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Biochemistry

Ein doppelt humanisiertes BLT-Mäuse-Modell mit einem stabilen humanähnlichen Gut-Mikrobiom und menschlichem Immunsystem

doi: 10.3791/59773 Published: August 30, 2019

Summary

Wir beschreiben eine neuartige Methode zur Erzeugung doppelt humanisierter BLT-Mäuse, die über ein funktionelles menschliches Immunsystem und ein stabiles transplantiertes menschenähnliches Darmmikrobiom verfügen. Dieses Protokoll kann ohne keimfreie Mäuse oder gnotobiotische Einrichtungen befolgt werden.

Abstract

Humanisierte Mäuse (Hu-Mäuse), die über ein funktionelles menschliches Immunsystem verfügen, haben die Untersuchung menschlicher Krankheitserreger und Krankheiten grundlegend verändert. Sie können verwendet werden, um Krankheiten zu modellieren, die sonst schwierig oder unmöglich sind, bei Menschen oder anderen Tiermodellen zu studieren. Das Darmmikrobiom kann einen tiefgreifenden Einfluss auf die menschliche Gesundheit und Krankheit haben. Jedoch, das murine Darmmikrobiom ist sehr anders als das beim Menschen gefunden.  Es besteht Bedarf an verbesserten präklinischen Hu-Mäuse-Modellen, die ein transplantiertes menschliches Darmmikrobiom haben. Daher haben wir Doppel-Hu-Mäuse entwickelt, die sowohl ein menschliches Immunsystem als auch ein stabiles menschenähnliches Darmmikrobiom aufweisen. nicken. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse sind aufgrund ihrer hohen Immunschwäche eines der besten Tiere für die Humanisierung. Keimfreie NSG-Mäuse und verschiedene andere wichtige keimfreie Mäusemodelle sind derzeit jedoch nicht kommerziell erhältlich. Darüber hinaus haben viele Forschungsumgebungen keinen Zugang zu gnotobiotischen Einrichtungen, und die Arbeit unter gnotobiotischen Bedingungen kann oft teuer und zeitaufwändig sein. Wichtig ist, dass keimfreie Mäuse mehrere Immunschwächen haben, die auch nach der Transplantation von Mikroben bestehen. Deshalb haben wir ein Protokoll entwickelt, das keine keimfreien Tiere oder gnotobiotischen Einrichtungen erfordert. Um Doppel-Hu-Mäuse zu erzeugen, wurden NSG-Mäuse vor der Operation mit Strahlung behandelt, um Knochenmark-, Leber-, Thymus-humanisierte (hu-BLT) Mäuse zu erzeugen. Die Mäuse wurden dann mit Breitspektrum-Antibiotika behandelt, um das bereits vorhandene murine Darmmikrobiom zu erschöpfen. Nach einer Antibiotika-Behandlung erhielten die Mäuse Fäkaltransplantationen mit gesunden menschlichen Spenderproben per oraler Gavage. Doppel-Hu-BLT-Mäuse hatten einzigartige 16S rRNA-Genprofile, die auf der einzelnen menschlichen Spenderprobe basierten, die transplantiert wurde. Wichtig ist, dass das transplantierte menschenähnliche Mikrobiom in den doppelhu-BLT-Mäusen für die Dauer der Studie bis zu 14,5 Wochen nach der Transplantation stabil war.

Introduction

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Humanisierte Mäuse (Hu-Mäuse) haben die Untersuchung vieler Aspekte der menschlichen Gesundheit und Krankheit verändert, einschließlich Hämatopoese, Immunität, Krebs, Autoimmunerkrankung und Infektionskrankheit1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Diese Hu-Mäuse haben den deutlichen Vorteil gegenüber anderen Mausmodellen, da sie ein funktionelles menschliches Immunsystem haben und mit humanspezifischen Krankheitserregern infiziert werden können. Dennoch hat sich die Bedeutung des Darmmikrobioms durch seine Rolle bei vielen menschlichen Krankheiten wie Fettleibigkeit, metabolischem Syndrom, entzündlichen Erkrankungen und Krebs10,11,12, 13. Das Schleimhaut-Immunsystem und Das Darmmikrobiom sind wechselseitig reguliert, um Darm und systemische Homöostase aufrechtzuerhalten. Das Immunsystem wird durch Antigene des Darmmikrobioms geformt und umgekehrt spielt das Immunsystem eine wichtige regulatorische Rolle bei der Förderung von darmen Darmbakterien und der Eliminierung von Krankheitserregern14,15, 16. Allerdings ist das Darmmikrobiom von Hu-Mäusen nicht gut charakterisiert und das murine Darmmikrobiom unterscheidet sich in Zusammensetzung und Funktion wesentlich von Menschen17. Dies ist auf evolutionäre, physiologische und anatomische Unterschiede zwischen dem murinen und menschlichen Darm sowie andere wichtige Faktoren wie Ernährung zurückzuführen, die die experimentellen Ergebnisse der Hu-Mäuse-Krankheitsmodelle beeinflussen können18. Daher wird über die Klassifizierung des murinen Darmmikrobioms von Hu-Mäusen hinaus ein Tiermodell benötigt, das sowohl ein menschliches Immunsystem als auch ein menschliches Darmmikrobiom zeigt, um die komplexen Wechselwirkungen menschlicher Krankheiten in vivo zu untersuchen.

