Summary
यहाँ, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूने की तैयारी के लिए एक पर झिल्ली पाचन तकनीक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस तकनीक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के सुविधाजनक विश्लेषण की सुविधा.
Abstract
कई इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन शारीरिक रूप से उनके इंट्रासेल्यूलर और एक्स्ट्रासेल्यूलर परिस्थितियों के अनुसार बातचीत करते हैं। वास्तव में, सेलुलर कार्य काफी हद तक intracellular प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन बातचीत पर निर्भर करते हैं. इसलिए, इन बातचीत के बारे में अनुसंधान शारीरिक प्रक्रियाओं की समझ को सुविधाजनक बनाने के लिए अपरिहार्य है. संबद्ध प्रोटीन की सह-वर्षा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के बाद, उपन्यास प्रोटीन बातचीत की पहचान सक्षम बनाता है. इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए ऑन-मेम्ब्रेन पाचन के साथ संयुक्त इम्यूनोवेसिशन-तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी)-एमएस/एमएस विश्लेषण की उपन्यास तकनीक का विवरण प्रदान किया है। यह तकनीक कच्चे इम्यूनोप्रिसिटेंट के लिए उपयुक्त है और प्रोटीओमिक विश्लेषणों के थ्रूपुट में सुधार कर सकती है। टैग की गईं पुनः संयोजक प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर वेग थे; अगले, इम्यूनोप्रिसिटिडेंट्स ने पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड झिल्ली के टुकड़ों पर दाग लगाया था, जो रिडक्टिव ऐल्किलेशन के अधीन थे। trypsinization के बाद, पचा प्रोटीन अवशेषों LC-MS/MS का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. इस तकनीक का उपयोग कर, हम कई जुड़े प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम थे. इस प्रकार, इस विधि सुविधाजनक और उपन्यास प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की विशेषता के लिए उपयोगी है.
Introduction
हालांकि प्रोटीन जीवित जीवों में संरचक भूमिका निभाते हैं, वे लगातार संश्लेषित कर रहे हैं, संसाधित, और intracellular वातावरण में अपमानित. इसके अलावा, इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन अक्सर शारीरिक और जैव रासायनिक रूप से बातचीत करते हैं, जो एक या दोनों1,2,3के कार्य को प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, यूकैरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4A3 (eIF4A3) के साथ spliceosome-संबद्ध प्रोटीन समलॉग CWC22 का प्रत्यक्ष बंधन एक्सोन जंक्शन परिसर4की विधानसभा के लिए आवश्यक है। इस के साथ संगत, एक eIF4A3 उत्परिवर्ती कि CWC22 के लिए आत्मीयता का अभाव है एक्सन जंक्शन जटिल संचालित MRNA splicing4की सुविधा में विफल रहता है. इस प्रकार, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन शारीरिक विनियमन की सटीक समझ के साथ ही सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है.
मास स्पेक्ट्रोमेट्री में हाल ही में अग्रिम (एमएस) प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के व्यापक विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, अंतर्जात प्रोटीन या exogenously उनके जुड़े प्रोटीन के साथ टैग प्रोटीन की सह वर्षा, एमएस विश्लेषण के बाद, उपन्यास प्रोटीन बातचीत की पहचान5सक्षम बनाता है. तथापि, एमएस/एमएस विश्लेषण की एक प्रमुख बाधा प्रोटीन नमूनों के ट्रिप्टिक डाइजेस्ट से खराब वसूली है। सेल lysates पर प्रोटीओमिक विश्लेषण के संचालन के लिए, इन-जेल और पर झिल्ली पाचन तकनीक आम तौर पर एमएस / हम पहले एक पर झिल्ली पाचन तकनीक6के साथ एक में जेल पाचन प्रक्रिया की तुलना में है, और पता चला है कि बाद बेहतर अनुक्रम कवरेज के साथ जुड़ा हुआ था. Polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त हो सकता है क्योंकि यह यंत्रवत् मजबूत और कार्बनिक सॉल्वैंट्स7,8केउच्च सांद्रता के लिए प्रतिरोधी है , स्थिर के एंजाइमी पाचन की अनुमति 80% ऐसीटोनीट्रिल9की उपस्थिति में प्रोटीन | इसके अलावा, एक झिल्ली पर स्थिरीकरण लक्ष्य प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन पैदा कर सकता है, जिससे ट्रिप् टिक पाचन दक्षता10में सुधार होता है। तदनुसार, इस लेख में, हमने एक ऑन-मेम्ब्रेन पाचन तकनीक का उपयोग करके प्रोटीन इंटरैक्शन के इम्यूनोप्रीफिएशन-एलसी/एमएस/एमएस विश्लेषण के उपयोग का वर्णन किया है। यह सरल विधि भी गैर-विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के सुविधाजनक विश्लेषण की सुविधा.
