Summary
Vi beskriver en ny metode for å generere dobbelt humanisert BLT-mus som har en funksjonell menneskelig immunsystem og en stabil engrafted menneske-lignende gut mikrobiomet. Denne protokollen kan følges uten bakteriefrie mus eller gnotobiotic fasiliteter.
Abstract
Humanisert mus (Hu-mus) som har en funksjonell menneskelig immunsystem har fundamentalt endret studiet av menneskelige patogener og sykdom. De kan brukes til å modellere sykdommer som ellers er vanskelige eller umulige å studere hos mennesker eller andre dyremodeller. Tarmen mikrobiomet kan ha en dyp innvirkning på menneskers helse og sykdom. Imidlertid er murine gut mikrobiomet svært annerledes enn den som finnes i mennesker. Det er behov for forbedrede pre-kliniske Hu-mus modeller som har en engrafted menneskelig gut mikrobiomet. Derfor skapte vi doble Hu-mus som har både en menneskelig immunsystem og stabilt menneske-lignende gut mikrobiomet. Nikk. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (nsg) mus er en av de beste dyrene for menneskeliggjøring på grunn av deres høye immunsvikt. Men bakteriefrie NSG-mus og diverse andre viktige bakteriefrie mus modeller er ikke tilgjengelig for øyeblikket. Videre har mange forsknings innstillinger ikke tilgang til gnotobiotic fasiliteter, og arbeid under gnotobiotic forhold kan ofte være kostbart og tidkrevende. Viktigere, bakteriefri mus har flere uimottakelig mangler som eksisterer selv etter engraftment av mikrober. Derfor har vi utviklet en protokoll som ikke krever bakteriefrie dyr eller gnotobiotic fasiliteter. For å generere doble Hu-mus, ble NSG-mus behandlet med stråling før kirurgi for å skape Ben-marg, lever, thymus-humanisert (Hu-BLT) mus. Musene ble deretter behandlet med bredt spekter antibiotika for å tømme eksisterende murine gut mikrobiomet. Etter antibiotika behandling, ble musene gitt avføring med friske menneskelige donor prøver via oral gavage. Double Hu-BLT mus hadde unike 16S rRNA gen profiler basert på den enkelte menneskelige donor prøven som ble transplantert. Viktigere, den transplanterte menneske-lignende mikrobiomet var stabil i den doble Hu-BLT mus for varigheten av studien opp til 14,5 uker etter transplantasjon.
Introduction
Humanisert mus (Hu-mus) har forvandlet studiet av mange aspekter av menneskers helse og sykdom, inkludert hematopoiesen, immunitet, kreft, autoimmune sykdommer, og smittsomme sykdommer1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Disse Hu-mus har den klare fordelen over andre musemodeller i at de har en funksjonell menneskelig immunsystem og kan bli smittet med menneskelige spesifikke patogener. Likevel, viktigheten av tarmen mikrobiomet har blitt demonstrert av sin rolle i mange menneskelige sykdommer som fedme, Metabolsk syndrom, inflammatoriske sykdommer, og kreft10,11,12, 13 i år. Slimhinnene immunsystem og gut mikrobiomet er gjensidig regulert for å opprettholde gut og systemiske homeostase. Immunsystemet er formet av antigener presentert av tarmen mikrobiomet og gjensidig immunforsvaret spiller en viktig regulatoriske rolle i å fremme Commensal gut bakterier og eliminere patogener14,15, 16. men gut mikrobiomet av Hu-mus har ikke vært godt karakterisert og murine gut mikrobiomet skiller seg vesentlig i komposisjon og funksjon fra mennesker17. Dette skyldes evolusjonære, fysiologiske, og anatomiske forskjeller mellom murine og menneskelige tarmen samt andre viktige faktorer som kosthold, som kan påvirke de eksperimentelle resultatene av Hu-mus sykdom modeller18. Derfor, utover klassifisering av murine gut mikrobiomet av Hu-mus, en dyr modell med både en menneskelig immunsystem og menneskelig gut mikrobiomet er nødvendig for å studere komplekse interaksjoner av menneskelig sykdom in vivo.
