Summary
Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.
Abstract
Los orgánulos celulares, como las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER), crean una red para realizar una variedad de funciones. Estas estructuras altamente curvadas se pliegan en varias formas para formar una red dinámica dependiendo de las condiciones celulares. La visualización de esta red entre las mitocondrias y la sala de res ha intentado utilizar imágenes de fluorescencia de superresolución y microscopía de luz; sin embargo, la resolución limitada es insuficiente para observar las membranas entre las mitocondrias y urgencia en detalle. La microscopía electrónica de transmisión proporciona un buen contraste de membrana y resolución a escala de nanómetros para la observación de orgánulos celulares; sin embargo, es excepcionalmente lento al evaluar la estructura tridimensional (3D) de los orgánulos altamente curvados. Por lo tanto, observamos la morfología de las mitocondrias y la ER a través de la microscopía electrónica de luz correlativa (CLEM) y las técnicas de microscopía electrónica de volumen utilizando ascorbato peroxidasa 2 mejorado y tinción de peroxidasa de rábano picante. Se aplicó un método de tinción en bloque, seccionamiento en serie ultrafino (tomografía de matriz) y microscopía electrónica de volumen para observar la estructura 3D. En este protocolo, sugerimos una combinación de clem y microscopía electrónica 3D para realizar estudios estructurales detallados de las mitocondrias y la ER.
Introduction
Las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER) son orgánulos celulares ligados a la membrana. Su conexión es necesaria para su función, y las proteínas relacionadas con su red han sido descritas1. La distancia entre las mitocondrias y la ER se ha notificado en aproximadamente 100 nm utilizando la microscopía de luz2; sin embargo, los recientes estudios de microscopía3 de superresolución y microscopía electrónica (EM)4 han revelado que es considerablemente más pequeño, de aproximadamente 10-25 nm. La resolución alcanzada en la microscopía de superresolución es inferior a EM, y el etiquetado específico es necesario. EM es una técnica adecuada para lograr un contraste de alta resolución suficiente para estudios estructurales de las conexiones entre las mitocondrias y la ER. Sin embargo, una desventaja es la información limitada del eje z porque las secciones delgadas deben ser aproximadamente 60 nm o más delgadas para la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM). Para obtener suficientes imágenes del eje z EM, se puede utilizar microscopía electrónica tridimensional (3DEM)5. Sin embargo, esto implica la preparación de cientos de secciones seriales delgadas de células enteras, que es un trabajo muy complicado que sólo unos pocos tecnólogos calificados han dominado. Estas secciones delgadas se recogen en rejillas TEM de un solo orificio recubiertas con película de formvar frágiles. Si la película se rompe en una faja, la toma de imágenes en serie y la reconstrucción del volumen no son posibles. La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) es una técnica popular para 3DEM que utiliza seccionamiento destructivo en bloque dentro de la cámara de vacío del microscopio electrónico de barrido (SEM) con un cuchillo de diamante (Dik-SBEM) o un haz de iones enfocado (FIB-SEM) 6. Sin embargo, debido a que esas técnicas no están disponibles en todas las instalaciones, sugerimos la tomografía de matriz7 utilizando seccionamiento en serie y SEM. En la tomografía de matriz, las secciones en serie cortadas con un ultramicrotomo se transfieren aun cubreobjetos de vidrio en lugar de a una rejilla TEM y se visualizan mediante microscopía de luz y SEM 8. Para mejorar la señal para la toma de imágenes de electrones de retrodispersión (EEB), utilizamosun protocolo de tinción EM en bloque que emplea células fijas de tetróxido de osmio (OsO 4) con tiocarbohidrazida osmiofílica (TCH)9,lo que nos permite obtener imágenes sin post-incorporación de doble tinción.