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Protocol
1. इम्यूनोसेवेज
नोट: हम गैर सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) lysis बफर और साइट्रेट elution, निम्नलिखित वर्गों में वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया. तथापि, एलसी-एमएस/एमएस नमूने तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक इन-हाउस इम्यूनोप्रीसेप्शन तकनीक का उपयोग भी लागू हो सकता है।
- एक epitope टैग अकेले या एक संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग वैक्टर के साथ transfect सुसंस्कृत कोशिकाओं. प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए, हस्तांतरण J774 कोशिकाओं (1 x 106) वैक्टर के साथ हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग (GFP) अकेले या GFP-fused Capn6 (कैलपाइन-6 जीन) धनाहारी liposomes का उपयोग कर.
- चुंबकीय मोती के लिए संयुग्मी एंटीबॉडी.
- इस प्रयोजन के लिए, 1.5 एमएल परीक्षण ट्यूब में 500 0 0 0 उग्राउफ्ट बफर (24.5 एमएम साइट्रिक एसिड, 51.7 एमएम डाइबेसिक फॉस्फेट; पीएच 5.0) में चुंबकीय मोती (25 डिग्री सेल्सियस/प्रतिक्रिया) के साथ एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (2 डिग्री एल/प्रतिक्रिया) मिलाएं।
- कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 50 आरपीएम पर मिश्रण घुमाएँ। फिर, आईजी-संयोजित मोती को साइट्रेट फॉस्फेट बफर के साथ तीन बार धोएं जिसमें 0.1% पॉलीऑक्सीएथिलीन (20) sorbitan मोनोलेरेट होता है।
- एक उपयुक्त lysis बफर का उपयोग कर transfected कोशिकाओं Lyse. प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए, 400 डिग्री सेल्सियस में बर्फ पर 30 मिनट के लिए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को lysis बफर (50 m Tris-HCl; pH 7.5, 120 m NaCl, 0.5% poly(oxyethelene) ऑक्टिलफेनिल ईथर, 40 डिग्री ललए फेनिलफिंइल फ्लोरो, 50/ एमएल एप्रोटिनिन, 200 [मोल/एल सोडियम ऑर्थोवनडेट, और 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल टेट्राऐसीटिक एसिड (ईजीटीए) में 1.5 एमएल टेस्ट ट्यूब 24 एच ट्रांसफेक्शन के बाद।
- 5 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर centrifuging द्वारा lysate साफ़ करें और supernatant इकट्ठा.
- lysate को स्पष्ट करें। 1.5 एमएल-परीक्षण ट्यूब में बिना लेबल वाले चुंबकीय मोती (25 डिग्री सेल्सियस/प्रतिक्रिया) जोड़ें। मोतियों को 500 डिग्री सेल्सियस से तीन बार सिक्रेट फॉस्फेट बफर से धोएं। अंतिम धोने में साइट्रेट फॉस्फेट बफर को हटाने के बाद, चुंबकीय मोती पर सेल lysate जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 50 आरपीएम पर रोटेटर का उपयोग कर मिश्रण घुमाएँ।
- चुंबकीय पृथक्करण के लिए 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर पर परीक्षण ट्यूब प्लेस, और सेल lysate इकट्ठा. निर्माता द्वारा नामित चुंबकीय स्टैंड के उपयोग की सिफारिश की है.
