Summary
우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.
Abstract
미토콘드리아 및 기관망망(ER)과 같은 세포 소기관은 다양한 기능을 수행하는 네트워크를 만듭니다. 이러한 고곡선 구조는 셀룰러 조건에 따라 동적 네트워크를 형성하기 위해 다양한 모양으로 접혀 있습니다. 미토콘드리아와 ER 사이 이 네트워크의 가시화는 초고해상도 형광 화상 진찰 및 광 현미경 검사법을 사용하여 시도되었습니다; 그러나, 제한된 해결책은 미토콘드리아와 ER 사이 막을 상세히 관찰하기에 불충분하다. 전송 전자 현미경 검사법은 세포 소기관의 관찰을 위한 좋은 막 대조 및 나노미터 규모 해결책을 제공합니다; 그러나 고곡선 소기관의 3차원(3D) 구조를 평가할 때 는 매우 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 우리는 강화된 아스코르브베이트 과산화공2 및 고추냉이 과옥시다아제 염색을 사용하여 상관경연산빛전자현미경법(CLEM) 및 부피 전자현미경기술을 통해 미토콘드리아와 ER의 형태를 관찰하였다. 3D 구조를 관찰하기 위해 엔블록 염색 방법, 초박형 직렬 단면화(배열 단층 촬영) 및 부피 전자 현미경을 적용하였다. 이 프로토콜에서는, 우리는 미토콘드리아와 ER의 상세한 구조적인 연구를 능력을 발휘하기 위하여 CLEM와 3D 전자 현미경 검사법의 조합을 건의합니다.
Introduction
미토콘드리아및기관망망소(ER)는 막결합 세포소기관입니다. 그들의 연결은 그들의 기능에 필요하고, 그들의 네트워크와관련있는 단백질은 1을 기술되었습니다. 미토콘드리아와 ER 사이의 거리는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 약 100 nm로 보고되었습니다2; 그러나, 최근 초고해상도 현미경 검사법3 및 전자 현미경 검사법 (EM)4 연구 결과는 대략 10-25 nm에서 상당히 더 작은 것으로 나타났습니다. 초고해상도 현미경 검사법에서 달성된 분해능은 EM보다 낮으며 특정 라벨링이 필요합니다. EM은 미토콘드리아와 ER 사이의 연결에 대한 구조적 연구를 위해 충분히 고분해능 대비를 달성하기에 적합한 기술이다. 그러나, 종래의 투과 전자현미경(TEM)의 경우 얇은 단면이 약 60 nm 또는 더 얇아야 하기 때문에 제한된 z축 정보가 제한된 단점이다. 충분한 EM z 축 화상 진찰을 위해, 3차원 전자 현미경검사법 (3DEM)는 5를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 단지 몇몇 숙련된 기술자가 마스터한 아주 까다로운 일인 전체 세포의 얇은 직렬 단면도의 수백의 준비를 관련시킵니다. 이러한 얇은 섹션은 깨지기 쉬운 formvar 필름 코팅 한 홀 TEM 그리드에 수집됩니다. 필름이 하나의 거드에서 파손되면 직렬 이미징 및 볼륨 재구성이 불가능합니다. 직렬 블록-얼굴 주사 전자 현미경 검사법 (SBEM)은 다이아몬드 나이프 (Dik-SBEM) 또는 초점 이온 빔 (FIB-SEM) 중 하나와 주사 전자 현미경 (SEM) 진공 챔버 내부 파괴적인 enbloc 절편을 사용하는 3DEM에 대한 인기있는 기술입니다 6. 그러나 이러한 기술은 모든 시설에서 사용할 수 없기 때문에 직렬 단면 및 SEM을 사용하여 배열 단층 촬영 7을 권장합니다. 어레이 단층 촬영에서, 울트라 마이크로 톰을 사용하여 절단 된 직렬 섹션은 TEM 그리드 대신 유리커버 슬립으로 전송되고 빛 현미경 검사법 및 SEM 8을 통해 시각화됩니다. 백스캐터 전자(BSE) 이미징신호를 향상시키기 위해 오스뮴 테트옥사이드(OsO 4)-오스미오필릭티오카르보하이드라지드(TCH) 9를 사용하는 고정형 세포를활용한 엔블록 EM 염색 프로토콜을 활용하여, 없이 이미지를 얻을 수 있게 되었습니다. 포스트 임베딩 이중 염색.