Studiet av menneskelige sykdommer direkte i menneskelige er ofte upraktisk eller uetisk. Mange dyremodeller kan ikke brukes til å studere menneskelige patogener som humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1). Ikke-menneskelige primater modeller er genetisk outbred, veldig dyrt, og er ikke utsatt for mange menneskelige patogener. Mus som har blitt avledet som Bakteriefri (GF) og tilberedt med menneske-lignende gut microbiomes har vært mye brukt til å studere menneskers helse og sykdom19,20. Imidlertid, disse dyrene som ikke har en human immunsystem og arbeider med GF dyrene behøver spesialisert fasiliteter, prosedyrer, og ekspertise. Derfor er det behov for forbedrede pre-kliniske modeller for å studere det komplekse forholdet mellom tarmen mikrobiomet og menneskets immunsystem. Mange stammer av mus, som NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (nsg), er ikke kommersielt tilgjengelig som GF. GF dyr kan også lide av langvarige immun mangler som ikke er fullstendig reversert av engraftment av mikrober21. Derfor har vi opprettet en dobbel Hu-mus med både en funksjonell menneskelig immunsystem og stabilt menneske-lignende gut mikrobiomet under spesifikke patogen gratis (SPF) forhold. For å generere doble Hu-mus, ble kirurgi utført på NSG mus for å lage Ben-marg, lever, thymus humanisert mus (Hu-BLT). Den Hu-BLT mus ble deretter behandlet med bredt spekter antibiotika og deretter gitt avføring transplantasjon med en sunn menneskelig donor prøven. Vi preget bakteriell gut mikrobiomet av 173 avføringsprøver fra 45 doble Hu-BLT mus og 4 menneskelige avføring donor prøver. Double Hu-BLT mus har unike 16S rRNA gen profiler basert på den enkelte menneskelige donor prøven som er transplantert. Viktigere, den transplanterte menneske-lignende mikrobiomet var stabil i mus for varigheten av studien opp til 14,5 uker etter transplantasjon. I tillegg viste spådde metagenomes at doble Hu-BLT mus har forskjellig spådd funksjonell kapasitet enn Hu-mus som er mer lik den menneskelige donor prøvene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her ble gjennomført i samsvar med institusjonelle Animal Care and Research Committee (IACUC)-godkjente protokoller ved University of Nebraska-Lincoln (UNL). Den IACUC på UNL har godkjent to protokoller knyttet til generering og bruk av Hu-BLT mus, inkludert dobbel Hu-mus. I tillegg har Scientific Research tilsyn Committee (SROC) på UNL også godkjent bruk av menneskelige embryonale stamceller og Foster vev, som er anskaffet fra Advanced Bioscience ressurser for humanisert mus studier (SROC # 2016-1-002).
1. mus boliger og vedlikehold
- Kjøp 6-8-ukers gamle NSG-mus (NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Hus musene under SPF forhold med luft utveksling, forfilterkalibrering og HEPA filter (0,22 μm) i et rom med kontrollert temperatur, fuktighet og trykk.
- Huse og vedlikeholde det mus inne autoklaveres individ microisolator burene inne en stativ system dugelig av driverselskap luften bytte med forfilterkalibrering og HEPA filterene (0,22 μm).
- Utfør alle prosedyrer og manipulasjoner av musene i en klasse II type a2 biologisk sikkerhets røyk hette som er pre-behandlet med 70% etanol. Før du arbeider i dyre rommet, dusj og bytte til rene scrubs, Tyvek Dress, støvel dekker, Hair cap, ansiktsmaske, og hansker. Bruk en operasjon kappe over Tyvek Dress under kirurgiske prosedyrer.