- समंजक ोंको लक्ष्य प्रोटीन को बांधें. चुंबकीय जुदाई के लिए 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजी) जी-संयोजित मोती रखें, साइट्रेट बफर को छोड़ दें, और फिर अलग-अलग मोती के लिए सेल lysate जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 50 आरपीएम पर मिश्रण घुमाएँ।
- लक्ष्य प्रोटीन को मुक्त गैर-लक्ष्य प्रोटीन से अलग करें। 0.1% पॉलीऑक्सीएथिलीन (20) sorbitan monolaurate युक्त साइट्रेट फॉस्फेट बफर के 500 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर तीन बार मोती धो लें। अंतिम धोने के बाद, लक्ष्य प्रोटीन को हल करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस साइट्रेट बफर (पीएच 2-3) जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: यदि इम्यूनोप्रीसिप्शन से वसूली अपर्याप्त है, तो वैकल्पिक एपिटोप टैग का उपयोग, जैसे FLAG या HIS, दक्षता में सुधार हो सकता है। यदि elution की दक्षता अपर्याप्त है, अन्य eluants का उपयोग, जैसे एक एसडीएस आधारित समाधान, दक्षता में सुधार हो सकता है.
2. प्रोटीन की ऑन-मेम्ब्रेन पाचन
नोट: प्रोटीन मुक्त सामग्री और उपकरणों का उपयोग exogenous प्रोटीन के साथ संदूषण से बचने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, यह अनुशंसा की जाती है कि ऑपरेटर मानव प्रोटीन द्वारा संदूषण से बचने के लिए एक सर्जिकल मास्क और दस्ताने पहनते हैं।
- पीवीडीएफ झिल्ली को 3 मिमी x 3 मिमी टुकड़ों में काट लें जो सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, जो मेथनॉल के साथ पोंछे गए हैं और उपयोग करने से पहले तुरंत सूख गए हैं।
- साफ एल्यूमीनियम पन्नी पर PVDF झिल्ली के टुकड़े पर इथेनॉल के 2-5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
- इससे पहले कि वे पूरी तरह से सूख, eluant जोड़ें (2-5 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक, प्रति नमूना 4-6 टुकड़े) हाइड्रोफिलिक PVDF झिल्ली पर, और फिर हवा सूखी झिल्ली जब तक झिल्ली मैट हो जाता है. सूखे झिल्ली 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- सभी झिल्ली को 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूबों में स्थानांतरित करें, झिल्ली हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए इथेनॉल का 20-30 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, और फिर एक पिपेट का उपयोग करके इथेनॉल को हटा दें।
- झिल्ली पूरी तरह से सूख जाने से पहले, डाइथियोथ्रेटोल (डीटीटी) के 200 डिग्री सेल्सियस-आधारित प्रतिक्रिया समाधान (80 एमएम एनएच4एचसीओ3, 10 एम एम डीटीटी, और 20% एसीटोनिल) जोड़ें और इसे 1 एच के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- प्रतिक्रिया समाधान को आयोडोऐसीटाइड विलयन के 300 डिग्री सेल्सियस (80 एमएम एनएच4एचसीओ3, 55 एम आईओडोऐसीटाइड, और 20% एसीटोनिल) के साथ बदलें, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- झिल्ली को 1 एमएल आसुत पानी से दो बार धोएं और एक बार 1 एमएल 2% एसीटोनिल के साथ भंवर मिश्रण द्वारा 10 एस के साथ धो एंडिल्ड पानी।
- lyophilized एमएस ग्रेड trypsin भंग (सामग्री की तालिका) सीधे प्रतिक्रिया समाधान में (30 m एनएच4HCO3 युक्त 70% एसीटोनिट्रिल). क्रिया-क्रिया समाधान का 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें जिसमें ट्रिप्सिन का 1 $g (सामग्री की तालिका) (30 एमएम एनएच4HCO3 जिसमें 70% एसीटोनिल) और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट होता है।
- एक पिपेट का उपयोग कर एक साफ 1.5 एमएल परीक्षण ट्यूब में tryptic डाइजेस्ट युक्त प्रतिक्रिया समाधान स्थानांतरण।
- झिल्ली में 100 डिग्री सेल्सियस वॉश घोल (70% एसीटोनिट्रिल/1% ट्राइफ्लोरोऐसीटिक एसिड) जोड़ें और इसे 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए इनक्यूबेट करें। धोने के समाधान को एकत्र करें और इसे प्रतिक्रिया समाधान के साथ मिलाएं। झिल्ली के लिए एक और 100 $L धोने समाधान जोड़ें और यह 10 मिनट के लिए sonicate. फिर धोने समाधान इकट्ठा करने और प्रतिक्रिया समाधान के साथ मिश्रण।
- प्रयोगशाला फिल्म के एक टुकड़े के साथ परीक्षण ट्यूब कवर और एक सुई के साथ छोटे छेद के एक जोड़े बनाते हैं. वैक्यूम कंथाकार का उपयोग करके समाधान को सुखाएं।
- इस अवशेष को 0ण्2% फोरमिक अम्ल के 10 डिग्री एल में घोला जा सकता है। अपकेंद्रण के बाद (12,000 $ ग्राम, कमरे के तापमान पर 3 मिनट), एक नमूना ट्यूब में supernatant हस्तांतरण.
नोट: washes इस खंड के महत्वपूर्ण चरण हैं। पर झिल्ली प्रोटीन पाचन के दौरान, कमी और आसुत पानी के साथ alkylation के बाद स्थिर प्रोटीन युक्त झिल्ली की धुलाई, 2% एसीटोनिल के बाद, 10 से अधिक सेकंड प्रत्येक के लिए, अभिकर्मकों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है.
3. LC-electrospray आयनन (ईएसआई)-एमएस/
- एक ईएसआई-एमएस/एमएस उपकरण को सक्रिय करें (सामग्री की तालिका) एक नैनो-एलसी एच पीएलसीप्रणाली ( सामग्री की तालिका )केसाथ युग्मित। एक पूर्व स्तंभ (सामग्री की तालिका) और एक विश्लेषणात्मक स्तंभ ( सामग्री कीतालिका)लिंक करें।
- विश्लेषण करने से पहले, गोजातीय सीरम एल्बुमिन के ट्रिप्टिक डाइजेस्ट का उपयोग करके द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को 0.2% फोरमिक एसिड में भंग कर दिया जाता है, जो मानक पेप्टाइड्स प्रदान करता है।
- धनात्मक आयन मोड और 400-1,250 m/z की एक द्रव्यमान श्रेणी का उपयोग कर के नमूनों का विश्लेषण करें; तब 100-1,600 m/z की एक द्रव्यमान श्रेणी के साथ 100-1,600 m/z और 2%-80% एसीटोनिट्रिल और 0.2% formic एसिड के लिए 80 मिनट के लिए 300 nL/min की एक प्रवाह दर पर एक बड़े पैमाने पर रेंज के साथ प्राप्त करें।
- प्रोटीन पहचान के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पादन डेटा का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिका) जुड़े उम्मीदवार जुड़े प्रोटीन की पहचान करने के लिए. एक उम्मीदवार प्रोटीन की सकारात्मक पहचान के लिए, कम से कम एक उच्च निष्ठा पेप्टाइड टुकड़ा का पता लगाने (gt; 95% निष्ठा) की आवश्यकता है.
- प्रोटीन है कि इसी तरह GFP-expressing lysates में वेग रहे हैं (एक GFP टैग अकेले व्यक्त वेक्टर के संक्रमण) उम्मीदवार प्रोटीन की सूची से omit.
नोट: यदि डेटाबेस विश्लेषण में कुछ प्रोटीनों की पहचान की जाती है, तो एमएस/एमएस अधिग्रहण शर्तों में संशोधन (जैसे, 100 एमएस प्रत्येक से 50 एमएस प्रत्येक के लिए समय बदलरहा है) की पहचान प्रोटीन की संख्या में वृद्धि हो सकती है।
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Representative Results
उपर्युक्त प्रक्रिया के माध्यम से, प्रतिरक्षा-प्रवर्तकों का एलसी-एमएस/एमएस (चित्र1)का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। बहिर्जात व्युत्पन्न प्रोटीन (अन्य प्रजातियों और आईजीजी से प्रोटीन) के अपवर्जन के बाद, कैलसन-6-संबद्ध इम्यूनोप्रिसिपेटेंट में 17 प्रोटीनों की पहचान की गई (तालिका 1) और 15 प्रोटीनों की पहचान जीएफपी-संबद्ध इम्यूनोप्रिसिपेटेंट में की गई थी ( तालिका 2) कैल्पिन-6 और जीएफपी-संबद्ध प्रोटीनों में से 11 की पहचान इम्यूनोप्रिसिपेटेंट दोनों में की गई थी (चित्र 2)। एक बार इन और calpain-6 ही बाहर रखा गया था, पांच उम्मीदवार calpain-6 संबद्ध प्रोटीन बने रहे: पूरक C1Q उपघटक उपइकाई सी, केराटिन प्रकार द्वितीय cytoskeletal 8, IgE बाध्यकारी प्रोटीन, ADP/
चित्र 1. पर झिल्ली पाचन तकनीक के लिए योजना
कोशिका lysates विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ संयुग्मी चुंबकीय मोती का उपयोग कर तेजाब थे. प्रतिरक्षा-वर्षा से संबंधित को पीवीडीएफ झिल्ली के टुकड़ों पर दागित किया गया था। बाद में, झिल्ली रिडक्टिव ऐल्किलन के लिए अभिकर्मकों के साथ इलाज किया गया, और फिर trypsin के साथ incubated. प्रतिक्रिया समाधान तो LC-MS/MS का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. प्रतिनिधि डेटा का ओवरव्यू
