Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Published: June 20, 2019 doi: 10.3791/59729
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 3, 3, 4, 1,2
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck Austria, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), University of Innsbruck Austria, 3Division of Genetic Epidemiology, Medical University of Innsbruck Austria, 4Faculty of Chemistry, Department of Organic Chemistry, University of Vienna Austria

Summary

Uttrykk og rensing av fumarylacetoacetate Hydrolase som inneholder proteiner er beskrevet med eksempler (uttrykk i E. coli, FPLC). Renset proteiner brukes for krystallisering og antistoff produksjon og ansatt for enzym analyser. Utvalgte fotometriske analyser presenteres for å vise multi-funksjonaliteten til FAHD1 som oxaloacetate decarboksilaza og acylpyruvate Hydrolase.

Abstract

Fumarylacetoacetate Hydrolase (FAH) domene inneholder proteiner (FAHD) er identifisert medlemmer av FAH overfamilie i Landplantenes. Enzymer i denne overfamilie generelt vise multi-funksjonalitet, involverer hovedsakelig Hydrolase og decarboksilaza mekanismer. Denne artikkelen presenterer en rekke påfølgende metoder for uttrykk og rensing av FAHD proteiner, hovedsakelig FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues blant arter (menneskelig, mus, nematoder, planter, etc.). Dekkede metoder er protein uttrykk i E. coli, affinitet kromatografi, ion Exchange kromatografi, preparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, X-ray Diffraksjon, og fotometriske analyser. Konsentrert protein av høy grad av renhet (> 98%) kan være ansatt for krystallisering eller antistoff produksjon. Proteiner av tilsvarende eller lavere kvalitet kan anvendes i enzym analyser eller brukes som antigener i deteksjons systemer (Western-Blot, ELISA). I diskusjonen om dette arbeidet, er de identifiserte enzymatisk mekanismer for FAHD1 skissert for å beskrive sin Hydrolase og decarboksilaza bi-funksjonalitet i mer detalj.

Introduction

Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah)1,2 overfamilie av enzymer beskriver en gruppe enzymer som deler den svært bevarte katalysator Fah domene3,4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10. til tross for deres felles katalysator sentrum, disse enzymene er multi-funksjonell, og de fleste er funnet i prokaryoter, hvor de brukes til å bryte ned forbindelser Hentet fra komplekse karbon kilder3. Bare tre medlemmer av denne familien ble identifisert i Landplantenes så langt: navnet gir Fah2, så vel som Fah domene-inneholdende protein 1 (FAHD1)11,12,13,14 ,15 og Fah domene-inneholdende PROTEIN 2 (FAHD2). Forringelse av FAHD1 har blitt assosiert med nedsatt mitokondrie åndedrett13,16 og assosiert med en reversibel type mobil senescence fenotype14 som er knyttet til mellomliggende potensial mangler i elektron transportsystemet. Human FAHD1 og dens orthologues i modellsystemer (mus, nematode, kreftcelle linjer, planter, etc.), samt utvalgte punkt mutasjon varianter, har blitt druggable mål av potensiell interesse. For denne forskningen er rekombinant protein på høye nivåer av renhet, samt informasjon om katalysatorer styrt av krystallstrukturer og selektive antistoffer avgjørende.

Dette manuskriptet beskriver metoder for FAHD protein uttrykk i E. coli, affinitet kromatografi, ion Exchange kromatografi, ammonium sulfat nedbør, preparativ og analytisk gel filtrering, krystallisering, X-ray Diffraksjon, og fotometriske analyser. Formålet med metoder og protokoller er beskrevet her er å gi veiledning for forskere som arbeider i ulike felt som bakteriologi, plante biologi, samt dyre-og menneskelige studier, å karakterisere medlemmer av FAH overfamilie, inkludert uncharacterized overfamilie medlemmer skulle de bli relevante i et bestemt felt. Protokollene beskrevet her kan gi verdifull støtte til prosjekter som tar sikte på å karakterisere andre prokaryote eller eukaryote FAH overfamilie medlemmer.

Begrunnelsen bak metodene som er beskrevet her er det faktum at for karakterisering av dårlig beskrevet proteiner (spesielt, metabolske enzymer av ukjent fysiologisk relevans), tilnærmingen til å starte med renset rekombinant proteiner gjør utvikling av uvurderlig, høy kvalitet forskningsverktøy som in vitro aktive enzym preparater, høy kvalitet antistoffer, og potente og spesifikke farmakologiske hemmere for utvalgte enzymer. De beskrevne metodene krever raske protein flytende kromatografi (FPLC) og røntgen crystallography. Alternative metoder (f. eks, for å uttrykke protein uten kjemisk induksjon, eller for å vise protein rensing av sentrifugering etter varmebehandling etterfulgt av avsaltingsspisser overlegne sammenlignet og størrelses eksklusjon kromatografi), kan finnes andre steder17. Mens et bredere spekter av metoder er tilgjengelig for uttrykk og rensing av Fah overfamilie enzymer2,7,9,17,18, fokuserer dette arbeidet på uttrykket og spesielt rensing av FAHD proteiner.

I diskusjons delen av dette manuskriptet er katalysatoren som identifiseres for FAHD1-proteinet (Hydrolase, decarboksilaza)15 , nærmere beskrevet, for å demonstrere den kjemiske karakteren til de katalysert reaksjonene. Dataene innhentet basert på tidligere arbeid7,15,18 (pdb: 6FOG, pdb: 6FOH) innebærer en tredje aktivitet av enzymet som keto-ENOL isomerase.

Protocol

1. uttrykk for FAHD proteiner i kompetente E. coli

  1. Transformasjon av E. coli med vektorer for uttrykk for FAHD protein
    Merk: trinnene omtalt i følgende avsnitt er oppsummert i skissen i figur 1a, B. Den samme protokollen gjelder for alle FAHD protein, inkludert punkt-mutant varianter. Slike varianter kan fås via område styrt mutagenese og PCR-teknikker19 (slik som tosidig SOE PCR20) fra Wild-type cDNA.
    Figure 1
    Figur 1 : Forsterkning av kompetent E. coli og induksjon av protein uttrykk.
    (A) innsetting av pET Vector i kompetente BL21 (DE3) pLysS E. coli bakterier, beskrevet i avsnitt 1. (B) varme sjokk protokoll og plating av kjæledyret forvandlet E. coli bakterier, beskrevet i trinn 1 av protokollen. Transformert bakterier er belagt på LB agar plater med antibiotika for valg. (C) forsterkning av kjæledyr forvandlet E. coli -bakterier, beskrevet i avsnitt 1. Koloniene er plukket fra en LB agar plate og forsterket i nærende medium (LB eller NZCYM) til bakteriell tetthet nådde den empiriske terskelen til 0,4. (D) induksjon av protein uttrykk via DE3-Ipth-pET system, beskrevet i avsnitt 1 og skissert i figur 2. Protein produksjon startes ved anvendelse av den kjemiske IPTH. På slutten av del 1 høstes bakterie pellet som inneholder proteinet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
    1. Skaff kompetente BL21 (DE3) PLysS E. coli bakterier og et kjæledyr uttrykk vektor (se tabell over materialer). Helst velge et kjæledyr vektor som også koder en N-Terminal His-tag eller relaterte fangst tag for enkelhets skyld å forenkle følgende rensing trinn.
    2. Skaff cDNA av FAHD protein av valg og sette den inn i den aktive kloning stedet av pET uttrykket vektor, i mellom T7 promoter og T7 Terminator nettsteder, henholdsvis.
    3. Etter vellykket plasmider forsterkning og verifisering [via sekvensering av en kommersiell leverandør (T7 primere kan brukes med pET system for enkelhets skyld: T7 promoter, Forward primer: TAATACGACTCACTATAGGG; T7 Terminator, omvendt primer: GCTAGTTATTGCTCAGCGG)], setter 5-10 ng av plasmider inn 100 μL av kompetente BL21 (DE3) PLysS E. coli bakterier på isen. Ikke aspirer opp og ned, men litt Trykk på røret med for å blande innholdet.
    4. Hold bakteriene på isen i 30 min, forsiktig tappe røret hver noen få min.
    5. Heat en oppvarming enhet eller vannbad til 42 ° c (eksakt). Sett røret som inneholder bakteriene inn i apparatet og oppbevar dem for 90 s (eksakt). Sett dem på isen umiddelbart (figur 1a).
    6. Etter 5 – 10 min på is, tilsett 600 μL av NCZYM medium (se tabell av materialer) og Legg røret inn i en bakterie inkubator. Rist slangen på middels hastighet orientert langs riste retningen ved 37 ° c for 1 time.
    7. Plate 200 μL av bakteriell kultur på en 10 cm LB-agar plate (se tabell over materialer), som inneholder valg antibiotika av valget [f. eks, en bestemt for BL21 (DE3) pLysS Resistance (kloramfenikol), og en for motstanden kodet på pET Vector (kanamycin eller Ampicillin, figur 1B)].
    8. Kultur bakteriene på LB-agar plate i en bakteriell inkubator på 37 ° c over natten.
  2. Uttrykk for FAHD proteiner ved IPTH induksjon
    Merk: de første trinnene som omtales i følgende avsnitt, oppsummeres som en skisse i figur 1C, D. Det T7 gjengivelsen system via kombinasjonen av det bakteriell DE3 kassetten og pET vektor system er sammenfattet inne skikkelsen 2.
    Figure 2
    Figur 2 : Den DE3 kassett/pET vektor dobbelt system forklart.
    (A) den skisserte Genova av pet Vector forvandlet BL21 (DE3) pLysS E. coli bakterier. De innfødte bakterielle Genova bærer en DE3 kassett (se panel B), samt en Lac genet som stadig uttrykker Lac hemmende enheter. Den ikke-innfødte pET Vector bærer protein genet inn mellom en T7 polymerase promoter og Terminator sekvens. Flere detaljer i panel B. (B) DE3 kassetten av de innfødte bakterielle Genova koder informasjonen for T7 polymerase i form av en E. coli RNA polymerase operon. Dette proteinet er imidlertid ikke uttrykt fordi Lac hemmende enhet hindrer RNA polymerase protein fra binding. Derfor ingen T7 polymerase uttrykkes og ingen eksogene protein uttrykkes. (C) anvendelse av den kjemiske ipth (tabell av materialer) forvrenger strukturen av Lac hemmende enheter og hindrer dem fra binding til DE3 kassetten. Som et resultat kan RNA-polymerase nå bindes til kassetten, der T7-polymerase uttrykkes, som er eksogene protein til slutt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
    1. Etter vellykket koloni formasjon, plukke en enkelt koloni (uten satellitt kolonier) og spre den i 5 mL NZCYM eller LB medium med antibiotika, valgt som før (trinn 1.1.7). Kultur i bakteriell inkubator ved 37 ° c over natten (figur 1C).
    2. Etter vellykket bakteriell vekst, forsterke bakteriene i 250 mL, 500 mL, eller 1 L partier av medium, avhengig av etterspørselen av protein kvantitet.
      1. Hensiktsmessig for volumet, gjelder antibiotika valgt som gjort i trinn 1.1.7 og tilsett ca 1%-2% av tett bakteriell pre-kultur (dvs. 2.5-5,0 mL til 250 mL volum av medium, etc.). Ta en prøve som skal brukes i trinn 1.2.5 (1 mL eller mer) og sjekk den optiske tettheten (OD) ved 600 NM. Kultur bakterier i bakteriell inkubator ved 37 ° c for 2 – 3 t (fig. 1C).
    3. Etter 2 – 3 h, tegn en prøve for fotometriske analyse. Hvis OD ved 600 NM har nådd 0,4, Påfør 200 μM opp til 1 mM isopropylalkohol-β-D-thiogalactopyranosid (IPTH, se tabell over materialer).
      Merk: den faktiske verdien er empirisk for hver FAHD protein eller punkt mutasjon variant, der 1 mM IPTH er det maksimale som skal brukes. Dette medfører et protein uttrykk (figur 1d, figur 2C).
    4. Etter 3 – 5 flere timer i den bakterielle inkubator ved 37 ° c, er protein uttrykket oppbrukt.
      Merk: se diskusjons delen for kommentarer på temperaturkontroll. Lengre enn 5 timer risting etter induksjon er ikke anbefalt. Ta en prøve for bruk i trinn 1.2.5 (1 mL eller mer) og sjekk den optiske tettheten (OD) ved 600 NM.
      1. Høste bakteriell pellet via sentrifugering på 5 000 x g i 5 min. forkaste supernatanten og fryse pellet ved-80 ° c for lengre lagring eller-20 ° c for kort lagring (figur 1d).
    5. Verifiser induksjon via de to hentede fotometriske prøvene, som er merket "-I" (før induksjon) og "+ I" (etter induksjon). Etter sentrifugering og blanding av bakteriell pellet, analysere de to prøvene av SDS-side ved lasting samme mengde av total protein.
      Merk: "+ I"-prøven skal vise et sterkt bånd knyttet til Molekylvekten til det valgte proteinet, mens "-I"-prøven ikke skal inneholde dette båndet. En lav induksjon nivå er et vanlig problem for produksjon av proteiner, men nivået av uttrykt protein er ofte tilstrekkelig for følgende trinn. En høy induksjon nivå er en fordel, men er ikke obligatorisk.

2. lyse av bakterielle pellets og filtrering av rusk

  1. Avhengig av om det valgte proteinet er hans-merket eller umerkede, Velg ni-nTa kjører buffer (hans-merket, se tabell av materialer) eller iskald hic kjører buffer (umerkede).
  2. For hver 250 mL av original bakteriell suspensjon, Påfør 5 mL av den valgte bufferen til bakteriell pellet (5 mL for 250 mL, 10 mL for 500 mL, etc.). Tilsett 10 μL β-mercaptoethanol (β-ME) per 5 mL anvendt buffer. Bruk en 10 mL Pasteur-Pipet til mekanisk å tvinge pellet til suspensjon ved å skrape og pipettering (unngå luftboble dannelse mens pipettering). Til slutt overfører alle suspensjonen til 1 50 mL rør.
  3. Fortrinnsvis sonikere (6 ganger for 15 s ved middels kraft) suspensjonen.
  4. Sentrifuger i 30 minutter ved høy hastighet (10 000 x g) ved 4 ° c. Filtrer supernatanten fortløpende med filter enheter (f.eks. 0,45 μm, 0,22 μm) på is.
    Merk: avhengig av forrige sentrifugering trinn, kan filtrering direkte gjennom et lite filter pore størrelse være kjedelig og vanligvis krever pre-filtrering gjennom en større pore størrelse. DNAse kan legges til for bedre resultater.
  5. Lagre prøven på isen og Fortsett umiddelbart med enten § 3 eller 4, avhengig av om proteinet er hans-merket eller umerkede.

3. rensing av hans-Tagged FAHD proteiner ved hjelp av ni-nTa affinitet kromatografi

Merk: ni2 + ioner er bundet via nitrilotri eddiksyre acid (nTa) til en agarose harpiks som brukes i affinitet kromatografi (immobilisert metall ion KROMATOGRAFI, iMac, figur 3a). Poly-histidin aminosyre koder binder sterkt til denne ni-chelate, og hans-Tagged proteiner kan skilles fra flertallet av gjenværende proteiner. Et alternativ til beskrevet utarbeidelse av ni-NTA kolonner bruker ferdigpakkede ni-NTA kolonner og et FPLC-system.

Figure 3
Figur 3 : Skissert illustrasjoner av vanlige typer kromatografi.
(A) harpiks av en ni-nTa kolonne. NTA holder bivalent nikkel ioner som brukes i form av immobilisert metall ion affinitet kromatografi (IMAC). Poly-histidin koder binder fortrinnsvis til dette motivet og kan være eluert av imidazole. (B) den typiske belegg av silika partikler i en fenyl-basert hydrofobe interaksjon KROMATOGRAFI (hic-fenyl). Hydrofobe proteiner samhandle med belegg materiale og er forsinket i sin migrasjon, mens andre ikke. (C) den typiske belegg av silika partikler i ioniske interaksjon kromatografi. Polarisert og ladet proteiner samhandle med belegg materiale og er forsinket i sin migrasjon, mens andre ikke. (D) harpiks av en silica gel i størrelses-eksklusjon KROMATOGRAFI (SEC). Basert på definerte porer i silika materialet, kan proteiner skilles med deres størrelse (i en første tilnærming som tilsvarer deres molekylære massen). Små proteiner gjennomsyrer det porøse søyle materialet og er tilbakestående, mens store proteiner migrerer raskere rundt de porøse partiklene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Fortsett fra trinn 2,5 (dvs. proteinet er i ni-NTA kjører buffer og filtrert av 0,22 μm filter enheter på is).
  2. Forbered en tom plast eller glass kolonne ved å vaske den tomme kolonnen og feste den til en stabil holderen. Velg størrelsen på kolonnen avhengig av volumet av protein suspensjonen.
  3. For hver 10 mL protein fjæring, Påfør 500 μL av ni-NTA agarose slurry i kolonnen (rist tungt før bruk). Påfør slurry langsomt og dråpevis på bunnen filter av kolonnen ved hjelp av en pipette. La kolonnen bosette seg, noe som tar noen sekunder.
  4. Fyll kolonnen helt med ni-NTA kjører buffer, slik at ikke å forstyrre agarose harpiks. La bufferen renne gjennom av tyngdekraften. Prosessen kan akselerere opp ved å påføre tommelen press på væsken (ved hjelp av et lokk eller hanske og tommelen trykk), men pass på å ikke forvrenge agarose harpiks.
  5. Påfør protein suspensjonen. Som før, La prøven kjøre gjennom av tyngdekraften. Akselererende dette trinnet ved hjelp av tommelen press er ikke anbefalt, som binding av proteiner til kolonnen er forbedret hvis strømningshastigheten er lav. Samle gjennomstrømning i et rør (tabell av materialer).
  6. Når prøven er passert, fyller du hele kolonnen på nytt med ni-NTA som kjører buffer. Pass på å ikke forstyrre agarose harpiks. La prøven kjøre gjennom av tyngdekraften, men i motsetning til forrige trinn, akselererende prosessen via tommelen trykk anbefales, som potensielle forurensninger grunn av løs interaksjoner kan bli forstyrret på denne måten. Samle vaskeløsningen i et rør. Gjenta dette trinnet.
  7. Plasser en UV-transparent Cuvette under kolonnen og påfør 1 mL av ni-NTA eluering buffer. Samle prøven uten å påføre noe tommel Trykk på harpiks.
  8. Sjekk den optiske tettheten (OD) av prøven ved 280 NM kontra en blank prøve (dvs. ni-NTA eluering buffer). Optimalt, viser prøven en OD på større enn 2,5. En OD under 0,5 betegner at ingen signifikant mengde protein er i prøven.
    Merk: som beskrevet i diskusjons delen, kan salt og imidazole konsentrasjoner av eluering buffer må tilpasses for hvert FAHD protein individuelt.
  9. Gjenta trinnene 3.1.7 og 3.1.8 til OD faller under 0,5. Pool alle prøvene med høyere OD i et rør på isen.
  10. Starte atter med steg 3.1.4, benytter det flyte-igjennom fra steg 3.1.5 idet ny input for denne gjentagelse av steg 3.1.5. Gjenta denne prosessen til det første eksemplet som ble samlet inn i trinn 3.1.6, viser en OD under 0,5.
    Merk: som beskrevet i feilsøkingen delen av diskusjonen delen, hans-Tagged proteiner kan binde utilstrekkelig til ni2 +-harpiks. I slike tilfeller er repetisjon av dette trinnet eller alternative metoder (f. eks, ion Exchange kromatografi) nødvendig.
  11. Ta prøver av alle mellomliggende fraksjoner for SDS-side analyse.
  12. FAHD proteiner i ni-NTA eluering buffer vil utløse ved frysing og tine. Derfor dialyze proteinet mot en annen buffer (over natten på isen, ved hjelp av 1 μL av DTT per 100 mL dialyse buffer). Bruk lav-salt buffer basert på hvilken type ion-Exchange kromatografi bør utføres etter dette trinnet. Bruk vanlig cellulose rør med en typisk molekylvekt cut-off av 14 kDa (tabell av materialer).
  13. Etter over natten dialyse, eventuelt konsentrere proteinet ved hjelp av ultra-sentrifugering filter enheter. Utfør SDS-PAGE analyse (12,5% kjører gel, 4% stabling gel) for å se etter potensielle tap av protein, utilstrekkelig eluering, og protein renhet generelt. Hvis alt er i orden, går du videre til del 5.

4. rensing av umerkede FAHD proteiner via hydrofobe interaksjon kromatografi (HIC)

Merk: fenyl-grupper på belegget overflaten av en silica gel i en HIC kolonne for FPLC (figur 3b) aktivere separasjon av proteiner i henhold til hydrofobe karakter. De beskrevne trinnene bør utføres med et FPLC-system utstyrt med en 5 mL HIC-fenyl-søyle. Kolonner kan vaskes med 1 M NaOH å bli gjenbrukt for ulike proteiner. Imidlertid bør kolonner som brukes for en type FAHD protein gjenbrukes for bare denne typen protein.

  1. Ammonium sulfat (AS) nedbør
    1. Gå videre fra trinn 2,5. Proteinet er i iskald HIC løpe buffer (tabell med materialer).
    2. Vurdere volumet av den tilberedte protein løsningen presist til mikroliter (VInitial). Langsomt og drop-klok sammenlegge pre-avkjøle HIC running buffer idet løsning, til en 35 kvantum-% idet metning er nådd: Videt addert = vInitial * 0,538. Rør oppløsningen forsiktig i 30 min. sentrifuge i 15 minutter ved høy hastighet (≥ 10 000 x g) ved 4 ° c.
    3. Filtrer supernatanten ved hjelp av en 0,22 μm Filterenhet på is. Alternativt, ta en prøve for SDS-side analyse: fortynne 1:4 og varme umiddelbart ved 95 ° c i 5 min eller ellers prøven vil klump. Prøven kan fryses på dette punktet (-20 ° c) for å kunne fortsette en annen dag.
  2. FPLC ved hjelp av en HIC kolonne
    1. Setup det FPLC system og likevekt en 5 ml HIC-fenyl søylen med 5 søylen mengder (CV) av 20% EtOH (inne H2O) føle etter av 5 CV av H2o.
    2. Bland 260 mL av HIC løpe buffer (eksakt) med 140 mL HIC løpe buffer AS (eksakt). Dette resulterer i en 35 volum-% AS-løsning. Sjekk pH (7,0); Dette er buffer A. buffer B er 250 mL av kjører buffer. Legg 1 mM DTT til begge buffere A og B, og deretter holde dem på isen.
    3. Likevekt kolonnen med 8 mL buffer A, 8 mL buffer B og 8 mL buffer A i denne sekvensen. Påfør prøven forberedt i protokollen trinn 4,1. Vask med buffer A, til den opprinnelige optiske absorpsjon ved 280 NM når 1000 – 500 mAU.
    4. Påfør en blanding av buffere A og B, slik at konsentrasjonen av som er 33% (w/v). Vask med 1 CV, som resulterer i et platå i kromatogram. Definer en gradering av buffer B (opptil 100% buffer B over tid): 1,5 mL buffer B i 3,8 min. (dvs. 5,7% buffer B med 1% B/mL helling). Når UV-signalet på 280 NM stiger, begynne å samle brøk og plassere den på isen umiddelbart.
    5. Til slutt, vask kolonnen med buffer B. Ta prøver av alle fraksjoner for SDS-side analyse. Frys alle prøvene med flytende nitrogen, og oppbevar dem ved-80 ° c.
    6. Utfør SDS-PAGE (og Western Blot) analyse, for å oppdage FAHD protein i de innsamlede fraksjoner. Fraksjoner som inneholder proteinet er gruppert og brukes til videre rensing, som beskrevet i følgende protokoll trinn. Vask kolonnen med H2o og 20% EtOH (i H2o).

5. rensing av FAHD proteiner via ion Exchange kromatografi

Merk: molekyler med ladet funksjonsgrupper er bundet til en silica partikkel søyle for FPLC (figur 3c). Dette gjør at differensiering av proteiner i henhold til deres ioniske karakter, for eksempel overflate ladning. De beskrevne trinnene bør utføres med en FPLC maskin og tilhørende kunnskap, henholdsvis. Den beskrevne metoden er den samme for enten kationiske eller anioniske Exchange kromatografi, men buffere som skal brukes er litt annerledes.

  1. Velg kationiske eller anioniske utvekslings kromatografi system. Dette valget er empirisk og kan variere blant FAHD proteiner. Optimalt, begge metodene kan brukes fortløpende.
  2. Oppsett av FPLC systemet og vask kolonnen med 5 CV på 20% EtOH (i H2O), etterfulgt av 5 CV av H2o. LIKEVEKT kolonnen med 1 CV med lav-salt buffer, høy-salt buffer, og igjen lav-salt buffer i denne sekvensen.
  3. Påfør prøven (dialyzed mot riktig lav salt buffer fra trinn 3.1.11) til kolonnen. Samle gjennomstrømning. Vask kolonnen for 1 CV med lav salt buffer.
  4. Setup en gradient eluering: 100% høy-salt buffer i 30 min ved en strømningshastighet på 1 mL/min, eller 60 min ved en strømningshastighet på 0,5 mL/min. Dette kan bli re-valgt basert på en allerede kjent FPLC kromatogram, for å optimalisere rensing. Samle alle topp fraksjoner.
    Merk: høy salt forhold kan variere mellom FAHD proteiner, som beskrevet i diskusjons seksjonen.
  5. Etter at graderingen er ferdig, Kjør med høy-salt buffer til ingen flere topper er oppdaget over rekkevidden av 1 CV (samle fraksjoner).
  6. Ta prøver av alle innsamlede fraksjoner og utføre SDS-side analyse (12,5% kjører gel, 4% stabling gel). Frys de enkelte prøvene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved-80 ° c.
  7. Etter SDS-PAGE analysen er fullført, Pool prøvene inneholder FAHD protein og forkaste de andre. Du kan også konsentrere proteinet ved hjelp av ultra-sentrifugering filter enheter.
  8. Påfør 1 mL 25% SDS i 0,5 M NaOH (eller andre vaskemidler) for å rengjøre søylen. Vask kolonnen med H2o og 20% EtOH (i H2o).
  9. Hvis du vil, gjentar du del 5 med den alternative kolonnen (kationiske eller anioniske Exchange kromatografi). Proteinet innhentet fra denne metoden er tilstrekkelig ren til å utføre grunnleggende aktivitet analyser eller kan brukes i screening analyser for crystallography. For avanserte applikasjoner, Fortsett med avsnitt 6.

6. rensing av FAHD proteiner via størrelses-eksklusjon kromatografi (SEC)

Merk: porøse partikler i en silica gel kolonne for FPLC muliggjøre differensiering av proteiner i henhold til molekylær størrelse, slik som hydrodynamisk radius (figur 3D). De beskrevne trinnene skal utføres med et FPLC-system, ved hjelp av SEC-kolonner.

  1. Velg en SEC kolonne, avhengig av molekylære vekter av forurensninger fortsatt til stede, som oppdages via SDS-side og sølv farging. Den disponerte metoden egner seg for begge kolonnene. Vask kolonnen over natten med 400 mL H2O og LIKEVEKT med SEC løpe buffer. Det anbefales å skrive et program for FPLC systemet for å automatisere dette trinnet.
  2. Tilsett 1 mM DTT til 300 mL SEC løpe buffer og sette den på is. Dette er den løpende bufferen. Påfør 60 mL av denne bufferen til kolonnen.
  3. Sentrifuger proteinet prøven (10 000 x g i 10 min) for å fjerne eventuelle mikro-nedbør. Bruk supernatanten på kolonnen. Det anbefales vanligvis å filtrere supernatanten før FPLC.
  4. Bruk den løpende bufferen til kolonnen til alt proteinet er eluert. Samle alle toppene i brøkdeler av passende volum (for eksempel 2 mL). Ta prøver for SDS-side og fryse alle fraksjoner ved hjelp av flytende nitrogen. Oppbevar de frosne fraksjonene ved-80 ° c.
  5. Etter SDS-PAGE (og Western Blot) analyse, samle og pool alle fraksjoner som inneholder FAHD protein. Silver farging anbefales å oppdage mindre forurensninger som fortsatt kan være til stede.
  6. Bruk ultra-sentrifugering filter enheter for å konsentrere proteinet. Selv om det ikke er obligatorisk for FAHD proteiner, er generelt et avsaltingsspisser overlegne sammenlignet trinn (for eksempel ved dialyse) anbefalt for enzym analyser og krystallisering.
  7. Gjenta trinn 6.3 – 6.6 flere ganger med ulike strømningsrater og salt konsentrasjoner (empirisk) for å øke renheten på FAHD protein. Vask kolonnen over natten med H2o og 20% EtOH (i H2o).

7. grunnleggende FAHD aktivitet analyser med underlag oxaloacetate og acetylpyruvate

Merk: FAHD protein 1 (FAHD1) viser oxaloacetate decarboksilaza (ODx) og acylpyruvate Hydrolase (ApH) aktivitet. Dette er mer detaljert beskrevet i diskusjons delen. På grunn av destabilisering av keto-ENOL tautomeri i vandig oppløsning (dvs. enolization), oxaloacetate henfall av seg selv over tid (Auto-dekarboksylering) som en funksjon av kofaktor konsentrasjon og pH. Ved rundt en pH av 7 og temperatur på 25 ° c, er denne effekten ikke dramatisk, men analysene må være borte for å gjøre rede for både Auto-dekarboksylering og enzym konsentrasjon. Pipettering ordningen er skissert i figur 4a. Generelt anbefales det å bruke godt kalibrert Pipetter for denne analysen, da det er ganske følsom for mindre pipettering feil.

Figure 4
Figur 4 : Skissert pipettering ordning for enzym analyser.
(A) et skissert pipettering ordning for grunnleggende substrat-baserte FAHD protein enzym analyser. Substrat blank:-S/-E; substrat prøve: + S/-E; enzym blank:-S/+ E; enzym prøve: + S/+ E (S: substrat, E: enzym). Se protokoll trinn 7 for mer informasjon. (B) et skissert pipettering ordning for vurdering av Michaelis-Menten KINETICS av FAHD protein. Substrat blank:-S/-E; substrat prøve: + S/-E; enzym blank:-S/+ E; enzym prøve: + S/+ E (S: substrat, E: enzym). Se punkt 8 i protokollen for flere detaljer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Start opp en mikroplate-leser og likevekt i 30 min ved 25 ° c. Setup et program for å lese 12 brønner (som beskrevet i figur 4a) ved 255 NM. Det anbefales å bruke 25 flere readouts med 5 MS tidsforsinkelse. Sett opp en syklus for å måle hver 2 min (30 min total).
  2. Som standard klargjør en enzym analysebuffer (se tabell over materialer) med 1 mm MgCl2 ved pH 7,4. Variant FAHD proteiner kan kreve ulike kofaktorer eller pH-verdier. Mg2 + og MN2 + er kjent kofaktorer for FAHD13,11,12,21.
  3. Lag en 1 μg/μL protein løsning, fortynning med enzym analysebuffer (tabell av materialer).
  4. Sett opp 1 mL av 20 mM løsning av et substrat som skal testes (så langt identifisert underlag av FAHD proteiner er listet opp andre steder3) i enzym analysen buffer.
  5. I henhold til pipettering ordningen som vises i figur 4a, klargjør enzymet blank og prøve brønner: Pipet 90 μL av enzym analysebuffer (tabell av materialer) i brønnene med 5 μL (5 μg) av enzym løsning.
  6. I henhold til pipettering skjemaet som vises i figur 4a, klargjør du underlaget tomt og prøve brønner: Pipet 95 μL av enzym analysebuffer i brønnene.
  7. Rett før måling, Påfør 5 μL av enzym analysen buffer i seks blanke brønner. Påfør 5 μL av 20 mM substrat oppløsning på prøve brønnene. Det anbefales å bruke en flerkanals pipette.
  8. Bruk en flerkanals pipette på 50 μL-innstillinger for å blande alle brønnene forsiktig. Start med de tomme feltene og fortsett med prøve brønnene. Pass på at du ikke lager bobler. Sett inn platen i en mikroplate leser og måle hver brønn på 255 NM (som beskrevet i trinn 7,1).
  9. Utfør analysen i et regneark. Kopier rådata fra fotometer til et regneark, og skriv alle innstillingene (dvs. all dokumentasjon) i et annet ark. Gjennomsnittlig dataene i de tre brønnene i hver av de fire forberedelsene. Trekk den tomme fra prøven. Også beregne standardavvik og summere avvik av blank og sample.
  10. Plot disse dataene (y: optisk tetthet, x: tid i min). En eksponentielt synkende kurve skal vises. Avhengig av hvilken type substrat i bruk, en innledende økning innen de første 10 min kan observeres, hvoretter signalet avtar. Dette er tilskrevet keto-ENOL tautomeri av underlaget, som beskrevet i mer detalj i diskusjonen delen.
  11. Del de optiske signal dataene over tid med den maksimale verdien av plottet, for å skalere dataene ned i området [0, 1] (et eksempel er angitt i figur 5a). Identifiser det lineære området av kurven, starter ved første nedgang, og beregne den negative skråningen (1/min).
  12. Tiden løpet av nedgangen i OD er knyttet til underlaget via sin opprinnelige konsentrasjon: 100 nmol/brønn * skråning. Ved hjelp av vurdert proteinkonsentrasjon c0, er den spesifikke aktiviteten beregnet: 100 nmol/brønn * skråning * 1/c0. Ved å uttrykke c0 i μg/brønn, vil den spesifikke aktiviteten som beregnes på denne måten uttrykkes ved bruk av enheten nmol/min/μg, som er lik mikromol/min/mg.

8. vurdering av Michaelis-Menten Kinetics av FAHD proteiner

Merk: å vurdere Michaelis-Menten Kinetics av FAHD proteiner er kjedelig, da den spesifikke protein aktiviteten er avhengig av både den relative protein-substrat konsentrasjon og fysisk volum som reaksjonen finner sted. Steady-state-Kinetics må etableres for å oppnå pålitelige resultater. En testet protokoll på en 96 brønn UV transparent plate er skissert i følgende trinn. Hvert trinn må utføres med stor forsiktighet, som mindre feil vanligvis ødelegge eksperimentet. Det anbefales å mestre analysene som er skissert i avsnitt 7, før du prøver den mer kompliserte analysen som er beskrevet nedenfor.

Figure 5
Figur 5 : Eksemplarisk resultater av enzym analyser.
(A) en eksemplarisk UV absorpsjon kurve innhentet for grunnleggende substrat-baserte FAHD protein enzym analyser (normalisert i området fra 0 til 1) med standardavvik. Den optiske tettheten (OD) ratio [OD (t)/OD (0)] til enhver tid t [OD (t)] er normalisert til den første OD [t = 0; OD (0)]. Se punkt 7 i protokollen for flere detaljer. (B) eksemplarisk Michaelis-Menten Kinetics av humant FAHD1 protein med standardavvik. Se punkt 8 i protokollen for flere detaljer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Start en mikroplate-leser og likevekt i 30 min ved 25 ° c. Sett opp et program for å lese 72 brønner (som skissert i figur 4b) ved 255 NM. Det anbefales å bruke 25 flere readouts med en 5 MS tidsforsinkelse. Sett opp en syklus for å måle opp til 2 minutter (30 min totalt).
  2. Utfør trinn 7,2 og 7,3. Deretter satt opp 1 mL av 100 mM substrat løsning i enzym analysen buffer.
  3. Forbered fortynninger av underlaget løsning i enzym analysen buffer: 40 mM, 20 mM, 10 mM, 6 mM, 4 mM, 2 mM. Analysen utføres med parvis ("justerte") enzym/substrat konsentrasjoner. For å gjøre dette, klargjør du følgende fortynninger i enzym analysen buffer: 0,5 mikrogram/μL, 0,4 μg/μL, 2,5 μg/μL, 2 μg/μL, 1,5 μg/μL, 1 μg/μL.
  4. I alle brønner som er avbildet i figur 4b Apply 180 μL av enzym analysen buffer. Påfør 10 μL av enzym analysebuffer i alle brønner for underlaget (blank og Sample). Påfør 10 μL av forberedt protein fortynning serien i brønnene for enzymet (blank og Sample). Påfør 10 μL av enzym analysen buffer i alle brønner for brønner for underlaget blank og enzymet blank.
  5. Rett før måling, påfør 10 μL av forberedt substrat fortynning serien i brønnene for substratet prøven og enzymet prøven.
  6. Bruk en flerkanals pipette på 50 μL-innstillinger for å forsiktig blande alle brønner, og start med de tomme feltene, og fortsetter til prøve brønnene. Pass på at du ikke lager bobler.
  7. Sett inn platen i en mikroplate leser og måle hver brønn på 255 NM, som beskrevet i trinn 8,1. Utfør analysen i et regneark. Kopier rådata fra fotometer til et regneark, skriv alle innstillingene (dvs. all dokumentasjon) i et annet ark.
  8. Utfør individuell dataanalyse per punkt i fortynning serien som beskrevet i trinn 7,11. til 7,14. Til slutt, få alle spesifikke aktiviteter og tomten mot den opprinnelige underlaget konsentrasjon: 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM.
  9. Vis alle datapunkter med individuelle standardavvik. Datamaskin Michaelis-Menten Kinetics via ikke-lineær kurve montering, eller via Lineweaver-Burk analyse. Det kan være nødvendig å re-måle individuelle poeng, og å tilpasse individuelle protein-konsentrasjon/substrat-konsentrasjon par prosenter i trinn 8,5 og 8,6. Michaelis-Menten-diagrammet for humant FAHD1 er gitt i figur 5B.

9. krystallisering av FAHD proteiner

Merk: krystallisering av FAHD proteiner (humant FAHD1 beskrevet tidligere15) kan oppnås ved hengende dråpe damp diffusjon metode i en 24 brønn format (figur 6a). En steg-for-trinn-protokollen om krystallisering av menneskelig FAHD1 bruker denne teknikken er presentert under15. Du finner en mer detaljert beskrivelse i diskusjons delen.

Figure 6
Figur 6 : Krystallisering av FAHD proteiner.
(A) krystallisering plater i standard 24 brønn eller 96 godt SBS fotavtrykk. Se avsnitt 9 for flere detaljer. (B) den grunnleggende plate oppsettsprosessen i KRYSTALLISERING av FAHD proteiner. Dette tallet tegnes med tillatelse23. Se avsnitt 9 for flere detaljer. (C) Human FAHD1 krystaller og tilsvarende Diffraksjon mønstre (små innsatser). Den nærmeste gitter avstanden er indikert i innlegg som et mål for Diffraksjon kvaliteten på krystallene. Lavere tall indikerer høyere oppløsning og dermed mer informative data. Se avsnitt 9 i protokollen for flere detaljer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Sørg for at proteinet er dialyzed mot SEC kjører buffer. FAHD1-proteinet bør være tilgjengelig ved høye konsentrasjoner (2 – 5 mg/mL). Ved lavere konsentrasjoner kan proteinet ikke utkrystallisere på grunn av mangel på spontan kjernedannelse.
  2. Klargjør ≥ 20 mL av reservoar oppløsningen for krystallisering. Lag tre lager løsninger med destillert eller deionisert vann som et løsemiddel: 1 M na-HEPES (minimum 25 mL, justert til pH 7,5), 50% (w/v) polyetylen glykol 4000 (PEG4k) (minimum 65 mL) og 1 M MgCl2 (10 ml).
  3. Setup et rutenett på 4 x 6 (24 totalt) forskjellige 15 mL rør. Merk dem i henhold til tilsvarende posisjoner på platen (f.eks. rad (A, B, C, D) kontra kolonne (1 – 6) som "a1", "B5", "D6", osv.). Pipetter 1 mL 1 M na-HEPES i hvert rør.
  4. Pipette 1 mL av 50% (w/v) PEG4k i rad A av rørene, 2 mL i rad B, 3 mL i rad C, og 4 mL inn i rad D. Pipetter 100 μL av 1 M MgCl2 i kolonne 1 av rørene, 250 μL i kolonne 2 , 500 μL i kolonne 3, 1,0 mL i kolonne 4, 1,5 mL i kolonne 5 og 2,0 mL til kolonne 6.
  5. Fyll alle rørene opp til et volum på 10 mL med destillert eller deionisert vann, der vekten på rørene er tilstrekkelig nøyaktig.
  6. Ta den menneskelige FAHD1 protein prøve (~ 5 mg/mL) fra kjøleskapet (eller fra isen) og spinne ned ved maksimal hastighet med en bordplate sentrifuger ved 4 ° c i minst 10 min. Hvis co-krystallisering med oksalat er ønsket, legger oksalat fra en lagerløsning slik at proteinet prøven inneholder en endelig oksalat konsentrasjon på 2 mM. Påfør 1 mM DTT og lagre på isen.
  7. I mellomtiden, Pakk ut en 24 brønn krystallisering plate, ideelt inne i en temperatur-kontrollerte rom ved 18 ° c. Distribuer et tynt lag med parafinolje på felgen på toppen av hver brønn av de 24 brønn platen ved hjelp av et tynt glass eller plast stang. Tilsett 800 μL av forberedt krystallisering cocktails (a1 til D6) i hver tilsvarende brønn av krystallisering plate.
  8. Plasser den friske 22 mm coverslips på en ren overflate. Unngå forurensende dekselet slips med skitt eller støv. Hvis det er nødvendig, må du fjerne smuss fra deksel Seddelen med trykkluft eller en støv spray.
  9. Når sentrifugering er ferdig, unngå å riste protein prøven slik at de spunnet ned aggregater og rusk på bunnen av røret ikke flyter opp igjen. I de følgende trinnene, pipette fra protein prøven rett under overflaten av løsningen for å unngå å røre opp aggregater og avleiringer fra bunnen.
  10. For hver brønn (se figur 6b) pipette 1 μL av protein løsning på midten av en cover slip og tilsett 1 μL av de respektive reservoar cocktail til protein dråpe, unngå bobler. Snu dekkglass opp ned og legg den på toppen av brønnen slik at oljen forsegler brønnen med den dekkglass lufttette. Gjenta til 24 brønn platen er ferdig.
  11. Oppbevar platen ved 18 ° c og Observer dråpene på en progressiv timeplan med riktig mikroskop. Human FAHD1 krystaller vises vanligvis over natten (se figur 6C).

Representative Results

Starter med en forberedt kloning vektor og kjøpt BL21 (DE3) PLysS E. coli, er plasmider satt inn i bakterier via varme-sjokk eller en passende alternativ metode (figur 1). Etter en kort periode med forsterkning, de transformert bakteriene er belagt på LB agar plater, for å vokse over natten. Platene på dette punktet kan se annerledes ut, avhengig av en rekke potensielle feilkilder. Platene kan være tomme (dvs. ingen kolonier), fullstendig overgrodd av bakterier, eller noe i mellom, henholdsvis. To eksempler på LB agar plater etter optimal og ikke-optimal transformasjon er avbildet i figur 7a. For mange bakterie kolonier indikerer enten at for mange bakterier var belagt (sannsynlig) eller at antibiotika i bruk kan være utløpt (usannsynlig). For få bakterie kolonier kan tyde på at enten ikke nok plasmider ble brukt for transformasjon (bruk mer neste gang) eller at for mye antibiotika ble brukt til å velge bakterier. I alle fall, hvis koloniene er til stede, bør de være i orden, som bruker to selektive antibiotika innebærer en heller ubetydelig sjanse for transformert bakterier å vokse. Ingen kolonier i det hele tatt, derimot, indikerer at enten bakteriene mistet sin transformasjon kompetanse (på grunn av feil lagring eller lagring over lengre perioder, repeterende fryse og tine, etc.), varme-sjokk var ikke vellykket (ingen plasmider opptak eller bakteriell død av for mye varme), er kloning vektoren ødelagt, eller ved en feiltakelse satt av selektiv antibiotika ble brukt (verifisere motstanden genet på plasmider vektor).

Figure 7
Figur 7 : Representative resultater for bakterie transformasjon og iMac.
(A) representant lb agar plater med transformert BL21 (DE3) E. coli, fremstilt ved å følge protokollen trinn 1,1. Venstre: en tallerken med godt fordelte kolonier (positivt eksempel). Høyre: en tallerken med bare en enkelt koloni (negativt eksempel). Hvite sirkler markerer gode kolonier. Den røde sirkelen markerer kolonier som vokser for nær hverandre og bør ikke plukkes så lenge isolerte kolonier er tilgjengelige. (B) en 12,5% akrylamid SDS-side analyse av en rekke induksjon kontroller ("-" indikerer før ipth induksjon; "+" indikerer etter IPTH induksjon, før pellet innhøsting), justert til like mengder av totalt protein. Dette er beskrevet i trinn 1,2. (C) en eksemplarisk 12,5% akrylamid SDS-side analyse av ni-nTa rensing av hans-Tagged FAHD1 protein. Dette er beskrevet i punkt 3 i protokollen. Affinitet kromatografi gir protein av høy renhet (> 70%, svart pil), men flere små forurensninger er også observert (røde piler). Disse forurensninger består av ikke-FAHD proteiner som binder til kolonnen, og fra proteiner som binder til FAHD protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Validerte kolonier velges og plukkes. Etter forsterkning i nærende medium utløses protein uttrykk ved anvendelse av den kjemiske IPTH. Den bakterielle pellet som inneholder uttrykt protein i mg mengder høstes, og uttrykket er verifisert via SDS-side (se for eksempel figur 7b). Noen problemer kan oppstå under denne ellers enkle prosessen. Først noen proteiner form inkludering organer, fordi de tydeligvis liksom forstyrre den naturlige metabolismen av verten bakterier. Dette ble observert for noen punkt mutasjoner av menneskelig FAHD1 og FAHD2. I slike tilfeller kan andre uttrykks systemer som insekt celler være mer hensiktsmessig og bør vurderes. Etter høsting av en pellet fra insekts celler, for eksempel, følger rensing av proteinene de samme trinnene som beskrevet i denne protokollen. For det andre er DE3-pET -systemet noen ganger funnet å være "lekk" (dvs. protein er allerede uttrykt til en viss grad før ipth induksjon). Den potensielle årsaken til dette er ikke godt forstått, men det kan bidra til å uttrykke proteinet langsomt over natten i et kaldt rom inkubator. For det tredje uttrykkes ikke protein. Dette er trolig den verst-case scenario, som det sannsynlig indikerer en ødelagt plasmider vektor og dermed tilrådelig å sekvens av plasmider.

Hvis en hans-tag ble brukt til å merke proteinet, affinitet kromatografi med ni-nTa agarose er en enkel og billig fangst metode eliminerer flertallet av forurensninger (figur 7C). Lignende metoder finnes for andre tag systemer (f. eks STREP-II). Hvis ingen tag ble brukt, en kombinasjon av ammonium sulfat nedbør og påfølgende hydrofobe utveksling kromatografi kan også skille proteinet fra de fleste andre proteiner (figur 8a). Men å sammenligne de to metodene (figur 7C vs figur 8a), OVERLEGENHET av ni-nTa metoder kan bli DEMONSTRERT ved SDS-side analyse. Ved hjelp av hans-Tagged protein er derfor anbefales.

Figure 8
Figur 8 : Representative resultater for FPLC eksperimenter (hic, ion Exchange, SEC).
(A) en typisk kromatogram og 12,5% akrylamid SDS-side analyse av hic-fenyl kromatografi etter ammonium SULFAT (AS) utfelling av umerkede FAHD1 protein, som beskrevet i punkt 4 i protokollen. Den grønne linjen gjenspeiler graderingen av buffer B som ikke inneholder AS. Under prosessen AS blir gradvis vasket ut fra systemet. Sammenligning av dette panelet til figur 7C viser kraften i ni-nTa affinitet kromatografi i forhold til hic-fenyl metoden, og fordelen av å bruke en hans-tag system for protein rensing. (B) en eksemplarisk kromatogram og 12,5% akrylamid SDS-side analyse av kationiske utvekslings kromatografi av hans-Tagged FAHD etter ni-nTa rensing. Ved hjelp av en salt gradient er anvendt prøven delt inn i individuelle proteiner. (C) en eksemplarisk kromatogram og 12,5% akrylamid SDS-side analyse av G75 størrelse utelukkelse kromatografi av hans-Tagged FAHD følgende kationiske utveksle kromatografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter hvert blir proteinet ytterligere adskilt fra leftover-forurensninger ved anion utvekslings kromatografi (for eksempel se figur 8B), etterfulgt av kromatografi for størrelses ekskludering (se for eksempel figur 8c). Det anbefales å sette opp en innledende rensing strategi i denne rekkefølgen; Imidlertid bør disse kolonnene brukes i kombinasjon, senere og i variasjon, til proteinet er tilstrekkelig ren.

Enkel aktivitet analyser, for å teste for "Ja eller nei" beslutninger på aktive underlag og/eller kofaktorer, kan utføres med hans-Tagged proteiner etter ni-nTa rensing, eller umerkede proteiner etter den joniske utveksling kolonnen. Spesifikke aktiviteter og kinetisk konstanter må fastsettes med protein av høyeste renhet. Krystallisering kan forsøkes med proteiner etter den joniske utvekslings søylen, men kvaliteten på krystallene samsvarer nesten alltid med protein renhet. Polyklonale antistoffer kan heves mot proteiner på ethvert Stadium i rense protokollen; men her kvaliteten også samsvarer med protein renhet.

Discussion

Kritiske trinn

FAHD proteiner er svært følsomme for salt konsentrasjoner. Ved lave NaCl konsentrasjoner, kan proteinene utløse ved tine, men de kan vanligvis være fullt rekonstituert ved høyere salt konsentrasjoner. Det vil si at hvis et FAHD protein precipitates av en eller annen grunn, kan det utvinnes eller ombrettes med høyere salt konsentrasjoner (> 300 μM). Noen mer hydrofobe proteiner, men kan ikke gjenopprettes (for eksempel humant FAHD2), men vaskemidler som gutter (maks 1%) eller glyserol (10%) kan brukes til å holde dem i stabil løsning. I alle fall anbefales sjokk frysing med flytende nitrogen og lagring ved-80 ° c, da det er en skånsom og langsom prosess med tine.

Noen uventede problemer kan oppstå under ni-NTA rensing i trinn 3.1.10. Av notatet, en høyere OD i den andre samlet prøven enn i den første prøven indikerer et for høyt volum av agarose harpiks (ta et notat og bruke mindre harpiks i neste eksperiment). Også, den agarose harpiks selv fører til en OD signal på 280 NM (dvs. avbrudd av agarose harpiks seng vil gi kunstige signaler). I tilfelle tvil, er det anbefalt å bruke andre metoder som en Bradford eller BSA-analysen for å bestemme protein konsentrasjoner.

I enzymatisk analyser, er det tre kritiske aspekter som skal vurderes. Først vurdere proteinkonsentrasjon er avgjørende for å få de riktige spesifikke aktiviteter. Nivået av renhet av proteinet er å påvirke resultatet og må anslås. I tilfelle av Tagged protein, massen av tag-delen må beregnes, og den spesifikke aktiviteten må være tilsvarende korrigert. For enkle analyser beskrevet i punkt 7 i protokollen, er ni-NTA renhet tilstrekkelig til å skille mellom aktive og inaktive underlag, kofaktorer, etc. I tilfelle av mer komplekse Michaelis-Menten Kinetics, må alle reaktant og substrat konsentrasjoner fastsettes riktig. Spesielt når du bruker oxaloacetate (som automatisk decarboxylates over tid) enzymatisk del av reaksjonen må rettes for Auto-dekarboksylering (under forutsetning av at begge reaksjonene oppstår samtidig). Initial endringer i den optiske tettheten signal adressert til keto-ENOL tautomeri av underlaget må vurderes. For det tredje må konsentrasjonen og volumene justeres. En reaksjon med definerte konsentrasjoner av enzym og substrat kan gi ulike resultater avhengig av analysen volum. Hvis det er for mye enzym per brønn, kan vedheft av væsken faktisk bias resultatet.

For å vurdere Michaelis-Menten Kinetics anbefales det å utføre innledende eksperimenter i 100 μL, 200 μL og 300 μL-batcher for å finne den optimale kombinasjonen. Lignende aspekter gjelder forholdet mellom enzym-substrat konsentrasjoner for kinetisk analyser. For mye enzym per substrat eller for mye substrat per enzym sette systemet utenfor den lineære steady-state Michaelis rekkevidde. Første eksperimenter er nødvendig for å optimalisere disse forholdene. Eksemplarisk justering for humant FAHD1 (vill-type) protein er gitt i punkt 8, noe som resulterer i kinetisk diagrammer (som presentert i figur 5B, for eksempel).

For krystallisering en dråpe protein løsning er Pipet tert i sentrum av en dekkglass og blandet med en dråpe av krystallisering cocktail, som vanligvis består av en buffer (f. eks, Tris-HCl, HEPES) og en overilet (f. eks, polyetylen glykol, ammonium sulfat). En dråpe av hemmer løsning for co-krystallisering (for eksempel oksalat i denne protokollen) kan eventuelt brukes. Dekkglass blir deretter plassert opp-ned over en brønn av reservoar som inneholder krystallisering cocktail, tetting av brønnen luften tett ved hjelp av tetningsmasse olje (figur 6b). Ideelt sett skjer det ingen nedbør i løpet av begynnelsen av eksperimentet, noe som betyr at proteinet forblir i løsningen. Siden overilet konsentrasjon i reservoaret er høyere enn i drop, begynner drop å miste vann ved fordampning i atmosfæren av brønnen til likevekt med reservoaret er nådd. Spredningen av vann inn i reservoaret fører til en langsom volumreduksjon av dråpe som igjen fører til en økning av både, protein og overilet konsentrasjon i drop. Hvis protein løsningen når ønsket tilstand av super-metning og dermed meta-stabilitet, spontan kjernedannelse etterfulgt av krystallvekst kan forekomme. Å nå overmettet tilstand er en nødvendig, men ikke tilstrekkelig forutsetning for krystallisering. Krystallisering av proteiner trenger begge, gunstige termodynamisk og kinetisk forhold, og avhenger sterkt av de uforutsigbare egenskapene til proteinet som skal krystallisert22.

Modifikasjoner og feilsøking

Uttrykk for protein i E. coli kan være ineffektiv. Varierende IPTH-konsentrasjoner, uttrykks temperatur og forsterknings tid, for eksempel romtemperatur i flere timer eller i kaldt rom over natten, må kanskje testes for hvert nye protein for å finne optimale forhold. Nedbør av protein i inkludering organer er noen ganger observert for mer hydrofobe FAHD proteiner. I slike tilfeller, protein uttrykk i andre modellsystemer som insekt celler anbefales, som inkludering organer er mindre sannsynlighet for å danne26.

Som FAHD proteiner er følsomme for salt og kofaktor konsentrasjoner, samt pH, rensing strategier for ulike homologe, orthologues, og punkt mutasjon varianter kan variere i individuelle innstillinger. Den rensing metoder beskrevet er utviklet for vill-type menneske og mus FAHD1 protein. Konsentrasjoner av kjemikalier, slik som NaCl og imidazole, samt pH, må tilpasses for individuelle proteiner med et annet isoelectric punkt (pI). Også av notatet, ikke alle hans-Tagged protein kan binde godt til en ni-nTa harpiks. Hvis proteinbinding til ni-NTA kolonnen er ineffektiv, tilpassede konsentrasjoner av NaCl og imidazole, samt varierende pH-forhold i ni-NTA kjører buffer kan bidra til å forbedre kvaliteten på utfallet. Hvis ikke, hoppe over ni-NTA trinn og fortsetter til trinn av ioniske utveksling kromatografi kan også føre til en vellykket rensing strategi. Hvis et protein binder seg til ni-NTA kolonnen, men kan ikke eluert fra kolonnen, tillegg av noen mM EDTA kan bidra til å forstyrre ni2 + kompleks.

Når det gjelder prosessen med krystallisering, må det forstås at selv-organisering av store og komplekse protein molekyler i en vanlig periodisk gitter er en iboende usannsynlig prosess som avhenger tungt på vanskelig å kontrollere kinetisk parametre. Selv små endringer i oppsettet brukes for krystallisering kan dramatisk endre resultatet og ingen krystaller vil danne. Protein renhet er generelt av største betydning. Som en tommelfingerregel, en tungt overbelastet SDS-side gel bør ikke vise andre band. I tillegg kan rekkefølgen som trinnene utføres i, påvirke utfallet. Som et eksempel, for å sikre reproduserbarhet, er det ofte nødvendig å holde pipettering sekvensen det samme, så først legge til protein, og til slutt legge overilet til krystallisering dråpe (eller vice versa). Uansett hvilken metode som brukes, bør det holdes det samme når du prøver å reprodusere eller skalere opp eksperimenter. Hvis ingen krystaller observeres etter denne protokollen, kan den kjemiske overilet sammensetning, pH, dråpestørrelse og protein-til-utfelling ratio varieres i små trinn. Tålmodighet og konsekvente observasjoner av dråpene er av dyd.

Bemerkninger til katalysatorer av FAHD1

De presenterte metodene er utviklet spesielt for å oppnå FAHD1 proteiner av høy kvalitet. Denne aktiverte veksten av FAHD1 krystaller samt prosjektering av krystaller som inneholder FAHD1 complexed til en hemmer (oksalat, PDB: 6FOG). The X-ray strukturer gir en 3D-arkitektur av enzymet ' s katalysator. Disse resultatene etablere en omfattende beskrivelse av rester potensielt viktig for katalysatoren av dette spennende enzymet. FAHD1 ble først beskrevet for å kunne holde acylpyruvates (acetylpyruvate, fumarylpyruvate)11. Senere ble det funnet at FAHD1 opererer også som en decarboksilaza av oxaloacetate12. Selv om underlaget acylpyruvate og oxaloacetate er forskjellige kjemiske andeler, den kjemiske transformasjoner dele mechanistically den strategiske kløften av en felles singel C3-C4 Bond, energisk tilrettelagt hvis C3 -C4 Bond orbitale bo ortogonale til π-orbitale i C2-karbonyl15. En slik konformasjon tillater resonans stabilisering av C3-carbanion midlertidig dannet under kløften prosessen. Den FAHD1 underlag (oxaloacetate og acylpyruvates) er fleksible molekyler og kan eksistere i tautomeric (keto-ENOL) samt C2-hydrert skjemaer (figur 9a). Equilibria mellom de ulike artene bestemmes hovedsakelig av arten av buffer sammensetning som brukes, pH og tilstedeværelsen av metall ioner. I det følgende diskuterer vi hypothetic mekanistisk scenarier inspirert av analyse av X-ray krystallstrukturer som avslørte katalysatoren sentrum av FAHD1.

Figure 9
Figur 9 : Detaljer om den foreslåtte katalysatoren for menneskelig FAHD1.
(A) Oxaloacetate finnes i krystallinsk tilstand så vel som i nøytral løsning hovedsakelig i Z-ENOL skjema24. Men under Fysiologiske pH-forhold på 2-keto skjemaet er den dominerende representasjon25. (B) kjemisk skisse av hFAHD1 hulrom15 med mg-Bound oxaloacetate (venstre) og acylpyruvate (høyre, med R1 som økologisk hvile, den røde pilen betegner et nukleofil angrep av tilstøtende stabilisert vann molekyl) (se diskusjon). (C) sammenligning av favoriserte konformasjonen for C3-C4 kløft i decarboksilaza (b til C) og Hydrolase (b ' til c) mekanisme FAHD1: begge prosessene resultere i mg-complexed pyruvat-enolate (se diskusjon). Mellom produkter b og b forventes å bli stabilisert av Q109, som skissert i panel B (se diskusjon). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den Decarboksilaza aktivitet av FAHD1

Oxaloacetate finnes i krystallinsk tilstand så vel som i nøytral løsning hovedsakelig i Z-ENOL skjema24. Men det ble vist at under Fysiologiske pH-forhold (buffer forholdene ved pH 7,4) den 2-keto form er den dominerende representasjon av oxaloacetate25 (figur 9a), og at enolization er ikke en forutsetning for dekarboksylering27 . Av notatet, mg2 + ioner har ingen innflytelse på forholdet mellom de oxaloacetate artene ved en pH på 7,4 eller under28. Transponering av oxaloacetate keto form i katalysatoren sentrum av FAHD1 (guidet av den bundne oksalat i complexed enzymet (PDB: 6FOG15)) avdekket rester Q109 som en conformational regulator av bundet oxaloacetate15. Som beskrevet i en annen artikkel15, er hydrogen binding til Carbamoyl gruppe Q109 stabiliserer en oxaloacetate-konformasjon som følge av rotasjon rundt C2-C3 Bond (figur 9B, venstre panel). Som en konsekvens av denne rotasjonen, C3-c4 Bond (skal kløyvde) vedtar en nær ortogonale disposisjon i forhold til π-orbitale av C2-karbonyl (figur 9C). Karbondioksid kan frigis. Det primære produktet av denne prosessen vil være resonans stabilisert mg-enolate av pyruvat. Det er kjent fra undersøkelser av oxaloacetate-mg komplekser at enolate danner den mest stabile kompleks28,29. Forutsatt en sammenlignbar stabilitet for en mg-pyruvat enolate-kompleks kofaktor av FAHD1 kan bli blokkert, men lysin rester K123 kan protonere pyruvat-enolate i en likevekt for å forby tap av kofaktor15.

Den gitte tolkningen antyder pyruvat ENOL som en distinkt mellomliggende i katalysatoren-funksjonen til FAHD1. På dette trinnet i hypotetisk gjennomsnitt modellen, gir eksperimentelle data ikke noen ytterligere indikasjon på hvorfor det lukkede lokket skal åpne for å løsne produktet. Det kan utledes imidlertid at den foreslåtte mekanismen ser ut som et enzym hemming av produktet: krystallstrukturen avslører en bevart vann molekyl holdt i retningsbestemt orientering mot FAHD1 katalysatorer sentrum av rester H30 og E33 presentert i en kort Helix15, som er indusert ved ligand binding og lokk lukking. Hvis den primære ENOL ville bo i en likevekt med enolate, kan resonans stabilisert enolate være slukket å pyruvat av vann molekylet. Den resulterende hydroksyl ville være i stand til å fortrenge pyruvat fra mg-kofaktor hvorpå lokket ville åpne. Til slutt vil katalysatoren bli restaurert i mitokondrie miljø. I denne hypothetic scenario, ville hulrom vann molekylet operere som en syre, henholdsvis.

Hydrolase aktivitet av FAHD1

Hydrolase aktivitet av et enzym implisitt krever den mellomliggende dannelsen av en hydroksyl nukleofilen. Denne mekanismen er vanligvis funnet i kombinasjon med syre-base katalysator aktivitet. Overgangs staten reaksjonen må være forberedt via conformational kontroll av kritiske aminosyre side kjeder i hulrommet. I analogi til drøfting av decarboksilaza funksjon, enzym-bundet acylpyruvate i 2-keto form vil bli satt under conformational kontroll av hydrogen-binding av 4-karbonyl oksygen til Q109 (figur 9B, høyre panel). Krystallstrukturen av oksalat-bundet FAHD1 (PDB: 6FOG) avslører en bevart vann molekyl holdt i retningsbestemt orientering mot FAHD1 katalysator sentrum av rester H30 og E33 presentert i en kort Helix15. Den E33-H30 Dyad er kompetent til å deprotonate retningsbestemt posisjonert vann og den resulterende hydroksyl er i ideell disposisjon for å angripe 4-karbonyl av acylpyruvate presentert under conformational kontroll av Q10915.

Av notatet, en lignende mekanisme har blitt foreslått for FAH18. Angrep av hydroksyl nukleofilen forventes å resultere i en oxyanion Art, som er stabilisert på orbital kontrollerte C3-C4 Bond kløft (figur 9C). I denne modellen, C3-c4 Bond rotasjon (figur 9C) skjer etter nukleofil angrepet av dannet hydroksyl indikert i figur 9B (dvs. forbereder acylpyruvate for obligasjons kløften). De primære produktene vil være eddiksyre og mg-pyruvat enolate. I dette hypothetic scenariet kan eddiksyre slukke ENOL til pyruvat og deretter bistå forskyvning av produktet. Over en pH på 7,5 og i nærvær av mg ioner, acylpyruvates finnes i en likevekt mellom keto-og ENOL-former, sistnevnte i liten preferanse30. Mest sannsynlig begge formene er i stand til å binde til kofaktor av FAHD1 under påfølgende lokk lukking. Behandling av enolic acylpyruvate underlag av enzymet er hemmet på grunn av den flate strukturen av ENOL-formen. C3-c4 kløft vil resultere i en vinyliske carbanion uten resonans stabilisering.

Derfor foreslår vi en katalysator ketonization skritt for å forberede for angrep av hydroksyl nukleofilen på acyl karbonyl. Denne prosessen av ketonization, men ville kreve kontroll over Proton transpositions av FAHD1 rester, som ville attributt en iboende isomerase aktivitet til FAHD1. Det er rapportert at Surhet av mg-bundet ENOL hydrogen avslører en 10000-fold økning i forhold til un-complexed form28. En deprotonering av mg bundet ENOL-form vil være gjennomførbart ved un-protonerte K123. Deprotonering av K123 kan bli assistert av carboxylat av D102. Et hydrogen bånd nettverk dannet av rester D102-K47-K123 kunne operere som den nødvendige Proton relé i katalysatoren sentrum av FAHD115. En slik dannet mellomliggende enolate kan da bli slukket av en E33-H30-H20 triaden under ketonization av underlaget15. Den 2-keto form ville komme under conformational kontroll av Q109, og samtidig dannet hydroksyl ville angripe acyl karbonyl. Sammendraget diskusjonen innebærer en kontroll av FAHD1 om et vann molekyl for å bytte mellom syre og base gjennom samspillet mellom hulrom-forming rester.

Future søknader eller retninger av metoden

Fremtidige anvendelser av metodene som er beskrevet her er mange. En overflod av prokaryote medlemmer av FAH overfamilie fremdeles venter funksjonell karakterisering. Selv tilgjengelig informasjon om katalysatorer av kjente FAH overfamilie medlemmer er knappe, og i de fleste tilfeller, basert på teoretiske forutsetninger snarere enn eksperimentelle data. Anvendelse av metodene som er beskrevet her for prokaryote FAH overfamilie medlemmer avhenger av spesifikke forskningsinteresser i bakteriologi. På den annen side, den siste demonstrasjonen som eukaryote FAH overfamilie medlemmer spille viktige roller i ulike cellulære rom (f. eks stoffer g. mitokondrier) fremhever behovet for å bedre karakterisere disse proteinene (tre av dem har vært identifisert så langt), spesielt fordi dagens data tyder på at noen uncharacterized proteiner kan utføre ulike funksjoner i sammenheng med mitokondrie biologi, aldring forskning, og kreftforskning. Det er foreslått at full molekylær og fysiologisk karakterisering av disse eukaryote FAH overfamilie medlemmer kan gi viktig innsikt i viktige felt av moderne forskning i biomedisinsk sektor. Mer forskning på mekanismer for FAHD1 (og beslektede enzymer) er nødvendig for å bedre forstå mekanismer underliggende bi-funksjonaliteten til FAHD1, som fortsatt ikke er fullt avklart. Ytterligere studier med FAHD1 mutanter, NMR-undersøkelser, og strukturelle studier på inhibitor komplekser kan bidra til å løse de sanne mekanistisk scenarier som FAHD1 synes å være kompetent. Videre, dataassistert design av ENOL etterligner stand til å binde til mg-kofaktor vil til slutt føre til potente hemmere av FAHD1.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre og erklære ingen konkurrerende finansielle interesser. H. G. er CEOCSO på MoleculeCrafting. klemmer EU og gitt acylpyruvates for denne studien via Custom syntese. Arbeid i P. J. D. s Lab ble støttet av den østerrikske Science Fund (FWF): prosjektnummer P 31582-B26. Publikasjons Gebyrene for dette manuskriptet har delvis blitt dekket av det østerrikske vitenskaps fondet (FWF) underprosjekt nummer P 31582-B26. A. N. og B. R. støttes av det østerrikske vitenskaps fondet (FWF) under prosjektet P28395-B26.

Acknowledgments

Forfatterne er svært takknemlig for ekspert teknisk assistanse av Annabella Pittl og pilot metoden utvikling av Haymo Pircher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) pLysS competent E. coli Promega L1195 High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site
pET E. coli T7 Expression Vectors MERCK - http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
15 mL Falcon VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon VWR 734-0448 centrifugal tubes
PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 30622-758 VIS transparent cuvettes
UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro VWR 47727-024 UV/VIS transparent cuvettes
isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ROTH 2316 chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system
imidazole ROTH X998 chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin
Glass Econo-Column Columns Bio-Rad - http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod
chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration
kanamycin Sigma-Aldrich 60615 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration
ampicillin Sigma-Aldrich A1593 antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration
Ultra-15, MWCO 10 kDa Sigma-Aldrich Z706345 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT
Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units Sigma-Aldrich Z677108 centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2
oxaloacetic acid Sigma-Aldrich O4126 TCA metabolite
sodium oxlalate Sigma-Aldrich 71800 a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes
Dialysis tubing cellulose membrane Sigma-Aldrich D9277 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable
Ni-NTA agarose Thermo-Fischer R90101 a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
HiTrap Phenyl HP column GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608
HiLoad Superdex column 75 pg (G75) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800
HiLoad Superdex column 200 pg (G200) GE Healthcare Life Sciences - https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283
TECAN microplate reader TECAN Life Sciences - https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers
acetylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
benzoylpyruvate MoleculeCrafting.HuGs e.U. - custom synthesis
VDX™ plate (24 wells) Hampton HR3-142 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
paraffin oil Hampton HR3-411 used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
coverslips (22 mm) Karl Hecht KG 14043 coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion
Luria broth (LB) medium self-prepared - a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar
NZCYM medium self-prepared - a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4
Luria broth (LB) agarose plates self-prepared - autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/
Ni-NTA running buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Ni-NTA elution buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
HIC running buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7
HIC running buffer AS self-prepared - HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0
Mono S low salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono S high salt buffer self-prepared - 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins
Mono Q low salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0
Mono Q high salt buffer self-prepared - 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0
G75 / G200 running buffer self-prepared - 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4
enzyme assay buffer self-prepared - 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2
protein crystallization buffer self-prepared - G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT
reservoir solution for crystallization self-prepared - 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
  2. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
  3. Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).
  4. Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. Biochemistry. 55, 2632 (2016).
  5. Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).
  6. Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
  7. Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
  8. Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).
  9. Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
  10. Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
  11. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
  12. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
  13. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  14. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  15. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
  16. Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
  17. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
  18. Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
  19. Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714 (2018).
  20. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
  21. Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
  22. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
  23. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  24. Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
  25. Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
  26. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
  27. Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
  28. Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
  29. Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
  30. Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).

Tags

Biokjemi FAH FAHD FAHD1 ODx ApH Hydrolase decarboksilaza oxaloacetate acetylpyruvate fumarylpyruvate acylpyruvate oksalat pyruvat MiDAS
Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M.,… More

Weiss, A. K. H., Holzknecht, M., Cappuccio, E., Dorigatti, I., Kreidl, K., Naschberger, A., Rupp, B., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins. J. Vis. Exp. (148), e59729, doi:10.3791/59729 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter