Summary
该协议演示如何使用电生理系统进行由神经元活动模式触发的闭环刺激。还提供可轻松针对不同刺激设备修改的示例 Matlab 代码。
Abstract
闭环神经生理学系统使用神经元活动模式来触发刺激，进而影响大脑活动。这种闭环系统已经在临床应用中找到，是基础脑研究的重要工具。最近一个特别有趣的发展是闭环方法与光遗传学的整合，这样神经元活动的特定模式可以触发选定神经元群的光学刺激。然而，为闭环实验建立电生理系统是很困难的。在这里，提供了一个随时应用的Matlab代码，用于根据单神经元或多个神经元的活动触发刺激。此示例代码可根据个人需求轻松修改。例如，它显示了如何触发声音刺激以及如何更改声音以触发连接到 PC 串行端口的外部设备。提出的协议设计用于动物研究（Neuralynx）的流行神经元记录系统。闭环刺激的实现在醒着的大鼠中得到证明。
Introduction
该协议的目的是演示如何在神经生理学实验中实现闭环刺激。神经科学中闭环实验的典型设置涉及基于神经元活动的在线读出触发刺激。这反过来又导致大脑活动的变化，从而关闭反馈循环1，2。这种闭环实验比标准开环设置具有多种优势，特别是与光遗传学结合时，这允许研究人员针对特定的神经元子集。例如，Siegle和Wilson使用闭环操作来研究ta振荡在信息处理中的作用3。他们证明，刺激海马神经元在塔振荡的下降阶段对行为的影响与在上升阶段应用相同的刺激不同。闭环实验在临床前研究也越来越重要。例如，多种癫痫研究表明，癫痫发作时触发的神经元刺激是降低癫痫发作严重程度的一种有效方法。此外，自动癫痫检测系统和或送治疗7、8的系统对癫痫患者9、10、11、12显示出显著益处。闭环方法迅速发展的另一个应用领域是使用皮质脑机接口控制神经假体。这是因为向假肢装置的用户提供即时反馈可显著提高准确性和能力13。
近年来，一些实验室已经开发出定制系统，用于同步电子记录神经元活动和在闭环系统14，15，16，17，18的刺激。尽管其中许多设置具有令人印象深刻的特性，但在其他实验室中实现它们并不总是那么容易。这是因为系统通常需要经验丰富的技术人员来组装所需的电子元件和其他必要的硬件和软件组件。
因此，为了便于在神经科学研究中采用闭环实验，本文提供了一个协议和Matlab代码，将开环电生理记录设置19、20、21、22转换为闭环系统2、6、23。该协议旨在与数字 Lynx 记录硬件配合使用，这是一种用于神经元群记录的常用实验室系统。典型的实验包括：1） 记录 5-20 分钟的尖峰数据;2） 尖峰排序创建神经元模板;3） 使用这些模板对神经活动模式进行在线检测;4） 检测到用户指定的模式时触发刺激或实验事件。
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Protocol
此处描述的所有程序均根据莱特布里奇大学动物福利委员会批准的动物研究协议进行。
1. 外科
注：用于植入神经生理学记录的探针的手术程序已在其他出版物24、25、26中发表。闭环刺激手术的确切细节取决于所使用的记录探头类型和目标的大脑区域。然而，在大多数情况下，典型的手术将包括以下步骤。
- 将一个笼子与老鼠一起植入硅胶探头或电极阵列，以记录神经元活动。
- 用2-2.5%异构物麻醉啮齿动物，并将头部固定在立体框架中。通过观察对轻度触觉刺激的任何运动反应，确保动物在手术过程中失去知觉。
- 在手术过程中涂抹眼膏以尽量减少干燥。
- 使用2%氯西丁溶液和70%无丙醇对手术区域进行切除，对皮肤进行消毒。
- 在将电极植入的大脑区域下，在头皮下注射利多卡因（5毫克/千克）。
- 使头皮的切口在未来植入物的区域，并使用手术刀和棉签清除外露的头骨25的骨质。
- 在颅骨上钻4-8个孔，植入锚螺钉（±0.5毫米）作为植入物25的结构支撑。将螺钉插入孔中，确保螺钉牢固地固定在原位，从而将螺钉固定在头骨上。
- 在指定的坐标处钻取颅骨，并植入微驱/探针植入物。
注：所述闭环刺激方案适用于插入电极的任何大脑区域。 - 使用牙科丙烯酸将微驱/探针和任何必需的电气接口接头固定到头骨上。牙科丙烯酸的量应足以牢固地附着植入物，但它不应与周围的软组织接触25。