부가적으로, 미토콘드리아 마커 SCO1(시토크롬 c 산화다아제 어셈블리 단백질 1)-아스코르브베이트 과산화아제 2(APEX2)10 분자 태그를 EM 수준에서 미토콘드리아를 가시화하는 데 사용되었다. APEX2는 약 28 kDa이며 대두 아스코르브베이트 과산화수지11에서 유래된다. 녹색 형광 단백질 태그 단백질이 가벼운 현미경 검사법에서 사용되는 것과 같은 방식으로 EM 수준에서 특정 단백질의 상세한 위치를 보여주기 위해 개발되었습니다. APEX2는 3,3' -다미노벤지딘(DAB)을 공동인자 과산화수소(H2O2)의 존재 시 태그 부위에 불용성OSMiophilic 폴리머로 변환합니다. APEX2는 EM에서 전통적인 항체 라벨링의 대안으로 사용될 수 있으며, 전체 세포의 깊이에 걸쳐 단백질 국소화를 할 수 있다. 즉, APEX2 태그가 부착된 단백질은 초저온 절제 후 면역골 표지 및 투과없이 특이적 삼투압(11)에 의해 가시화될 수 있다. 고추냉이 과산화 효소(HRP)는 또한 H2O2-의존적DAB를 국부화된 침전물 내로 촉매시키는 민감한 태그이며, OsO4로처리한 후 EM 대비를 제공한다. ER 표적 펩티드 서열 HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)(12)을 전체 세포 내에서 ER을 시각화하기 위해 적용하였다. 감소된 오스뮴 및 TCH(rOTO 방법)로 유전적 태그 및 enbloc 염색을 활용하는 우리의 프로토콜을 평가하기 위해, 동시에 삼투유 효과를 사용하여, 우리는 rOTO en bloc 염색에서 각 유전자 태그의 사용 없이 막 대비를 비교하였다. APEX 및 HRP를 가진 배열 단층 촬영 및 DAB 염색을 가진 3DEM이 각각, 그밖 목적을 위해 이용되었더라도, 우리가 미토콘드리아와 ER 라벨링을 위한 3DEM및 DAB 염색을 위한 배열 단층 촬영을 결합했기 때문에 우리의 프로토콜은 유일합니다. 특히, 우리는 세포에 대한 유전자 변형의 효과를 조사하는 데 도움이 같은 섹션에서 APEX 태그 유전자없이 다섯 세포를 보여 주었다.
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Protocol
1. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드 벡터를 가진 패턴격자 배양 접시 및 세포 형질혈을 가진 세포 배양
- 종자 1 x 105 HEK293T 세포는 Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)에서 37 °C에서 5 % CO2를 포함하는 가습 된 분위기에서 35mm 유리 그리드 바닥 배양 접시에 배치하여 10 % 태아 소 혈청, 100 U / mL로 보충했습니다. 페니실린, 및 100 U / mL 연쇄상 구균.
- 세포를 파종 한 다음 날, 50 %-60 % 컨플루앙으로 성장했을 때 제조업체의 지침에 따라 형질 감염 시약을 사용하여 세포에 SCO1-APEX210 및 HRP-KDEL12 플라스미드를 도입하십시오 (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 μg + HRP-KDEL 플라스미드 DNA 0.5 μg 당 3 μL 트랜스펙션 시약).
2. 패턴 배양 접시에 성장하는 세포의 가벼운 현미경 검사법 및 APEX2 및 HRP를 위한 DAB 염색
- 형질전환 후 16-24시간에서, 모든 배양 배지를 제거하고 즉시 250 μL의 따뜻한(30-37°C) 고정 액액을 첨가한다(표 1)에 부드러운 파이펫팅을 한다. 즉시 고정 용액을 제거하고 1.5 mL의 새로운 고정 솔루션으로 교체하십시오. 60분 동안 얼음 위에 배양한 다음, 얼음-차가운 0.1 M 나트륨 카코디산완충제1mL에각각 10분동안 3회 세척한다(표 1).
