Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.
Abstract
חלבונים תאיים רבים אינטראקציה פיזית בהתאם לנסיבות תאיים שלהם מסחטות. אכן, פונקציות הסלולר תלוי במידה רבה חלבון תאיים – אינטראקציות חלבון. לכן, המחקר הנוגע לאינטראקציות אלו הוא הכרחי להקלה על הבנת התהליכים הפיזיולוגיים. שיתוף משקעים של חלבונים משויכים, ולאחריו ניתוח ספקטרומטר המסה (MS), מאפשר זיהוי אינטראקציות של חלבונים חדשניים. במחקר זה, סיפקנו את הפרטים של הטכניקה הרומן של immunoprecipitation-נוזלי כרומטוגרפיה (LC)-MS/MS ניתוח בשילוב עם העיכול על הקרום לניתוח של חלבון-אינטראקציות החלבון. טכניקה זו מתאימה לimmunoprecipitants גולמי ויכולה לשפר את התפוקה של ניתוחים פרוטאואריים. מתויג רקומביננטי חלבונים היו זירז באמצעות נוגדנים ספציפיים; בשלב הבא, immunoprecipitants מחק על החלקים הממבראני של הממברנה, שהיו חשופים לאלקיללציה. בעקבות טריסיזציה, משקעי החלבון המשועכלים נותחו באמצעות LC-MS/MS. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לזהות מספר מועמדים משויכים חלבונים. כך, שיטה זו היא נוחה ושימושית לאפיון של החלבון הרומן – אינטראקציות חלבונים.
Introduction
למרות החלבונים לשחק תפקידים מחוקה באורגניזמים חיים, הם מסונתז ללא הרף, מעובד, ומושפל בסביבה תאיים. יתר על כן, חלבונים תאיים לעתים קרובות האינטראקציה פיזית ביולוגית, אשר משפיע על הפונקציה של אחד או שניהם1,2,3. לדוגמה, הכריכה הישירה של הומוCWC22 החלבון המשויך ל-איקריוטית באמצעות תרגום מסוג 4a3 (eIF4A3) הכרחית להרכבת מתחם הצומת אקסון4. בהתאם למצב זה, מוטציה eIF4A3 חסר אהדה עבור CWC22 נכשלת להקל על החדרת הצומת mRNA מונחה מורכבים מורכב של שחבור4. לפיכך, המחקר של אינטראקציות חלבונים הוא חיוני להבנה מדויקת של רגולציה הפיזיולוגית כמו גם של פונקציות סלולריות.
ההתקדמות האחרונה בספקטרומטר המסה (MS) הוחלו על הניתוח המקיף של אינטראקציות חלבונים בחלבון. למשל, שיתוף משקעים של חלבונים אנדוגני או אקסוגנבאופן ברור הציג חלבונים מתויגים עם החלבונים המשויכים שלהם, ואחריו ניתוח MS, מאפשר זיהוי של אינטראקציות החלבון הרומן5. עם זאת, בקבוק אחד גדול של ניתוח MS/MS הוא התאוששות ירודה מעיכול טריפטי של דגימות חלבון. עבור ניהול ניתוחים פרוטאומית על lysates תא, ב-ג'ל ושיטות עיכול על-ממברנה מועסקים בדרך כלל כדי להכין בדיקות MS/MS. בעבר השוונו הליך העיכול ב-ג'ל עם טכניקת העיכול6, והראה כי האחרון היה קשור כיסוי רצף טוב יותר. Pvc difluoride (pvdf) קרום עשוי להיות מתאים למטרה זו, כי היא חזקה מכנית עמידים בפני ריכוזים גבוהים של ממיסים אורגניים7,8, המתיר העיכול אנזימטי של קיבוע חלבונים בנוכחות 80% acetonitrile9. יתר על כן, השתק על קרום יכול לגרום לשינויים שינויים בחלבונים היעד, המוביל שיפורים ביעילות העיכול הטריפטי10. בהתאם לכך, במאמר זה, תיארנו את השימוש בניתוח immunoprecipitation-LC/MS/MS של אינטראקציות חלבונים באמצעות טכניקת העיכול על הממברנה. שיטה פשוטה זו מקלה על הניתוח הנוח של אינטראקציות חלבונים בחלבון גם במעבדות שאינן מתמחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Immunoprecipitation
הערה: השתמשנו במאגר הליזה שאינו נתרן dodecyl סולפט (SDS) ומשחרלי ציטראט, כפי שמתואר בסעיפים הבאים. עם זאת, השימוש בטכניקה immunoprecipitation חלופית בתוך הבית עשוי להיות גם ישים עבור הכנת דגימות LC-MS/MS.
- מעבר תאים מתורבתים עם וקטורים קידוד תג אפירופה לבד או חלבון פיוז'ן. עבור רכישת נתונים נציג, העברת J774 תאים (1 x 106) עם וקטורים קידוד חלבון פלורסנט ירוק (gfp) בלבד או gfp-התמזגו Capn6 (calpain-6 גנים) באמצעות ליפוזומים בליקיק.
- נוגדן ממשלים לחרוזים מגנטיים.
- למטרה זו, לערבב אנטי GFP נוגדן (2 μL/התגובה) עם חרוזים מגנטיים (25 μL/תגובה) ב 500 μL של מאגר ציטראט פוספט (24.5 מ"מ חומצה לימון, 51.7 mM dibasic נתרן פוספט; pH 5.0) במבחנה 1.5 mL.
- לסובב את התערובת ב 50 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף את החרוזים המצוייסים שלוש פעמים עם מאגר פוספט ציטראט המכיל 0.1% פוליוקסלין (20) סורביתן מונאולאורון.
- לאחר מכן תאים מזוהמים באמצעות מאגר פירוק המתאים. עבור רכישת נתונים נציג, לאחר תאים מזוהמים 30 דקות על הקרח ב 400 μL של מאגר לפירוק (50 mM טריס-HCl; pH 7.5, 120 mM הנאקל, 0.5% פולי (oxye,) octylphenyl אתר) המכיל 40 Μm/L פנילתיל סולולוניל, 50 μg/mL לleupeptin, מתוך. mL aprotinin נין, 200 μm/ליטר נתרן אורטודאנואט, ו 1 מ"מ אתילן (EGTA) בחומצה בדיקה 1.5 mL 24 שעות לאחר הזיהום.
- נקה את הליפוסט על ידי תפרידו ב 15,000 x g עבור 5 דקות ולאסוף את supernatant.
- . לנקות את הליפוסט הוסף חרוזים מגנטיים ללא תווית (25 μL/תגובה) במבחנה 1.5 mL-מבחן. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 500 μL של מאגר ציטראט פוספט. לאחר הסרת מאגר פוספט ציטראט בשטיפה הסופי, להוסיף את התא למטה על החרוזים המגנטיים. לסובב את התערובת באמצעות מסובבי ב 50 סל ד עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את צינור הבדיקה על מעמד מגנטי עבור 5 דקות עבור הפרדה מגנטית, ולאסוף את התא ליפוסט. מומלץ להשתמש במעמד המגנטי המיועד ליצרן.
- אגד את חלבונים היעד לחרוזים מצוהים. מניחים את החרוזים החיסוני (Ig) G-מעלה על דוכן מגנטי עבור 5 דקות עבור הפרדה מגנטית, למחוק את מאגר ציטראט, ולאחר מכן להוסיף את התא ליפוסט החרוזים המופרדים.
- לסובב את התערובת ב 50 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- הפרד בין החלבונים היעד מחלבונים ללא יעד בחינם. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים באמצעות 500 μL של מאגר פוספט ציטראט המכיל 0.1% Polyoxyethylene (20) סורביתן monolaurate. לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 30 μL של מאגר ציטראט (pH 2 – 3), ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי elute היעד חלבונים.
הערה: אם ההתאוששות מimmunoprecipitation אינה מספיקה, השימוש בתגי אפירופה חלופיים, כגון דגל או שלו, עשוי לשפר את היעילות. אם היעילות של הימנעות אינה מספיקה, השימוש באלואנטים אחרים, כגון פתרון מבוסס SDS, עשוי לשפר את היעילות.
2. העיכול על-ממברנה של חלבונים
הערה: שימוש בחומרים וציוד ללא חלבון הכרחי כדי למנוע זיהום בחלבונים אקגניים. בנוסף, מומלץ כי המפעיל ללבוש מסכה כירורגית וכפפות כדי למנוע זיהום על ידי חלבונים אנושיים.