कैलीन-6-संबद्ध इम्यूनोप्रिसिपेटेंट में सत्रह प्रोटीनों की पहचान की गई थी और जीएफपी-संबद्ध इम्यूनोप्रिसिपेटेंट में 15 प्रोटीन पाए गए थे। इनमें से, 11 प्रोटीन दोनों इम्यूनोप्रिसिटेंट में पहचाने गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नाम | विलय | पेप्टाइड्स(95%) | %Cov |
| Actin, कोशिकाद्रव्यी 2 | एसपीजेड P63260] एसीटीजी | 5 | 18.4 |
| Actin, महाधमनी चिकनी मांसपेशियों | एसपीजेड P62737] Acta | 5 | 18.57 |
| Actin, कोशिकाद्रव्य ी 1 | एसपीजेड P60710] एसीटीबी | 5 | 18.41 |
| Actin, अल्फा कंकाल की मांसपेशी | एसपीजेड P68134] अधिनियमों | 5 | 13.53 |
| Actin, अल्फा हृदय की मांसपेशी 1 | एसपीजेड P68033] एसीटीसी | 5 | 13.53 |
| Actin, गामा-एंटेरिक चिकनी मांसपेशियों | एसपीजेड P63268] एसीटीएच | 5 | 13.56 |
| दीर्घीकरण कारक 1-अल्फा 1 | एसपीजेड P10126] EF1A1 | 3 | 33.33 |
| दीर्घीकरण कारक 1-अल्फा 2 | एसपीजेड P62631] EF1A2 | 3 | 16.2 |
| केरातिन, प्रकार द्वितीय साइटोस्केलेटल 8 | एसपीजेड P11679] K2C8 | 3 | 22.65 |
| पूरक C1Q उपघटक उपइकाई सी | एसपीजेड Q02105] C1QC | २ | 8.94 |
| आईजीई-बाइंडिंग प्रोटीन | एसपीजेड P03975] आईजीईबी | २ | 21.72 |
| कैल्पाइन-6 | एसपीजेड O35646] कर सकते हैं 6 | 1 | 15.91 |
| ADP/ATP ट्रांसलोकेस 2 | एसपीजेड P51881] एडीटी 2 | 1 | 27.52 |
| ADP/ATP ट्रांसलोकेस 1 | एसपीजेड P48962] एडीटी1 | 1 | 19.13 |
| यूबीक्विटिन | एसपीजेड P62991] यूबीआईक्यू | 1 | 40.79 |
| Runt से संबंधित प्रतिलेखन कारक 3 | एसपीजेड Q64131] RUNX3 | 1 | 15.89 |
| Runt से संबंधित प्रतिलेखन कारक 3 के Isoform 2 | एसपीजेड Q64131-2] RUNX3 | 1 | 13 |
| "पेप्टाइड्स (95%)" एक निष्ठा स्कोर के साथ पहचाने पेप्टाइड्स की संख्या इंगित करता है gt; 95% MS/MS डेटा में। "%Cov" सभी पेप्टाइड्स में पहचान े गए एमिनो एसिड अवशेषों के प्रतिशत को संदर्भित करता है (के साथ gt; 95% निष्ठा) इसी प्रोटीन गठन एमिनो एसिड अवशेषों की कुल संख्या के सापेक्ष. स्पष्टता में सुधार करने के लिए, exogenous प्रोटीन (अन्य प्रजातियों और IgGs से प्रोटीन), राइबोसोमल प्रोटीन, और histones नहीं दिखाए जाते हैं. | |||
तालिका 1. कैल्पाइन-6-संबद्ध प्रोटीन
| नाम | विलय | पेप्टाइड्स(95%) | %Cov |
| दीर्घीकरण कारक 1-अल्फा 1 | एसपीजेड P10126] EF1A1 | 3 | 24.24 |
| दीर्घीकरण कारक 1-अल्फा 2 | एसपीजेड P62631] EF1A2 | 3 | 24.41 |
| Actin, अल्फा कंकाल की मांसपेशी | एसपीजेड P68134] अधिनियमों | 3 | 13.53 |
| Actin, अल्फा हृदय की मांसपेशी 1 | एसपीजेड P68033] एसीटीसी | 3 | 13.53 |
| Actin, गामा-एंटेरिक चिकनी मांसपेशियों | एसपीजेड P63268] एसीटीएच | 3 | 13.56 |
| Actin, कोशिकाद्रव्यी 2 | एसपीजेड P63260] एसीटीजी | 3 | 13.6 |
| Actin, महाधमनी चिकनी मांसपेशियों | एसपीजेड P62737] Acta | 3 | 13.53 |
| Actin, कोशिकाद्रव्य ी 1 | एसपीजेड P60710] एसीटीबी | 3 | 13.6 |
| ADP/ATP ट्रांसलोकेस 2 | एसपीजेड P51881] एडीटी 2 | २ | 25.5 |