Además, se utilizó el marcador mitocondrial SCO1 (proteína de ensamblaje del citocromo c oxidasa 1)– ascorbato peroxidasa 2 (APEX2)10 etiqueta molecular para visualizar las mitocondrias a nivel EM. APEX2 es aproximadamente 28 kDa y se deriva de la soja ascorbato peroxidasa11. Fue desarrollado para mostrar la ubicación detallada de proteínas específicas a nivel EM de la misma manera que la proteína etiquetada con proteína fluorescente verde se utiliza en la microscopía ligera. APEX2 convierte 3,3' -diaminobenzidina (DAB) en un polímero osmiofílico insoluble en el sitio de la etiqueta en presencia del peróxido de hidrógeno cofactor (H2O2). APEX2 se puede utilizar como una alternativa al etiquetado tradicional de anticuerpos en EM, con una localización de proteínas a lo largo de toda la célula. En otras palabras, la proteína etiquetada APEX2 se puede visualizar mediante la osmicación específica11 sin etiquetado de inmunooro y permeabilización después de la ultracriosección. La peroxidasa de rábano picante (HRP) es también una etiqueta sensible que cataliza la polimerización dependiente H2O2de DAB en un precipitado localizado, proporcionando contraste EM después del tratamiento con OsO4. La secuencia de péptidos objetivo de ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 se aplicó para visualizar ER dentro de una célula entera. Para evaluar nuestro protocolo de utilización de etiquetas genéticas y tinción en bloque con osmio reducido y TCH (método rOTO), utilizando el efecto de osmication al mismo tiempo, comparamos el contraste de membrana con y sin el uso de cada etiqueta genética en la tinción rOTO en bloc. Aunque 3DEM con tomografía de matriz y tinción DAB con APEX y HRP se han utilizado, respectivamente, para otros fines, nuestro protocolo es único porque hemos combinado la tomografía de matriz para tinción 3DEM y DAB para mitocondrias y etiquetado ER. Específicamente, mostramos cinco células con y sin genes etiquetados con APEX en la misma sección, lo que ayudó a investigar el efecto de la modificación genética en las células.
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Protocol
1. Cultivo celular con plato de cultivo de rejilla estampado y transfección celular con vector de plásmido SCO1-APEX2 y HRP-KDEL
- Semilla 1 x 105 HEK293T células colocándolas en platos de cultivo con fondo de rejilla de vidrio de 35 mm en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 a 37 oC en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco complementado con suero bovino fetal 10%, 100 U/ml penicilina y 100 U/ml de estreptomicina.
- Al día siguiente de la sembración de las células, cuando han crecido a 50%-60% de confluencia, introducir el Plásmido SCO1-APEX210 y HRP-KDEL12 a las células utilizando reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 g + ADN plásmido HRP-KDEL 0,5 g por reactivo de transfección de 3 l).
2. Microscopía ligera de células que crecen en platos de cultivo estampados y tinción DAB para APEX2 y HRP
- A 16-24 h después de la transfección, retire todos los medios de cultivo y agregue inmediatamente 250 éL de solución de fijación caliente (30-37 oC) (Tabla1) mediante pipeteo suave. Retire inmediatamente la solución de fijación y reemplácela por 1,5 ml de solución de fijación fresca. Incubar sobre hielo durante 60 minutos, y luego lavar tres veces durante 10 minutos cada una en 1 ml de tampón de cacodilato sódico de 0,1 M de hielo (Tabla 1).
ADVERTENCIA: Los humos de aldehuroson son extremadamente tóxicos. Realice todo el trabajo bajo una campana de humo ventilada. - Añadir 1 ml de solución de glicina fría (0-4 oC) 20 mM e incubar durante 10 min sobre hielo seguido de tres lavados de 5 min cada uno en 1 ml de tampón frío de cacolido sódico de 0,1 M.
- Preparar una solución DAB fresca de 1x (3,33 ml de solución de cacodilato de 0,3 M + 10 ml de 30% H2O2 + 5,67 ml de agua fría + 1 ml 10x solución DAB).
- Añadir 500 l de la solución DAB 1x recién preparada (paso 2.3) e incubar sobre hielo durante aproximadamente 5-45 min hasta que una mancha marrón claro sea visible bajo un microscopio de luz invertida (Figura1A).
- Retire suavemente la solución DAB y enjuague tres veces con 1 ml de tampón de cacodilato sódico frío de 0,1 M durante 10 minutos cada uno.
- Utilice un microscopio invertido de contraste de fase (o un microscopio de luz de campo brillante) para visualizar la tinción DAB con un aumento de 100x o superior. Utilice un rotulador para marcar la parte inferior del cristal donde se encuentra la región de interés (ROI) (Figura1B,C).
3. Preparación de muestras para el bloque EM
- Realice el cultivo celular y la tinción DAB como se describe en los pasos 2.1-2.6.