- חותכים ממברנות PVDF לתוך 3 מ"מ x 3 מ"מ חתיכות באמצעות מספריים כירורגי כי נמחקו עם מתנול ומיובשים מיד לפני השימוש.
- הוסף 2 – 5 μL של אתנול על פיסות של קרום PVDF על רדיד אלומיניום נקי.
- לפני שהם יבשים לחלוטין, להוסיף את הללויה (2 – 5 μL כל אחד, 4 – 6 חתיכות לכל מדגם) על הקרומים PVDF הידרופילי, ולאחר מכן האוויר יבש הקרומים עד משטח הקרום הופך מאט. ניתן לאחסן ממברנות יבשים ב -4 ° c.
- העבר את כל הקרומים לתוך 1.5 מ"ל צינורות פלסטיק, להוסיף 20 – 30 μL של אתנול כדי להפוך את הקרומים הידרופילי, ולאחר מכן להסיר את האתנול באמצעות פיפטה.
- לפני הקרום מתייבש לחלוטין, להוסיף 200 μL של dithiothreitol (DTT) מבוססי פתרון התגובה (80 mM NH4hco3, 10 מ"מ dtt, ו 20% acetonitrile) ו-דגירה את זה ב 56 ° c עבור 1 h.
- החלף את פתרון התגובה עם 300 μL של פתרון iodoacetamide (80 mM NH4hco3, 55 mm iodoamide, ו 20% acetonitrile), ו דגירה עבור 45 מינימום בטמפרטורת החדר בחושך.
- רוחצים את הקרומים פעמיים עם 1 מ ל של מים מזוקקים ופעם אחת עם 1 מ ל של 2% acetonitrile על ידי ערבוב מערבולת עבור > 10 s.
- התמוססות הגברת טריפסין (טבלת חומרים) ישירות בפתרון הריאקציה (30 מ"מ NH4hco3 המכיל 70% acetonitrile). הוסף 100 μL של פתרון התגובה המכיל 1 μg של טריפסין (טבלת חומרים) (30 מ"מ NH4hco3 המכיל 70% acetonitrile) ו דגירה ב 37 ° צ' לילה.
- העבר את פתרון התגובה המכיל את מעכל טריטיק לתוך שפופרת נקי 1.5 mL באמצעות פיפטה.
- הוסף 100 μL של הפתרון לשטוף (70% acetonitrile/1% trifluoroacetic חומצה) כדי קרום ו מודטה אותו ב 60 ° צ' עבור 2 h. לאסוף את הפתרון לשטוף ולערבב אותו עם פתרון התגובה. הוסף עוד 100 μL של הפתרון לשטוף את קרום וsonicate אותו עבור 10 דקות. לאחר מכן לאסוף את הפתרון לשטוף ולערבב עם פתרון התגובה.
- מכסים את צינור הבדיקה עם פיסת סרט מעבדה ולעשות כמה חורים קטנים עם מחט. יבש את הפתרון באמצעות מרכז ואקום.
- מפזר את שאריות ב 10 μl של 0.2% חומצה פורמית. לאחר צנטריפוגה (12,000 × g, 3 דקות בטמפרטורת החדר), העבר את הסופרנטנט לתוך שפופרת דגימה.
הערה: הסירים הם הצעדים הקריטיים בסעיף זה. במהלך העיכול חלבון ממברנה, כביסה של הקרומים המכילים את החלבונים לאחר הפחתת והאללציה עם מים מזוקקים, ואחריו 2% acetonitrile, עבור יותר מ 10 שניות כל אחד, הוא קריטי להסרת הריאגנטים.
3. LC-electrospray יינון (ESI)-ניתוח MS/MS
- הפעלת כלי ESI-MS/MS (טבלת חומרים) בשילוב עם מערכת מערכות ננו-LC (טבלת חומרים). קישור עמוד מראש (טבלת חומרים) וטור אנליטי (טבלת חומרים).
- לפני הניתוח, לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות מעכל טריטיק של סרום שור מומס 0.2% פורמית חומצה, המספקת פפטידים סטנדרטיים.
- ניתוח דגימות באמצעות מצב יון חיובי וטווח מסה של 400 – 1250 m/z; לאחר מכן לרכוש עד 10 ms/ms ספקטרום (100 ms כל אחד) עם טווח המוני של 100-1600 m/z ו מעבר ליניארי של 2% – 80% acetonitrile ו 0.2% פורמית חומצה עבור 80 דקות בקצב הזרימה של 300 nL/min.