Merk: ultrafiolett (UV) lys rensing er også foretrukket før prosedyrer.- Autoklav alle instrumenter og reagenser om mulig, og deretter desinfisere før overføring til avtrekksvifte.
- Under prosedyrene må du fjerne dyrenes individuelt ventilerte bur fra stativet og desinfisere før du overfører til avtrekks panseret.
- Fôrer musene en bestrålt diett og gi autoklaveres vann. Gi bestrålt mat AB lib og supplere med ytterligere bestrålt mat etter behov. Endre autoklaveres vann ukentlig eller etter behov.
Merk: autoklaveres surgjort vann kan også brukes. Den bestrålt dietten forutsatt hadde en hylle-Life på 6 måneder etter produksjon.
2. generering av humanisert BLT-mus
Merk: generering av Hu-BLT mus har blitt beskrevet tidligere22,23,24.
- På Operasjonsdagen, gi musene hele kroppen bestråling med en dose på 12 cGy/g kroppsvekt.
- Forbered musene for kirurgi.
- Gi hver bestrålt musen en blanding av ketamin ved arbeids konsentrasjonen av 100 mg/kg og Xylazine ved konsentrasjonen av 12 mg/kg, som varierte fra 130-170 μL per mus basert på kroppsvekt ved intraperitoneal (IP) injeksjon for anestesi. For å forberede 3 ml av ketamin-og Xylazine-blandingen, tilsett 0,27 mL ketamin ved lager konsentrasjonen 100 mg/mL og 0,03 mL Xylazine ved konsentrasjonen av 100 mg/mL til 2,7 mL sterilt saltvann og bland godt. Desinfisere huden med 70% isopropanol før injeksjon.
- Gi hver bestrålt mus buprenorfin 1 mg/kg kroppsvekt (Half-Live 72 h, SR-LAB) ved subkutan injeksjon for langvarig smertebehandling.
- Gi hver bestrålt mus 100 μL (858 μg) av Cefazolin med IP-injeksjon for preoperativ antibiotika forebygging.
- Barbere håret av musene ved hjelp av elektrisk hår Clippers rundt venstre lateral og midtre side av musen på det senere operasjonsstedet brukes til å utsette venstre nyre.
- Kontroller riktig nivå av anestesi ved pedal refleks (fast tå knipe).
- Gi isoflurane gass på 3-5% Hvis ytterligere anestesi er nødvendig på noe punkt under operasjonen.
- Påfør øye salve på begge øyne for å hindre at hornhinnen uttørking. Påfør øre merke hvis nødvendig.
- Utfør kirurgi for å implantatet leveren og thymus vev i venstre nyre kapsel.
- Desinfisere huden på operasjonsstedet ved å bruke jod scrub fra sentrum av operasjonsstedet og beveger seg mot utsiden i en sirkulær måte. Gjenta denne prosessen med 70% isopropanol og en tredje gang med jod.
- Ved hjelp av tang, først laste en menneskelig Foster leveren vev fragment inn i en trokaren. Deretter bruker tang, laste en menneskelig fosterets thymus vev fragment i trokaren. Deretter bruker tang, laste en annen menneskelig Foster leveren vev fragment inn i trokaren. Vev bør kuttes til 1-1,6 mm3 for å passe de indre dimensjonene av trokaren.
- Bruk tang for å løfte huden og bruke saks til å lage en liten kutt lengderetningen. Utvid kuttet til 1,5-2 cm i venstre side av musen.
- Bruk tang for å løfte muskel lag og bruke saks til å lage en liten kutt lengderetningen. Forleng kuttet etter behov for å avdekke nyrene.
- Utsett nyrene ved å forsiktig fatte fettvevet rundt nyrene. Du må ikke berøre nyre parenchyma direkte.
- Lag et 1-2 mm snitt ved den bakre enden av nyre kapselen ved hjelp av en skalpell.
- Langsomt sette den forhåndslastede trokaren gjennom snittet parallelt med den lange aksen av nyrene og slipp vevet mellom nyre kapsel og nyre.