Das Studium menschlicher Krankheiten direkt beim Menschen ist oft unpraktisch oder unethisch. Viele Tiermodelle können nicht zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger wie dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) verwendet werden. Nichtmenschliche Primatenmodelle sind genetisch ausgezüchtet, sehr teuer und nicht anfällig für viele menschliche Krankheitserreger. Mäuse, die als keimfrei (GF) abgeleitet und mit menschenähnlichen Darmmikrobiomen rekonstituiert wurden, wurden weit verbreitet verwendet, um die menschliche Gesundheit und Krankheit zu studieren19,20. Diese Tiere haben jedoch kein menschliches Immunsystem und die Arbeit mit GF-Tieren erfordert spezielle Einrichtungen, Verfahren und Fachwissen. Daher ist es notwendig, verbesserte präklinische Modelle zu studieren, um die komplexe Beziehung des Darmmikrobioms und des menschlichen Immunsystems zu untersuchen. Viele Stämme von Mäusen, wie NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sind nicht als GF erhältlich. GF-Tiere können auch an langanhaltenden Immunschwächen leiden, die durch die Transplantation von Mikroben nicht vollständig umgekehrt werden21. Daher haben wir eine doppelhu-Mäuse mit einem funktionellen menschlichen Immunsystem und stabilem menschenähnlichen Darmmikrobiom unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen entwickelt. Um Doppel-Hu-Mäuse zu erzeugen, wurde an NSG-Mäusen operiert, um Knochenmark, Leber, Thymus humanisierte Mäuse (hu-BLT) zu erzeugen. Die hu-BLT-Mäuse wurden dann mit Breitspektrum-Antibiotika behandelt und dann mit einer gesunden menschlichen Spenderprobe fäkal transplantiert. Wir charakterisierten das bakterielle Darmmikrobiom von 173 Fäkalienproben von 45 doppelhu-BLT-Mäusen und 4 menschlichen Fäkalien-Spenderproben. Doppel-Hu-BLT-Mäuse haben einzigartige 16S rRNA-Genprofile, die auf der einzelnen menschlichen Spenderprobe basieren, die transplantiert wird. Wichtig ist, dass das transplantierte menschenähnliche Mikrobiom bei den Mäusen für die Dauer der Studie bis zu 14,5 Wochen nach der Transplantation stabil war. Darüber hinaus zeigten die vorhergesagten Metagenome, dass Doppel-Hu-BLT-Mäuse eine andere vorhergesagte funktionelle Kapazität haben als Hu-Mäuse, die den menschlichen Spenderproben ähnlicher sind.

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Protocol

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den von Institutional Animal Care and Research Committee (IACUC) genehmigten Protokollen an der Universität Nebraska-Lincoln (UNL) durchgeführt. Die IACUC an der UNL hat zwei Protokolle zur Erzeugung und Verwendung von Hu-BLT-Mäusen genehmigt, darunter Doppel-Hu-Mäuse. Darüber hinaus hat das Scientific Research Oversight Committee (SROC) an der UNL auch die Verwendung menschlicher embryonaler Stammzellen und fetaler Gewebe genehmigt, die aus der Advanced Bioscience Resources für humanisierte Mäusestudien (SROC-1-002) beschafft werden.

1. Mäusegehäuse und Wartung

  1. Kaufen Sie 6-8 Wochen alte NSG-Mäuse (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
  2. Beherbergen Sie die Mäuse unter SPF-Bedingungen mit Luftaustausch, Vorfiltern und HEPA-Filtern (0,22 m) in einem Raum mit kontrollierter Temperatur, Feuchtigkeit und Druck.
    1. Die Mäuse in autoklavierten Einzelmikroisolatorkäfigen in einem Racksystem unterbringen und warten, das in der Lage ist, den Luftaustausch mit Vorfiltern und HEPA-Filtern (0,22 m) zu verwalten.
  3. Führen Sie alle Verfahren und Manipulationen der Mäuse in einer biologischen Sicherheitsrauchhaube der Klasse II Typ A2 durch, die mit 70% Ethanol vorbehandelt wurde. Vor der Arbeit im Tierzimmer, Duschen und wechseln Sie in saubere Peelings, Tyvek Anzug, Stiefelabdeckungen, Haarkappe, Gesichtsmaske und Handschuhe. Tragen Sie während der chirurgischen Eingriffe ein OP-Kleid über dem Tyvek-Anzug.
    HINWEIS: Ultraviolette (UV) Lichtdekontamination wird auch vor Verfahren bevorzugt.
    1. Autoklaven Sie nach Möglichkeit alle Instrumente und Reagenzien und desinfizieren Sie sie dann vor dem Transfer auf die Dunstabzugshaube.
    2. Entfernen Sie während der Eingriffe die individuell belüfteten Käfige der Tiere aus dem Gestell und desinfizieren Sie sie, bevor Sie auf die Dunstabzugshaube übertragen werden.
  4. Füttern Sie die Mäuse mit einer bestrahlten Nahrung und liefern Sie autoklaviertes Wasser. Bestrahlte Lebensmittel ab libitum zur Verfügung stellen und bei Bedarf mit zusätzlichen bestrahlten Lebensmitteln ergänzen. Ändern Sie autoklaviertes Wasser wöchentlich oder nach Bedarf.
    HINWEIS: Autoklaviertes saures Wasser kann auch verwendet werden. Die bereitgestellte bestrahlte Ernährung hatte eine Haltbarkeit von 6 Monaten nach der Herstellung.

