Summary
L'articolo descrive un protocollo rapido per l'etichettatura dei vasi sanguigni in un pesce teleostico da perfusione cardiaca di DiI diluito in fissativo, utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello e concentrandosi sul tessuto del cervello e dell'ipofisi.
Abstract
I vasi sanguigni innervano tutti i tessuti nei vertebrati, permettendo la loro sopravvivenza fornendo i nutrienti necessari, ossigeno, e segnali ormonali. È uno dei primi organi ad iniziare a funzionare durante lo sviluppo. I meccanismi di formazione dei vasi sanguigni sono diventati un argomento di alto interesse scientifico e clinico. Negli adulti, tuttavia, è difficile visualizzare la vascolarizzazione nella maggior parte degli animali viventi a causa della loro localizzazione in profondità all'interno di altri tessuti. Tuttavia, la visualizzazione dei vasi sanguigni rimane importante per diversi studi come l'endocrinologia e la neurobiologia. Mentre diverse linee transgeniche sono state sviluppate nel pesce zebra, con i vasi sanguigni visualizzati direttamente attraverso l'espressione delle proteine fluorescenti, non esistono strumenti simili per altre specie di teleostico. Utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello, il protocollo attuale presenta una tecnica rapida e diretta per etichettare i vasi sanguigni nel cervello e nell'ipofisi che irrora attraverso il cuore con fissativo contenente dii. Questo protocollo consente di migliorare la nostra comprensione su come le cellule cerebrali e ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.
Introduction
I vasi sanguigni giocano una parte essenziale del corpo dei vertebrati in quanto forniscono i nutrienti necessari, ossigeno e segnali ormonali a tutti gli organi. Inoltre, dal momento che la scoperta del loro coinvolgimento nello sviluppo del cancro1, hanno ricevuto molta attenzione nella ricerca clinica. Sebbene alcune pubblicazioni abbiano indagato sui meccanismi che consentono la crescita e la morfogenesi dei vasi sanguigni, e un gran numero di geni importanti per la loro formazione sono stati identificati2, molto resta da intendere per quanto riguarda l'interazione tra cellule o tessuti e il sangue circolante.
La visualizzazione della vasculatura del sangue nel cervello e nell'ipofisi è importante. I neuroni nel cervello richiedono un elevato apporto di ossigeno e glucosio3, e l'ipofisi contiene fino a otto importanti tipi di cellule che producono ormoni che utilizzano il flusso sanguigno per ricevere il segnale dal cervello e inviare i loro rispettivi ormoni a diversi organi periferici4,5. Mentre nei mammiferi, il sistema del portale alla base dell'ipotalamo chiamato l'eminenza mediana, collega il cervello e l'ipofisi6, tale ponte sanguigno chiaro non è stato descritto nel pesce teleostico. Infatti, nei teleosts, i neuroni preoptico-ipotalamici proiettano direttamente i loro assoni nel Pars nervosa dell'ipofisi7 e per lo più innervano i diversi tipi di cellule endocrine direttamente8,9. Tuttavia, alcuni di questi neuroni hanno le loro terminazioni nervose situate nello spazio extravascolare, in prossimità di capillari sanguigni10. Pertanto, la differenza tra il pesce teleostico e i mammiferi non è così chiara, e la relazione tra la vasculatura del sangue e le cellule del cervello e dell'ipofisi richiede una maggiore indagine nel pesce teleostico.
Il zebrafish ha, in molti aspetti, un sistema vascolare anatomicamente e funzionalmente paragonabile ad altre specie di vertebrati11. È diventato un potente modello di vertebrato per la ricerca cardiovascolare principalmente grazie allo sviluppo di diverse linee transgeniche dove i componenti del sistema vascolare sono etichettati con proteine reporter fluorescenti12. Tuttavia, l'anatomia esatta del sistema circolatorio può variare tra le specie, o anche tra due individui appartenenti alla stessa specie. Pertanto, la visualizzazione dei vasi sanguigni può essere di grande interesse anche in altre specie teleostico per le quali non esistono strumenti di transgenesi.
