3-142 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil Hampton HR3-411 used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm) Karl Hecht KG 14043 coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium self-prepared - a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium self-prepared - a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates self-prepared - autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS self-prepared - HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer self-prepared - 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer self-prepared - 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2
protein crystallization buffer self-prepared - G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization self-prepared - 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
  2. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
  3. Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).
  4. Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. Biochemistry. 55, 2632 (2016).
  5. Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).
  6. Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
  7. Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
  8. Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).
  9. Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
  10. Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
  11. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
  12. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
  13. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  14. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  15. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
  16. Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
  17. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
  18. Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
  19. Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714 (2018).
  20. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
  21. Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
  22. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
  23. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  24. Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
  25. Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
  26. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
  27. Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
  28. Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
  29. Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
  30. Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).

Tags

Biokemi udstedelse 148 FAH FAHD FAHD1 ODx ApH hydrolase decarboxylase oxaloacetat acetylpyruvate fumarylpyruvate acylpyruvate oxalat pyruvate MiDAS
Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M.,… More

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M., Cappuccio, E., Dorigatti, I., Kreidl, K., Naschberger, A., Rupp, B., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins. J. Vis. Exp. (148), e59729, doi:10.3791/59729 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter