Summary
Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.
Abstract
Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) gibi hücresel organeller, çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek için bir ağ oluşturur. Bu son derece kavisli yapılar, hücresel koşullara bağlı olarak dinamik bir ağ oluşturmak için çeşitli şekillerde katlanmış. Mitokondri ve ER arasında bu ağın görselleştirme süper çözünürlüklü floresan görüntüleme ve ışık mikroskobu kullanılarak denenmiştir; Ancak, sınırlı çözünürlük mitokondri ve ER arasındaki membranları ayrıntılı olarak gözlemlemek için yeterli değildir. Şanzıman Elektron Mikroskopisi, hücresel organizerin gözlem için iyi membran kontrast ve nanometre ölçekli çözünürlük sağlar; Ancak, son derece eğri organelleri üç boyutlu (3B) yapısını değerlendirirken son derece zaman alıcı. Bu nedenle, mitokondri ve er 'in bağıntılı ışık-elektron mikroskobu (Clem) ve hacim elektron mikroskopi teknikleri ile gelişmiş askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama kullanılarak morfolojisini gözlemledik. 3B yapıyı gözlemlemek için en blok boyama yöntemi, ultra ince seri sekleme (dizi tomografi) ve hacim elektron mikroskobu uygulandı. Bu protokolde, mitokondri ve ER 'in ayrıntılı yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için CLEM ve 3D elektron mikroskobu kombinasyonunu öneriyoruz.
Introduction
Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) membran bağlı hücresel organellerdir. Onların bağlantı fonksiyonları için gerekli olan ve proteinleri ağ ile ilgili1tanımlanmıştır. Mitokondri ve ER arasındaki mesafe yaklaşık 100 Nm ışık mikroskobu kullanarak bildirilmiştir2; Ancak, son süper çözünürlüklü microskopi3 ve elektron mikroskobu (EM)4 çalışmalar yaklaşık 10-25 Nm, önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koydu. Süper çözünürlüklü mikroskopide elde edilen çözünürlük EM 'den daha düşüktür ve özel etiketleme gereklidir. EM, mitokondri ve ER arasındaki bağlantıların yapısal çalışmaları için yeterince yüksek çözünürlüklü kontrast elde etmek için uygun bir tekniktir. Ancak, ince bölümler geleneksel iletim elektron mikroskobu (TEM) için yaklaşık 60 Nm veya daha ince olması gerektiğinden, sınırlı z ekseni bilgileri dezavantajı. Yeterli EM z ekseni görüntüleme için üç boyutlu elektron mikroskobu (3DEM)5kullanılabilir. Ancak, bu tüm hücrelerin ince seri bölümlerin yüzlerce hazırlanması içerir, bu çok zor bir iştir sadece birkaç yetenekli teknolojistler hakim var. Bu ince bölümler, kırılgan formvar film kaplı tek delikli TEM ızgaraları üzerinde toplanır. Film bir gird üzerinde kırarsa, seri görüntüleme ve hacim yeniden yapılanma mümkün değildir. Seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu (SBEM) bir elmas bıçak (dik-SBEM) ya da bir odaklı iyon ışın (FıB-SEM) ile Tarama elektron mikroskop (SEM) vakum odası içinde yıkıcı en bloğun bölünmesi kullanan 3DEM için popüler bir tekniktir 6. ancak, bu teknikler tüm tesislerinde mevcut olmadığından, biz dizi tomografi7 seri kesme ve SEM kullanarak öneririz. Dizi tomografi, bir ultralotome kullanılarak kesilmiş seri bölümler bir Tem ızgara yerine bir cam lamel magazini aktarılır ve ışık mikroskobu ve SEM8aracılığıyla görselleştirildi. Backscatter Electron (BSE) görüntülemenin sinyalini geliştirmek için, osmiofilik thiocarbohidazid (TCH)9ile sabit hücreler olan bir en bloklu em boyama protokolüne (OSO4) Çift boyama sonrası katıştırma.