| आर.आर.ए.एन.ए. 2'-ओ-मेथिलट्रांसफरेज फिब्रिलारिन | एसपीजेड P35550] एफबीआरएल | २ | 14.37 |
| निषिद्बिन | एसपीजेड P67778] Phb | 1 | 9.19 |
| विषमजातीय नाभिकीय राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन यू | एसपीजेड Q8VEK3] एच.एन.आर.पी.यू. | 1 | 10.63 |
| Runt से संबंधित प्रतिलेखन कारक 3 | एसपीजेड Q64131] RUNX3 | 1 | 39.12 |
| Runt से संबंधित प्रतिलेखन कारक 3 के Isoform 2 | एसपीजेड Q64131-2] RUNX3 | 1 | 26 |
| दीर्घीकरण कारक 1-गामा | एसपीजेड Q9D8N0] EF1G | 1 | 12.36 |
| "पेप्टाइड्स (95%)" एक निष्ठा स्कोर के साथ पहचाने पेप्टाइड्स की संख्या इंगित करता है gt; 95% MS/MS डेटा में। "%Cov" सभी पेप्टाइड्स में पहचान े गए एमिनो एसिड अवशेषों के प्रतिशत को संदर्भित करता है (के साथ gt; 95% निष्ठा) इसी प्रोटीन गठन एमिनो एसिड अवशेषों की कुल संख्या के सापेक्ष. स्पष्टता में सुधार करने के लिए, exogenous प्रोटीन (अन्य प्रजातियों और IgGs से प्रोटीन), राइबोसोमल प्रोटीन, और histones नहीं दिखाए जाते हैं. | |||
तालिका 2. जीएफपी-संबद्ध प्रोटीन
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Discussion
हमने पहले एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके एपोलिपोप्रोटीन बी-100 के ऑक्सीकरणात्मक संशोधनों का विश्लेषण किया है। वर्तमान अध्ययन में, हम प्रतिरक्षा वर्षा के साथ इस तकनीक को संयुक्त और कई calpain-6 संबद्ध प्रोटीन की पहचान की है. इस उपन्यास तकनीक जुड़े प्रोटीन उम्मीदवार के लिए स्क्रीनिंग की एक सुविधाजनक विधि का प्रतिनिधित्व करता है. कैल्पाइन-6 कैल्पाइन प्रोटीओलिटिक परिवार11 का एक गैर-प्रोटीओलिटिक सदस्य है जिसने कथित तौर पर अपने प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन12,13के माध्यम से सेलुलर कार्यों को संशोधित किया है। एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का उपयोग करना, हम पहले से अन्य calpain-6 संबद्ध प्रोटीन एक अलग एमएस सेट अप12रोजगार की पहचान की है. इसलिए, हम पहचाने गए उम्मीदवारों की संख्या को अधिकतम करने के लिए कई MS शर्तों का परीक्षण करने की अनुशंसा करते हैं. इसी कारण से, इम्यूनोप्रीसिप्शन की स्थिति का मूल्यांकन, जैसे कि एपिटोप टैग के प्रकार, डिटर्जेंट, और एल्यूशन समाधान का उपयोग किया जाता है, इष्टतम आउटपुट प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
वर्तमान अध्ययन में, हमने कैल्पाइन-6- और जीएफपी-संबद्ध इम्यूनोप्रिसिपेटेंट दोनों में 11 प्रोटीनों की पहचान की। ओवरलैपिंग प्रोटीन के बहुमत actin isotypes थे, और actin cytoskeletal प्रोटीन के साथ संदूषण सेलुलर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण में आम है क्योंकि इन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्तर बहुत अधिक हैं. इसलिए इन उम्मीदवारों को आगे के विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, दोनों इम्यूनोप्रिसिटेंट्स में दीर्घीकरण कारक पाए गए। वे प्रोटीन संश्लेषण की गति और निष्ठा को विनियमित करते हैं और प्रोटीन-फोल्डिंग14को प्रभावित करते हैं, और इसलिए, दीर्घीकरण कारकों की सह-प्रतिरक्षा-वर्षा आश्चर्यजनक नहीं है। इन प्रोटीनों को भी आगे के मूल्यांकन से हटाया जाना चाहिए।