주의: 알데히드 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오. - 차가운 (0-4 °C) 20 mM 글리신 용액 1 mL을 추가하고 얼음에 10 분 동안 배양한 다음 차가운 0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액의 1 mL에서 각각 5 분의 3 번의 세차서를 넣습니다.
- 신선한 1x DAB 용액(0.3M 카코디레이트 용액 3.33 mL + 30% H2O2 + 5.67 mL의 냉수 + 1 mL 10x DAB 용액)을 준비합니다.
- 신선하게 제조된 1x DAB 용액(단계 2.3)의 500 μL을 추가하고 뒤집힌 빛 현미경 아래에서 밝은 갈색 얼룩이 보일 때까지약 5-45분 동안 얼음위에 배양합니다(그림 1A).
- DAB 용액을 부드럽게 제거하고 차가운 0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액 1mL로 각각 10 분 동안 3 회 헹구십시오.
- 위상 대비 반전 현미경(또는 밝은 필드 광 현미경)을 사용하여 100배 이상의 배율로 DAB 염색을 시각화합니다. 관심 영역(ROI)이 있는 유리의 맨 아래에 마커 펜을 표시합니다(그림1B,C).
3. EM 블록에 대한 샘플 준비
- 단계 2.1-2.6에 기재된 바와 같이 세포 배양 및 DAB 염색을 수행한다.
- 1 mL의 2%로 시료를 4°C에서 1시간 동안 OsO4를 감소시다.
주의: OsO4 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오. - 3.2단계에서 새로운TCH 용액(표 1)을 준비하고 0.22-μm 필터를 통과한다.
주의: TCH 연기는 매우 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드 아래에서 모든 작업을 수행하십시오. - 1 mL의 증류수로 고정물을 제거하고 실온(RT)에서 각각 5분 동안 헹구어 보시고 헹구어 보시기합니다.
- RT에서 이전에 제조되고 여과된 TCH 용액의 1 mL에 세포를 20분 동안 놓습니다.
- RT에서 각각 5 분 동안 증류수 1 mL로 세포를 세 번 헹구고.
- RT에서 30분 동안 증류수에 2% 오스뮴 테트옥사이드의 1 mL에 세포를 두 번째로 노출시켰다.
- RT에서 증류수 1mL로 3회 고정식을 제거하고 3회 헹구십시오.
- RT에서 증류수 1 mL에서 세포를 3 회 5 분 동안 씻으소서.
- 30 분 동안 60 °C에서오븐에 미리 따뜻한 월튼의 납 아스파타트 용액 (표 1).
- 미리 데운 납 아스파르타액 1mL를 첨가하여 월튼의 납 아스파르타액으로 세포를 염색한 다음 60°C에서 30분 동안 오븐에 넣습니다.
- RT에서 각각 5 분 동안 증류수 1 mL로 세포를 세 번 헹구고.
- 2mL 에탄올 aliquots의 등급시리즈로 배양(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) RT에서 각각 20 분 동안.
- 에탄올을 3:1 에탄올의 1 mL에서 30분 동안 배양하였다:RT에서 저점도 임베딩 혼합물 배지.
- 배지를 제거하고 1mL의 1mL를 추가하여 1:1 에탄올:저점도 임베딩 혼합물 배지를 넣습니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 배지를 제거하고 1mL의 1mL를 추가하여 1:3 에탄올:저점도 임베딩 혼합물 배지를 삽입합니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 배지를 제거하고 100% 저점도 임베딩 배지의 1 mL를 추가하고 밤새 배양합니다.
- 샘플을 100% 저점도 임베딩 혼합물에 넣고 60°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 울트라 마이크로토메를 사용하여 90-nm 두께의 섹션을 준비합니다.
- 200 kV에서 TEM 아래의 그리드를 관찰하십시오.
4. SEM 이미징을 위한 인듐 주석 산화물 코팅 커버슬립에 직렬 단면 및 장착
-
기판 준비
- 30-60s의 이소프로판올에서 부드럽게 교반하여 인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 커버슬립 (22mm x 22mm)을 청소하십시오.
- 커버립을 제거하고, 여분의 이소프로판올을 빼내고, 건조해질 때까지 먼지가 없는 환경에 두십시오.
- 1분 동안 플라즈마 코팅기를 사용하여 광섬유 배출에 의해 ITO 코팅 유리 커버슬립을 처리합니다.