Ayrıca, mitokondriyal Marker SCO1 (sitokrom c oksidaz montaj protein 1) – askorbat peroksidaz 2 (APEX2)10 moleküler etiket em düzeyinde mitokondri görselleştirmek için kullanıldı. APEX2 yaklaşık 28 kDa ve soya askorbat peroksitase11türetilmiştir. Özel proteinlerin EM seviyesinde ayrıntılı yerini, yeşil floresan protein etiketli proteinin ışık mikroskobu içinde kullanıldığı şekilde göstermek için geliştirilmiştir. APEX2, kofaktör hidrojen peroksit (H2O2) varlığında etiketin yerinde çözünebilir bir osmiophic polimer içine 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) dönüştürür. APEX2, tüm hücrenin derinliği boyunca bir protein lokalizasyonu ile EM 'de geleneksel antikor etiketleme alternatifi olarak kullanılabilir. Başka bir deyişle, APEX2-etiketlenmiş protein, Ultra-kriyobölümlemeden sonra immünogeski etiketleme ve geçirgen olmadan spesifik osmikasyon11 ile görselleştirilebilir. Horserpu peroksidaz (HRP) Ayrıca, OsO4ile tedavi EDILDIKTEN sonra em kontrast sağlayan, lokalize bir çökelme Içine DAB H2O2bağımlı polimerizasyonu katalizleyen hassas bir etikettir. ER hedef peptid serisi HRP-KDEL (LYS-ASP-Glu-Leu)12 tüm hücre içinde er görselleştirmek için uygulandı. Genetik etiketlerin kullanılması ve en az osmiyum ve TCH (rOTO yöntemi) ile aynı anda osmikasyon etkisini kullanarak blok boyama ile ilgili protokollerimizi değerlendirmek için, membranı kontrast ile ve rOTO en bloğunda her genetik etiketin kullanmadan karşılaştırdık. Dizi tomografi ve DAB boyama ile APEX ve HRP ile 3DEM, sırasıyla, diğer amaçlar için kullanılmıştır, çünkü biz 3DEM için dizi tomografi ve mitokondri ve ER etiketleme için DAB boyama kombine var bizim protokol benzersizdir. Özellikle, biz hücrelerde genetik modifikasyon etkisini araştırırken destekli aynı bölümde APEX Tagged genleri ile ve olmadan beş hücre gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL Plasmid vektör ile desenli ızgara kültürü çanak ve hücre transfeksiyon ile hücre kültürü
- Tohum 1 x 105 HEK293T hücreleri, 35-mm cam ızgara-altta kültür yemekleri içine yerleştirerek% 5 Co2 ' de 37 °c ' de bulunan bir nemlendirici atmosferde, Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (dmem) ile% 10 fetal Sığır serum, 100 U/ml ile tamamlayıcı Penisilin ve 100 U/mL streptomisin.
- Hücrelerin tohumlama sonrası gün, onlar% 50-60% konfluency yetiştiği zaman, SCO1-APEX210 ve HRP-kdel12 Plasmid, üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reakajı kullanarak hücrelere tanıtmak (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-KDEL plazmid DNA 0,5 μg başına 3 μL transfeksiyon reaktesi).
2. APEX2 ve HRP için desenli kültür yemekleri ve DAB boyama üzerinde büyüyen hücrelerin ışık mikroskopisi
- Transfeksiyondan sonra 16-24 h 'de, tüm kültür medyasını çıkarın ve hemen 250 μL sıcak (30-37 °C) sabitleme çözeltisi (Tablo 1) yumuşak pipetleme ile ekleyin. Hemen sabitleme çözümünü çıkarın ve 1,5 mL taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin. 60 dk için buzda inküye ve sonra 1 mL buz-soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tampon (Tablo 1) her 10 dakika için üç kez yıkayın.
DIKKAT: aldehit dumanları son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin. - 1 ml soğuk (0-4 °C) 20 mM gcine solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca buzun üzerinde 3 adet 5 dk, 1 mL soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tamponunun ardından inküye yapın.
- Yeni bir 1x DAB çözümü hazırlayın (3,33 mL 0,3 M cacodylate çözeltisi + 10 μL, 30% H2O2 + 5,67 ml soğuk su + 1 ml 10X DAB çözeltisi).
- Taze hazırlanmış 1x DAB çözeltisi (adım 2,3) 500 μL ekleyin ve hafif kahverengi leke ters ışık mikroskobu altında görünür olana kadar yaklaşık 5-45 dakika boyunca buzun üzerinde inküye yapın (Şekil 1a).
- DAB çözümünü yavaşça çıkarın ve 1 mL soğuk 0,1 M sodyum cacodylate tamponu ile üç kez durulayın ve her biri 10 dk.
- 100 x veya daha yüksek bir büyütmede DAB boyama görselleştirmek için faz kontrast ters mikroskop (veya parlak alan ışık mikroskop) kullanın. İlgi alanı (ROı) bulunduğu bölgenin (Şekil 1B, C) bulunduğu camın alt kısmına işaretlemek için bir işaret kalemi kullanın.
3. EM bloğu için numune hazırlama
- 2.1-2.6 adımda açıklandığı gibi hücre kültürünü ve DAB boyama gerçekleştirin.
- 1 mL% 2 azaltılmış OsO4 ' ü 4 °c ' de 1 h 'ye kadar olan örnekleri Post-Fix.
DIKKAT: OsO4 dumanı son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin. - 3,2 adım sırasında yeni TCH çözümü (Tablo 1) hazırlayın ve 0,22-μm filtresine geçin.
DIKKAT: TCH dumanları son derece zehirlidir. Tüm çalışmaları havalandırmalı bir duman kaputu altında gerçekleştirin. - Oda sıcaklığında (RT) her biri 5 dakika boyunca 1 mL distile su ile sabitleme ve durulama üç kez çıkarın.
- Hücreleri, RT 'de 20 dakika boyunca önceden hazırlanmış ve filtrelenmiş TCH çözeltisi 1 mL 'ye yerleştirin.
- Hücreleri üç kez 1 mL distile su ile 5 dakika boyunca RT 'de durulayın.
- Hücre, RT 'de 30 dakika boyunca damıtılmış suda% 2 osmiyum tetrokid 1 mL 'ye ikinci kez maruz bırakmayın.
- Her RT 'de 5 dakika boyunca 1 mL distile su ile sabitleme ve durulama üç kez çıkarın. 1% 1 mL uranyl asetat (sulu) ekleyin ve gece 4 °C ' de karanlıkta bırakın.
- Hücreleri üç kez 1 mL distile suda 5 dakika boyunca RT 'de yıkayın.
- 60 °C ' de 30 dakika boyunca sıcak Walton 'ın kurşun aspartat çözeltisi (Tablo 1) bir fırında.
- Ön ısıtılmış kurşun aspartat çözeltisi 1 mL ekleyerek Walton 'un kurşun aspartat solüsyonu ile hücreleri leke ve daha sonra 60 °C ' de 30 dakika için bir fırında yerleştirin.
- Hücreleri üç kez 1 mL distile su ile 5 dakika boyunca RT 'de durulayın.
- 2-ml etanol plakaya (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%,% 100) dereceli bir dizi içinde inküat RT 'de 20 dk.
- Etanol ve 1 mL 3:1 etanol: düşük viskozite gömme karışımı orta RT olarak 30 dakika boyunca inkük.
- Orta çıkarın ve 1 mL 1:1 etanol ekleyin: düşük viskozite gömme karışımı orta. RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın.
- Orta çıkarın ve 1 mL 1:3 etanol ekleyin: düşük viskozite gömme karışımı orta. RT 'de 30 dakika boyunca inküye yapın.
- Orta kaldırın ve 1 mL 100% düşük viskozite gömme ortam ekleyin ve bir gecede inküye.
- Numuneyi 100% düşük viskoziteli gömme karışımıyla katıştırın ve 60 °C ' de 24 saat boyunca inküye yapın.
- 90-nm kalın bölümleri ultrayicrotome kullanarak hazırlayın.
- 200 kV 'de TEM altında ızgaraya uyun.
4. SEM görüntüleme için ındum-kalay-oksit kaplı coverfon seri sekleme ve montaj
-
Substrat hazırlama
- 30-60 s için izopropanol içinde nazik ajitasyon ile temiz indium-kalay-oksit (ITO) kaplı cam Cover, (22 mm x 22 mm).
- Kapağı çıkarın, aşırı isopropanol boşaltın ve kuru kadar tozsuz bir ortamda bırakın.
- 1 dakika boyunca bir plazma kaplayıcı kullanarak Ito-kaplamalı cam coverl 'i kızdırma deşarj ile tedavi edin.