- ניתוח נתוני הפלט באמצעות תוכנה לזיהוי חלבונים (טבלת חומרים) כדי לזהות את המועמדים המשויכים חלבונים. לזיהוי חיובי של חלבון מועמד, יש צורך בזיהוי של רסיס פפטיד באיכות גבוהה אחד לפחות (> 95% אמינות).
- להשמיט את החלבונים כי הם זירז דומה ב-GFP-ביטוי lysates (העברה של וקטור ביטוי תג GFP לבד) מרשימת חלבונים המועמדים.
הערה: אם מעט חלבונים מזוהים בניתוח מסד הנתונים, שינוי של תנאי הרכישה MS/MS (g., שינוי הזמן מ 100 ms כל אחד ל 50 ms כל) עשוי להגדיל את מספר החלבונים המזוהים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך הנ ל תיאר, immunoprecipitants נותחו באמצעות LC-MS/MS (איור 1). לאחר החרגה של חלבונים הנגזרים באופן שונה (חלבונים ממינים אחרים IgGs), 17 חלבונים זוהו calpain-6-הקשורים immunoprecipitants (שולחן 1) ו 15 חלבונים זוהו ב gfp הקשורים immunoprecipitants ( טבלה 2). של calpain-6 ו-GFP הקשורים חלבונים, 11 זוהו הן immunoprecipitants (איור 2). ברגע אלה ו calpain-6 עצמו היו מנשלל, חמישה calpain-6-הקשורים חלבונים נותרו: המשלים C1q רכיב משנה C, קרטין סוג II ציטושלד 8, ige-כריכת חלבון, ADP/ATP טרנסלוקייס 1, ו אוביקוויב.
איור 1. ערכה לטכניקת העיכול האנטי-ממברנה
התאים המגנטיים השתמשו בחרוזים מגנטיים. עם נוגדנים ספציפיים האלואנט מimmunoprecipitation הייתה מפודת על פיסות קרום PVDF. לאחר מכן טופלו הממברנות בעזרת ריאגנטים לאלקילציה, ולאחר מכן הודבטו בטריפסין. פתרון התגובה נותחו לאחר מכן באמצעות LC-MS/MS. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. איור 2 מבט כולל על נתוני הנציג
17 חלבונים זוהו ב calpain-6 הקשורים immunoprecipitant ו 15 חלבונים זוהו ב-GFP הקשורים immunoprecipitant. מתוך אלה, 11 חלבונים זוהו בשני הimmunoprecipitants. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | הצטרפות | פפטידים (95%) | % Cov |
| אקטין, cytoplasmic 2 | התקן התקן | P63260 | מיכל שגיא | מיכל 5 | 18.4 |
| אקטין, השריר החלק של אבי העורקים | התקן התקן | P62737 | ACTA | מיכל 5 | 18.57 |
| אקטין, cytoplasmic 1 | התקן התקן | P60710 | מיכל שגיא | מיכל 5 | 18.41 |
| אקטין, שריר השלד האלפא | התקן התקן | P68134 | עשי | מיכל 5 | 13.53 |
| אקטין, שריר לב אלפא 1 | התקן התקן | P68033 | מיכל בע | מיכל 5 | 13.53 |
| אקטין, שריר החלקה גמא-בידור | התקן התקן | P63268 | הורמונים | מיכל 5 | 13.56 |
| פקטור התארכות 1-אלפא 1 | התקן התקן | P10126 | EF1A1 | 3 | 33.33 |
| פקטור התארכות 1-אלפא 2 | התקן התקן | P62631 | EF1A2 | 3 | 16.2 |
| קרטין, סוג 2 ציטושלד 8 | התקן התקן | P11679 | K2C8 | 3 | 22.65 |
| משלים C1q יחידת משנה של רכיב משנה C | התקן התקן | Q02105 | C1QC | 2 | 8.94 |
| חלבון מחייב IgE | התקן התקן | P03975 | מיכל הייקוב | 2 | 21.72 |
| כאבים-6 | התקן התקן | O35646 | CAN6 | 1 | 15.91 |
| במקרה של ADP/ATP 2 | התקן התקן | P51881 | ADT2 | 1 | 27.52 |
| במקרה של ADP/ATP 1 | התקן התקן | P48962 | ADT1 | 1 | 19.13 |
| אוביקוויטין | התקן התקן | P62991 | היכל ה, אוביקיו | 1 | 40.79 |
| מקדם התמלול הקשור לגמד 3 | התקן התקן | Q64131 | RUNX3 | 1 | 15.89 |