- 手术后，密切监测动物，直到它恢复足够的意识，以保持胸腔性25。在接下来的3天里，服用皮下镇痛药（如Metacam，1毫克/千克）和抗生素，以防止感染（例如，enrofloxacin，10毫克/千克）。
注意：在进行任何测试或记录之前，动物通常需要从手术中恢复一周。
2. 软件安装
注：这在 Windows 10 64 位版本上进行了测试。
- 安装数据采集和处理软件。
- 安装数据采集系统 Cheetah 6.4 （https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control），其中包括与猎豹采集系统交互的库。
- 安装 SpikeSort3D （https://neuralynx.com/software/spikesort-3d） 或任何其他使用 KlustaKwik27进行尖峰排序的软件。在线检测软件使用 KlustaKwik 引擎中的群集定义。该软件可能在同一台计算机上运行，或者它可能在同一网络上的单独计算机上运行。
- 安装 NetCom 开发包 （https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0），也可以从https://neuralynx.com/software/netcom-development-package下载。
- 安装 Matlab（https://www.mathworks.com/downloads/;在 Matlab 版本 R2018a 上测试了代码）。请确保在 Windows 防火墙中启用了 Matlab。通常，在第一次连接期间会弹出一个弹出窗口。
- 登录到 Matlab 帐户。选择许可证。选择版本。选择操作系统。
- 下载以下库进行联机事件触发：https://github.com/leomol/cheetah-interface并将文件提取到计算机的"文档/Matlab"文件夹。随附的补充材料中提供了代码的副本。
3. 初始数据采集
- 使用猎豹软件开始数据采集。
- 记录几分钟的尖峰数据以填充模板波形。
- 停止数据采集，对记录的数据执行峰值排序。
- 打开 SpikeSort3D，单击文件 |菜单|加载尖峰文件，并从文件夹中选择一个带有记录数据的尖峰文件。
- 单击"群集菜单"，然后使用 KlustaKwik 进行自动群集，保留默认设置并单击"运行"。
4. 闭环实验
- 在猎豹中恢复数据采集。
- 打开马特拉布。
- 打开闭合循环.m并单击"运行"。或者，在 Matlab 命令窗口中，执行闭合环（）。确保 ClosedLoop.m 位于 Matlab 路径上。如果用户希望使用自定义函数调用每个触发器，请改为执行 ClosedLoop（''回调，自定义函数），其中自定义函数是该函数的句柄。
- 通过单击"加载"、浏览到录制文件夹并选择其中一个尖峰数据文件 （.ntt、.nse） 来加载在初始录制上定义的峰值信息。
- 通过单击绘制的波形下的复选框，选择一个或多个将触发刺激的神经元。
- 通过在"最小匹配"文本框中键入整数，定义触发刺激的最小神经元数;并通过在"窗口"文本框中键入数字来定义匹配不同波形的峰值被视为共同活动的时间窗口。
- 单击"发送"以启动。这将开始在线触发事件（默认为音调），基于所选神经元的尖峰活动。
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Representative Results
Fisher-Brown挪威大鼠在现场出生和长大，在实验前两周习惯处理。一个记录驱动器被手术植入，类似于前面描述的方法28，29，30，31，32，33，34。使用数字采集系统在32 kHz下记录神经元信号。神经元信号首先被放大，使用统一增益无线头级，然后以增益1000放大，带通被过滤在600至6000赫兹之间。 超过手动设定振幅阈值（通常为48-60 μV）的神经元尖峰被自动保存，然后分类成不同的簇。因此，每个聚类大概对应于来自不同神经元27的尖峰。对于这个协议演示，大鼠在花盆上休息，在行为实验中休息时，花盆是一个熟悉的休息场所（图1）。