2. Erzeugung von humanisierten BLT-Mäusen

HINWEIS: Die Erzeugung von hu-BLT-Mäusen wurde zuvor beschrieben22,23,24.

  1. Geben Sie den Mäusen am Tag der Operation eine Ganzkörperbestrahlung in einer Dosis von 12 cGy/g Körpergewicht.
  2. Bereiten Sie die Mäuse für eine Operation vor.
    1. Geben Sie jeder bestrahlten Maus eine Mischung aus Ketamin bei der Arbeitskonzentration von 100 mg/kg und Xylazin in der Konzentration von 12 mg/kg, die zwischen 130-170 l pro Maus auf der Grundlage des Körpergewichts durch intraperitoneale (IP) Injektion zur Anästhesie reichte. Zur Zubereitung von 3 ml des Ketamin- und Xylazin-Gemischs 0,27 ml Ketamin bei der Lagerkonzentration von 100 mg/ml und 0,03 ml Xylazin in der Konzentration von 100 mg/ml bis 2,7 ml steriler Saline hinzufügen und gut vermischen. Desinfizieren Sie die Haut vor der Injektion mit 70% Isopropanol.
    2. Geben Sie jeder bestrahlten Maus Buprenorphin 1 mg/kg Körpergewicht (halblebend 72 h, SR-LAB) durch subkutane Injektion für ein lang anhaltendes Schmerzmanagement.
    3. Geben Sie jeder bestrahlten Maus 100 l (858 g) Cefazolin durch IP-Injektion zur präoperativen Antibiotikaprophylaxe.
    4. Rasieren Sie die Haare der Mäuse mit elektrischen Haarschneider um die linke seitliche und mediale Seite der Maus an der späteren chirurgischen Stelle verwendet, um die linke Niere zu belichten.
    5. Überprüfen Sie das richtige Maß an Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme).
    6. Geben Sie Isoflurangas bei 3-5%, wenn eine zusätzliche Anästhesie an jedem Punkt während der Operation benötigt wird.
    7. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um hornhautaustrocknung zu verhindern. Tragen Sie bei Bedarf ein Ohrschild auf.
  3. Führen Sie eine Operation durch, um die Leber und Thymusgewebe in die linke Nierenkapsel zu implantieren.
    1. Desinfizieren Sie die Haut an der chirurgischen Stelle, indem Sie Jodpeeling von der Mitte der chirurgischen Stelle aus auftragen und sich kreisförmig nach außen bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit 70% Isopropanol und ein drittes Mal mit Jod.
    2. Mit Zangen, laden Sie zuerst ein menschliches fetales Lebergewebe Fragment in einen Trokar. Dann mit Zangen, laden Sie ein menschliches fetales Thymus-Gewebefragment in den Trokar. Dann mit Zangen, laden Sie ein weiteres menschliches fetales Lebergewebe Fragment in den Trokar. Gewebe sollten auf 1-1,6 mm3 geschnitten werden, um die Innenabmessungen des Trokars zu passen.
    3. Verwenden Sie Zangen, um die Haut zu heben und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt längs zu machen. Verlängern Sie den Schnitt auf 1,5-2 cm in der linken Seite der Maus.
    4. Verwenden Sie Zangen, um die Muskelschicht zu heben und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt längs zu machen. Erweitern Sie den Schnitt nach Bedarf, um die Niere freizulegen.
    5. Setzen Sie die Niere aus, indem Sie das Fettgewebe, das die Niere umgibt, sanft erfassen. Berühren Sie das Nierenparenchym nicht direkt.
    6. Machen Sie einen 1-2 mm Schnitt am hinteren Ende der Nierenkapsel mit einem Skalpell.
    7. Setzen Sie den vorbelasteten Trokar langsam durch den Schnitt parallel zur langen Achse der Niere ein und geben Sie das Gewebe zwischen Nierenkapsel und Niere frei.
    8. Bringen Sie die Niere und den Darm vorsichtig in ihre normale Position zurück. Verwenden Sie resorbierbare 5/0 P-3 (P-13) Nähte mit 13mm 3/8 Kreisnadel, um die Muskelschicht und chirurgische Klammern zu schließen, um die Haut zu schließen.
  4. Nach der Operation, legen Sie die Maus in einen sauberen autoklavierten Mikroisolator Käfig für die Genesung.
    1. Um den Wärmeverlust während der postoperativen Rückgewinnung zu minimieren, legen Sie den Käfig mit den Mäusen auf ein Heizkissen, das mit einer Wasserpumpe verbunden ist, die das Wasser erwärmt und zirkuliert.
    2. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten.
  5. Innerhalb von 6 h nach Abschluss der Operation, über die Schwanzvene, injizieren CD34+ hämatopoetische Stammzellen aus menschlichen fetalen Lebergewebe isoliert.
    1. Erwärmen Sie die Mäuse mit einer Wärmelampe. Desinfizieren Sie den Schwanz mit 70% Isopropanol und injizieren Sie dann 1,5 bis 5 x 105 Stammzellen/200 l in die Schwanzvene.
    2. Stoppen Sie alle Blutungen aus der Injektion und bringen Sie Mäuse in den Mikroisolatorkäfig und den Mikroisolatorkäfig in den Käfigträger zurück.
      HINWEIS: Mäuse nach der Operation sind in der Regel zusammen untergebracht, fünf pro Mikroisolatorkäfig, während und nach der Genesung. Mäuse werden jedoch nur zusammen untergebracht, wenn sie alle am selben Tag operiert werden.
  6. Überprüfen Sie die Mäuse täglich. Überwachen Sie die chirurgischen Heftklammern sorgfältig und ersetzen Sie sie bei Bedarf. Beobachten Sie die Mäuse genau auf Anzeichen einer Infektion oder Beschwerden. Liefern Sie autoklavierte Lebensmittel auf dem Boden des Mikroisolatorkäfigs für ein paar Tage nach der Operation.
  7. Entfernen Sie die chirurgischen Heftklammern 7-10 Tage nach der Operation. Geben Sie Isoflurangas bei 3-5%, um die Mäuse zu anästhesieren. Entfernen Sie vorsichtig die Heftklammern und wenden Sie dann Antibiotikum und schmerzlindernde Salbe auf die Website.
  8. Erlauben Sie 9-12 Wochen für die Rekonstitution von menschlichen Immunzellen, dann sammeln peripheres Blut aus der medialen saphenous Vene von jeder der humanisierten Mäuse.
    1. Beschränken Sie bewusste Mäuse mit einer entsprechend großen Kunststoffkegelrückhalteeinrichtung mit einer Öffnung in der Nähe des Mauskopfes zum Atmen und einer Öffnung in der Nähe der Rückseite der Maus, um ein Bein zu isolieren. Setzen Sie die Mäuse zuerst in den Rückhaltekegelkopf und ziehen Sie dann sanft ein Bein durch die Beinöffnung.
    2. Sprühen Sie die mediale Seite des isolierten Beins mit 70% Isopropanol, dann verbreiten Sie Antibiotika und schmerzlindernde Salbe auf die gleiche Stelle.
      HINWEIS: Die Salbe hilft, die Position der Vene ohne die Notwendigkeit der Haarentfernung zu offenbaren und hilft auch bei der Bildung von Bluttröpfchen.
    3. Mit einer 25-Spur-Nadel in einem 90°-Winkel, punktieren Sie die Vene und sammeln Sie 50-100 l Blut mit einem EDTA-beschichteten Blutentnahmeröhrchen. Stoppen Sie die Blutung, indem Sie Druck auf die Stelle mit steriler Gaze ausüben. Sobald die Blutung aufgehört hat, kehren Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück.
      HINWEIS: Die maximalen Blutmengen, die gesammelt werden, betragen in der Regel 50 l pro Woche oder 100 l alle zwei Wochen.
    4. Verwenden Sie das gesammelte periphere Blut, um das Niveau der rekonstitutionen der menschlichen Immunzellen mithilfe der Durchflusszytometrie mit Antikörpern für hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19 zu testen.