참고 : 플라즈마 활성화는 기판 표면에 친수성 특성을 부여합니다. 단면이 기판에 부착될 때 섹션내의 주름 형성을 방지하기 위해 기판 상에 매우 얇은 물 막을 생성한다. - ITO 코팅 유리 커버를 기판 홀더에 삽입하고 칼 보트에 넣습니다.
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샘플 블록 및 직렬 단면 트리밍
- 샘플 블록을 울트라마이크로토메의 샘플 홀더에 넣고 트리밍 블록에 넣습니다.
- 면도날을 사용하여 대상 위치 주위의 모든 여분의 수지(단계 2.6, 그림 1D-G에서식별)를 다듬습니다. 블록 면의 모양은 사다리꼴 또는 직사각형이어야 합니다. 선행 가장자리와 후행 가장자리는 절대적으로 평행해야 합니다(그림1H,I).
- 샘플 홀더를 울트라마이크로톤의 팔에 삽입하고 다이아몬드 나이프를 칼 홀더에 넣습니다. ITO 유리 커버슬립을 리본 캐리어에 삽입하고 핸들로캐리어를 고정합니다(그림 1J). 리본 캐리어를 칼 보트에 넣고 여과 된 증류수로칼 보트를 채웁니다 (그림 1K).
- 홀더의 손잡이를 조심스럽게 밀어 ITO 유리의 가장자리를 칼에 가깝게 설정하여 칼의 슬라이드로 캐리어위치를 조정합니다(그림 1L).
- 절편을 절단 한 후, 절편 과정을 중지하고 천천히 튜브의 클램핑 나사를 열고 물 보트 (초당 물 한 방울의 유량)를 배수.
- 리본 수집 과정을 완료한 후, 클램핑 장치의 손잡이로 기판을 제거하고리본을 건조시다(도 1M).
5. SEM의 이미징 및 SEM 이미지 스택정렬
- 끈적끈적한 카본 테이프로 알루미늄 스텁에 ITO 코팅 커버슬립을 장착합니다. 끈적끈적한 탄소 테이프로 스텁의 유리 표면과 표면을 밀봉한 다음 10-nm두께의 탄소 층으로 코팅합니다(그림 1N).
- 5kV의 낮은 가속도 전압과 효율적인 BSE 수집을 위한 적절한 작업 거리에서 현장 방출 SEM에서 ITO 코팅 커버슬립을 관찰합니다.
- 가상 스택 옵션을 사용하여 직렬 이미지를 이미지 J 소프트웨어(Fiji)13으로 가져옵니다. 새 TrakEM14를열고 이미지 스택을 TrakEM으로 가져옵니다. 오른쪽 마우스 버튼을 클릭하고 정렬 메뉴를 선택합니다.
- 그런 다음 첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지 이미지 범위를 선택합니다. 자동 정렬을 완료하고 정렬된 데이터 집합을 저장한 다음 내보내기를 선택하여 선택한 이미지 범위(첫 번째 이미지에서 마지막 이미지까지)에서 플랫 이미지를 컴파일합니다. 마지막으로, 이미지 J 메인 메뉴에 AVI 형식으로 평면 이미지 데이터를 저장합니다.
참고: 보조 동영상 1과 추가 동영상 2는 각각 SEM 이미지 스택과 잘림된 이미지 스택을 표시합니다.
6. 직렬 이미지에서 미토콘드리아 및 ER의 세분화
- IMOD15 소프트웨어에서 3dmod를 시작하고 이미지 파일을 엽니 다.
- ZaP 창에서 중간 마우스 단추를 사용하여 미토콘드리아와 ER의 윤곽을 그립니다.
- 분할된 볼륨을 시각화하려면 모델 뷰 창(추가동영상3)을 엽니다.