Diverse tecniche sono state descritte per etichettare i vasi sanguigni in entrambi i mammiferi e teleosts. Questi includono l'ibridazione in situ per i geni specifici della vasculatura, la colorazione della fosfatasi alcalina, la microangiografia e le iniezioni di colorante (per una recensione vedere13). Fluorescente lipofilico cationico indocarbocyanine Dye (dii) è stato utilizzato per la prima volta per studiare la mobilità laterale dei lipidi della membrana come viene mantenuto nei bilayer del lipido e può migrare attraverso di essa14,15,16. Infatti, una molecola di DiI è composta da due catene di idrocarburi e croofori. Mentre le catene di idrocarburi si integrano nella membrana a cellule a doppio strato lipidico delle cellule a contatto con esso, i croofori rimangono sulla sua superficie17. Una volta nella membrana, le molecole DiI diffondono lateralmente all'interno del doppio strato lipidico che aiuta a macchiare le strutture della membrana che non sono a diretto contatto con la soluzione DiI. Iniettare una soluzione DiI attraverso la perfusione cardiaca, quindi etichetterà tutte le cellule endoteliali a contatto con il composto permettendo l'etichettatura diretta dei vasi sanguigni. Oggi DiI è utilizzato anche per altri scopi di colorazione, come la singola molecola di imaging, la mappatura del destino, e traccia neuronale. È interessante notare che esistono diversi fluorofori (con diverse lunghezze d'onda di emissione) che consentono la combinazione con altre etichette fluorescenti, e l'incorporazione così come la diffusione laterale di DiI possono verificarsi in entrambi i tessuti dal vivo e fissi18, 19. la
La formaldeide, scoperta da Ferdinand Blum nel 1893, è stata utilizzata ampiamente fino ad oggi come la sostanza chimica preferita per la fissazione dei tessuti20,21. Mostra un'ampia specificità per la maggior parte degli obiettivi cellulari e conserva la struttura cellulare22,23. Conserva anche le proprietà fluorescenti della maggior parte dei fluorofori, e quindi può essere utilizzato per fissare gli animali transgenici per i quali le cellule bersaglio esprimono proteine reporter fluorescenti.
In questo manoscritto, un precedente protocollo sviluppato per etichettare i vasi sanguigni nei piccoli modelli sperimentali di mammiferi24 è stato adattato all'uso nei pesci. L'intera procedura richiede solo un paio di ore per eseguire. Esso dimostra come profumi una soluzione fissativa di formaldeide contenente dii nel cuore del pesce al fine di etichettare direttamente tutti i vasi sanguigni nel cervello e l'ipofisi del modello di pesce Medaka. Medaka è un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia, che si trova principalmente in Giappone. Si tratta di un organismo modello di ricerca con una suite di strumenti molecolari e genetici disponibili25. Pertanto, l'identificazione dei vasi sanguigni in questa specie così come in altri permetterà di migliorare la nostra comprensione su come il cervello e le cellule ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.
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Protocol
Tutta la manipolazione degli animali è stata eseguita secondo le raccomandazioni per la cura e il benessere degli animali di ricerca presso l'Università norvegese di Scienze della vita, e sotto la supervisione di investigatori autorizzati.
1. preparazione di strumenti e soluzioni
- Preparare la soluzione di stock DiI dissolvendo 5 mg di cristallo DiI in 1,5 mL di tubo di plastica con 1 mL di 96% EtOH. Vortex per 30 s e tenere coperto con foglio di alluminio.
Nota: La soluzione di azioni DiI può essere conservata al buio a-20 ° c per diversi mesi. - Preparare il supporto per pesci (Figura 1a) tagliando un pezzo di polistirolo a 5 cm di lunghezza, 3 cm di larghezza e 2 cm di spessore, e incollandolo ad un piatto di plastica di diametro 9 cm. Fare un foro a forma di barca di 3 cm con una lama di bisturi nel polistirolo.
- Preparare il sistema di che irrora (Figura 2) aggiungendo una cannula di plastica lunga 30-50 cm all'estremità dell'ago.
- Preparare 40 mL di soluzione di paraformaldeide fresca al 4% (PFA) diluendo 10 mL di PFA al 16% con 30 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) in un tubo di plastica da 50 mL.
- Preparare 10 mL di soluzione di Fixative/DiI diluendo 1 mL di soluzione di azione DiI in 9 mL di PFA appena preparata 4% in un tubo di plastica da 10 mL. Tenere al buio fino all'uso.
Nota: I cristalli DiI che non sono disciolti possono essere conservati nel tubo di soluzione di magazzino, e nuovo etanolo può essere aggiunto per preparare nuova soluzione di stock DiI (vedi passo 1,1). -
Preparare 50 mL di brodo tricaina (MS-222).
- Sciogliere 200 mg di polvere di tricaina in 48 mL di H2O. aggiungere 2 ml di base tris da 1 M (pH 9). Regolare a pH 7 con 1 M HCl e conservare a-20 ° c.
- Diluire 5 mL di brodo di tricaina in 50 mL di acqua pulita in un piccolo bicchiere.
- Preparare diverse pipette di vetro da 5 cm (Figura 2) allungando un capillare di vetro con un estrattore di pipette seguendo le istruzioni del fabbricante.
2. dissezione e perfusione
Nota: PFA è un composto volatile tossico, quindi la dissezione e la perfusione devono essere eseguite in un cofano o in una stanza ventilata, e l'utente deve indossare una maschera antigas.
- Prepara gli strumenti di dissezione, comprese le piccole forbici, e una pinza affilata e una forte prima della dissezione.
- Riempire la siringa con la soluzione preparata di PFA/DiI posizionandola nel tubo 50 mL e disegnando. Quindi posizionare l'ago con la cannula all'estremità della siringa (Figura 2).
- Fissare la siringa al banco utilizzando diversi pezzi di nastro posizionati in direzioni diverse, regolare la posizione del microscopio e la sede per ottenere una buona posizione per la dissezione e per la pressione del pistone della siringa (Figura 1B).
Nota: In questo protocollo, il gomito viene utilizzato per premere il pistone della siringa, ma altre possibilità opzioni possono essere utilizzate, ad esempio, l'assistenza di un'altra persona. - Euthanize il pesce con un sovradosaggio di tricaina posizionando il pesce nella soluzione preparata al passo 1,7. Attendere 30 s e testare i riflessi del pesce afferrando la sua pinna caudale con le pinze. Il pesce può essere utilizzato quando ha smesso di rispondere agli stimoli.
- Posizionare il pesce nel supporto del pesce con l'addome rivolto verso l'alto e fissare un ago all'estremità della testa e un altro sopra la coda per mantenere il pesce in posizione.
- Aprire l'addome anteriore con le forbici tagliando orizzontalmente lo strato superficiale della pelle.
- Utilizzando pinze, rimuovere la pelle sopra il cuore fino a quando un chiaro accesso al ventricolo e l'arterioso di bulbo è fornito (Figura 3).
- Aggiungere una pipetta di vetro all'estremità del capillare e rompere l'estremità della punta della pipetta di vetro.
Nota: Il buco della punta rotta dovrebbe essere abbastanza grande da lasciare il liquido fuori, ma ancora abbastanza piccolo per entrare facilmente nel tessuto. La pipetta di vetro può essere riutilizzata se non rotto o intasato. - Portare la pipetta di vetro vicino al ventricolo e aggiungere pressione al pistone della siringa con il gomito per forzare il liquido fuori.
- Fissare il ventricolo cardiaco con la pipetta di vetro aggiungendo pressione alla siringa.
- Direttamente dopo, perforare il venoso sinusale con pinze per consentire al sangue di lasciare la circolazione.
Nota: Il ventricolo cardiaco diventa più fragile a causa del fissativo. Diventa anche meno rosso come il sangue viene diluito con la soluzione Fixative/DiI. - Dal ventricolo, regolare l'angolo della pipetta di vetro per trovare l'ingresso del bulbo arterioso. Portare l'apertura della pipetta all'interno dell'arterioso bulbo come mostrato nella Figura 2e aggiungere maggiore pressione alla siringa.
Nota: Il bulbo arterioso è trasparente e il tessuto è elastico. Quando si sostituisce il sangue con dii/Fixative, la pipetta di vetro all'interno del cuore dovrebbe diventare più visibile e aggiungendo pressione, la dimensione del bulbo arterioso dovrebbe espandersi. Questo passaggio è cruciale per assicurarsi che sia stata utilizzata una pressione sufficiente per sostituire tutto il sangue con la soluzione fissativa/DiI e che tutti i vasi sanguigni siano stati raggiunti. Spesso quando ha successo, il PFA provoca contrazioni muscolari e il pesce si muoverà. - Continuare ad aggiungere pressione sulla siringa per 30-60 s ancora mantenendo la pipetta di vetro all'interno del bulbo arterioso.
- Rimuovere la pipetta di vetro e gli aghi dal pesce.
- Dissezionare il cervello e l'ipofisi, e incubare i tessuti in fresco 4% PFA in PBS per 2 h al buio a temperatura ambiente.
Nota: La dissezione del cervello e dell'ipofisi in precedenza è stata descritta in dettaglio in due modi diversi da Fontaine et al.26 e Ager-Wick et al.27. A causa della fissazione, il tessuto diventa abbastanza duro e il legame fragile tra il cervello e l'ipofisi può essere rotto. Dopo la dissezione, la lavorazione post-fissazione può essere eseguita anche durante la notte a 4 ° c. - Sciacquare il tessuto due volte in PBS per 10 minuti prima di prepararsi per l'imaging.
Nota: Il tessuto può quindi essere montato tra scivolo e coperchio slittamento con distanziali in mezzo e supporto di montaggio per l'imaging confocale (Vedi Figura 4), o sezionato con un VIBRATOME come descritto in dettaglio in Fontaine et al.26 prima del montaggio tra scivolo e coperchio per l'imaging con uno stereomicroscopio (vedere Figura 4).
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Representative Results
Questo protocollo dimostra una procedura passo per passo per etichettare i vasi sanguigni nel cervello Medaka e ipofisi, e allo stesso tempo fissare il tessuto. Dopo l'etichettatura mediante iniezione cardiaca di una soluzione fissativa contenente DiI nel cuore, i vasi sanguigni possono essere osservati su fette utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 4) o su tessuto intero utilizzando un microscopio confocale (Figura 5). Sia sulla fetta di tessuto spessa o su tutto il tessuto, l'architettura della vasculatura del sangue può essere osservata in tre dimensioni. Le fette di tessuto possono essere etichettate per specifiche proteine mirate utilizzando protocolli di immunofluorescenza standard dopo la fine della fissazione e su linee transgeniche in cui le cellule di interesse esprimono le proteine reporter fluorescenti (Figura 6). Ciò consente indagini sulle interazioni tra i vasi sanguigni e altri tipi specifici di cellule. Qui, per esempio, l'uso di una linea transgenica di Medaka dove le cellule produttrici di proteine fluorescenti verdi (GFP) hanno rivelato la posizione delle cellule di LH pituitaria28. Si può osservare che queste cellule inviano estensioni verso i vasi sanguigni. Alcuni vasi sanguigni non possono essere etichettati correttamente se la perfusione è sub-ottimale. Questo può essere il caso, ad esempio, se la soluzione viene iniettata nel ventricolo cardiaco invece dell'arterioso bulbo, o se si utilizza una pressione troppo bassa e/o per un periodo troppo breve sul pistone della siringa (Figura 7). Infine, immaginando lo stesso tessuto con gli stessi parametri di imaging, l'intensità dell'etichettatura ha mostrato di diminuire dopo quattro giorni, con il segnale più diffuso (Figura 8).
Figura 1 : Immagini della piastra di tenuta per la perfusione del pesce (A) e la configurazione dell'iniezione (B). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : Schema del cuore di pesce Medaka e sistema di perfusione mostrato con la posizione Idel dell'ago di vetro nel cuore per una perfusione di successo. La testa di freccia Mostra dove perforare il cuore per consentire al sangue di lasciare la circolazione. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3 : Immagine del lato ventrale del pesce aperto, con il cuore esposto per la perfusione. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4 : Immagine della vasculatura del sangue in una fetta di cervello e tessuto pituitario da Medaka. Un Medaka adulto è stato perfuso con una soluzione fissativa contenente DiI. Cervello e ipofisi sono stati dissezionati e fissi durante la notte. I tessuti sono stati montati in 3% di agarosio e sezionati con un vibratoma prima dell'imaging con un microscopio a fluorescenza. Tutti i vasi sanguigni etichettati con DiI sono visti attraverso l'intera sezione che mostra la vascolarizzazione nel cervello e l'ipofisi. OT = Tectum ottico; Tel = telencefon; Hyp = ipotalamo; Fossa = ipofisi; CB = cervelletto; Hind = hindbrain. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5 : rendering 3D di uno stack z confocale dalla vascolarizzazione del sangue nell'ipofisi Medaka. Un Medaka adulto è stato perfuso con una soluzione fissativa contenente DiI. Cervello-ipofisi sono stati dissezionati e fissi durante la notte. L'ipofisi è stato dissezionato dal cervello e montato tra una diapositiva e coprioggetto con distanziali IB tra, prima di imaging con un microscopio confocale. Z-stack è stato registrato, e un rendering 3D è stato fatto utilizzando il software Fiji e il plugin visualizzatore 3D29. L'intera vasculatura del sangue pituitario potrebbe essere osservata in 3D. RPD = Pars rostrali distalis; PPD = Pars prossimali distalis; PI = Pars intermedia. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6 : Proiezione z di z-stack confocale da una fetta di tessuto di Medaka transgenico dove il promotore Lhβ controlla l'espressione della proteina reporter verde fluorescente. Un TG adulto (LHB: hrgfpii) Medaka è stato perfuso con una soluzione fissativa contenente dii. Cervello-ipofisi sono stati dissezionati e fissi durante la notte. I tessuti sono stati montati in 3% di agarosio e sezionati con un VIBRATOME. Alcune cellule che producono ormoni, cellule di LH in questo caso, l'invio di estensioni (teste di freccia) verso i vasi sanguigni possono essere osservati, probabilmente per percepire i segnali dal sangue e/o rilasciare i loro ormoni nella circolazione. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 7 : Immagine della vasculatura del sangue in una fetta di cervello e tessuto pituitario da Medaka scarsamente perfuso. Un Medaka adulto è stato scarsamente perfuso con una soluzione fissativa contenente DiI iniettando la soluzione solo nel ventricolo. Cervello-ipofisi sono stati dissezionati e fissi durante la notte. I tessuti sono stati montati in 3% di agarosio e sezionati con un vibratoma prima dell'imaging con un microscopio confocale. I vasi sanguigni sono stati scarsamente etichettati con DiI e alcuni di loro non sono stati etichettati affatto. OT = Tectum ottico; Tel =, telencefalopatia; Hyp = ipotalamo; Fossa = ipofisi; CB = cervelletto; Hind = hindbrain. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 8 : Imaging time lapse di vasculatura del sangue etichettato nella sezione del tessuto cerebrale-ipofisi Medaka. Un Medaka adulto è stato perfuso con una soluzione fissativa contenente DiI. Cervello-ipofisi sono stati dissezionati e fissi durante la notte. I tessuti sono stati montati in 3% di agarosio e sezionati con un vibratoma prima dell'imaging con uno stereomicroscopio direttamente dopo il montaggio (a) e 4 giorni dopo il montaggio (B) con gli stessi parametri di imaging. Si noti che l'etichettatura è diminuita e si diffonde con il tempo. OT = Tectum ottico; Tel = telencefon; Hyp = ipotalamo; Fossa = ipofisi; CB = cervelletto; Hind = hindbrain. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
La perfusione cardiaca con DiI in precedenza è stata utilizzata per etichettare i vasi sanguigni in diverse specie di modello24, tra cui il pesce teleostico13.
Come DiI è direttamente consegnato alla membrana cellulare endoteliale per perfusione nella vasculatura, è possibile aumentare il rapporto segnale-rumore aumentando la concentrazione DiI nella soluzione fissativa. Inoltre, il fluoroforo fornisce una colorazione intensa quando eccitato con il minimo candeggio permettendo un'emissione relativamente lunga18,30. Inoltre, l'etichettatura può rimanere per diversi giorni ed essere utilizzato in combinazione con altre tecniche di etichettatura che richiedono trattamenti lievi, come ad esempio in immuofluorescenza (IF)31.
Tuttavia, questa tecnica ha alcune limitazioni. Dopo la rimozione dalla soluzione fissativa, l'etichettatura e l'imaging dei tessuti devono essere eseguiti il più rapidamente possibile perché l'intensità dell'etichettatura si indebolirà e il segnale si diffonderanno con il tempo (Figura 8). Questo processo sarà ancora più veloce quando si utilizzano detergenti che aumentano la porosità della membrana. Inoltre, poiché il PFA è un composto volatile tossico, è necessario adottare diverse precauzioni quando si esegue questo esperimento. Per minimizzare gli aspetti pericolosi di questo protocollo, si può profumi una soluzione di dii e PBS prima di dissezione del tessuto di interesse e fissarlo con la soluzione PFA subito dopo la perfusione. Tuttavia, questo può essere eseguito solo per i tessuti di piccole dimensioni, poiché la penetrazione di PFA in campioni di tessuto più grandi sarà meno efficiente rispetto alla perfusione.
Il tasso di successo di questo protocollo è migliorato dalla formazione, quindi si prevede che i ricercatori avranno bisogno di un po' di tempo per conoscere i diversi passaggi della tecnica. Per esempio, la perfusione della soluzione nel bulbo arterioso è un passo particolarmente critico del protocollo e richiede una certa formazione per ottenere un buon risultato. Anche mantenere l'ago nella posizione corretta per abbastanza a lungo durante la perfusione non è banale, e richiederà l'addestramento da parte del manipolatore.
Infine, questo protocollo è ottimizzato per adulti Medaka ma può essere utilizzato per altre specie con alcuni adattamenti. Diversi tessuti di interesse, o anche diverse fasi di vita dell'animale all'interno dello stesso tessuto richiederà anche ottimizzazioni per la concentrazione di DiI e il tempo di perfusione così come il materiale utilizzato (dimensioni dell'ago e della siringa per esempio).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Ringraziamo Dr Shinji Kanda per la dimostrazione di perfusione cardiaca con soluzione fissativa in Medaka, Sig. ra Lourdes Carreon G Tan per l'aiuto con l'allevamento di Medaka, e il signor Anthony Peltier per le illustrazioni. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio di ricerca della Norvegia, Grant Number 248828 (programma Digital Life Norway).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
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