- Post-fijar las muestras con 1 mL de 2% de OsO reducido4 durante 1 h a 4 oC.
ADVERTENCIA: Los humos OsO4 son altamente tóxicos. Realice todo el trabajo bajo una campana de humo ventilada. - Prepare una nueva solución de TCH (Tabla1) durante el paso 3.2 y pase a través de un filtro de 0,22 m.
ADVERTENCIA: Los humos TCH son altamente tóxicos. Realice todo el trabajo bajo una campana de humo ventilada. - Retire el fijador y enjuague tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente (RT).
- Coloque las celdas en 1 ml de solución TCH previamente preparada y filtrada durante 20 minutos a RT.
- Enjuague las células tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada una a RT.
- Exponer las células por segunda vez a 1 ml de tetróxido de osmio al 2% en agua destilada durante 30 minutos a RT.
- Retirar el fijador y enjuagar tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada uno en RT. Añadir 1 ml de acetato de ursilo al 1% (acuoso), y dejar pasar la noche a 4 oC en la oscuridad.
- Lavar las células tres veces en 1 ml de agua destilada durante 5 minutos cada una a RT.
- Precalentar la solución de aspartato de plomo de Walton (Tabla1) en un horno a 60 oC durante 30 min.
- Manchar las células con la solución de aspartato de plomo de Walton agregando 1 ml de la solución de aspartato de plomo precalentada, y luego colocar en un horno durante 30 minutos a 60 oC.
- Enjuague las células tres veces con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada una a RT.
- Incubar en una serie calificada de alícuotas de etanol de 2 ml (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) durante 20 minutos cada uno en RT.
- Decantar el etanol e incubar durante 30 min en 1 ml de etanol 3:1:bajo caudal de viscosidad a RT.
- Retire el medio y agregue 1 ml de etanol 1:1: medio de mezcla de incrustación de baja viscosidad. Incubar durante 30 min a RT.
- Retire el medio y agregue 1 ml de etanol 1:3: medio de mezcla de incrustación de baja viscosidad. Incubar durante 30 min a RT.
- Retire el medio y agregue 1 ml de medio de incrustación 100% de baja viscosidad e incubar durante la noche.
- Incruste la muestra en una mezcla de incrustación 100% de baja viscosidad e incubar durante 24 h a 60 oC.
- Prepare secciones gruesas de 90 nm con un ultramicrotome.
- Observe la rejilla bajo TEM a 200 kV.
4. Seccionamiento y montaje en serie en cubiertas recubiertas de óxido de indio-tin para imágenes SEM
-
Preparación del sustrato
- Limpie los revestimientos de vidrio recubiertos de indio-tin-óxido (ITO) (22 mm x 22 mm) mediante agitación suave en isopropanol durante 30-60 s.
- Retire los labios de las cubiertas, drene el exceso de isopropanol y deje en un ambiente libre de polvo hasta que se seque.
- Trate los revestimientos de vidrio recubiertos con ITO por descarga de resplandor utilizando una recubridora de plasma durante 1 min.
NOTA: La activación del plasma confiere una propiedad hidrófila a la superficie del sustrato. Crea una película de agua muy delgada en el sustrato para evitar la formación de arrugas en las secciones cuando la sección está unida al sustrato. - Inserte las cubiertas de vidrio recubiertas de ITO en el soporte del sustrato y colóquelas en el bote de cuchillos.
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Recorte del bloque de muestra y seccionamiento en serie
- Inserte el bloque de muestra en el soporte de muestra del ultramicrotoma y establézcalo en el bloque de recorte.
- Utilice una cuchilla de afeitar para recortar todo el exceso de resina alrededor de la posición objetivo (identificada en el paso 2.6, Figura 1D-G). La forma de la cara del bloque debe ser trapezoidal o rectangular. El borde delantero y el borde final deben ser absolutamente paralelos (Figura1H,I).
- Inserte el soporte de muestra en el brazo del ultramicrotoma y coloque el cuchillo de diamante en el portacuchillas. Inserte los cubreobjetos de vidrio ITO en el soporte de cinta y sujete el soporte con el mango (Figura 1J). Ponga el portacintas en el barco de la cuchilla y llene el barco con agua destilada filtrada (Figura1K).
- Ajuste la posición del soporte con la corredera del cuchillo empujando cuidadosamente el mango del soporte para ajustar el borde del cristal ITO cerca del cuchillo (Figura1L).
- Después de cortar la sección, detenga el proceso de corte y abra lentamente el tornillo de sujeción del tubo y drene el bote de agua (tasa de flujo de una gota de agua por segundo).
- Después de completar el proceso de recogida de cintas, retire el sustrato con el mango del dispositivo de sujeción y seque la cinta (Figura1M).
5. Imágenes en el SEM y alineación de la pila de imágenes SEM
- Monte el cubreobjetos recubierto de ITO en talones de aluminio con cinta adhesiva de carbono. Sellar la superficie de vidrio y la superficie en el talón con cinta adhesiva de carbono, y luego cubrir con una capa de carbono de 10 nm de espesor (Figura1N).
- Observe el cubreobjetos recubierto con ITO en una emisión de campo SEM a una baja tensión de aceleración de 5 kV y una distancia de trabajo adecuada para la recogida eficiente de BSe.
- Importe las imágenes serie al software Image J (Fiji)13 utilizando la opción de pila virtual. Abra un nuevo TrakEM14e importe la pila de imágenes en TrakEM. Haga clic con el botón derecho del ratón y elija el menú de alineación.
- A continuación, seleccione el rango de imágenes (desde la primera imagen hasta la última imagen). Finalice la alineación automática, guarde el dataset alineado y elija exportar para compilar una imagen plana desde el rango de imágenes seleccionado (desde la primera imagen hasta la última imagen). Por último, guarde los datos de imagen plana en formato AVI en el menú principal imagen J.
NOTA: La película suplementaria 1 y la película suplementaria 2 muestran la pila de imágenes SEM y la pila de imágenes recortadas, respectivamente.
6. Segmentación de mitocondrias y urgencias a partir de imágenes en serie
- Inicie el 3dmod en el software IMOD15 y abra los archivos de imagen.
- En la ventana de ZaP, dibuje el contorno de las mitocondrias y ER usando el botón central del ratón.
- Para visualizar el volumen segmentado, abra la ventana Vista modelo (Película suplementaria 3).
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Representative Results
La figura 1 describe la programación y el flujo de trabajo de este protocolo. El protocolo requiere 7 días; sin embargo, dependiendo del tiempo dedicado a la toma de imágenes SEM, esto puede aumentar. Para la transfección celular, la confluencia de las celdas debe controlarse para no cubrir la parte inferior de toda la placa de rejilla (Figura1A). Una alta densidad celular podría impedir la identificación de la célula de interés durante el microscopio de luz y la observación EM. Utilizamos plásmidos genéticamente etiquetados que expresaban APEX2 y HRP para seleccionar células transoperemente eficientemente entre las numerosas células cultivadas en el plato de cultivo. Cultivamos células HEK293T y confirmamos la expresión de APEX2 vinculados a SCO1 (espacio intermembrana mitocondrial [IMS]) y KDEL conjugado por HRP (ER) en células co-transinfectadas. Bajo microscopía ligera, las células transtróficadas de APEX2 se teñieron un color marrón, mientras que las células sin transfección permanecieron sin mancha (Figura1A y Figura 2). Esto permitió la identificación de las células diana transfectó, que luego se utilizaron para la microscopía electrónica de luz correlativa (CLEM), utilizando la tinción DAB en una población celular cultivada (Figura3D-F y Figura 4B). Fue útil marcar el fondo de vidrio (Figura1B,C) para facilitar la identificación de la ubicación de la celda de destino durante el paso de incrustación plana (Figura1E,F). Cuando las células HEK293T fueron tratadas con un protocolo de tinción mejorado de "doble osmio" (rOTO), las células enteras se tiñeron de un color oscuro (Figura1D). Después de retirar el cubreobjetos cuadriculados de la vajilla de cultivo, identificamos la ubicación objetivo en la superficie del bloque bajo un microscopio estéreo (Figura1G). Recortamos las celdas en el ROI en forma de trapezoidal, y los bordes iniciales y finales se hicieron paralelos (Figura1H,I). Para implementar la reconstrucción de la red de mitocondrias y ER, utilizamos un cuchillo de diamante grande con un gran bote de agua para la sección en serie SCO1-APEX2 y HRP-KDEL-expresando células HEK293T (Figura1J-L). Las secciones de cinta de espesor en serie de 90 nm se unieron con éxito al cubredor de vidrio recubierto con ITO (Figura1M),y la superficie fue recubierta con carbono de 10 nm de espesor para su observación a través de SEM (Figura1N).
Las proteínas SCO1-APEX2 y HRP-KDEL generan señales electrónicas muy densasderivadas de la conversión de DAB que son detectables en TEM (Figura 3) y SEM (Figura4). La mancha oscura generada por SCO1-APEX2 se observó exclusivamente en el IMS y no en el espacio de matriz de las mitocondrias (Figura3D). Células co-transsemiadas (la célula izquierda en la Figura 3D,E) con plásmidos SCO1-APEX2 y HRP-KDEL expresaron una señal de electrones altamente densa en IMS mitocondrial y ER; sin embargo, no observamos ninguna tinción de ER en células que fueron transfectó sólo con SCO1-APEX2 (la célula derecha en la Figura 3D, F). Para las imágenes en serie que utilizan SEM, primero, creamos una visión general de toda la imagen de matriz utilizando el detector de EEB sobre un área grande (Figura4A). En segundo lugar, el ROI se colocó en la primera sección y se propagó a todas las demás secciones (Figura4B). Por último, visualizamos el ROI que contiene cinco celdas de destino con píxeles de imagen de 5 nm (Figura4C). Las imágenes ampliadas revelaron estructuras subcelulares detalladas (Figura4D)como aparatos Golgi, mitocondrias, núcleos y ER. Las imágenes en serie mostraron claramente que los contactos de ER-mitocondrias se estaban produciendo en diferentes planos z (Películasuplementaria 2 y Película suplementaria 3).
Figura 1 : S amplio flujo de trabajo de preparación para SEM y TEM. (A) Un plato de cultivo que contiene cubiertas cuadriculadas fue sembrado con células y teñido con DAB. (B,C) Después de la tinción DAB, se utilizó un rotulador para marcar la parte inferior del vidrio donde se encontraban las celdas de destino. (D) Después de la tinción OsO4, las células se convierten en un color oscuro. (E,F) Los tubos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (o cualquier tipo de cápsulas de incrustación) se utilizaron para hacer fácilmente un bloque EM que contenía las posiciones marcadas. (E) Vista superior. (F) Vista inferior. (G) Una imagen de microscopía estéreo de bajo aumento de la superficie de un bloque EM. (H) El ROI está en el centro de la superficie plana. (I) Una imagen de microscopía estéreo de mayor aumento del ROI rectangular. (J) los revestimientos de vidrio recubiertos con ITO (asterisco blanco) se insertan en el soporte de cinta (flecha azul), y el soporte se sujeta girando el mango en el sentido de las agujas del reloj. (K,L) La manija del soporte se empuja cuidadosamente, y el soporte se ajusta para colocar el borde de la cubierta de vidrio recubierta de ITO cerca del cuchillo por deslizamiento. (M) Las cintas están unidas a los revestimientos de vidrio recubiertos con ITO. (N) Los revestimientos de vidrio recubiertos con ITO están unidos a los talones SEM, y el vidrio residual está sellado con cinta de carbono pegajosa y recubierto con una capa de rosca de carbono de 10 nm. Los asteriscos blancos indican el tapón de vidrio recubierto con ITO, y los asteriscos negros indican la cinta de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen de microscopía de contraste de fase invertida de células HEK293T cultivadas teñidas con DAB. (A) Manchación de células con DAB solamente (sin tinción OsO4). Las flechas blancas indican las celdas no manchadas y las flechas negras indican celdas teñidas con DAB. (B) Imagen de mayor ampliación del ROI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : imágenes TEM de células HEK293T que presentan el IMS mitocondrial objetivo (SCO1-APEX2) y ER (HRP-KDEL). (A-C) Células HEK293T no transinfectadas que muestran la doble membrana de las mitocondrias (M) y el retículo endoplasmático (ER). (D-F) APEX2 y HRP catalizan la polimerización de DAB en un precipitado local, que posteriormente se tiñe con OsO4denso de electrones. Un contraste oscuro es evidente en el IMS mitocondrial (cabeza de flecha negra) y ER (flecha negra); sin embargo, las células que no fueron transcinfectadas con HRP–KDEL exhiben ER (flecha blanca) sin manchar. Barras de escala: 1 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes SEM en serie de células HEK293T que presentan el IMS mitocondrial objetivo (SCO1-APEX2) y el ER (HRP-KDEL). (A) Descripción general de las cintas de sección serie observadas mediante el detector de EEB. (B) Correlación de imagen de bajo aumento (inset) con imagen de EEB de alta magnificación (el cuadro de línea de puntos blanco indica el ROI de las celdas teñidas daB). (C) Ampliación alta de las celdas de destino de ROI con píxeles de imagen de 5 nm. (D,E) Un contraste oscuro es evidente en el IMS mitocondrial y ER, pero no en el aparato Golgi. (F-I) Los contactos ER-mitocondrias (flecha blanca) se producen en diferentes planos z. N, núcleo; M, mitocondrias; ER, retículo endoplasmático; G, aparato Golgi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Recetas de solución.