3. Antibiotika-Behandlung

  1. Sammeln Sie vor der Antibiotikabehandlung Fäkalienproben vor der Behandlung. Bewegen Sie die Mäuse in einen neuen autoklavierten Mikroisolatorkäfig.
  2. Bereiten Sie täglich einen frischen Cocktail mit Breitspektrum-Antibiotika zu.
    1. Bereiten Sie 250 ml Wasser mit frisch zubereitetem Metronidazol (1 g/L), Neomycin (1 g/L), Vancomycin (0,5 g/L) und Ampicillin (1 g/L) für jeden Mikroisolatorkäfig von Mäusen vor.
      HINWEIS: Verwenden Sie autoklaviertes oder steriles Wasser für das mit Antibiotika ergänzte Trinkwasser.
    2. 9,2 g Grapezucker gesüßtes Getränk in 250 ml antibiotisches, mitzusätzlichem Wasser hinzufügen.
      HINWEIS: Die Verwendung von Traubenzucker gesüßten Getränk Mischung maskiert den bitteren Geschmack der Antibiotika und hilft, Austrocknung bei den Mäusen zu verhindern.
    3. Ändern Sie das Antibiotikum und Traubenzucker gesüßt Getränk Mischung ergänzt Wasser und legen Sie die Mäuse in einem neuen autoklavierten Käfig täglich.
      HINWEIS: Mäuse sind koprophamisch und tägliches Wechseln der Käfige verhindert, dass sich die Mäuse wieder mit Darmbakterien impfen.
    4. Zur maximalen Engraftmentierung des menschenähnlichen Darmmikrobioms, antibiotika für 14 Tage zur Verfügung stellen. Während der Antibiotika-Behandlung, überwachen Sie die Mäuse auf Gewichtsverlust und Dehydrierung. Gewichtsverlust wird während der ersten 3-4 Tage und Plateaus danach für die Dauer der Behandlung erwartet. Wenn Dehydrierung auftritt, geben Sie den Mäusen Saline oder Ringers Lösung durch intraperitoneale Injektion.
      HINWEIS: Andere Darmmikrobiom Humanisation Protokolle erfordern orale Gavage von Antibiotika. Während wirksam bei der Erschöpfung der murinen Darmbakterien, Fanden wir, dass die weniger invasive Methode der Zugabe von Antibiotika in das Trinkwasser weniger Stress auf unsere humanisierten Mäuse und führte zu besseren Ergebnissen.

