Summary
Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de digestión en la membrana para la preparación de muestras para espectrometría de masas. Esta técnica facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína.
Abstract
Numerosas proteínas intracelulares interactúan físicamente de acuerdo con sus circunstancias intracelulares y extracelulares. De hecho, las funciones celulares dependen en gran medida de las interacciones proteína-proteína intracelular. Por lo tanto, la investigación sobre estas interacciones es indispensable para facilitar la comprensión de los procesos fisiológicos. La co-precipitación de proteínas asociadas, seguida de un análisis de espectrometría de masas (EM), permite la identificación de nuevas interacciones proteicas. En este estudio, hemos proporcionado detalles de la novedosa técnica de la cromatografía inmunoprecipitada-líquido (LC)-MS/MS combinado con la digestión en la membrana para el análisis de interacciones proteína-proteína. Esta técnica es adecuada para inmunoprecipitados crudos y puede mejorar el rendimiento de los análisis proteómicos. Las proteínas recombinantes etiquetadas se precipitaron utilizando anticuerpos específicos; a continuación, los inmunoprecipitados borrados en piezas de membrana de difluoruro de polivinilideno fueron sometidos a alquilación reductiva. Después de la tripinización, los residuos de proteínas digeridas se analizaron utilizando LC-MS/MS. Usando esta técnica, pudimos identificar varias proteínas asociadas candidatas. Por lo tanto, este método es conveniente y útil para la caracterización de nuevas interacciones proteína-proteína.
Introduction
Aunque las proteínas desempeñan un papel constitutivo en los organismos vivos, se sintetizan, procesan y degradan continuamente en el entorno intracelular. Además, las proteínas intracelulares interactúan con frecuencia física y bioquímicamente, lo que afecta a la función de uno o ambos1,2,3. Por ejemplo, la unión directa del homólogo proteico asociado al esferoctico CWC22 con el factor de inicio de latraslación eucariota 4A3 (eIF4A3) es necesaria para el montaje del complejo de unión de exón 4. En consonancia con esto, un mutante eIF4A3 que carece de afinidad por CWC22 no facilita el empalme de ARNm impulsado por el complejo de cruces de exón4. Por lo tanto, el estudio de las interacciones proteicas es crucial para la comprensión precisa de la regulación fisiológica, así como de las funciones celulares.
Los avances recientes en espectrometría de masas (EM) se han aplicado al análisis exhaustivo de las interacciones proteína-proteína. Por ejemplo, la co-precipitación de proteínas endógenas o proteínas etiquetadas introducidas exógenamente con sus proteínas asociadas, seguida según el análisis de la EP, permite la identificación de nuevas interacciones proteicas5. Sin embargo, uno de los principales cuellos de botella del análisis de la SM/MS es la mala recuperación de los resúmenes trípticos de las muestras de proteínas. Para realizar análisis proteómicos en los lysatos celulares, generalmente se emplean técnicas de digestión en gel y en membrana para preparar muestras de MS/MS. Hemos comparado previamente un procedimiento de digestión en gel con una técnica de digestión en la membrana6, y hemos demostrado que este último se asoció con una mejor cobertura de secuencia. La membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) puede ser adecuada para este fin, ya que es mecánicamente robusta y resistente a altas concentraciones de disolventes orgánicos7,8, lo que permite la digestión enzimática de inmovilizados proteínas en presencia de 80% acetonitrilo9. Además, la inmovilización en una membrana puede inducir cambios de conformación en las proteínas diana, lo que conduce a mejoras en la eficiencia de la digestión tríptica10. En consecuencia, en este artículo, hemos descrito el uso del análisis de inmunoprecipitación-LC/MS/MS de interacciones proteicas utilizando una técnica de digestión en la membrana. Este sencillo método facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína incluso en laboratorios no especializados.
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Protocol
1. Inmunoprecipitación
NOTA: Utilizamos tampón de lisis dodecilo no sódico (SDS) y elución de citrato, como se describe en las secciones siguientes. Sin embargo, el uso de una técnica alternativa de inmunoprecipitación interna también puede ser aplicable para preparar muestras LC-MS/MS.
- Células cultivadas transfectos con vectores que codifican una etiqueta de epítopos solo o una proteína de fusión. Para adquirir datos representativos, transfiera células J774 (1 x 106) con vectores que codifican proteína fluorescente verde (GFP) solo o Capn6 fusionado con GFP (gen calpain-6) utilizando liposomas catiónicos.
- Conjugar anticuerpos a cuentas magnéticas.
- Para ello, mezcle el anticuerpo anti-GFP (2 l/reacción) con perlas magnéticas (25 l/reacción) en 500 l de tampón de fosfato de citrato (24,5 mM de ácido cítrico, fosfato sódico dibásico de 51,7 ml; pH 5,0) en un tubo de ensayo de 1,5 ml.
- Gire la mezcla a 50 rpm durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, lave las perlas conjugadas con IgG tres veces con tampón de fosfato de citrato que contenga un monolaurate de polioxietileno (20%) de polioxietileno (20).
- Lise las células transinfectadas utilizando un tampón de lisis adecuado. Para la adquisición de datos representativos, licela las células transtramperosas durante 30 minutos en hielo en 400 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% de poli(oxyethelene) octilfenil éter) que contiene 40 mmol/L de flúor, 50 g/mL de éter de leupetina, 50 mL de aprotinin, ortovanato sódico de 200 omol/L y ácido tetraacético de etilenglicol de 1 mM (EGTA) en tubos de ensayo de 1,5 ml 24 h después de la transfectuación.
- Limpie el lisado centrifugando a 15.000 x g durante 5 min y recoja el sobrenadante.
- Prelimpiar el lisado. Añadir perlas magnéticas sin etiquetar (25 l/reacción) en un tubo de ensayo de 1,5 ml. Lave las perlas tres veces con 500 ml de tampón de fosfato de citrato. Después de la eliminación del tampón de fosfato de citrato en el lavado final, agregue el lisato celular sobre las cuentas magnéticas. Gire la mezcla utilizando un rotador de 50 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo de ensayo en un soporte magnético durante 5 minutos para la separación magnética y recoja el lisado celular. Se recomienda el uso del soporte magnético designado por el fabricante.
- Une las proteínas diana a las cuentas conjugadas. Coloque las perlas conjugadas con jugadas de inmunoglobulina (Ig)G en un soporte magnético durante 5 minutos para la separación magnética, deseche el tampón de citrato y luego agregue el lisado celular a las cuentas separadas.
- Gire la mezcla a 50 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
- Separe las proteínas diana de las proteínas libres no objetivo. Lave las perlas tres veces con 500 ml de tampón de fosfato de citrato que contiene un monolaurate de polioxietileno al 0,1% (20). Después del lavado final, añadir 30 l de tampón de citrato (pH 2-3), e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para eluir las proteínas diana.
NOTA: Si la recuperación de la inmunoprecipitación es insuficiente, el uso de etiquetas de epítopos alternativas, como FLAG o HIS, puede mejorar la eficiencia. Si la eficiencia de la elución es insuficiente, el uso de otros eluantes, como una solución basada en SDS, puede mejorar la eficiencia.
2. Digestión en la membrana de las proteínas
NOTA: El uso de materiales y equipos libres de proteínas es necesario para evitar la contaminación con proteínas exógenas. Además, se recomienda que el operador use una máscara quirúrgica y guantes para evitar la contaminación por proteínas humanas.
- Cortar las membranas PVDF en trozos de 3 mm x 3 mm utilizando tijeras quirúrgicas que han sido limpiadas con metanol y secas inmediatamente antes de su uso.
- Añadir de 2 a 5 ml de etanol en las piezas de membrana PVDF en papel de aluminio limpio.
- Antes de que se sequen por completo, agregue el eluant (2-5 l cada uno, 4-6 piezas por muestra) en las membranas fotovoltaicas hidrófilas, y luego seque al aire las membranas hasta que la superficie de la membrana se vuelva mate. Las membranas secas se pueden almacenar a 4 oC.
- Transfiera todas las membranas en tubos de plástico de 1,5 ml, agregue 20-30 ml de etanol para hacer las membranas hidrófilas y, a continuación, retire el etanol con una pipeta.
- Antes de que la membrana se seque por completo, añadir 200 ml de solución de reacción basada en ditiothreitol (TDT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM de TDT y 20% acetonitrilo) e incubarla a 56 oC durante 1 h.
- Sustituya la solución de reacción por 300 ml de solución de yodoacetamida (80 mM NH4HCO3,55 mM de yodoacetamida y 20% acetonitrilo), e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lavar las membranas dos veces con 1 ml de agua destilada y una vez con 1 ml de acetonitrilo al 2% mediante mezcla de vórtice para >10 s.
- Disolver la trippsina liofilizada de grado MS (Tablade materiales)directamente en la solución de reacción (30 mM NH4HCO3 que contiene 70% de acetonitrilo). Añadir 100 l de la solución de reacción que contenga 1 g de tripsina (Tablade materiales)(30 mM NH4HCO3 que contenga 70% de acetonitrilo) e incubar a 37 oC durante la noche.
- Transfiera la solución de reacción que contiene los digeridos trípticos a un tubo de ensayo limpio de 1,5 ml utilizando una pipeta.
- Añadir 100 oC de solución de lavado (70% acetonitrilo/1% ácido trifluoroacético) a la membrana e incubarla a 60 oC durante 2 h. Recoger la solución de lavado y mezclarla con la solución de reacción. Añadir otros 100 l de solución de lavado a la membrana y sonicarla durante 10 minutos. A continuación, recoja la solución de lavado y mezcle con la solución de reacción.
- Cubra el tubo de ensayo con un pedazo de película de laboratorio y haga un par de pequeños agujeros con una aguja. Seque la solución con un concentrador de vacío.
- Disolver el residuo en 10 s de ácido fórmico al 0,2%. Después de la centrifugación (12.000 g , 3 minutos a temperatura ambiente), transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra.
NOTA: Los lavados son los pasos críticos de esta sección. Durante la digestión de proteínas en la membrana, el lavado de las membranas que contienen las proteínas inmovilizadas después de la reducción y alquilación con agua destilada, seguido de un 2% de acetonitrilo, durante más de 10 segundos cada una, es fundamental para la eliminación de los reactivos.
3. Análisis de ionización LC-electrospray (ESI)-MS/MS
- Activar un instrumento ESI-MS/MS (Tablade materiales)junto con un sistema HPLC nano-LC (Tablade materiales). Vincular una columna previa (Tabla de materiales) y una columna analítica (Tabla de materiales).
- Antes del análisis, calibrar el espectrómetro de masas utilizando digeridos trípticos de albúmina sérica bovina disuelta en 0,2% de ácido fórmico, que proporciona péptidos estándar.
- Analizar las muestras utilizando el modo iónico positivo y un rango de masa de 400–1,250 m/z; luego adquirir hasta 10 espectros MS/MS (100 ms cada uno) con un rango de masa de 100–1.600 m/z y un gradiente lineal de 2%–80% de acetonitrilo y 0.2% de ácido fórmico durante 80 min a un caudal de 300 nL/min.
- Analizar los datos de salida utilizando software para la identificación de proteínas (Tabla de Materiales) para identificar las proteínas asociadas candidatas. Para la identificación positiva de una proteína candidata, se requiere la detección de al menos un fragmento de péptido de alta fidelidad (> 95% de fidelidad).
- Omita las proteínas que se precipitan de manera similar en los lysatos que expresan GFP (transfección de vector que expresa una etiqueta GFP solamente) de la lista de proteínas candidatas.
NOTA: Si se identifican pocas proteínas en el análisis de la base de datos, la modificación de las condiciones de adquisición de EM/MS (por ejemplo, cambiar el tiempo de 100 ms cada una a 50 ms cada una) puede aumentar el número de proteínas identificadas.
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Representative Results
Mediante el procedimiento descrito anteriormente, se analizaron los inmunoprecipitantes utilizando LC-MS/MS (Figura1). Después de la exclusión de proteínas derivadas exógenamente (proteínas de otras especies e IgG), se identificaron 17 proteínas en inmunoprecipitantes asociados con calpato-6 (Tabla 1) y se identificaron 15 proteínas en inmunoprecipitantes asociados a la PTF ( Tabla 2). De las proteínas asociadas al calpato-6 y al GFP, se identificaron 11 en ambos inmunoprecipitantes (Figura2). Una vez que estos y el calpain-6 en sí fueron excluidos, cinco proteínas candidatas asociadas al calpain-6 permanecieron: complementar la subunidad C 1q subcomponente C, queratina tipo II citoesquelética 8, proteína de unión a IgE, translocase 1 ADP/ATP y ubiquitina.
Figura 1. Esquema para la técnica de digestión en la membrana
Los lisados celulares se precipitaron con perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos. El eluante de la inmunoprecipitación fue borrado en trozos de membrana PVDF. Posteriormente, las membranas fueron tratadas con reactivos para la alquilación reductiva, y luego incubadas con trippsina. La solución de reacción se analizó utilizando LC-MS/MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Resumen de los datos representativos
Se identificaron diecisiete proteínas en el inmunoprecipitante asociado al calpain-6 y se detectaron 15 proteínas en el inmunoprecipitante asociado a la PTF. De ellas, se identificaron 11 proteínas en ambos inmunoprecipitantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Adhesión | Péptidos(95%) | %Cov |
| Actin, citoplasma 2 | sp á P63260 ACTG | 5 | 18.4 |
| Actin, músculo liso aórtico | sp á P62737 ACTA | 5 | 18.57 |
| Actin, citoplasma 1 | sp á P60710 ACTB | 5 | 18.41 |
| Actin, músculo esquelético alfa | sp á P68134 Actos | 5 | 13.53 |
| Actin, músculo alfa cardíaco 1 | sp á P68033 ACTC | 5 | 13.53 |
| Actin, músculo liso gamma-entérico | sp á P63268 Acth | 5 | 13.56 |
| Factor de alargamiento 1-alfa 1 | sp á P10126 EF1A1 | 3 | 33.33 |
| Factor de alargamiento 1-alfa 2 | sp á P62631 EF1A2 | 3 | 16.2 |
| Queratina, citoesquelético tipo II 8 | sp á P11679 K2C8 | 3 | 22.65 |
| Complemento Subcomponente C1q Subunidad C | sp á Q02105 C1QC | 2 | 8.94 |
| Proteína de unión a IgE | sp á P03975 IGEB | 2 | 21.72 |
| Calpain-6 | sp á O35646 CAN6 | 1 | 15.91 |
| Translocase ADP/ATP 2 | sp á P51881 ADT2 | 1 | 27.52 |
| Translocase ADP/ATP 1 | sp á P48962 ADT1 | 1 | 19.13 |
| Ubiquitina | sp á P62991 UBIQ | 1 | 40.79 |
| Factor de transcripción relacionado con Runt 3 | sp á Q64131 RUNX3 | 1 | 15.89 |
| Isoforma 2 del factor de transcripción relacionado con Runt 3 | sp á Q64131-2 RUNX3 | 1 | 13 |
| "Péptidos (95%)" indica el número de péptidos identificados con una puntuación de fidelidad > 95% en los datos de MS/MS. "%Cov" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos identificados en todos los péptidos (con > fidelidad del 95%) en relación con el número total de residuos de aminoácidos que constituyen la proteína correspondiente. Para mejorar la claridad, no se muestran las proteínas exógenas (proteínas de otras especies e IgG), las proteínas ribosomales y las histonas. | |||
Tabla 1. Proteínas asociadas a Calpain-6
| Nombre | Adhesión | Péptidos(95%) | %Cov |
| Factor de alargamiento 1-alfa 1 | sp á P10126 EF1A1 | 3 | 24.24 |
| Factor de alargamiento 1-alfa 2 | sp á P62631 EF1A2 | 3 | 24.41 |
| Actin, músculo esquelético alfa | sp á P68134 Actos | 3 | 13.53 |
| Actin, músculo alfa cardíaco 1 | sp á P68033 ACTC | 3 | 13.53 |
| Actin, músculo liso gamma-entérico | sp á P63268 Acth | 3 | 13.56 |
| Actin, citoplasma 2 | sp á P63260 ACTG | 3 | 13.6 |
| Actin, músculo liso aórtico | sp á P62737 ACTA | 3 | 13.53 |
| Actin, citoplasma 1 | sp á P60710 ACTB | 3 | 13.6 |
| Translocase ADP/ATP 2 | sp á P51881 ADT2 | 2 | 25.5 |
| rRNA 2'-O-metiltransferasa fibrilina | sp á P35550 FBRL | 2 | 14.37 |
| Prohibitin | sp á P67778 Phb | 1 | 9.19 |
| Ribonucleoproteína nuclear heterogénea U | sp á Q8VEK3 HNRPU | 1 | 10.63 |
| Factor de transcripción relacionado con Runt 3 | sp á Q64131 RUNX3 | 1 | 39.12 |
| Isoforma 2 del factor de transcripción relacionado con Runt 3 | sp á Q64131-2 RUNX3 | 1 | 26 |
| Factor de alargamiento 1-gamma | sp á Q9D8N0 EF1G | 1 | 12.36 |
| "Péptidos (95%)" indica el número de péptidos identificados con una puntuación de fidelidad > 95% en los datos de MS/MS. "%Cov" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos identificados en todos los péptidos (con > fidelidad del 95%) en relación con el número total de residuos de aminoácidos que constituyen la proteína correspondiente. Para mejorar la claridad, no se muestran las proteínas exógenas (proteínas de otras especies e IgG), las proteínas ribosomales y las histonas. | |||
Cuadro 2. Proteínas asociadas a la PFP
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Discussion
Hemos descrito previamente un análisis de las modificaciones oxidativas de la apolipoproteína B-100 en lipoproteínas oxidadas de baja densidad utilizando LC-MS/MS precedida por una técnica de digestión en membrana6. En el presente estudio, combinamos esta técnica con la inmunoprecipitación y hemos identificado varias proteínas asociadas al calpain-6. Esta novedosa técnica representa un método conveniente de detección de proteínas asociadas a los candidatos. Calpain-6 es un miembro no proteolítico de la familia proteolítica de calpain11 que al parecer ha modificado las funciones celulares a través de sus interacciones proteína-proteína12,13. Utilizando una técnica de digestión en la membrana, hemos identificado previamente otras proteínas asociadas al calpain-6 que emplean una configuración diferente de la EM12. Por lo tanto, recomendamos probar varias condiciones de la EP para maximizar el número de candidatos identificados. Por la misma razón, la evaluación de las condiciones de inmunoprecipitación, como los tipos de etiqueta de epítopo, detergente y solución de elución utilizada, es importante para obtener resultados óptimos.
En el presente estudio, identificamos 11 proteínas en inmunoprecipitantes asociados a calpain-6 y GFP. La mayoría de las proteínas superpuestas eran isotipos de actina, y la contaminación con proteínas citoesqueléticas de actina es común en los análisis de las interacciones celulares proteína-proteína porque los niveles de expresión de estas proteínas son muy altos. Por lo tanto, estos candidatos deben omitirse de un análisis ulterior. Además, se detectaron factores de alargamiento en ambos inmunoprecipitantes. Regulan la velocidad y fidelidad de la síntesis de proteínas y afectan al plegado de proteínas14,y, por lo tanto, la co-inmunoprecipitación de los factores de elongación no es sorprendente. Estas proteínas también deben omitirse de una evaluación adicional.
Los inmunoprecipitantes pueden someterse a alquilación reductiva y digestión enzimática directamente en la solución de elución15,y este método de digestión en solución también se puede aplicar para la preparación de muestras para la SM/SM. Sin embargo, consideramos que el uso de la digestión en la membrana tiene ventajas considerables sobre la digestión en la solución. La membrana PVDF sirve como un andamio para la posterior alquilación reductiva y digestión enzimática, lo que significa que los disolventes necesarios para estos procesos pueden ser reemplazados fácilmente. Por lo tanto, es posible utilizar una variedad de soluciones de elución para la inmunoprecipitación. Por el contrario, para la digestión en la solución, puede ser difícil utilizar soluciones de elución de pH baja o basadas en SDS, ya que la actividad de la proteasa puede estar limitada en tales condiciones. Además, la inmovilización de las proteínas diana puede facilitar el posterior procedimiento de lavado. Por lo tanto, la digestión en la membrana es muy adecuada para la preparación de inmunoprecipitantes para el análisis de LA MS/MS. Un número limitado de proteasas puede ser apropiado para este protocolo. Hasta ahora, sólo Lysyl-C, aparte de la trippsina, es al parecer activo en presencia de hasta 80% acetonitrilo6,9,10,15.
Nuestra técnica de digestión en la membrana es adecuada para la identificación de proteínas en una pequeña cantidad de inmunoprecipitante con un límite de detección altamente sensible. Sin embargo, debe recordarse que la eficiencia de detección de una proteína diana depende de la cantidad presente. Las proteínas que están presentes en grandes cantidades se detectan preferentemente y pueden evitar que otras proteínas presentes en cantidades más pequeñas sean detectadas por la EM. Sin embargo, en circunstancias normales se detectan numerosas proteínas mediante el análisis LC-MS/MS, y se deben utilizar otros ensayos para aclarar cuáles de las proteínas candidatas son de importancia biológica adecuada.
En este estudio, hemos evaluado una técnica de digestión en la membrana para el análisis de inmunoprecipitantes. Un método tan cómodo y completo para el análisis de las interacciones proteína-proteína debe ser ampliamente aplicable para mejorar el rendimiento de futuros análisis proteómicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI Grant Number 17K09869 (a AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), una beca de investigación de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation y una beca de investigación de Suzuken Memorial Foundation (todo a TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
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