Not: plazma aktivasyonu, substrat yüzeyinde hidrofilik bir özellik oluşturmaktadır. Bu bölüm substrat bağlı olduğunda bölümlerde kırışıklık oluşumu önlemek için substrat su çok ince bir film oluşturur. - ITO-kaplamalı cam kaplamaları, substrat tutucusuna yerleştirin ve bıçak teknesine yerleştirin.
-
Numune bloğunun ve seri bölümleme, kırpma
- Örnek bloğu ultrayicrotome örnek tutucusuna yerleştirin ve kırpma bloğuna ayarlayın.
- Hedef pozisyondaki tüm aşırı reçineyi kırpmak için bir jilet kullanın (adım 2,6, Şekil 1D-Golarak tanımlanır). Blok yüzün şekli yamuk veya dikdörtgen olmalıdır. Önde gelen kenar ve sondaki kenar kesinlikle paralel olmalıdır (Şekil 1h, ı).
- Örnek tutucuyu ultraticrotomenin kolunun üzerine takın ve elmas bıçağı bıçak tutucusuna yerleştirin. ITO cam kaplamaları şerit taşıyıcısına takın ve taşıyıcıyı kolu (Şekil 1J) ile kelepçeler. Şerit taşıyıcıyı bıçak teknesine ayarlayın ve bıçak teknesini filtrelenmiş damıtılmış suyla doldurun (Şekil 1K).
- ITO camının kenarını bıçağa yakın bir şekilde ayarlamak için tutucunun kolunu dikkatlice itmek suretiyle taşıyıcı pozisyonunu bıçağın kaydırağı ile ayarlayın (Şekil 1L).
- Bölümü kestikten sonra, kesit sürecini durdurun ve tüpün sıkma vidasını yavaşça açın ve su teknesini (saniyede bir damla su debisi) boşaltın.
- Şerit toplama sürecini tamamladıktan sonra, sıkıştırma cihazının kolu ile substrat çıkarın ve şeridini kurutun (Şekil 1m).
5. SEM ve SEM görüntü yığını hizalama görüntüleme
- Ito kaplı lamel magazini yapışkan karbon bant ile alüminyum tutucular monte edin. Cam yüzeyini ve yüzeyi yapışkan karbon bant ile mühürleyin ve sonra 10 Nm kalınlığında karbon katmanıyla kat (Şekil 1N).
- 5 kV 'lik düşük ivme voltajında bir alan emisyonu SEM 'de Ito kaplı lamel magazini ve verimli bses koleksiyonu için uygun bir çalışma mesafesi gözleyin.
- Seri görüntüleri görüntü J yazılımı (Fiji)13 sanal yığın seçeneğini kullanarak alın. Yeni bir TrakEM14açın ve trakem içine görüntü yığını alın. Sağ fare düğmesini tıklatın ve Hizalama menüsünü seçin.
- Ardından görüntü aralığını seçin (ilk görüntüden son görüntüye). Otomatik hizalamayı tamamlayın, hizalanmış veri kümesini kaydedin ve seçili görüntü aralığından (ilk görüntüden son görüntüye) düz bir görüntü derlemek için Dışa Aktar 'ı seçin. Son olarak, düz görüntü verilerini görüntü J ana menüsünde AVI formatında kaydedin.
Not: ek film 1 ve ek film 2 , sırasıyla SEM Image yığınını ve kırpılmış görüntü yığınını göster.
6. seri görüntülerden mitokondri ve ER segmentasyon
- IMOD15 yazılım ve açık görüntü dosyalarında 3dmod başlatın.
- ZaP penceresinde, orta fare düğmesini kullanarak mitokondri ve ER kontur çizin.