- Forsiktig returnere nyre og tarm til deres normale posisjon. Bruk absorberbare 5/0 P-3 (P-13) sting med 13mm 3/8 sirkel nål for å lukkemuskel lag og kirurgiske stifter for å lukke huden.
- Etter kirurgi, putte musa i en feilfri autoklaveres microisolator bur for det å bli frisk.
- Å minimere heten forlis i løpet av stolpe-kirurg det å bli frisk, putte byrået inneholder det mus opp på en heten pute det er koplet å en vannpumpe det varmer og sirkulerer vannet.
- Overvåk musene til de har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Innen 6 h av kirurgi ferdigstillelse, via halen-venen, injisere CD34 + blodkreft stamceller isolert fra menneskelig Foster leveren vev.
- Varm opp musene med en varme-lampe. Desinfisere halen med 70% isopropanol og deretter injisere 1,5 til 5 × 105 stamceller/200 μL i halen blodåre.
- Opphøre alle blø fra injeksjonen og retur mus å det microisolator bur og det microisolator bur å byrået rack.
NOTE: post-kirurgi mus er vanligvis plassert sammen, fem per microisolator bur, under og etter utvinning. Men mus er bare plassert sammen hvis de alle fikk kirurgi på samme dag.
- Sjekk musene daglig. Nøye overvåke kirurgiske stifter og erstatte dem etter behov. Nøye overvåke mus for noen tegn på infeksjon eller ubehag. Supply autoklaveres mat på gulvet i microisolator buret for et par dager etter operasjonen.
- Fjern kirurgiske stifter 7-10 dager etter operasjonen. Gi isoflurane gass på 3-5% for å bedøve musene. Forsiktig fjerne stifter og deretter bruke antibiotika og smertestillende salve på området.
- Tillat 9-12 uker for rekonstituering av menneskelige immunceller, deretter samle perifert blod fra midtre saphenavenen vene fra hver av humanisert mus.
- Dempe bevisste mus ved hjelp av en hensiktsmessig størrelse plast kjegle tilbakeholdenhet med en åpning i nærheten av hodet på musen for å puste og en åpning nær baksiden av musen for å isolere ett ben. Sett mus i tilbakeholdenhet kjegle hodet først og deretter forsiktig trekke ett ben gjennom beinet åpningen.
- Spray den midtre siden av den isolerte benet med 70% isopropanol, deretter spre antibiotika og smertestillende salve på samme sted.
Merk: salven bidrar til å avdekke plasseringen av venen uten behov for hårfjerning og også bistår i blod dråpe formasjon. - Ved hjelp av en 25-gauge nål ved en 90 ° vinkel, punktering av venen og samle 50-100 μL av blod ved hjelp av en EDTA belagt blodprøvetakingsrør. Stopp blødningen ved å legge press på området med sterilt gasbind. Når blødningen har stoppet, returnere musene til buret sitt.
Merk: maksimalt antall blod volumer som samles inn er vanligvis 50 μL per uke eller 100 μL annenhver uke. - Bruk det innsamlede perifert blod for å teste nivået av menneskelig immun celle rekonstituering ved hjelp av strømnings flowcytometri med antistoffer for hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. antibiotika behandling
- Før antibiotika behandling, samle pre-Treatment avføringsprøver. Flytt musene til et nytt autoklaveres microisolator bur.
- Forbered en frisk cocktail av bredspektret antibiotika daglig.
- Klargjør 250 mL vann som inneholder ferskt tilberedte Metronidazol (1 g/L), Neomycin (1 g/L), Vancomycin (0,5 g/L) og Ampicillin (1 g/L) for hvert microisolator bur med mus.
Merk: Bruk autoklaveres eller sterilt vann for antibiotika supplert drikkevann. - Tilsett 9,2 g druesukker søtet drikk bland til 250 mL antibiotika supplert vann.