Película suplementaria 1: pila de imágenes SEM. Fiji13 con el software TrakEM14 se utilizó para alinear 91 imágenes. El conjunto de datos alineado original es de 11 GB. Para reducir el tamaño de la pila, se utilizó un conjunto de imágenes redimensionadas y recortadas. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Película suplementaria 2: Pila de imágenes recortadas. Para visualizar las mitocondrias, la ER y sus sitios de contacto en detalle, las imágenes se recortaron del conjunto de datos original (5 nm/píxel). Barras de escala: 1 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Película suplementaria 3: Reconstrucción 3D de mitocondrias y ER. Para la visualización 3D, el contorno de las mitocondrias y ER se segmentó y visualizó utilizando el software IMOD15. Las mitocondrias se visualizaban como estructuras tubulares largas (rojas), y las redes de ER (verde) mostraron su complicada morfología. El amarillo representaba una gran superficie de sitio de contacto entre las mitocondrias y la ER en diferentes planos z. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
Determinar la localización celular de proteínas específicas a una resolución de nanómetro utilizando EM es crucial para entender las funciones celulares de las proteínas. Generalmente, hay dos técnicas para estudiar la localización de una proteína diana a través de EM. Una es la técnica de inmunooro, que se ha utilizado en EM desde 1960, y la otra es una técnica que utiliza etiquetas genéticamente codificadasrecientemente 16. Las técnicas tradicionales de inmunooro han empleado partículas de oro conjugadas con anticuerpos o puntos cuánticos para mostrar la ubicación de la proteína etiquetada. Sin embargo, debido a la necesidad de anticuerpos de alta calidad y la eficiencia de penetración de anticuerpos afectados por resina y fijadores, esta técnica se limita significativamente17. Específicamente, debido a que el etiquetado de inmunooro se limita predominantemente a la superficie de una sección ultradelgada sin tinción de metal en bloque y fuerte fijación de osmio, esta técnica no es directamente aplicable a la moderna 3DEM18. Para utilizar métodos 3DEM recientes, incluyendo SBEM y tomografía de matriz, con etiquetado de proteínas, utilizamos etiquetas EM codificadas genéticamente en este protocolo. Las etiquetas codificadas genéticamente no requieren permeabilización, técnicamente exigentes de ultracriosección e inmunomanchación de secciones individuales porque se localizan en el lugar de interés antes de la fijación.
Los procedimientos para la preparación de muestras en 3DEM generalmente incluyen una combinación de fijación química común y métodos de tinción de metales pesados porque las células se componen principalmente de C, H, O y N, lo que requiere tinción con metales pesados para adquirir contraste bajo EM9 . Por lo tanto, empleamos una fijación reducida de osmio y tinción de metal para mejorar el contraste y la conductividad de las imágenes en serie. El procedimiento para manchar muestras antes de la seccionamiento, conocido como tinción en bloque, se ha notificado como un paso esencial para los métodos 3DEM como SBEM y FIB-SEM19. Confirmamos que las células manchadas en bloque en nuestro protocolo demostraron claro SCO1-APEX2 y HRP-KDEL EM contraste exclusivamente en el IMS mitocondrial y ER, respectivamente, en TEM (Figura3). Además, las imágenes SEM de secciones seriales de 90 nm revelaron un claro contraste en ambos orgánulos (Figura4). En particular, el contraste mejorado por la tinción en bloque se distinguía claramente de la señal DAB, y el contraste y la conductividad dieron lugar a imágenes seriales de buena calidad (Figura4). Además, este alto contraste ayuda a facilitar tareas posteriores como la alineación y segmentación con software de imagen tridimensional (3D).