- Bölümlere ayrılmış birimi görselleştirmek için model görünümü penceresini açın (ek film 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , bu protokol için zamanlama ve iş akışını açıklar. Protokol 7 gün gerektirir; Ancak, SEM görüntüleme için harcanan zamana bağlı olarak, bu artabilir. Hücre transfeksiyon için, hücrelerin konflukans tüm ızgara plaka alt kapak değil olarak kontrol edilmelidir (Şekil 1a). Yüksek hücreli yoğunluk, ışık mikroskobu ve EM gözlem sırasında ilgi hücresinin tanımlanmasını engelleyebilir. Biz APEX2 ve HRP verimli kültür çanak sayısız kültürlü hücreler arasında transfekte hücreleri seçmek için ifade genetik etiketli plazmids kullanılır. Biz HEK293T hücreler kültürlü ve SCO1 bağlı APEX2 (mitokondriyal intermembran uzay [ıMS]) ve HRP-konjugated KDEL (ER) Co-transfected hücrelerde ifade doğruladı. Işık mikroskobu altında, APEX2-transfected hücreler kahverengi renk lekelenmiştir, ancak transfeksiyon olmaksızın hücreler lekelenmemiştir (Şekil 1a ve Şekil 2). Bu, daha sonra Korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu (CLEM) için kullanılan transfitatif hedef hücrelerin tanımlanması, bir kültürlü hücre popülasyon DAB boyama kullanarak izin (şekil 3D-F ve Şekil 4b). Düz gömme adım (Şekil 1E, F) sırasında hedef hücrenin konumunu belirlemek kolaylaştırmak için cam alt (Şekil 1B, C) işaretlemek için yararlı oldu. HEK293T hücreleri gelişmiş bir "çift Osmium" boyama Protokolü (rOTO) ile tedavi edildiğinde, tüm hücreler koyu renk lekelendiler (Şekil 1D). Izgara lamel magazini 'ı kültür yemeğinden çıkardıktan sonra, blok yüzeyinde bir stereo mikroskop altında hedef konumu tespit ettik (Şekil 1G). YG 'deki hücreleri trapez şeklinde kesilmiş ve önde gelen ve sondaki kenarlar paralel olarak yapılmıştır (Şekil 1h, ı). Mitokondri ve ER ağ yeniden yapılanma uygulamak için, biz seri bölüm SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL-HEK293T hücreleri ifade büyük bir su teknesi ile büyük bir elmas bıçak kullanılan (Şekil 1J-L). Seri 90-nm kalınlığında şerit bölümler Ito kaplı cam lamel magazini (Şekil 1m) başarıyla bağlı ve yüzey SEM (Şekil 1n) ile gözlem için 10 Nm kalınlığında karbon ile kaplanmıştır.
SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL proteinleri, TEM (Şekil 3) ve SEM (Şekil 4) ' de algılanabilir DAB dönüşümden elde edilen son derece yoğun elektronik sinyaller üretir. SCO1-APEX2 tarafından oluşturulan koyu leke, sadece ıMS 'de ve mitokondri Matrix alanında değil (şekil 3D) görüldü. Hem SCO1-APEX2 hem de HRP-KDEL plazmids ile birlikte Transferli hücreler ( şekil 3D, E'de sol hücre) mitokondriyal ıMS ve er 'de son derece yoğun bir elektron sinyali ifade etti; Ancak, sadece SCO1-APEX2 ( şekil 3D, F'de sağ hücre) ile transferleştirilmiş HÜCRELERDE er boyama izlenmedi. SEM kullanarak seri görüntüler için, ilk olarak, büyük bir alan üzerinde BSE dedektörü kullanarak tüm dizi görüntü genel bir bakış oluşturduk (Şekil 4A). İkinci olarak, YG ilk bölüme yerleştirildi ve diğer tüm bölümlere (Şekil 4b) yayıldı. Son olarak, 5-Nm görüntü pikseli (Şekil 4c) ile beş hedef hücre içeren YG 'yi görselleştirdik. Yakınlaştırılmış görseller, Golgi aparatı, mitokondri, Çekirdekler ve ER gibi ayrıntılı alt hücresel yapıları (Şekil 4d) ortaya koymuştur. Seri görüntüler açıkça ER-Mitochondri kontakları farklı z-düzlemlerde oluştuğunu gösterdi (ek film 2 ve ek film 3).