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Representative Results
그림 1은 이 프로토콜의 일정및 워크플로를 설명합니다. 프로토콜은 7 일이 필요합니다. 그러나 SEM 이미징에 소요된 시간에 따라 증가할 수 있습니다. 세포 형질감염의 경우, 세포의 결합은 전체 그리드 플레이트의 바닥을 덮지 않도록 제어되어야 한다(도1A). 높은 세포 밀도는 빛 현미경 및 EM 관찰 도중 관심 있는 세포의 확인을 방지할 수 있었습니다. 우리는 배양 접시에 있는 수많은 배양세포 중에서 효율적으로 형질감염된 세포를 선택하기 위하여 APEX2 및 HRP를 표현한 유전으로 표를 붙인 플라스미드를 이용했습니다. 우리는 HEK293T 세포를 배양하고 공동 형질감염 세포에서 SCO1-연결된 APEX2(미토콘드리아 막 간 공간 [IMS]) 및 HRP 접합 KDEL(ER)의 발현을 확인하였다. 가벼운 현미경 검사법하에서, APEX2 형질감염된 세포는 갈색으로 염색된 반면, 형질감염이 없는 세포는 얼룩이 없는 채로 남아 있었다(그림1A 및 그림2). 이는 배양된 세포 집단에서 DAB 염색을 사용하여 상관경광-전자 현미경 검사법(CLEM)을 위해 사용된 형질감염된 표적 세포의 식별을 허용하였다(그림3D-F 및 도 4B). 평평한 임베딩 단계 동안 대상 셀의 위치를 쉽게 식별할 수 있도록 유리 바닥(도1B,C)을표시하는 것이 도움이 되었다(도1E,F). HEK293T 세포를 강화된 "이중 오스뮴" 염색 프로토콜(rOTO)으로 처리했을 때, 전체 세포를어두운 색으로 염색하였다(도 1D). 배양 접시에서 격자 커버슬립을 제거한 후, 스테레오 현미경으로 블록 표면의표적 위치를 확인하였다(도 1G). 우리는 사다리꼴 모양으로 ROI의 세포를 트리밍하고, 선행 및 후행 가장자리는 병렬로 만들어졌다 (그림1H,I). 미토콘드리아 및 ER 네트워크 재구성을 구현하기 위해 대형 워터 보트가 달린 대형 다이아몬드 나이프를 사용하여 SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 표현 HEK293T 셀(그림1J-L)을연속적으로 섹션으로 처리했습니다. 직렬 90-nm 두께의 리본 섹션은 ITO 코팅 유리커버슬립(도 1M)에 성공적으로 부착되었고, 표면은 SEM을 통해 관찰을 위해 10-nm 두께의 탄소로 코팅되었다(도1N).
SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 단백질은 TEM(그림3)및 SEM(그림 4)에서 검출가능한 DAB 변환에서 유래된 고밀도 전자 신호를 생성합니다. SCO1-APEX2에 의해 생성된 어두운 얼룩은 미토콘드리아의 매트릭스 공간이 아닌 IMS에서 독점적으로 관찰되었다(그림3D). SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드를 모두 사용하여 공동 형질감염 세포(도 3D,E)는 미토콘드리아 IMS 및 ER에서 고밀도 전자 신호를 발현하고; 그러나, 우리는 SCO1-APEX2 (그림 3D,F에있는 오른쪽 세포)로만 형질감염된 세포에서 ER 염색이 없는 것을 관찰했습니다. 먼저 SEM을 사용하는 직렬 이미지의 경우 넓은 영역에 걸쳐 BSE 검출기를 사용하여전체 배열 이미지의 개요를 만들었습니다(그림 4A). 둘째, ROI는 첫 번째 섹션에 배치되고 다른 모든섹션으로 전파되었습니다(그림 4B). 마지막으로 5nm 이미지 픽셀(그림 4C)을 가진 5개의대상 셀을 포함하는 ROI를 시각화했습니다. 확대 된 이미지는 골지 장치,미토콘드리아, 핵 및 ER과 같은 상세한 세포 내 세포 구조 (그림 4D)를 밝혀냈습니다. 직렬 이미지는 ER-미토콘드리아 접촉이 다른 z-평면에서 발생하고 있음을 명확하게 보여 주었다 (보충영화 2 및 보충 영화3).