Merk: bruk av druesukker søtet drikke bland masker den bitre smaken av antibiotika og bidrar til å hindre dehydrering i mus. - Endre antibiotika og druesukker søtet drikke bland supplert vann og plassere mus i en ny autoklaveres bur daglig.
Merk: mus er coprophagic og endre burene daglig hindrer musene fra re-vaksinere seg med gut bakterier. - For maksimal engraftment av menneske-lignende gut mikrobiomet, gi antibiotika i 14 dager. Under antibiotika behandling, overvåke mus for vekttap og dehydrering. Vekttap er forventet i løpet av de første 3-4 dager og vidder etter at for varigheten av behandlingen. Hvis dehydrering oppstår, gi musene saltvann eller ringesignaler Solution via intraperitoneal injeksjon.
Merk: andre gut mikrobiomet menneskeliggjøring protokoller krever oral gavage av antibiotika. Mens effektiv på å tappe den murine tarmen bakterier, fant vi at mindre invasiv metode for å legge antibiotika til drikkevannet sette mindre stress på våre humanisert mus og førte til bedre resultater.
- Klargjør 250 mL vann som inneholder ferskt tilberedte Metronidazol (1 g/L), Neomycin (1 g/L), Vancomycin (0,5 g/L) og Ampicillin (1 g/L) for hvert microisolator bur med mus.
4. donor prøver og avføring transplantasjon
- Forbered menneske donor avføringsprøver.
- Bruk riktig forberedt kilder til avføring bakterieflora transplantasjon (FMT) materiale for avføring transplantasjon inn i humanisert mus.
- Tine FMT forberedelser og alikvot dem under anaerobe forhold i en anaerob kammer.
- Hvis ønskelig, på dette trinnet bland like deler av avførings prøvene sammen for å skape en upartisk "menneskelig" sample.
- Hold frysing og tine av FMT materialet til et minimum, hvis aliquoting eller blanding av prøver ikke er nødvendig, bare tine umiddelbart før inngrepet.
- Human avføring transplantasjon
- Etter avslutningen av 14 dager antibiotika behandling, endre drikkevannet å autoklaveres vann og bevege det mus i en ny autoklaveres bur. Opphøre daglig bur endre og iverksette en en gang enhver 1-2 ukens bur skiftende tidsramme.
- Gi to avføring på 24 og 48 h etter opphør av antibiotika.
- 24 timer etter antibiotika behandling, tine den nødvendige mengden av FMT-materiale, gi hver mus 200 μL av FMT-materiale via oral gavage. Gjenta prosedyren igjen på 48 h innlegg antibiotika.
- Spre eventuelle gjenværende eller leftover tint FMT materiale på pelsen til humanisert mus eller på buret sengetøy.
5. fersk avføringsprøve samling
- Autoklav individuelle papirposer før du overfører til avtrekks panseret.
- I avtrekks panseret, Legg en mus i hver enkelt papirpose og la musen defekt.
- Ved hjelp av steril tang, samle avføringsprøve i 1,5 mL plastrør og fryse ved-80 ° c. Returner musene til microisolator bur.
Merk: denne metoden for å samle avføringsprøver gir mulighet for fersk avføringsprøve samling fra individuelle mus uten stress inducing manipulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en oversikt over metodene som brukes til å opprette doble Hu-BLT-mus, og beskriver kort prosessen med å legge til et funksjonelt menneske immunsystem og stabile menneske-lignende gut-MIKROBIOMET til NSG-musene. Figur 2 viser et eksempel på Flow flowcytometri analyse av perifert blod fra en humanisert BLT-Mouse 10 uker etter operasjonen. Figur 3 viser den relative overflod av den menneskelige avføring donor prøvene brukes til å overføre en gut mikrobiomet å lage doble Hu-mus. Figur 4 viser fenotypiske endringer indusert av antibiotika behandling til milten og cecum, ligner på det som er observert i bakteriefrie dyr. Figur 5 viser en rektor komponent analyse (PCA) tomten av 16S rRNA sekvensering data avslørende doble Hu-mus har menneske-lignende gut microbiomes som er unike for den menneskelige donor prøven.