En los últimos años, las técnicas de microscopía electrónica de volumen (dik-SBEM, FIB-SEM y tomografía de matriz) han respondido a preguntas biológicas que requerían la observación de un gran campo de visión y una vista 3D. Dik-SBEM y FIB-SEM no implican el manejo físico de las secciones, por lo que se puede reducir el tiempo necesario para la alineación de las imágenes. Sin embargo, la muestra tiene que ser destruida para obtener imágenes en serie, y el campo de visión es más pequeño que el de la tomografía de matriz. Las imágenes SEM en serie mediante tomografía de matriz se emplean cada vez más como alternativa a la sección en serie TEM, y la principal ventaja de esta técnica es su manera no destructiva y su amplio campo de visión. A diferencia de otras técnicas 3DEM como dik-SBEM y FIB-SEM, las secciones se pueden almacenar en un cubreobjetos, un revestimiento ITO, una oblea de silicio o una cinta y se pueden tomar imágenes repetidamente7.
APEX2 es fácil de usar y puede dar una amplia gama de densidades de tinción sin equipo especial, a diferencia de mini generador de oxígeno singlete20 o proteína fluorescente21 técnicas, generando precipitación DAB a través de una fotooxidación. Su aplicación variable ha sido probada en varios orgánulos celulares incluyendo núcleo, membrana plasmática, matriz mitocondria, cristae mitocondrial, ER, tubulina y actina en COS 7 y HEK293T célula22. Sin embargo, hay algunas limitaciones y varios puntos de control para el uso de etiquetado codificado genéticamente en micrografías de electrones. Los niveles de expresión de los genes exógenos deben controlarse para lograr una tinción razonable a nivel EM porque si la expresión de la etiqueta genética es demasiado alta, puede inducir señales falsas positivas y perturbar la ultraestructura de las células a través de la ruptura de la membrana y la agregación de orgánulos subcelulares23. Otro posible problema es el exceso de manchas DAB, que se ha informado de que causa borrosidad y destrucción de la membrana22. Para garantizar la expresión adecuada de los genes, las células teñidas con DAB se compararon con células no manchadas utilizando tanto la microscopía de luz como la EM (Figura2 y Figura 3). Además, el nivel de fijación debe estar bien regulado para garantizar que las oxidasis endógenas estén totalmente inactivas. Para evitar cualquier artefacto de oxidases endógenas durante el procesamiento, fijamos una monocapa de células en lugar de usar células desprendidas y peletadas24. Esto también ayudó a identificar las células de interés cuando comprobamos la señal DAB bajo microscopía de luz. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la tinción y fijación de monocapas celulares son útiles para clem utilizando la tinción DAB (Figura 2). Las imágenes en serie con tomografía de matriz y modelo 3D revelaron que los sitios de contacto ER-mitocondrias se producen en diferentes planos z (PelículaSuplementaria 2 y Película Suplementaria 3). La imagen produce una visualización 3D completa de las redes mitocondrial y ER en celdas enteras (Películasuplementaria 1). Sugiere que el análisis del volumen 3D es esencial para la comparación cuantitativa de los contactos ER-mitocondrias. Al estudiar las complejas redes de orgánulos intracelulares, esta es una técnica excepcionalmente útil.
En conclusión, este protocolo era una combinación eficiente de técnicas clem y 3DEM que permitía la investigación de células enteras a nivel EM. En particular, dos etiquetas diferentes al mismo tiempo y señales DAB en dos orgánulos diferentes eran visibles en una célula entera. Además, las celdas etiquetadas y las celdas sin etiquetar en la misma sección se pueden comparar, debido a EM a gran escala. En este protocolo, las señales de tinción en bloque y DAB de etiquetas codificadas genéticamente fueron útiles para investigar la interacción entre los orgánulos membranosos en células enteras. Esto podría ser una aplicación adecuada para EM a gran escala para investigar otras interacciones celulares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación básica KBRI a través del Instituto de Investigación Cerebral de Corea financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (19-BR-01-08), y la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). Los plásmidos SCO1-APEX2 y HRP-KDEL fueron amablemente proporcionados por Hyun-Woo Rhee (Universidad Nacional de Seúl). Los datos de TEM se adquirieron en Brain Research Core Facilities en KBRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
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