| איזוטופס 2 של מקדם התמלול הקשור לגמד 3 | התקן התקן | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 13 |
| "פפטידים (95%)" מציין את מספר פפטידים המזוהים עם תוצאת נאמנות > 95% בנתוני MS/MS. "% Cov" מתייחס לאחוז של שאריות חומצות אמינו מזוהה בכל הפפטידים (עם > 95% נאמנות) ביחס למספר הכולל של שאריות חומצות אמינו המהווים את החלבון המתאים. כדי לשפר את הבהירות, חלבונים אקסוגני (חלבונים ממינים אחרים IgGs), חלבונים ריבוזומניים, והאבנים לא מוצגים. | |||
. שולחן 1 Calpain-6-הקשורים חלבונים
| שם | הצטרפות | פפטידים (95%) | % Cov |
| פקטור התארכות 1-אלפא 1 | התקן התקן | P10126 | EF1A1 | 3 | 24.24 |
| פקטור התארכות 1-אלפא 2 | התקן התקן | P62631 | EF1A2 | 3 | 24.41 |
| אקטין, שריר השלד האלפא | התקן התקן | P68134 | עשי | 3 | 13.53 |
| אקטין, שריר לב אלפא 1 | התקן התקן | P68033 | מיכל בע | 3 | 13.53 |
| אקטין, שריר החלקה גמא-בידור | התקן התקן | P63268 | הורמונים | 3 | 13.56 |
| אקטין, cytoplasmic 2 | התקן התקן | P63260 | מיכל שגיא | 3 | 13.6 |
| אקטין, השריר החלק של אבי העורקים | התקן התקן | P62737 | ACTA | 3 | 13.53 |
| אקטין, cytoplasmic 1 | התקן התקן | P60710 | מיכל שגיא | 3 | 13.6 |
| במקרה של ADP/ATP 2 | התקן התקן | P51881 | ADT2 | 2 | 25.5 |
| rRNA 2 '-או-מתילטרנספראז fibrillarin | התקן התקן | P35550 | בעלי מעגל | 2 | 14.37 |
| Prohibitin | התקן התקן | P67778 | מיכל הפלב | 1 | 9.19 |
| מבריאואופלפרוטאין גרעינית | התקן התקן | Q8VEK3 | מיכל ברופו | 1 | 10.63 |
| מקדם התמלול הקשור לגמד 3 | התקן התקן | Q64131 | RUNX3 | 1 | 39.12 |
| איזוטופס 2 של מקדם התמלול הקשור לגמד 3 | התקן התקן | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 26 |
| פקטור התארכות 1-גמא | התקן התקן | Q9D8N0 | EF1G | 1 | 12.36 |
| "פפטידים (95%)" מציין את מספר פפטידים המזוהים עם תוצאת נאמנות > 95% בנתוני MS/MS. "% Cov" מתייחס לאחוז של שאריות חומצות אמינו מזוהה בכל הפפטידים (עם > 95% נאמנות) ביחס למספר הכולל של שאריות חומצות אמינו המהווים את החלבון המתאים. כדי לשפר את הבהירות, חלבונים אקסוגני (חלבונים ממינים אחרים IgGs), חלבונים ריבוזומניים, והאבנים לא מוצגים. | |||
. שולחן 2 חלבונים המשויכים ל-GFP
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבר תיארנו ניתוח של שינויים חמצוניים של אפוליפופרוטאין B-100 ב תחמוצת בצפיפות נמוכה ליפופרוטאין באמצעות LC-ms/ms לפניו על-ידי טכניקה העיכול הממברנה6. במחקר הנוכחי, אנו משולבים טכניקה זו עם immunoprecipitation וזיהה מספר calpain-6-הקשורים חלבונים. טכניקה זו מייצגת שיטה נוחה להקרנה עבור חלבונים הקשורים למועמדים. Calpain-6 הוא חבר שאינו פרוטנוגד חרדה של המשפחה calpain פרוטחרדה משפחה11 כי הדיווחים לשנות את הפונקציות הסלולר באמצעות החלבון שלה אינטראקציות חלבון12,13. באמצעות טכניקת העיכול על הקרום, זיהינו בעבר calpain-6-הקשורים חלבונים המעסיקים הגדרת MS שונים12. לכן, אנו ממליצים לבדוק כמה תנאים MS למקסם את מספר המועמדים שזוהו. מאותה סיבה, הערכת התנאים הimmunoprecipitation, כגון סוגי התגים האפיפי, חומר הניקוי, ופתרון האלויורטור, חשובה להשגת תפוקות אופטימליות.