Figur 1 : Opprette doble HUMANISERT BLT-mus. Opprette doble Hu-BLT mus er en to-trinns prosess. Det første trinnet er å engraft menneskets immunsystem til NSG-musene. På Operasjonsdagen er NSG-mus gitt bestråling for å skape en nisje for stamceller. Musene blir deretter implantert med menneskelig Foster lever og thymus vev og injisert med humant blodkreft stamceller. Human immun celle rekonstituering er sjekket rundt 10 uker etter operasjonen. Det andre trinnet er å engraft den menneskelige gut mikrobiomet. Mus behandles med antibiotika for å redusere eksisterende murine tarmbakterier. Mus blir så gitt avføring transplantasjon for å gi den menneskelige gut mikrobiomet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Testing menneskelig immun celle rekonstituering i dobbelt HUMANISERT BLT-mus. Et eksempel på Flow flowcytometri analyse av en humanisert BLT-Mouse perifere blod 10 uker etter operasjonen. Figuren viser gating strategien brukes til å identifisere lymfocytter befolkningen, mCD45-hCD45 + celler, CD19 + B-celler, CD3 + T-celler, CD4 + T-celler, og CD8 + T-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Human donor avførings sample profiler. Relativ overflod av de 3 menneskelige donor og blandet (alle givere) prøvene vist på familie nivå. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Antibiotika behandlede mus likner bakteriefri fenotyper. Hu-mus ble ofret etter 9 dager med antibiotika behandling (antibiotika) eller ingen antibiotika behandling (kontroll). Etter antibiotika behandling, begynner fenotype av humanisert mus å ligne de sett i bakteriefrie dyr. Som et resultat av antibiotika behandling er det en reduksjon i størrelsen på milten (venstre) og cecum er forstørret (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Double HUMANISERT BLT-mus funksjonen avføring donor spesifikke gut microbiomes. PCA tomten av 16S rRNA sekvensering data Vis etter menneskelig avføring transplantasjon den doble Hu-BLT mus funksjonen gut microbiomes som er unike for den enkelte menneskelige avføring donor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her er for etablering av doble Hu-BLT mus som har både en funksjonell menneskelig immunsystem og en stabil menneske-lignende gut mikrobiomet. Denne protokollen kan tilpasses andre humanisert eller ikke-humanisert mus modeller uten behov for GF dyr og gnotobiotic fasiliteter. Mens metodene beskrevet her er relativt enkle, er det flere viktige detaljer som er viktige for vellykket etablering av doble Hu-BLT mus. NSG-mus er ekstremt immunodeficient og forebygger infeksjoner er nøkkelen til lang tids overlevelse av musene. Vi tok følgende tiltak for å forebygge smitte. Først ble dyrene plassert i individuelle microisolator bur med HEPA filter (0,22 μm) i et rack-system med luft vekslingskurs ledelse i en dedikert Suite. Luften handler for rack inneholdt pre-filtre sammen med HEPA filtrert (0,22 μm) forsyning og avtrekksluft, samt sanntids on-line overvåking av bur avtrekkslufttemperatur og relativ luftfuktighet. For det andre, alle som kom inn i dyret rommet måtte dusje og slitasje rene scrubs og sko, samt sette på hansker, disponibel Tyvek Dress, sokker, hår panseret, og ansiktsmaske. For det tredje ble alle prosedyrer, inkludert bur endringer og tillegg av mat og vann, utført i en klasse II type a2 biologisk sikkerhets røyk hette som var pre-sterilisert med 70% etanol og UV-lys. Fjerde, aseptisk kirurgisk teknikk ble brukt under overlevelse kirurgi, som inkluderte kirurgen og assistenter iført et ekstra lag med beskyttelse inkludert en operasjon kappe og hansker. Kirurgi ble utført i desinfiseres avtrekks hette, med bare sterile instrumenter, gauzes, og sår lukking materialer, og samtidig opprettholde sterilitet av hansker og instrumenter gjennom hele operasjonen. Til slutt, for å hindre smitte og sikre stabiliteten i engrafted mikrobiomet gut, var all mat og vann som ble gitt til musene sterile. All mat skal være bestrålt og alt vann bør være autoklaveres. For å minimere smerte og nød, administrerte vi en lang-fungerende buprenorfin subkutant til mus før operasjonen. Kombinasjonen av ketamin og Xylazine for musen kirurgisk anestesi er svært pålitelig og kan vare ca i 30 min. Hvis det ikke er lenge nok, gir vi isoflurane gass til ytterligere bedøve musene. Det er også svært viktig å opprettholde musen kroppstemperatur post-kirurgi. Vi satte buret på oppvarmede oppvarmingen puten til blodkreft stilk cellen injeksjon via halen blodåre. På den tiden, musene utvinnes fra anestesi og tilbake til rack.
