Summary
Vi beskriver en ny metod för att generera dubbla humaniserade BLT-möss som har ett funktionellt humant immunförsvar och en stabil inympad människoliknande Gut microbiome. Detta protokoll kan följas utan behov av bakteriefria möss eller gnotobiotiska anläggningar.
Abstract
Humaniserade möss (HU-möss) som har ett funktionellt humant immunförsvar har i grunden förändrat studiet av mänskliga patogener och sjukdom. De kan användas för att modellera sjukdomar som annars är svåra eller omöjliga att studera hos människor eller andra djurmodeller. Tarmen mikrobiomet kan ha en djupgående inverkan på människors hälsa och sjukdom. Emellertid, den murina Gut mikrobiomet är mycket annorlunda än den som finns i människor. Det finns ett behov av förbättrade prekliniska hu-möss-modeller som har en inympad Human tarmmikrobiome. Därför skapade vi dubbla hu-möss som har både ett humant immunsystem och stabil människoliknande Gut microbiome. Nicka. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) möss är en av de bästa djuren för humanisering på grund av deras höga nivå av immunbrist. Men bakteriefria NSG-möss och olika andra viktiga bakterie fria möss modeller är för närvarande inte kommersiellt tillgängliga. Vidare har många forsknings inställningar inte tillgång till gnotobiotiska anläggningar, och arbetar under gnotobiotiska förhållanden kan ofta vara dyrt och tidskrävande. Viktigt, bakteriefria möss har flera immunbrist som finns även efter engrafharm av mikrober. Därför utvecklade vi ett protokoll som inte kräver bakteriefria djur eller gnotobiotiska anläggningar. För att generera dubbla hu-möss, NSG-möss behandlades med strålning före operationen för att skapa benmärg, lever, thymus-humaniserad (HU-BLT) möss. Mössen behandlades sedan med bredspektrumantibiotika för att tömma den redan existerande murina Gut microbiome. Efter antibiotikabehandling fick möss fekala transplantationer med friska humana donatorprover via oral Sonat. Dubbel hu-BLT möss hade unika 16S rRNA gen profiler baserat på enskilda mänskliga givaren provet som transplanterades. Viktigt, den transplanterade människoliknande mikrobiomet var stabil i den dubbla hu-BLT möss för varaktigheten av studien upp till 14,5 veckor efter transplantation.
Introduction
Humaniserade möss (HU-möss) har förändrat studiet av många aspekter av människors hälsa och sjukdom inklusive hematopoies, immunitet, cancer, autoimmun sjukdom, och infektionssjukdom1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Dessa hu-möss har den distinkta fördelen framför andra musmodeller i att de har ett funktionellt humant immunförsvar och kan smittas med humana specifika patogener. Ändå har betydelsen av Gut mikrobiomet visats av dess roll i många mänskliga sjukdomar som fetma, metabola syndromet, inflammatoriska sjukdomar, och cancer10,11,12, 13. Slemhinnor immunsystemet och Gut mikrobiomet är ömsesidigt reglerad att upprätthålla Gut och systemisk homeostas. Immunförsvaret är formad av antigener som presenteras av tarmen mikrobiomet och ömsesidigt immunförsvaret spelar en viktig reglerande roll för att främja kommensaler tarmbakterier och eliminera patogener14,15, 16. emellertid, Gut mikrobiomet av hu-möss har inte varit väl kännetecknas och murina Gut mikrobiomet skiljer sig avsevärt i sammansättning och funktion från människor17. Detta beror på evolutionära, fysiologiska och anatomiska skillnader mellan murina och mänskliga tarmen samt andra viktiga faktorer såsom diet, som kan påverka de experimentella resultaten av hu-möss sjukdomsmodeller18. Därför, bortom klassificering av murina Gut mikrobiomet av hu-möss, en djurmodell med både ett humant immunförsvar och mänskliga Gut mikrobiomet behövs för att studera komplexa interaktioner av mänskliga sjukdomar in vivo.