4. Spenderproben und Fäkaltransplantation

  1. Bereiten Sie menschliche Spender-Fäkalienproben vor.
    1. Verwenden Sie richtig vorbereitete Quellen von fäkalem Mikrobiota-Transplantationsmaterial (FMT) für die Fäkaltransplantation in die humanisierten Mäuse.
    2. FMT-Präparate auftauen und unter anaeroben Bedingungen in einer anaeroben Kammer aliquotieren.
    3. Wenn gewünscht, mischen Sie bei diesem Schritt gleiche Teile der Fäkalienproben zusammen, um eine unvoreingenommene "menschliche" Probe zu erstellen.
    4. Einfrieren und Auftauen des FMT-Materials auf ein Minimum beschränken, wenn keine Aliquotierung oder Vermischung von Proben erforderlich ist, nur unmittelbar vor dem Eingriff auftauen.
  2. Menschliche Fäkaltransplantation
    1. Nach Abschluss der 14-tägigen Antibiotika-Behandlung, ändern Sie das Trinkwasser in autoklaviertes Wasser und bewegen Sie die Mäuse in einen neuen autoklavten Käfig. Stoppen Sie tägliche Käfigwechsel und implementieren Sie einmal alle 1-2 Wochen Käfigwechsel.
    2. Geben Sie zwei Fäkalientransplantationen bei 24 und 48 h nach Beendigung der Antibiotika.
    3. 24 h nach Antibiotika-Behandlung, tauen Sie die benötigte Menge an FMT-Material, geben Sie jeder Maus 200 l FMT-Material über orale Gavage. Wiederholen Sie den Vorgang erneut bei 48 h nach Antibiotika.
    4. Verteilen Sie das verbleibende oder übrig gebliebene aufgetaute FMT-Material auf das Fell der humanisierten Mäuse oder auf die Käfigbetten.

5. Frische Fäkalienprobensammlung

  1. Autoklavn Sie einzelne Papiertüten vor dem Transfer auf die Dunstabzugshaube.
  2. In der Dunstabzugshaube eine Maus in jede einzelne Papiertüte stecken und die Maus defäkieren lassen.
  3. Mit sterilen Zangen die Fäkalienprobe in 1,5 ml Kunststoffrohre einsammeln und bei -80 °C einfrieren. Bringen Sie die Mäuse in Mikroisolatorkäfige zurück.
    HINWEIS: Diese Methode der Sammlung von Fäkalienproben ermöglicht eine frische Fäkalienprobenentnahme von einzelnen Mäusen, ohne dass Stress zu Manipulationen führt.

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Representative Results

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Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Methoden zur Herstellung von Doppel-Hu-BLT-Mäusen und beschreibt kurz den Prozess der Zugabe eines funktionellen menschlichen Immunsystems und eines stabilen menschenähnlichen Darmmikrobioms zu den NSG-Mäusen. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die Analyse der Durchflusszytometrie von peripherem Blut aus einer humanisierten BLT-Maus 10 Wochen nach der Operation. Abbildung 3 zeigt die relative Häufigkeit der menschlichen Fäkalienspenderproben, die verwendet werden, um ein Darmmikrobiom zu übertragen, um doppel hu-Mäuse zu erstellen. Abbildung 4 zeigt die phänotyptischen Veränderungen, die durch die Behandlung von Antibiotika an Milz und Zecum induziert werden, ähnlich wie bei keimfreien Tieren. Abbildung 5 zeigt ein PCA-Diagramm (Principal Component Analysis) der 16S rRNA-Sequenzierungsdaten, die zeigen, dass Doppel-Hu-Mäuse humanähnliche Darmmikrobiome aufweisen, die für die menschliche Spenderprobe einzigartig sind.