इम्यूनोप्रेशनर्स को एल्यूशन समाधान15में सीधे रिडक्टिव ऐल्किलेशन और एंजाइमी पाचन के अधीन किया जा सकता है, और यह इन-समाधान पाचन विधि एमएस/एमएस के लिए नमूने तैयार करने के लिए भी लागू की जा सकती है। हालांकि, हम पर झिल्ली पाचन के उपयोग पर विचार करने के लिए में समाधान पाचन पर काफी लाभ है. PVDF झिल्ली बाद रिडक्टिव alkylation और एंजाइमी पाचन के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य करता है, जिसका अर्थ है कि सॉल्वैंट्स इन प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक आसानी से बदला जा सकता है. नतीजतन, यह इम्यूनोप्रीसिप्शन के लिए elution समाधान की एक किस्म का उपयोग करने के लिए संभव है। इसके विपरीत, में समाधान पाचन के लिए, यह एसडीएस आधारित या कम पीएच elution समाधान का उपयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि protease गतिविधि ऐसी स्थितियों में सीमित हो सकता है. इसके अलावा, लक्ष्य प्रोटीन की अचलीकरण बाद में धोने की प्रक्रिया को आसान बना सकता है। इसलिए, ऑन-मेम्ब्रेन पाचन एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए इम्यूनोप्रिसिपेटेंट की तैयारी के लिए अत्यधिक उपयुक्त है। proteases की एक सीमित संख्या में इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त हो सकता है. अब तक केवल लिसिल-सी, जो ट्रिप्सिन के अलावा अन्य है, कथित तौर पर 80% एसीटोनिल6,9,10,15तक की उपस्थिति में सक्रिय है।
हमारे पर झिल्ली पाचन तकनीक एक अत्यधिक संवेदनशील पहचान सीमा के साथ इम्यूनोप्रिसिपेटेंट की एक छोटी मात्रा में प्रोटीन की पहचान के लिए उपयुक्त है। हालांकि, यह याद रखना चाहिए कि एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए पता लगाने की क्षमता वर्तमान राशि पर निर्भर करता है. प्रोटीन है कि बड़ी मात्रा में मौजूद हैं अधिमानी पता लगाया है और वे एमएस द्वारा पता लगाया जा रहा छोटी मात्रा में मौजूद अन्य प्रोटीन को रोका जा सकता है. फिर भी, सामान्य परिस्थितियों में कई प्रोटीन LC-MS/MS विश्लेषण का उपयोग कर पता चला है, और अन्य परख स्पष्ट जो उम्मीदवार प्रोटीन के उपयुक्त जीवविज्ञान महत्व के हैं के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
इस अध्ययन में, हम इम्यूनोप्रेशन के विश्लेषण के लिए एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का मूल्यांकन किया है. प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण के लिए इस तरह के एक सुविधाजनक और व्यापक विधि व्यापक रूप से भविष्य proteomic विश्लेषण के थ्रूपुट में सुधार करने के लिए लागू किया जाना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस अध्ययन के भाग में जापान सोसायटी द्वारा विज्ञान के संवर्धन के लिए समर्थित किया गया था KAKENHI अनुदान संख्या 17K09869 (AM करने के लिए), जापान सोसायटी विज्ञान के संवर्धन के लिए KAKENHI अनुदान संख्या 15K09418 (टीएम करने के लिए), Kanehara Ichiro चिकित्सा विज्ञान फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान और Suzuken मेमोरियल फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान (सभी TM के लिए).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
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