במחקר הנוכחי, זיהינו 11 חלבונים בשני calpain-6-ו-GFP הקשורים immunoprecipitants. רוב החלבונים חופפים היו מסוג איזוטין, ומזהמים עם חלבונים אקטין השלד בתאי הוא נפוץ בניתוח של אינטראקציות חלבונים חלבון-חלבון כי רמות הביטוי של חלבונים אלה הם גבוהים מאוד. לכן יש להשמיט מועמדים אלה מניתוח נוסף. בנוסף, גורמי התארכות זוהו בשני הimmunoprecipitants. הם מווסת את מהירות ונאמנות של סינתזה חלבונים ומשפיעים על קיפול חלבונים14, ולכן, הimmunoprecipitation של גורמי התארכות אינו מפתיע. חלבונים אלה צריכים גם להיות מושמט מהערכה נוספת.
Immunoprecipitants יכול להיות נתון לעיכול הפחתת האלקציה ו אנזימטיות ישירות בפתרון להתחמק15, ואת זה בפתרון שיטת העיכול ניתן גם להחיל על הכנת דגימות עבור MS/ms. עם זאת, אנו מחשיבים את השימוש בעיכול ממברנה כדי לקבל יתרונות ניכרים על העיכול בפתרון. קרום PVDF משמש כפיגום לצורך העיכול האחר והספיגה האנזימטית, כלומר הממיסים הנדרשים לתהליכים אלה ניתנים להחלפה בקלות. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש במגוון פתרונות הימנעות מimmunoprecipitation. לעומת זאת, עבור העיכול בתוך הפתרון, זה יכול להיות מאתגר להשתמש בפתרונות מבוססי SDS או נמוך, כי פעילות פרוטאז עשויה להיות מוגבלת בתנאים כאלה. יתר על כן, השתק של חלבונים היעד יכול להפוך את הליך הכביסה הבאים קל יותר. מכאן, העיכול על הממברנה מתאים מאוד להכנת immunoprecipitants עבור ניתוח MS/MS. מספר מצומצם של הפרוטסים עשוי להיות מתאים לפרוטוקול זה. עד כה, רק lysyl-C, מלבד טריפסין, מדווח פעיל בנוכחות של עד 80% acetonitrile6,9,10,15.
טכניקת העיכול שלנו על הקרום מתאימה לזיהוי חלבונים בכמות קטנה של immunoprecipitant עם מגבלת זיהוי רגישה מאוד. עם זאת, יש לזכור כי יעילות הזיהוי של חלבון היעד תלויה בכמות הנוכחית. חלבונים המצויים בכמויות גדולות יותר הם בעלי היתר מזוהה והם עשויים למנוע חלבונים אחרים נוכח כמויות קטנות יותר להתגלות על ידי MS. אף על פי כן, בנסיבות רגילות חלבונים רבים מזוהים באמצעות ניתוח LC-ms/MS, ו בחני אחרים חייב לשמש להבהרת מי החלבונים המועמדים הם של המשמעות הביולוגית המתאימה.
במחקר זה, יש לנו הערכה טכניקת העיכול על הממברנה לניתוח של immunoprecipitants. שיטה כזו נוחה ומקיפה לניתוח אינטראקציות חלבונים בחלבון צריך להיות ישים באופן נרחב כדי לשפר את התפוקה של ניתוחים פרוטמית עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך בחלק על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 17K09869 (כדי AM), יפן האגודה לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 15K09418 (ל TM), מענק מחקר מבית החולים Kanehara איצ'ירו המדע ומענק מחקר מקרן הזיכרון של סוזוקן (all-TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