Figure 1
Abbildung 1 : Erstellung doppelt humanisierter BLT-Mäuse. Das Erstellen von Doppelhu-BLT-Mäusen ist ein zweistufiger Prozess. Der erste Schritt besteht darin, das menschliche Immunsystem in die NSG-Mäuse zu transplantieren. Am Tag der Operation werden NSG-Mäuse bestrahlt, um eine Nische für Stammzellen zu schaffen. Die Mäuse werden dann mit menschlichen fetalen Leber- und Thymusgeweben implantiert und mit menschlichen hämatopoetischen Stammzellen injiziert. Die Rekonstitution der menschlichen Immunzelle wird etwa 10 Wochen nach der Operation überprüft.  Der zweite Schritt besteht darin, das menschliche Darmmikrobiom zu transplantieren. Mäuse werden mit Antibiotika behandelt, um die bereits vorhandenen murinen Darmbakterien zu reduzieren. Mäuse erhalten dann Fäkaltransplantationen, um das menschliche Darmmikrobiom bereitzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Prüfung der Rekonstitution menschlicher Immunzellen bei doppelt humanisierten BLT-Mäusen. Ein Beispiel für die Durchflusszytometrie-Analyse eines humanisierten BLT-Maus peripheren Blutes 10 Wochen nach der Operation. Die Abbildung zeigt die Gating-Strategie zur Identifizierung der Lymphozytenpopulation, der mCD45- hCD45+-Zellen, der CD19+-B-Zellen, der CD3+ T-Zellen, der CD4+ T-Zellen und der CD8+-T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Menschliche Spender-Fäkalprobenprofile. Relative Häufigkeit der 3 menschlichen Spender und gemischten (alle Spender) Proben, die auf Familienebene gezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Antibiotikabehandelte Mäuse ähneln keimfreien Phänotypen. Hu-Mäuse wurden nach 9 Tagen Antibiotika-Behandlung (Antibiotika) oder keine Antibiotika-Behandlung geopfert (Kontrolle). Nach der Antibiotika-Behandlung beginnt der Phänotyp der humanisierten Mäuse denen bei keimfreien Tieren zu ähneln. Als Folge der Antibiotika-Behandlung gibt es eine Verkleinerung der Milz (links) und das Cecum wird vergrößert (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Doppelte humanisierte BLT-Mäuse verfügen über fäkalspenderspezifische Darmmikrobiome. PCA-Diagramm von 16S rRNA Sequenzierungsdaten zeigen nach der menschlichen Fäkalientransplantation, dass die doppelten Hu-BLT-Mäuse Darmmikrobiome aufweisen, die für den einzelnen menschlichen Fäkalienspender einzigartig sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Das hier beschriebene Protokoll ist für die Schaffung von doppelhu-BLT-Mäusen, die sowohl ein funktionelles menschliches Immunsystem als auch ein stabiles menschenähnliches Darmmikrobiom aufweisen. Dieses Protokoll kann an andere humanisierte oder nicht-humanisierte Mäusemodelle angepasst werden, ohne dass GF-Tiere und gnotobiotische Einrichtungen benötigt werden. Während die hier beschriebenen Methoden relativ einfach sind, gibt es einige kritische Details, die für die erfolgreiche Erstellung von Doppelhu-BLT-Mäusen wichtig sind. NSG-Mäuse sind extrem immundefizi0. Wir haben folgende Maßnahmen ergriffen, um Infektionen zu verhindern. Zunächst wurden die Tiere in einzelnen Mikroisolatorkäfigen mit HEPA-Filtern (0,22 m) in einem Rack-System mit Luftwechselkursmanagement in einer speziellen Suite untergebracht. Der Lufthandler für das Rack enthielt Vorfilter zusammen mit HEPA-gefilterter Zu- und Abluft sowie Echtzeit-Online-Überwachung der Käfigablufttemperatur und der relativen Luftfeuchtigkeit. Zweitens musste jeder, der den Tierraum betrat, duschen und saubere Peelings und Schuhe tragen sowie Handschuhe, Einweg-Tyvek-Anzug, Booties, Haarhaube und Gesichtsmaske anziehen. Drittens wurden alle Verfahren, einschließlich Käfigwechsel und Zugabe von Lebensmitteln und Wasser, innerhalb einer biologischen Sicherheitsrauchhaube der Klasse II Typ A2 durchgeführt, die mit 70 % Ethanol und UV-Licht vorsterilisiert wurde. Viertens wurde aseptische operationstechnische Technik während der Überlebensoperation verwendet, die den Chirurgen und Assistenten mit einer zusätzlichen Schutzschicht einschließlich eines OP-Kleides und Handschuhen umfasste. Die Operation wurde in der desinfizierten Dunstabzugshaube durchgeführt, wobei nur sterile Instrumente, Gazen und Wundverschlussmaterialien verwendet wurden, während die Sterilität von Handschuhen und Instrumenten während der gesamten Operation beibehalten wurde. Um eine Infektion zu verhindern und die Stabilität des transplantierten menschenähnlichen Darmmikrobioms zu gewährleisten, war die gesamte Nahrung und das Wasser, die den Mäusen gegeben wurden, steril. Alle Lebensmittel sollten bestrahlt und das gesamte Wasser autoklaviert werden. Um Schmerzen und Not zu minimieren, verabreichten wir lang wirkenden Buprenorphin subkutan Mäusen vor der Operation. Die Kombination von Ketamin und Xylazin für die chirurgische Anästhesie der Maus ist sehr zuverlässig und kann etwa 30 min dauern. Wenn das nicht lang genug ist, geben wir Isoflurangas, um die Mäuse weiter zu beächen. Es ist auch sehr wichtig, Maus Körpertemperatur nach der Operation zu halten. Wir legen den Käfig auf das erhitzte Wärmepolster, bis die hämatopoetische Stammzellinjektion über die Schwanzvene erfolgt. Zu dieser Zeit werden die Mäuse aus der Anästhesie geborgen und ins Rack zurückgebracht.