그림 1 : S 충분한 준비 워크플로우 SEM 및 TEM에 대한. (a) 격자커버를 함유한 배양접시를 세포로 씨를 뿌리고 DAB로 염색하였다. (B,C) DAB 염색 후, 마커 펜을 사용하여 표적 세포가 위치한 유리의 바닥을 표시하였다. (D) OsO 4 염색 후, 세포는 어두운 색이 됩니다. (E,F) 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 튜브(또는 모든 유형의 임베딩 캡슐)를 사용하여 표시된 위치를 포함하는 EM 블록을 쉽게 만들 수 있습니다. (E) 맨 위 보기. (F) 하단 보기입니다. (G) EM 블록의 표면의 저배선 스테레오 현미경 이미지. (H) ROI가 평평한 표면의 중간에 있습니다. (I) 직사각형 ROI의 더 높은 배율 스테레오 현미경 이미지. (J) ITO 코팅 유리 커버슬립(흰색 별표)이 리본 캐리어(파란색 화살표)에 삽입되고, 캐리어는 핸들을 시계 방향으로 돌려 서 고정됩니다. (K,L) 홀더의 손잡이를 조심스럽게 밀고, 캐리어는 ITO 코팅 유리 커버 슬립의 가장자리를 슬라이딩하여 칼에 가깝게 배치하도록 조정됩니다. (M) 리본은 ITO 코팅 유리 커버슬립에 부착되어 있습니다. (N) ITO 코팅 유리 커버슬립은 SEM 스텁에 부착되고 잔류 유리는 끈적끈적한 카본 테이프로 밀봉되고 10nm 탄소 실 층으로 코팅됩니다. 흰색 별표는 ITO 코팅 유리 커버슬립을 나타내고 검은색 별표는 탄소 테이프를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: DAB로 염색된 배양 HEK293T 세포의 반전상 대비 현미경 영상. (A) DAB만으로 세포의 염색 (OsO4 염색 제외). 흰색 화살표는 얼룩지지 않은 셀을 나타내고 검은 색 화살표는 DAB 염색 된 세포를 나타냅니다. (B) ROI의 고배율 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 표적 미토콘드리아 IMS(SCO1-APEX2) 및 ER(HRP-KDEL)을 나타내는 HEK293T 세포의 TEM 이미징. (A-C) 미토콘드리아(M) 및 안구 망막(ER)의 이중 막을 나타내는 비트랜스퍼 HEK293T 세포. (D-F) APEX2 및 HRP는 DAB의 중합을 국부침수로 촉매화하고, 이는 이후에 전자 조밀한OsO 4로 염색된다. 미토콘드리아 IMS(검은색 화살촉)와 ER(검은색 화살표)에서 어두운 대비가 뚜렷합니다. 그러나, HRP-KDEL으로 형질감염되지 않은 세포는 얼룩지지 않은 ER(흰색 화살표)을 나타낸다. 배율 표시줄: 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 표적 미토콘드리아 IMS(SCO1-APEX2) 및 ER(HRP-KDEL)을 나타내는 HEK293T 세포의 직렬 SEM 이미징. (A) BSE 검출기를 사용하여 관찰된 직렬 섹션 리본의 개요. (B) 고배율 BSE 이미지와 저배율 이미지(inset)의 상관관계(흰색 점선 상자는 DAB 염색 셀의 ROI를 나타낸다). (C) 5-nm 이미지 픽셀을 가진 ROI 대상 셀의 높은 배율. (D,E) 어두운 대조는 미토콘드리아 IMS 및 ER에서 명백하지만 골지 장치는 아닙니다. (F-I) ER-미토콘드리아 접점(흰색 화살표)은 다른 z-평면에서 발생합니다. N, 핵; M, 미토콘드리아; ER, 안구 망막; G, 골지 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 솔루션 레시피.