Şekil 1 : S geniş hazırlama iş akışı SEM ve Tem için. (A) ızgaralı coverfları içeren bir kültür çanak hücreler ile sıvıştı ve DAB ile lekelenmiş. (B,C) DAB boyama işleminden sonra, hedef hücrelerin bulunduğu camın alt kısmına işaretlemek için bir işaret kalemi kullanılmıştır. (D) oso4 boyama sonra, hücreler koyu bir renk haline gelir. (E, F) Polymerase zincir reaksiyonu (PCR) tüpler (veya gömme Kapsüller herhangi bir tür) kolayca işaretlenmiş pozisyonları içeren bir EM bloğu yapmak için kullanıldı. (E) üst görünüm. (F) alt görünüm. (G) bir EM bloğunun yüzeyinin düşük büyütülebilir stereo mikroskobu görüntüsü. (H) YG, düz yüzeyin ortasında yer almaktadır. (I) dikdörtgen YG 'nin daha yüksek büyütme özellikli Stereo mikroskobu görüntüsü. (J) Ito kaplı cam coverfları (beyaz yıldız) şerit taşıyıcıya (mavi ok) yerleştirilir ve taşıyıcı kolu saat yönünde çevirerek yapışmış durumdadır. (K, L) Tutucunun kolu dikkatle itilir ve taşıyıcı, Ito kaplı cam lamel magazini kenarını kaydırılarak bıçağa yakın konumlandırmak üzere ayarlanır. (M) ŞERITLERI Ito-kaplamalı cam kapakların bağlı. (N) Ito kaplı cam COVERLARı SEM sapları bağlı, ve kalıntı cam yapışkan karbon bant ile mühürlü ve 10-Nm karbon iplik tabakası ile kaplanmış. Beyaz yıldızlar ıTO-kaplı cam coverslip gösterir ve siyah asteriskler karbon bandı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: DAB ile lekelenmiş kültürlü HEK293T hücrelerin ters faz kontrast mikroskobu görüntü. (A) sadece dab hücrelerinde boyama (oso4 boya olmadan). Beyaz oklar, lekelenmiş hücreleri gösterir ve siyah oklar DAB lekeli hücreleri gösterir. YG 'nin (B) daha yüksek büyütme görüntüsü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Hedeflenen mitokondriyal ıMS (SCO1-APEX2) ve er (HRP-KDEL) sergileme HEK293T hücrelerin Tem görüntüleme. (A-C) Mitokondri (M) ve endoplazmik retikulum (er) çift membranı gösteren untransfected HEK293T hücreler. (D-F) APEX2 ve HRP daha sonra elektron-yoğun OsO4ile lekelenmiş bir yerel ÇÖKELME içine DAB polimerizasyonu katalizleme. Karanlık bir kontrast mitokondriyal ıMS (siyah ok ucu) ve ER (siyah oku) görülür; Ancak, HRP-kdel sergi unvifacı (beyaz ok) ile transfekte değildi hücreler. Ölçek çubukları: 1 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4: hedeflenen mitokondriyal ıMS (SCO1-APEX2) ve er (HRP-KDEL) sergileme HEK293T hücrelerin SERI SEM görüntüleme. (A) BSE dedektörü kullanılarak gözlenen seri bölüm şeritleri genel bakış. (B) yüksek büyütme BSE görüntüsünde düşük büyütme görüntü (inset) Korelasyonu (beyaz noktalı ÇIZGI kutusu DAB-lekelenmiş hücrelerin YG 'sini gösterir). (C) 5 Nm görüntü pikseli ile YG hedef hücrelerinin yüksek büyütme. (D, E) Karanlık bir kontrast mitokondriyal ıMS ve ER ancak Golgi aparat belirgindir. (F-ı) ER-mitokondri kontakları (beyaz ok) farklı z düzlemlerinde meydana gelir. N, çekirdek; M, mitokondri; ER, endoplazmik reticulum; G, Golgi aparatı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Tablo 1: çözüm tarifleri.