Um das murine Darmmikrobiom zu erschöpfen und sich auf eine menschliche Fäkaltransplantation vorzubereiten, ist es wichtig, immer frisch zubereitete Antibiotika zu verwenden und täglich antibiotikaergänztes Wasser und Käfige zu wechseln. Dies wird viele MikroisolatorKäfige während der 14-tägigen Antibiotika-Behandlung verwenden, aber es stellt sicher, dass die Mäuse nicht durch Koprophagie wieder geimpft werden. Während der Antibiotika-Behandlung ist es auch wichtig, das Körpergewicht und die Gesundheit der Mäuse zu überwachen. Nach der Fäkaltransplantation gewinnen die Mäuse schnell wieder an Abstrichen. Es ist wichtig, alle Frost-Tau-Zyklen für das Fäkal-Transplantationsmaterial zu minimieren und sicherzustellen, dass eine anaerobe Kammer verwendet wird, wenn Proben aliquotiert werden. Bei der Erstellung von Doppelhu-BLT-Mäusen ist es wichtig, die Handhabung und den Stress, der an den Mäusen verursacht wird, zu minimieren. Dies hilft, Infektionen zu verhindern und verbessert das langfristige Überleben.

Wir versuchten zunächst, Mäuse mit Anti-Pilz-Amphotericin B vorzubehandeln, fanden aber heraus, dass die Mäuse die Behandlung nicht sehr gut vertragen und sie nicht mehr verwendet wird. Wir experimentierten auch mit unterschiedlichen Daueren der Antibiotika-Behandlung. Wir fanden heraus, dass, während die Mehrheit der murinen Darmbakterien nach 7 Tagen Antibiotika erschöpft zu sein scheinen, das Niveau der Spendertransplantation nach 14 Tagen Behandlung viel höher ist. Wir haben auch versucht, Antibiotika durch zweimal täglich orale Gavage zu verabreichen. Wir fanden jedoch heraus, dass diese Methode zu invasiv für unsere Hu-Mäuse war. Wir wechselten zu einem einzigen tagestäglichen Gavage-Zeitplan, aber die Mäuse schienen immer noch gestresst und ungesund zu sein. Wir fanden heraus, dass die Bereitstellung von Antibiotika im Trinkwasser die beste Methode war. Es reduzierte die Menge Handhabung und Stress auf die Mäuse, während immer noch ausreichend die murinen Darmbakterien reduzieren. Wir stellten Traubenzucker gesüßte Getränkemischung im Trinkwasser zur Verfügung, um sicherzustellen, dass die Mäuse eine ausreichende Dosierung von Antibiotika erhalten und Um Austrocknung zu verhindern. Die Mäuse erleben eine Verringerung des Körpergewichts während der ersten 3-4 Tage der Antibiotika-Behandlung, aber die Bereitstellung zusätzlicher Flüssigkeiten durch intraperitoneale Injektion erhöht nicht das Körpergewicht. Nach der Fäkaltransplantation gewinnen die Mäuse schnell das verlorene Gewicht zurück.

Während diese Methode in der Lage ist, reproduzierbar Doppel-Hu-BLT-Mäuse zu erzeugen, gibt es einige Einschränkungen für das Modell. Das erste, was zu berücksichtigen ist, hu-Mäuse haben weniger organisierte Lymphstruktur, einschließlich der Keimzentrum, was zu reduzierten Antikörperklassenwechsel und begrenzter Affinitätsreifung führt. NSG hu-BLT-Mäuse haben jedoch eine systemische Immunrekonstitution und übersetzbare T-Zellreaktionen und können verwendet werden, um viele menschliche Krankheiten zu modellieren. Ein weiteres Problem ist die mögliche Entwicklung von Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD) bei einigen Hu-Mäusen nach mehreren Monaten übermäßiger menschlicher Immunrekonstitution. Wir und andere haben GVHD Manifestationen wie Blepharitis, Alopezie, Gewichtsverlust und Maloklusion beobachtet, die sorgfältig überwacht werden müssen25.