보조 동영상 1: SEM 이미지 스택. TrakEM14 소프트웨어피지13 91 이미지를 정렬하는 데 사용되었다. 원래 정렬된 데이터 집합은 11GB입니다. 스택의 크기를 조정하기 위해 크기 조정 및 자른 이미지 집합이 사용되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
추가 동영상 2: 잘렸은 이미지 스택. 미토콘드리아, ER 및 연락처 사이트를 자세히 시각화하기 위해 원본 데이터 세트(5nm/픽셀)에서 이미지를 잘라내었습니다. 배율 표시줄: 1 μm. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
보충 영화 3: 미토 콘 드리 아 와 ER의 3D 재건. 3D 시각화의 경우 IMOD15 소프트웨어를 사용하여 미토콘드리아와 ER의 윤곽을 세분화하고 시각화했습니다. 미토콘드리아는 긴 관 구조(빨간색)로 시각화되었고 ER 네트워크(녹색)는 복잡한 형태를 보였다. 노란색은 상이한 z-평면에서 미토콘드리아와 ER 사이의 접촉 부위의 넓은 표면적을 나타냈다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
EM을 사용하여 나노미터 해상도에서 특정 단백질의 세포 국소화를 결정하는 것은 단백질의 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 EM을 통해 표적 단백질의 국소화를 연구하는 두 가지 기술이 있다. 하나는 1960년부터 EM에서 사용되어 온 면역골 기술이며, 다른 하나는 최근에 개발된 유전자 부호타호16을사용하는 기술이다. 전통적인 면역금 기술은 표지된 단백질의 위치를 보여주기 위하여 항체 공액 금 입자 또는 양자점을 채택했습니다. 그러나, 고품질 항체에 대한 요구 사항 및 수지 및 고정제에 의해 영향을받는 항체의 침투 효율로 인해,이 기술은17크게 제한된다. 구체적으로, 면역골 라벨링은 주로 엔블록 금속 염색 및 강한 오스뮴 고정없이 초박형 섹션의 표면에 제한되기 때문에, 이 기술은 현대 3DEM18에직접 적용되지 않는다. SBEM 및 어레이 단층 촬영을 포함한 최근의 3DEM 방법을 단백질 라벨링과 함께 사용하기 위해 이 프로토콜에서 유전적으로 인코딩된 EM 태그를 활용했습니다. 유전적으로 인코딩된 태그는 고정 전에 관심 부위에 국한되어 있기 때문에 투과, 기술적으로 까다로운 초저온 절제 및 개별 섹션의 면역 염색을 필요로 하지 않습니다.
3DEM에서 시료 준비를 위한 절차는 일반적으로 세포가 주로 C, H, O 및 N으로 구성되기 때문에 일반적인 화학 적 고정 및 중금속 염색 방법의 조합을 포함하며, EM 9하에서 대비를 얻기 위해 중금속으로 염색해야합니다. . 따라서 직렬 이미징의 대비와 전도도를 향상시키기 위해 감소된 오스뮴 고정 및 금속 염색을 사용했습니다. 단면화 전에 샘플을 염색하는 절차는, en bloc 염색으로 알려져 있으며, SBEM 및 FIB-SEM19와같은 3DEM 방법에 대한 필수적인 단계로 보고되었다. 우리는 우리의 프로토콜에 있는 en bloc 염색된 세포가 TEM에서 각각 미토콘드리아 IMS 및 ER에서 독점적으로 명확한 SCO1-APEX2 및HRP-KDEL EM 대조를 입증했다는 것을 확인하였다(그림 3). 더욱이, 90-nm 직렬 단면도에서 SEM 심상은두 세포기관 모두에서 명확한 대조를 드러냈습니다 (그림 4). 특히, 엔블록 염색에 의한 향상된 콘트라스트는 DAB 신호와 뚜렷하게 구별되었고, 콘트라스트와전도도는 양질의 직렬 이미지(그림 4)를 낳았다. 또한 이 고대비는 3차원(3D) 이미지 소프트웨어로 정렬 및 세분화와 같은 후속 작업을 용이하게 하는 데 도움이 됩니다.
최근 몇 년 동안, 볼륨 전자 현미경 기술 (dik-SBEM, FIB-SEM 및 배열 단층 촬영)은 넓은 시야와 3D 보기의 관찰을 요구하는 생물학적 질문에 대답했습니다. Dik-SBEM 및 FIB-SEM은 섹션의 물리적 처리를 포함하지 않으므로 이미지 정렬에 소요되는 시간을 줄일 수 있습니다. 그러나, 샘플은 직렬 이미지를 얻기 위하여 파괴되어야 하고, 보기의 필드는 배열 단층 촬영의 그것 보다는 더 작습니다. 배열 단층 촬영을 사용하여 직렬 SEM 화상 진찰은 TEM 직렬 단면도에 대한 대안으로 점점 더 채택되고, 이 기술의 주요 이점은 그것의 비파괴적인 방법 및 넓은 시야입니다. dik-SBEM 및 FIB-SEM과 같은 다른 3DEM 기술과 달리, 섹션은 커버슬립, ITO 코팅 커버슬립, 실리콘 웨이퍼 또는 테이프에 저장될 수 있으며7을반복적으로 이미지화할 수 있다.