Å tømme murine gut mikrobiomet og forberede for menneskelig avføring transplantasjon, er det viktig å alltid bruke fersk tilberedt antibiotika og å endre antibiotika supplert vann og bur daglig. Dette vil bruke mange microisolator bur gjennom 14-dagers antibiotika behandling, men det sikrer at musene ikke blir re-inokulert gjennom coprophagia. Under antibiotika behandling, er det også viktig å overvåke kroppsvekt og helse av mus. Etter avføring transplantasjon, musene raskt gjenvinne noen tapt vekt. Det er viktig å minimere eventuelle fryse-tine sykluser for avføring transplantasjon materiale og sørge for å bruke en anaerob kammer hvis aliquoting prøvene er nødvendig. Mens du oppretter doble Hu-BLT mus er det viktig å minimere håndtering og stress indusert på mus. Dette bidrar til å forebygge smitte og forbedrer langsiktig overlevelse.
Vi har i utgangspunktet forsøkt å pre-behandle mus med anti-fungal amfotericin B men fant musene ikke tolerere behandling veldig bra og det er ikke lenger brukes. Vi eksperimenterte også med ulik varighet av antibiotika behandling. Vi grunnlegge det stund en flertallet av murine tarmen bacteria komme å bli utarmet etter 7 dager av antibiotika, nivået av donor engraftment er mange høyere etter 14 dager av handling. Vi har også prøvd å administrere antibiotika gjennom to ganger daglig oral gavage. Vi fant imidlertid at denne metoden var for invasiv for våre Hu-mus. Vi byttet til en enkelt daglig gavage tidsplan, men musene fortsatt syntes å være stresset og usunn. Vi fant ut at å gi antibiotika i drikkevannet var den beste metoden. Det reduserte mengden håndtering og stress til mus mens fortsatt tilstrekkelig redusere murine gut bakterier. Vi ga druesukker søtet drikke bland i drikkevannet for å sikre at musene fikk en tilstrekkelig dosering av antibiotika og for å hindre dehydrering. Musene opplever en reduksjon i kroppsvekt i løpet av de første 3-4 dagene med antibiotika behandling, men å gi ekstra væsker via intraperitoneal injeksjon øker ikke kroppsvekten. Etter avføring transplantasjon, musene raskt gjenvinne den tapte vekten.
Selv om denne metoden er i stand til å reproduserbar generere doble Hu-BLT mus, er det noen begrensninger for modellen. Det første du må vurdere er Hu-mus har mindre organisert lymfoide struktur, inkludert Germinal sentrum, som fører til redusert antistoff klasse veksling og begrenset affinitet modning. Men NSG Hu-BLT mus har systemisk immun rekonstituering og oversettbare T celle svar og kan brukes til å modellere mange menneskelige sykdommer. Et annet problem er den potensielle utviklingen av pode-versus-host sykdom (GVHD) i noen Hu-mus etter flere måneder med overdreven menneskelig immun rekonstituering. Vi og andre har observert GVHD manifestasjoner som blefaritt, alopecia, vekttap, og malocclusion som må overvåkes nøye25.