Ek film 1: SEM görüntü yığını. Fiji13 trakem14 yazılımı ile 91 görüntüleri hizalamak için kullanıldı. Özgün hizalanmış veri kümesi 11 GB 'dır. Yığını küçültecek şekilde yeniden boyutlandırılan ve kırpılmış görüntü kümesi kullanıldı. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Ek film 2: kırpılmış görüntü yığını. Mitokondri, ER ve ayrıntılı olarak iletişim sitelerini görselleştirmek için, görüntüler orijinal veri setinden (5 Nm/pixel) kırpıldı. Ölçek çubukları: 1 μm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Ek film 3: mitokondri ve er 3D yeniden yapılanma. 3D görselleştirme için, mitokondri ve ER kontur bölümlere ayrılır ve ıMOD15 yazılımı kullanılarak görselleştirildi. Mitokondri uzun tübüler yapıları (kırmızı) olarak görselleştirildi ve ER ağları (yeşil) karmaşık morfoloji gösterdi. Sarı farklı z-düzlemlerde mitokondri ve ER arasında iletişim sitesi büyük bir yüzey alanı temsil. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EM kullanarak bir nanometre çözünürlükte belirli proteinlerin hücresel lokalizasyonu belirlenmesi proteinlerin hücresel işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Genellikle, EM aracılığıyla bir hedef protein lokalizasyonu incelemek için iki teknikleri vardır. Bir immünogold tekniği, hangi EM 1960 beri kullanılan ve diğer bir teknik son zamanlarda geliştirilen genetik kodlu Etiketler16kullanarak olduğunu. Geleneksel immünogold teknikleri, etiketli protein yerini göstermek için antikor-konjuçe altın parçacıklar veya kuantum noktalar istihdam var. Ancak, yüksek kaliteli antikorlar ve reçine ve fiklatif tarafından etkilenen antikorların penetrasyon verimliliği gereksinimi nedeniyle, bu teknik önemli ölçüde sınırlıdır17. Özellikle, immünogeski etiketleme ağırlıklı olarak en blok metal boyama ve güçlü osmiyum fikyasyon olmadan bir ultra ince bölümünün yüzeyine kısıtlı olduğu için, bu teknik doğrudan modern 3dem18için geçerli değildir. SBEM ve dizi tomografi dahil olmak üzere son 3DEM yöntemlerini kullanmak için, protein etiketleme ile, bu protokolde genetik olarak kodlanmış EM etiketlerini kullandık. Genetik olarak kodlanmış Etiketler, teknik olarak Ultra-cryosectioning gerektiren ve bireysel bölümlerin immünostasyonlarında, çünkü fikstasyon öncesinde ilgi alanına yerelleştirmek için, geçirgenlik gerektirmez.
3DEM numune hazırlama prosedürleri genellikle hücreler C, H, O ve N oluşur çünkü yaygın kimyasal fiktasyon ve ağır metal boyama yöntemlerinin bir kombinasyonu dahil, ağır metaller ile boya gerektiren EM 9 altında kontrast elde etmek . Bu nedenle, seri görüntüleme için kontrast ve iletkenliği artırmak için azaltılmış osmiyum fikreme ve metal boyama istihdam. SBEM ve FıB-SEM19gibi 3dem yöntemleri için önemli bir adım olarak bildirilen, en blok boyama olarak bilinen bölümleme önce numune leke prosedürü. Protokoldeki en blok lekeli hücrelerin, sırasıyla TEM 'de (Şekil 3) mitokondriyal ıMS ve er 'de sadece net SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL em kontrast gösterdiğini teyit ettik. Ayrıca, 90-nm seri bölümlerindeki SEM görüntüleri her iki organda da net bir kontrast göstermiştir (Şekil 4). Özellikle, en blok boyama tarafından geliştirilmiş kontrast DAB sinyalinden belirgin olarak ayırt edildi ve kontrast ve iletkenlik iyi kalitede seri görüntülerle sonuçlandı (Şekil 4). Ayrıca, bu yüksek kontrast, üç boyutlu (3B) görüntü yazılımı ile hizalama ve segmentasyon gibi sonraki görevlerin kolaylaştırılması yardımcı olur.
Son yıllarda, hacim elektron mikroskobu teknikleri (dik-SBEM, FıB-SEM ve dizi tomografi), büyük bir bakış alanı ve 3B görünüm gözlemlenmesi gereken biyolojik soruları yanıtladı. Dik-SBEM ve FıB-SEM, bölümlerin fiziksel olarak işlenmesini içermez, bu nedenle görüntülerin hizalanması için zaman alıcı azaltılabilir. Ancak, örnek seri görüntüleri elde etmek için yok edilmelidir ve görünüm alanı dizi tomografi daha küçüktür. Dizi tomografi kullanarak seri SEM görüntüleme, TEM seri bölümleme alternatifi olarak giderek daha fazla istihdam edilir ve bu tekniğin büyük avantajı yıkıcı olmayan bir şekilde ve büyük görüş alanıdır. Dik-SBEM ve FıB-SEM gibi diğer 3DEM tekniklerinin aksine, bölümler bir coverslip, ıTO kaplı coverslip, silikon gofret veya teyp üzerinde saklanabilir ve art arda7kez görüntülenebilir.