Es gibt mehrere dokumentierte Therapien für die Erschöpfung von Darmbakterien bei Mäusen mit Antibiotika26,27,28,29,30,31. Wir wählten unseren Cocktail von Antibiotika aufgrund ihrer bekannten Fähigkeit, eine breite Palette von Bakterien im Darm anzugreifen und weil wir mehrere Beispiele für eine erfolgreiche bakterielle Erschöpfung in der Literatur gefunden haben. Viele veröffentlichte Fälle verwenden einen weit weniger strengen Kurs von Antibiotika, aber in unserer Studie, fanden wir, dass 14 Tage für die optimale Transplantation eines menschenähnlichen Darmmikrobioms benötigt wird. Während wir zunächst ein Protokoll versuchten, das auf Hintze et al. basiert, fanden wir heraus, dass orale Gavage zu invasiv war und dass die Antimykotikabehandlung für Mäuse schädlich war26. Wir glauben, dass NSG hu-BLT Mäuse einzigartig sind und weniger invasive Verfahren im Vergleich zu anderen robusteren Mäusen bevorzugt werden. Wir haben in unserer Studie keine GF-Tiere verwendet. Die Verwendung von GF-Mäusen zur Untersuchung der Wirkung des Darmmikrobioms ist gut dokumentiert, jedoch haben diese Tiere kein menschliches Immunsystem19,32. Darüber hinaus geben wir zu, dass die Arbeit mit einem GF NSG hu-BLT-Mäusemodell interessante Forschungsmöglichkeiten schaffen würde. Zum einen könnte die Untersuchung der Rekonstitution menschlicher Immunzellen und der Pathogenese von humanspezifischen Krankheitserregern wie HIV-1 ohne das Vorhandensein des Darmmikrobioms interessante Ergebnisse liefern. Darüber hinaus können GF-Modelle eine vollständigere Rekonstitution eines menschenähnlichen Darmmikrobioms nach einer Fäkaltransplantation ermöglichen. GF-Mäuse haben jedoch auch nach der Darmmikrobiokonstituierung21langanhaltende Immunschwächen. Unser Modell hat den Vorteil, dass wir SPF-Gehäusebedingungen verwenden, die im Vergleich zu GF-Anlagen weit verbreitet und kostengünstiger sind. Unser Modell hat auch den Vorteil, dass die normalen Verfahren der chirurgischen Erzeugung von Hu-BLT-Mäusen nicht gestört werden, da keine vollständige GF-Umgebung erforderlich ist.

Wir glauben, dass dieses Doppel-Hu-BLT-Mausmodell einzigartig ist, da es nicht nur verwendet werden kann, um die menschliche Immunfunktion und menschliche Krankheiten zu untersuchen, sondern auch die Auswirkungen des Darmmikrobioms auf die Pathogenese und Behandlung in vivo bestimmen kann. Mit diesem Protokoll können wir reproduzierbar Doppel-Hu-BLT-Mäuse mit humanen spenderspezifischen Darmmikrobiomprofilen erstellen. Daher glauben wir, dass die Verwendung von Doppel-Hu-BLT-Mäusen für zukünftige personalisierte Medizinanwendungen von Vorteil sein wird, die entwickelt wurden, um die Auswirkungen des Darmmikrobioms auf Behandlungen für verschiedene menschliche Krankheiten wie HIV-1 und Krebs zu testen. Zusammenfassend ist unser Doppel-Hu-BLT-Mäusemodell ein wichtiges und neuartiges präklinisches Modell, das sowohl ein funktionelles menschliches Immunsystem als auch ein stabiles menschenähnliches Darmmikrobiom zur Untersuchung der menschlichen Gesundheit und Krankheit aufweist.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Yanmin Wan, Guobin Kang und Pallabi Kundu für ihre Unterstützung bei der Erzeugung von BLT-humanisierten Mäusen. Wir möchten die UNMC Genomics Core Facility würdigen, die teilweise Unterstützung vom Nebraska Research Network In Functional Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology of Neurosensory Systems CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela erhält. Buffett Cancer Center - P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, und die Nebraska Research Initiative. Wir danken der University of Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex und ihren Mitarbeitern für ihre Unterstützung. Diese Studie wird teilweise von den National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li unterstützt.  Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Erstellung des Manuskripts oder der Entscheidung für die Veröffentlichung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Feeding Needles 18G Cadence Science 9928B
Clidox-s Activator Pharmacal Research Laboratories 95120F
Clidox-s Base Pharmacal Research Laboratories 96125F
DGM 108 cage rack Techniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L  Grainger 12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations  OpenBiome FMP30
Grape Kool-Aid Kraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5 Biolegend 302209
hCD3-PE Biolegend 300408
hCD4-Alexa 700 Biolegend 300526
hCD45-FITC Biolegend 304006
hCD8-APC/Cy7 Biolegend 301016
Lactate Buffered Ringer's Solution Boston BioProducts Inc  PY-906-500 
mCD45-APC Biolegend 103111
Microvette 100 K3E Microvette 20.1278.100
Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment Neosporin
NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) The Jackson Laboratory 005557
PrecisionGlide 25 G Needle BD 305127
RS200 X-ray irradiator RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 microisolator cages Techniplast
Sterile Non-woven Gauze Fisherbrand 22-028-558
Teklad global 16% protein irradiated mouse chow Teklad 2916

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References

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Ein doppelt humanisiertes BLT-Mäuse-Modell mit einem stabilen humanähnlichen Gut-Mikrobiom und menschlichem Immunsystem
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Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).More

Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).

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