APEX2는 사용하기 쉽고 미니 일중염 산소 발생기(20) 또는 형광 단백질21 기술과 달리 특수 장비 없이 다양한 염색 밀도를 제공할 수 있으며, 광산화를 통해 DAB 침전을 발생시다. 그것의 가변 적인 응용은 COS 7 및 HEK293T 세포22에서핵, 혈장 막, 미토콘드리아 매트릭스, 미토콘드리아 크리스티, ER, tubulin 및 액틴을 포함하는 몇몇 세포 소기관에서 시험되었습니다. 그러나 전자 현미경에서 유전적으로 인코딩된 태깅을 사용하기 위한 몇 가지 제한 사항과 몇 가지 체크포인트가 있습니다. 외인성 유전자의 발현 수준은 유전 태그의 발현이 너무 높으면 가양성 신호를 유도하고 막 파열을 통해 세포의 초구조를 교란시킬 수 있기 때문에 EM 수준에서 합리적인 염색을 달성하기 위해 제어되어야 합니다. 및 세포소기관 응집23. 또 다른 가능한 문제는 DAB 오버스테인링이며, 이는 흐림및 막 파괴(22)를 유발하는 것으로 보고되었다. 유전자의 적절한 발현을 보장하기 위해, DAB 염색 된 세포는 가벼운 현미경 검사법 및 EM을 모두 사용하여 염색되지 않은 세포와 비교하였다 (도2 및 도3). 추가적으로, 고정 수준은 내인성 산화증이 완전히 비활성이다는 것을 확인하기 위하여 잘 통제되어야 합니다. 처리 도중 내인성 산화제에서 어떤 유물든지 방지하기 위하여, 우리는 분리된 및 펠릿한 세포(24)를사용하는 대신 세포의 단층을 고정했습니다. 이것은 또한 우리가 빛 현미경 검사법의 밑에 DAB 신호를 검사할 때 관심있는 세포를 확인하는 것을 도왔습니다. 따라서, 우리의 결과는 세포 단층의 염색 및 고정이 DAB 염색을 사용하는 CLEM에 유용하다는 것을 나타낸다(도 2). 어레이 단층 촬영 및 3D 모델이있는 직렬 이미지는 ER -미토콘드리아 접촉 부위가 다른 z-planes에서 발생한다는 것을 밝혔다 (보충영화 2 및 보충 영화3). 이미지는 전체 세포에서 미토콘드리아 및 ER 네트워크의 완전한 3D 시각화를 생성합니다(보충영화1). 그것은 3D 부피 분석이 ER-미토콘드리아 접촉의 정량적인 비교를 위해 필수적이다는 것을 건의합니다. 세포 내 세포 기관의 복잡한 네트워크를 연구 할 때, 이것은 매우 유용한 기술입니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 EM 수준에서 전체 세포 조사를 허용하는 CLEM 및 3DEM 기술의 효율적인 조합이었습니다. 특히, 두 개의 서로 다른 태그동시에 두 개의 다른 세포기관에서 DAB 신호는 전체 세포에서 볼 수 있었다. 또한, 동일한 섹션에 표지된 세포 및 표지되지 않은 세포는 대규모 EM으로 인해 비교될 수 있다. 이 프로토콜에서, 유전자 부호화 태그로부터의 엔블록 염색 및 DAB 신호는 전체 세포에서 막대한 세포기관 간의 상호작용을 조사하는데 유용하였다. 이것은 그밖 세포 상호 작용을 조사하기 위하여 대규모 EM을 위한 적당한 응용일 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 한국과학기술정보통신부(19-BR-01-08)의 지원을 받는 한국뇌연구원과 한국정부(MSIT)의 후원을 받은 한국뇌연구원(NRF)을 통해 지원되었다. 2019R1A2C10634). SCO1-APEX2와 HRP-KDEL 플라스미드는 이현우(서울대학교)가 친절하게 제공했다. TEM 데이터는 KBRI의 뇌 연구 핵심 시설에서 수집되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
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