Studiet av mänskliga sjukdomar direkt i mänskliga ämnen är ofta opraktiskt eller oetiskt. Många djurmodeller kan inte användas för att studera humana patogener som humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1). Icke-mänskliga primater modeller är genetiskt utavlade, mycket dyra, och är inte mottagliga för många mänskliga patogener. Möss som har framställts som bakteriefria (GF) och rekonstitueras med Human-liknande Gut microbiomes har använts i stor utsträckning för att studera människors hälsa och sjukdom19,20. Emellertid, dessa djur har inte ett humant immunförsvar och arbetar med GF djur kräver specialiserade anläggningar, förfaranden, och expertis. Därför finns det ett behov av förbättrade prekliniska modeller för att studera det komplexa sambandet mellan tarmmikrobiomen och människans immunsystem. Många stammar av möss, såsom nickar. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), är inte kommersiellt tillgängliga som GF. GF djur kan också lida av långvariga immunbrist som inte är helt omvänd av engrafharm av mikrober21. Därför skapade vi en dubbel hu-möss med både ett funktionellt humant immunsystem och stabil Human-liknande Gut mikrobiomet under specifika patogenfria (SPF) villkor. För att generera dubbla hu-möss, kirurgi utfördes på NSG-möss för att skapa benmärg, lever, tymus humaniserade möss (HU-BLT). HU-BLT möss behandlades sedan med bredspektrumantibiotika och sedan ges fekal transplantationer med en hälsosam Human givare prov. Vi karakteriserade bakterien Gut mikrobiomet av 173 fekal prover från 45 dubbel hu-BLT möss och 4 mänskliga fekal givare prover. Dubbla hu-BLT möss har unika 16S rRNA gen profiler baserade på enskilda mänskliga givare prov som transplanteras. Viktigt, den transplanterade människoliknande mikrobiomet var stabil i möss för varaktigheten av studien upp till 14,5 veckor efter transplantation. Dessutom visade de förutspådda metagenomes att dubbla hu-BLT-möss har olika förväntad funktionell kapacitet än hu-möss som är mer likt de humana donatorproverna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här genomfördes i enlighet med institutionella djuromsorg och forskning kommitté (IACUC)-godkända protokoll vid University of Nebraska-Lincoln (UNL). Den IACUC på UNL har godkänt två protokoll som rör generering och användning av hu-BLT möss, inklusive dubbel hu-möss. Dessutom har vetenskapliga kommittén för forsknings tillsyn (SROC) vid UNL också godkänt användningen av mänskliga embryonala stamceller och fostervävnader, som upphandlas från de avancerade biovetenskapliga resurserna för humaniserade möss studier (SROC # 2016-1-002).
1. möss bostäder och underhåll
- Köp 6-8 veckor gamla NSG-möss (NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj).
- Hus möss under SPF villkor med luftväxling, för filter och HEPA-filter (0,22 μm) i ett rum med kontrollerad temperatur, luftfuktighet och tryck.
- Hus och underhålla möss i autoklaverade enskilda microisolator burar i ett racksystem som kan hantera luftväxling med för filter och HEPA-filter (0,22 μm).
- Utför alla procedurer och manipulationer av möss i en klass II typ a2 biologisk säkerhet draghuv som har förbehandlats med 70% etanol. Innan du arbetar i djur rummet, dusch och byta till rena Scrubs, Tyvek kostym, stövlar, hår mössa, ansiktsmask, och handskar. Bär en operation klänning över Tyvek kostym under kirurgiska ingrepp.
Obs: ultraviolett (UV) ljus sanering är också att föredra före förfaranden.- Autoklav alla instrument och reagenser om möjligt och desinficera sedan innan du överför till draghuv.
- Underprocedurer, ta bort djurens individuellt ventilerade burar från racket och desinficera innan du flyttar till rök huven.
- Mata mössen en bestrålad diet och ge autoklaverat vatten. Ge bestrålat foder AB libitum och komplettera med ytterligare bestrålade livsmedel efter behov. Byt autoklaverat vatten varje vecka eller efter behov.
Observera: Autoklaverat syrat vatten kan också användas. Den bestrålade kosten som tillhandahölls hade en hållbarhetstid på 6 månader efter tillverkningen.
2. generering av humaniserade BLT möss
Anmärkning: generering av hu-BLT möss har beskrivits tidigare22,23,24.
- På operationsdagen, ge möss hela kroppen bestrålning i en dos av 12 cGy/g kroppsvikt.
- Förbered mössen för kirurgi.
- Ge varje bestrålad mus en blandning av ketamin vid den arbetande koncentrationen av 100 mg/kg och xylazin vid koncentrationen 12 mg/kg, som varierade från 130-170 μL per mus baserat på kroppsvikt genom intraperitoneal (IP) injektion för anestesi. För beredning av 3 ml av blandningen ketamin och xylazin, tillsätt 0,27 mL ketamin i lager koncentrationen på 100 mg/mL och 0,03 mL xylazin vid koncentrationen 100 mg/mL till 2,7 mL steril saltlösning och blanda väl. Desinficera huden med 70% isopropanol före injektion.
- Ge varje bestrålad mus buprenorfin 1 mg/kg kroppsvikt (Half-Live 72 h, SR-LAB) genom subkutan injektion för långvarig smärt Lind rad.
- Ge varje bestrålad mus 100 μL (858 μg) cefazolin genom IP-injektion för preoperativ antibiotikaprofylax.
- Raka håret på möss med hjälp av elektriska hårklippningsmaskiner runt den vänstra laterala och mediala sidan av musen på den senare kirurgisk plats som används för att exponera vänster njure.
- Kontrollera lämplig nivå av anestesi genom pedal reflex (fast tå nypa).
- Ge isofluran gas på 3-5% om ytterligare anestesi behövs vid någon tidpunkt under operationen.
- Applicera oftalmologiska salva till båda ögonen för att förhindra korneal uttorkning. Applicera öronmärke om det behövs.
- Operera för att implantatet levern och tymus vävnader i den vänstra njure kapseln.
- Desinficera huden på operationsområdet genom att tillämpa jod scrub från mitten av operationsområdet och rör sig mot utsidan på ett cirkulärt sätt. Upprepa denna process med 70% isopropanol och en tredje gång med jod.
- Med hjälp av tång, först ladda en mänsklig foster levervävnad fragment i en trobil. Sedan använda tång, ladda en mänsklig foster tymus vävnad fragment i Trocar. Sedan använda tång, ladda en annan mänsklig foster levervävnad fragment i Trocar. Vävnader bör skäras till 1-1.6 mm3 för att passa de inre dimensionerna av trobilen.
- Använd tång för att lyfta huden och använda saxar för att göra en liten klippa längdriellt. Förläng snittet till 1,5-2 cm på vänster sida av musen.
- Använd tång för att lyfta muskellagret och använda saxar för att göra en liten klippa longitudinellt. Utöka snittet som behövs för att exponera njuren.
- Exponera njuren genom att försiktigt gripa fettvävnaden som omger njuren. Vidrör inte njurparenkymet direkt.
- Gör en 1-2 mm snitt vid den bakre änden av njure kapseln med en skalpell.
- Sakta in den förladdade troakaren genom snittet parallellt med den långa axeln av njuren och släpp vävnaderna mellan njure kapseln och njure.
- Försiktigt tillbaka njure och tarm till sin normala position. Använd resorberbara 5/0 P-3 (P-13) suturer med 13mm 3/8 cirkel nål för att stänga muskellagret och kirurgiska häftklamrar för att stänga huden.
- Efter operationen, sätta musen i en ren autoklaverad microisolator bur för återhämtning.
- För att minimera värmeförlusten under post-kirurgisk återhämtning, sätta buren innehåller möss på en värmedyna som är ansluten till en vattenpump som värmer och cirkulerar vattnet.
- Övervaka möss tills de har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala recumbency.
- Inom 6 h av kirurgi avslutad, via svans-ven, injicera CD34 + hematopoietiska stamceller isolerade från mänskliga foster levervävnad.
- Värm upp mössen med en värmelampa. Desinficera svansen med 70% isopropanol och injicera sedan 1,5 till 5 × 105 stamceller/200 μl i svans venen.
- Stoppa eventuella blödningar från injektionen och returnera möss till mikroisolatorhållaren och mikroisolatorhållaren till bur hållaren.
Anmärkning: möss efter operationen är vanligtvis inhysta tillsammans, fem per mikroisolatorbur, under och efter återhämtning. Men möss är bara inhysta tillsammans om de alla fick kirurgi på samma dag.
- Kontrollera mössen dagligen. Noggrant övervaka de kirurgiska häftklamrarna och ersätta dem efter behov. Noggrant övervaka möss för eventuella tecken på infektion eller obehag. Leverera autoklaverad mat på golvet i microisolator bur för ett par dagar efter operationen.
- Ta bort de kirurgiska häftklamrarna 7-10 dagar efter operationen. Ge isofluran gas på 3-5% att söva möss. Ta försiktigt bort häftklamrarna och applicera sedan antibiotika och smärtlindrande salva på platsen.
- Låt 9-12 veckor för beredning av mänskliga immunceller, sedan samla perifert blod från mediala ytlig ven från var och en av de humaniserade möss.
- Hindra medvetna möss med hjälp av en lämplig storlek plast kon återhållsamhet med en öppning nära huvudet av musen för andning och en öppning nära bak på musen för att isolera ett ben. Sätt möss i återhållsamhet konen huvudet först och sedan försiktigt dra ett ben genom benet öppningen.
- Spraya den mediala sidan av det isolerade benet med 70% isopropanol, sedan sprida antibiotika och smärtlindrande salva på samma plats.
Obs: salvan hjälper till att avslöja placeringen av venen utan behov av hårborttagning och även hjälper till i blod droppbildning. - Med hjälp av en 25-gauge nål i en 90 ° vinkel, punktera venen och samla 50-100 μL blod med ett EDTA-belagt bloduppsamlingsrör. Stoppa blödningen genom att tillämpa tryck på webbplatsen med steril gasväv. När blödningen har slutat, returnera möss till sin bur.
Obs: de maximala blod volymerna som samlas in är vanligtvis 50 μL per vecka eller 100 μL varannan vecka. - Använd det insamlade perifera blodet för att testa nivån av människans immun cells beredning med flödescytometri med antikroppar för hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. antibiotikabehandling
- Före antibiotikabehandling, samla in förbehandling fekal prover. Flytta möss till en ny autoklaverad microisolator bur.
- Förbered en fräsch cocktail av bredspektrumantibiotika dagligen.
- Bered 250 mL vatten som innehåller nyberedd metronidazol (1 g/L), neomycin (1 g/L), vankomycin (0,5 g/L) och ampicillin (1 g/L) för varje mikroisolatorbur av möss.
Anmärkning: Använd autoklaverat eller sterilt vatten för antibiotikum kompletterat dricksvatten. - Tillsätt 9,2 g druvsocker sötad dryck blanda till 250 mL av antibiotika kompletterat vatten.
Obs: användningen av druvsocker sötad dryck blanda masker den bittra smaken av antibiotika och hjälper till att förhindra uttorkning i möss. - Ändra antibiotikum och druvsocker sötad dryck blanda kompletterat vatten och placera mössen i en ny autoklav bur dagligen.
Obs: möss är coprophagic och ändra burar dagligen förhindrar möss från åter inoculating sig med tarmbakterier. - För maximal inympelse av den mänskliga-liknande Gut microbiome, ge antibiotika för 14 dagar. Under antibiotikabehandling, övervaka möss för viktminskning och uttorkning. Viktminskning väntas under de första 3-4 dagarna och platåer efter det under behandlingens längd. Om uttorkning uppstår, ge mössen saltlösning eller Ringers lösningen via intraperitoneal injektion.
Obs: andra Gut mikrobiomet humanisering protokoll kräver oral sonden av antibiotika. Samtidigt effektivt på att tömma murina tarmbakterier, fann vi att den mindre invasiva metoden för att lägga till antibiotika till dricksvattnet sätta mindre stress på våra humaniserade möss och ledde till bättre resultat.
- Bered 250 mL vatten som innehåller nyberedd metronidazol (1 g/L), neomycin (1 g/L), vankomycin (0,5 g/L) och ampicillin (1 g/L) för varje mikroisolatorbur av möss.
4. givar prov och fekal transplantation
- Förbered humana donatorprover.
- Använd ordentligt preparerade källor av fekal bakterieflora Transplant (FMT) material för fekal transplantation i humaniserade möss.
- Tina fmt preparat och alikvot dem under anaeroba förhållanden i en anaerob kammare.
- Om så önskas, vid denna steg blanda lika delar av fekal proverna tillsammans för att skapa en opartisk "mänsklig" prov.
- Hålla frysning och upptining av FMT-materialet till ett minimum, om det inte behövs en Ali citering eller blandning av prover, ska endast Tina omedelbart före ingreppet.
- Mänsklig fekal transplantation
- Efter avslutad 14 dagar antibiotikabehandling, ändra dricksvattnet till autoklaverat vatten och flytta möss till en ny autoklav bur. Stoppa dagliga bur förändringar och genomföra en gång varje 1-2 veckor bur ändra schema.
- Ge två fekala transplantationer vid 24 och 48 h efter avslutad antibiotika.
- 24 h efter antibiotikabehandling, Tina den nödvändiga mängden FMT material, ge varje mus 200 μL av FMT material via oral Sonda. Upprepa proceduren igen på 48 h post antibiotika.
- Sprid alla kvarvarande eller överblivna, tinade FMT-material på pälsen på de humaniserade mössen eller på bur sängkläderna.
5. färsk fekal provsamling
- Autoklav enskilda papperspåsar innan du överför till draghuv.
- I rök huven, sätta en mus i varje enskild papperspåse och låt musen att uträtta.
- Använd sterila tång, samla fekal provet i 1,5 mL plaströr och frys vid-80 ° c. Returnera mössen till microisolator burar.
Anmärkning: denna metod för att samla fekal prover möjliggör färsk fekal provinsamling från enskilda möss utan stress inducerande manipulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en disposition av de metoder som används för att skapa dubbla hu-BLT möss och kortfattat beskriver processen för att lägga till ett funktionellt humant immunsystem och stabil människoliknande Gut mikrobiomet till NSG-möss. Figur 2 visar ett exempel på flödescytometri analys av perifert blod från en HUMANISERAD BLT-mus 10 veckor efter operationen. Figur 3 visar det relativa överflöd av de humana fekala donatorproverna som används för att överföra en tarmmikrobiome för att skapa dubbla hu-möss. Figur 4 visar de fenotypiska förändringar som induceras av antibiotikabehandling till mjälten och blindtarmen, liknande vad som observeras i bakteriefria djur. Figur 5 visar en huvudkomponent analys (PCA) Plot av 16s rRNA sekvenserings data avslöjar dubbla hu-möss har Human-liknande Gut mikrobiomes som är unika för den mänskliga givaren provet.
Figur 1 : Skapa dubbla humaniserade BLT-möss. Att skapa dubbla hu-BLT-möss är en tvåstegsprocess. Det första steget är att att det mänskliga immunförsvaret till NSG-möss. På operationsdagen ges NSG-möss bestrålning för att skapa en nisch för stamceller. Mössen är sedan implanteras med mänskliga foster lever och bräss vävnader och injiceras med mänskliga hematopoietiska stamceller. Människans immun cells beredning kontrolleras runt 10 veckor efter operationen. Det andra steget är att att den mänskliga Gut microbiome. Möss behandlas med antibiotika för att reducera de redan existerande murina tarmbakterierna. Möss ges sedan fekal transplantationer för att ge den mänskliga tarmmikrobiomen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Testa människans immun cells beredning i dubbla humaniserade BLT-möss. Ett exempel på flödescytometri analys av en humaniserad BLT-mus perifera blod 10 veckor efter operationen. Figuren visar den gating strategi som används för att identifiera lymfocytpopulationen, mCD45-hCD45 + celler, CD19 + B-celler, CD3 + T celler, CD4 + T-celler, och CD8 + T-celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Humana donations prov profiler. Relativ förekomst av de tre humana donatorerna och blandade (alla givare) prover som visas på familjenivå. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Antibiotika behandlade möss liknar bakteriefria fenotyper. HU-möss offrades efter 9 dagar av antibiotikabehandling (antibiotika) eller ingen antibiotikabehandling (kontroll). Efter antibiotikabehandling börjar fenotypen hos de humaniserade mössen likna dem som ses i bakteriefria djur. Som ett resultat av antibiotikabehandling finns det en minskning av storleken på mjälten (vänster) och blindtarmen är förstorad (höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Dubbla humaniserade BLT-möss funktionen fekal donator specifika Gut microbiomes. PCA Plot av 16S rRNA sekvensering data visar efter mänsklig fekal transplantation den dubbla hu-BLT möss har Gut microbiomes som är unika för enskilda mänskliga fekal donator. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här är för skapandet av dubbla hu-BLT möss som har både ett funktionellt humant immunförsvar och en stabil människoliknande Gut microbiome. Detta protokoll kan anpassas till andra humaniserade eller icke-humaniserade möss modeller utan behov av GF djur och gnobiotisk anläggningar. Medan de metoder som beskrivs här är relativt enkla, det finns flera viktiga detaljer som är viktiga för en lyckad skapandet av dubbla hu-BLT möss. NSG-möss är extremt immunbrist och förhindra infektioner är nyckeln till långsiktig överlevnad av möss. Vi vidtog följande åtgärder för att förhindra infektion. Först var djuren inhysta i enskilda mikroisolatorburar med HEPA-filter (0,22 μm) i ett racksystem med hantering av luftväxling i en dedikerad svit. Luft hanteraren för rack innehöll för filter tillsammans med HEPA filtrerad (0,22 μm) till-och frånluft, samt realtid on-line övervakning av buren frånluftstemperatur och relativ luftfuktighet. För det andra var alla som kom in i djur rummet tvungen att duscha och bära rena Scrubs och skor samt sätta på handskar, disponibel Tyvek kostym, tossor, hår Bonnet, och ansiktsmask. Tredje, alla förfaranden, inklusive bur förändringar och tillsats av mat och vatten, utfördes inom en klass II typ a2 biologisk säkerhet draghuv som var Försteriliserad med 70% etanol och UV-ljus. Fjärde, aseptisk kirurgisk teknik användes under överlevnad kirurgi, som inkluderade kirurgen och assistenter bär ett extra lager av skydd inklusive en operation klänning och handskar. Kirurgi utfördes i desinficerade rök huven, med endast sterila instrument, gauzes, och sår stängning material, samtidigt som sterilitet av handskar och instrument under hela operationen. Slutligen, för att förhindra infektion och säkerställa stabiliteten i den inympade människoliknande Gut microbiome, all mat och vatten som ges till möss var steril. All mat ska bestrålas och allt vatten bör autoklaveras. För att minimera smärta och ångest, administrerade vi långverkande buprenorfin subkutant till möss före operationen. Kombinationen av ketamin och xylazin för mus kirurgisk anestesi är mycket tillförlitlig och kan pågå i ca 30 min. Om det inte är tillräckligt länge, ger vi isofluran gas för att ytterligare bedra möss. Det är också mycket viktigt att upprätthålla mus kroppstemperatur efter operationen. Vi lägger buren på den uppvärmda uppvärmningen pad tills den hematopoietiska stamcells injektion via svansen ven. På den tiden, möss återvinns från anestesi och återvände till rack.
För att tömma murina Gut mikrobiomet och förbereda sig för mänskliga fekal transplantation, är det viktigt att alltid använda nyberedda antibiotika och att ändra antibiotika kompletteras vatten och burar dagligen. Detta kommer att använda många microisolator burar under hela 14-dagars antibiotikabehandling, men det säkerställer att möss inte åter inokuleras genom koprofagi. Under antibiotikabehandling är det också viktigt att övervaka mössen kroppsvikt och hälsa. Efter fekal transplantation, möss snabbt återfå någon förlorad vikt. Det är viktigt att minimera frys-Tina-cykler för det fekala transplantations materialet och se till att använda en anaerob kammare om det behövs alicitatprover. Samtidigt som man skapar dubbla hu-BLT-möss är det viktigt att minimera hanteringen och stressen som induceras på mössen. Detta bidrar till att förebygga infektion och förbättrar långsiktig överlevnad.
Vi försökte initialt att pre-behandla möss med anti-svamp amfotericin B men fann möss tolererar inte behandlingen mycket väl och det är inte längre används. Vi experimenterade också med olika varaktigheter för antibiotikabehandling. Vi fann att medan en majoritet av murina tarmbakterier verkar vara uttömda efter 7 dagar av antibiotika, nivån av donator inympelse är mycket högre efter 14 dagars behandling. Vi försökte också administrera antibiotika genom två gånger dagligen oral sond. Vi fann dock att denna metod var för invasiv för våra hu-möss. Vi bytte till en enda daglig sondmatning schema men mössen verkade fortfarande vara stressad och ohälsosam. Vi konstaterade att det var den bästa metoden att tillhandahålla antibiotika i dricksvattnet. Det minskade mängden hantering och stress till möss samtidigt tillräckligt minska murina tarmbakterier. Vi tillhandahöll druvsocker sötad dryck blanda i dricksvattnet för att säkerställa att möss fick en adekvat dos av antibiotika och för att förhindra uttorkning. Mössen upplever en minskning av kroppsvikten under de första 3-4 dagarna av antibiotikabehandling, men att ge extra vätskor via intraperitoneal injektion ökar inte kroppsvikten. Efter fekal transplantation, möss snabbt återfå den förlorade vikten.
Även om denna metod kan reproducerbart generera dubbla hu-BLT möss, det finns vissa begränsningar för modellen. Det första man bör tänka på är hu-möss har mindre organiserad lymfoida struktur, inklusive avelsmaterial Center, vilket leder till minskad antikropp klass byte och begränsad affinitet mognad. Emellertid, NSG hu-BLT möss har systemisk immun beredning och översättningsbara T cell svar och kan användas för att modellera många mänskliga sjukdomar. En annan fråga är den potentiella utvecklingen av graft-versus-host sjukdom (GVHD) i vissa hu-möss efter flera månaders överdriven mänsklig immun beredning. Vi och andra har observerat GVHD manifestationer såsom blefarit, alopeci, viktminskning, och malocklusion som måste övervakas noggrant25.
Det finns flera dokumenterade regimer för att tömma tarmbakterier hos möss med antibiotika26,27,28,29,30,31. Vi valde vår cocktail av antibiotika på grund av deras kända förmåga att rikta ett brett spektrum av bakterier i tarmen och eftersom vi hittade flera exempel på framgångsrik bakteriell utarmning i litteraturen. Många publicerade fall använder en mycket mindre rigorös kurs av antibiotika men i vår studie, vi fann att 14 dagar behövs för optimal inympelse av en människoliknande Gut microbiome. Medan vi initialt försökte ett protokoll baserat på Hintze et al., fann vi att oral sondera var för invasiv och att anti-svamp behandling var skadligt för möss26. Vi tror att NSG hu-BLT möss är unika och mindre invasiva procedurer är att föredra jämfört med andra mer robusta möss. Vi använde inte GF-djur i vår studie. Användningen av GF möss för att studera effekterna av tarmen mikrobiomet har väl dokumenterade, men dessa djur har inte ett humant immunsystem19,32. Vidare medger vi att arbeta med en GF NSG hu-BLT möss modell skulle skapa intressanta möjligheter för forskning. För en, studerar människans immun cell beredning och patogenesen av mänskliga specifika patogener som hiv-1 utan närvaron av tarmen mikrobiomet kan ge intressanta resultat. Ytterligare, GF-modeller kan möjliggöra en mer komplett beredning av en human-liknande Gut mikrobiomet efter fekal transplantation. Emellertid, GF möss har långvariga immunbrist, även efter Gut mikrobiomet beredning21. Vår modell har fördelen av att använda SPF boendeförhållanden, som är allmänt tillgängliga och billigare jämfört med GF anläggningar. Vår modell har också fördelen av att inte störande de normala förfarandena för kirurgiskt genererar hu-BLT möss eftersom det inte finns något behov av en helt GF miljö.
Vi tror att denna dubbla hu-BLT musmodell är unik i att det inte bara kan användas för att studera människans immun funktion och mänskliga sjukdomar, men också bestämma effekten av tarmen mikrobiomet på sjukdomens patogenes och behandling in vivo. Med detta protokoll, vi kan reproducerbart skapa dubbla hu-BLT möss med mänsklig givare specifika Gut mikrobiomet profiler. Därför tror vi att använda dubbla hu-BLT möss kommer att vara fördelaktigt för framtida personlig medicin applikationer som utformats för att testa effekten av tarmen mikrobiomet på behandlingar för olika mänskliga sjukdomar som hiv-1 och cancer. Sammanfattnings, vår dubbla hu-BLT möss modellen är en viktig och ny preklinisk modell som har både ett funktionellt humant immunförsvar och en stabil människa-liknande Gut mikrobiomet att studera människors hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Yanmin WAN, Guobin Kang, och Pallabi Kundu för deras hjälp med att generera BLT-humaniserade möss. Vi skulle vilja erkänna UNMC Genomics Core facility som får partiellt stöd från Nebraska Research Network i funktionell genomik NE-INBRE P20GM103427-14, molekylärbiologi Neurosensoriska system CoBRE P30GM110768, fred & Pamela Buffett Cancer Center-P30CA036727, centrum för root och Rhizobiome innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, och Nebraska forskning initiativ. Vi skulle vilja tacka University of Nebraska-Lincoln Life Sciences Annex och deras personal för deras hjälp. Denna studie stöds delvis av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 kronisk hiv-infektion och åldrande i NEUROAIDS (Chain) Center, 1R01AI111862 till Q Li. Finansiärer hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, förberedelse av manuskriptet eller beslut för publicering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W.
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