APEX2 kullanımı kolaydır ve özel ekipman olmadan boyama yoğunlukları geniş bir yelpazede verebilir, Mini atlet oksijen jeneratör aksine20 veya floresan protein21 teknikleri, bir photooxidation aracılığıyla DAB yağış üreten. Değişken uygulama çekirdek, plazma membran, mitokondri matris, mitokondriyal cristae, er, tubulin ve aktin cos 7 ve HEK293T hücre22de dahil olmak üzere birkaç hücresel organeli test edilmiştir. Ancak, bazı sınırlamalar ve elektron micrographs genetiği kodlanmış etiketleme kullanımı için birkaç kontrol noktaları vardır. Eksojen genlerin ifade seviyeleri, çünkü genetik etiketin ifadesi çok yüksek ise, EM düzeyinde makul boyama elde etmek için kontrol edilmelidir, bu sahte pozitif sinyaller ve membran rüptürü ile hücrelerin ultrastrture Perturb neden olabilir ve hücre altı organel toplama23. Başka bir olası sorun, bulanıklık ve membran imha22neden olduğu bildirilmiştir DAB overstaining olduğunu. Genlerin uygun ifadesinin sağlanması için DAB-lekeli hücreler hem ışık mikroskobu hem de EM (Şekil 2 ve Şekil 3) kullanılarak lekelenmiş hücrelerle karşılaştırıldı. Ayrıca, sabitleme seviyesi endojen oksidalar tamamen aktif olduğundan emin olmak için iyi düzenlenmiş olmalıdır. İşleme sırasında endojen oksitlenmesinden herhangi bir eser önlemek için, biz ayrık ve pelleted hücreleri kullanmak yerine hücrelerin bir tek tabakalı sabit24. Bu aynı zamanda ışık mikroskobu altında DAB sinyalini kontrol ederken ilgi hücrelerini belirlemek için yardımcı oldu. Bu nedenle, sonuçlar, hücre monolayerlerin boyama ve fikmasyonu DAB boyama kullanarak CLEM için yararlı olduğunu gösterir (Şekil 2). Dizi tomografi ve 3D modeline sahip seri görüntüler, ER-Mitochondri iletişim sitelerinin farklı z-düzlemlerde (ek film 2 ve ek film 3) oluştuğu ortaya çıktı. Görüntü tüm hücrelerde mitokondriyal ve ER ağları tam bir 3B görselleştirme üretir (ek film 1). Bu 3D hacim Analizi ER-mitokondri kontakları niceliksel karşılaştırma için önemlidir öneriyor. Hücre içi organelelerin karmaşık ağları çalışırken, bu son derece yararlı bir tekniktir.
Sonuç olarak, bu protokol, EM düzeyinde tüm hücre soruşturmasına izin veren CLEM ve 3DEM tekniklerinin verimli bir kombinasyonudur. Özellikle, iki farklı organda aynı anda iki farklı etiket ve DAB sinyalleri tüm hücrede görülebilir. Ayrıca, etiketli hücreler ve aynı bölümde etiketlenmemiş hücreler karşılaştırılabilir, çünkü büyük ölçekli EM. Bu protokolde, genetik olarak kodlanmış etiketlerden en blok boyama ve DAB sinyalleri, tüm hücrelerdeki membranöz organeller arasındaki etkileşimi araştırmak için yararlıdır. Bu, diğer hücresel etkileşimleri araştırmak için büyük ölçekli EM için uygun bir uygulama olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma tarafından desteklenmektedir KBRI temel araştırma programı Kore beyin Araştırma Enstitüsü Bakanlığı Bilim ve BIT tarafından finanse (19-BR-01-08), ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) Grant Kore hükümeti tarafından finanse (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL plazmids, Hyun-Woo Rhee (Seul Ulusal Üniversitesi) tarafından temin edildi. TEM verileri KBRı 'deki Brain Research Core tesisleri 'nde elde edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