Det er flere dokumenterte regimer for tappe gut bakterier i mus med antibiotika26,27,28,29,30,31. Vi valgte vår cocktail av antibiotika på grunn av deres kjente kapasitet til å målrette et bredt spekter av bakterier i tarmen og fordi vi fant flere eksempler på vellykket bakteriell tømming i litteraturen. Mange publiserte tilfeller bruke en langt mindre strenge løpet av antibiotika, men i vår studie, fant vi at 14 dager er nødvendig for optimal engraftment av et menneske-lignende gut mikrobiomet. Mens vi i utgangspunktet prøvde en protokoll basert på Hintze et al., fant vi ut at oral gavage var for invasiv og at anti-fungal behandling var skadelig for mus26. Vi mener at NSG Hu-BLT-mus er unike og mindre invasive prosedyrer foretrekkes sammenlignet med andre mer robuste mus. Vi brukte ikke GF dyr i vår studie. Bruken av GF mus for å studere virkningene av tarmen mikrobiomet har vært godt dokumentert, men disse dyrene ikke har en menneskelig immunsystem19,32. Videre innrømmer vi at å jobbe med en GF NSG Hu-BLT mus modell ville skape interessante muligheter for forskning. For en, studere menneskelige immun celle rekonstituering og patogenesen av menneskelige spesifikke patogener som HIV-1 uten tilstedeværelse av tarmen mikrobiomet kunne gi interessante resultater. Videre kan GF modeller tillate en mer fullstendig rekonstituering av en menneske-lignende gut mikrobiomet etter avføring transplantasjon. Men GF mus har langvarige immun mangler, selv etter gut mikrobiomet rekonstituering21. Vår modell har fordelen av å bruke SPF bolig forhold, som er allment tilgjengelig og rimeligere i forhold til GF fasiliteter. Vår modell har også fordelen av å ikke perturbing de normale prosedyrene for kirurgisk generering av Hu-BLT-mus, fordi det ikke er behov for et helt GF-miljø.
Vi tror at denne doble Hu-BLT mus modellen er unik i at den ikke bare kan brukes til å studere menneskets immun funksjon og menneskelige sykdommer, men også bestemme virkningen av tarmen mikrobiomet på sykdoms patogenesen og behandling in vivo. Med denne protokollen, kan vi reproduserbar opprette doble Hu-BLT mus med menneskelige donor spesifikke gut mikrobiomet profiler. Derfor tror vi at bruk av doble Hu-BLT mus vil være fordelaktig for fremtidige personlig medisin programmer utviklet for å teste effekten av tarmen mikrobiomet på behandlinger for ulike menneskelige sykdommer som HIV-1 og kreft. Oppsummert er vår doble Hu-BLT mus modell en viktig og romanen pre-klinisk modell som har både en funksjonell menneskelig immunsystem og en stabil menneske-lignende gut mikrobiomet å studere menneskers helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Yanmin WAN, Guobin Kang, og Pallabi Kundu for deres assistanse i å generere BLT-humanisert mus. Vi ønsker å erkjenne UNMC Genomics Core Facility som mottar delvis støtte fra Nebraska Research Network i funksjonell Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology av Nevro Systems CoBRE P30GM110768, The fred & Pamela Buffett Cancer Center-P30CA036727, The Center for root og Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, og Nebraska Research Initiative. Vi vil gjerne takke University of Nebraska-Lincoln Life Sciences Annex og deres stab for deres assistanse. Denne studien støttes delvis av National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 kronisk HIV-smitte og aldring i NEUROAIDS (Chain) Center, 1R01AI111862 til Q Li. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, utarbeidelse av manuskriptet eller vedtak for publisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