如图2所示，来自记录计算机的代表性屏幕截图。它显示同步运行的录音软件（左）和Matlab程序，显示实时获取的峰值波形。此 Matlab 脚本包含在补充材料中。当检测到预定义触发群集的尖峰时，波形在 Matlab 图形窗口中以粗体虚线显示（图2），并触发音调，提供闭环系统。例如，这种闭环实验设置允许研究神经可塑性，在那里可以测试将神经元活动与外部刺激（音）配对是否会影响这些神经元的可接受场。
图1：将无线头级（带前置放大器和蓝色LED的板）连接到植入硅胶探头的老鼠照片。探头位于牙科丙烯酸（粉红色材料）下方，不可见。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：录音和闭环软件的屏幕截图。左侧面板是 Cheetah 记录系统的一部分，用于可视化和控制数据采集。屏幕右侧的窗口显示运行所述软件的 Matlab 会话。中间窗口显示与预定义模板匹配的在线检测到的尖峰的波形。属于该群集的尖峰用于触发所呈现视频中的声音。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：数据流的架构管道。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：刺激延迟测试。（A） 生成人工尖峰的时间与触发信号时间之间的延迟的直方图.（B） 微处理器板设置的原理图，用于生成人工尖峰波形。黑色和橙色连接输出一个RC，如波形（范围从0到810 mV），它通过"信号鼠标"接口连接到头部级，将电压降低到810 μV。 插入面包板同一列的元件已连接（电阻：110欧姆;220欧姆;1000欧姆;电容器：10μF）。Arduino 通过 USB/UART 连接到 PC，触发 Arduino 尖峰，并接收来自 Arduino 电路和采集软件 API 的回信号。Arduino 被指示生成 1000 个尖峰。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件 1：Matlab 脚本。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Discussion
此处描述的协议演示如何使用标准神经生理记录系统执行闭环刺激。该协议允许在计算机科学方面拥有有限专业知识的神经科学家以很少的成本快速实施各种闭环实验。这种实验经常是必要的，以研究在大脑的因果关系。
在准备动物并安装软件（步骤 1 和 2）后，闭环实验由两个单独的阶段组成。首先，初始数据采集（步骤3）收集数据，以定义与单个神经元活动对应的模板（即尖峰排序;步骤 3.5）。其次，闭环刺激，其中新记录的尖峰将自动实时分配给预定义的聚类，如果检测到峰值形成指定的神经元，则触发刺激（步骤 4）。提出的Matlab脚本（见补充材料）演示了基于单个神经元的活性和多个选定神经元的活动的不同刺激的触发。后者是一个特别重要的选择，因为神经元被认为是处理信息作为一个程序集（例如，数据包35，36）。因此，基于神经元群体模式的触发刺激可能是回答各种研究问题的关键工具。闭环控制期间的数据流如图3所示。
在此协议演示中，使用了 3 kHz 的音调刺激。通过更改变量"音0"，可以由任意声波形替换这种纯音。此外，请注意，许多其他设备可以连接到计算机的音频输出，以触发刺激，而不是扬声器。例如，音频输出用于驱动振动电机，以提供低频（20 Hz）触觉刺激22。或者，Matlab 代码可用于将 TTL 信号发送到连接到计算机串行端口的设备。这可以通过将"sound（）"命令替换为以下代码来实现：obj_串行（"COM1"）;丰（奥布）;Obj。请求发送 = "打开"。补充材料（参见 pulse.m）中提供了此方法的示例实现。同样，Matlab 也可用于通过 USB 端口向外部设备发送信号。因此，此处提供的代码允许用户以各种方式向多个设备发送闭环触发器。
测试显示，神经元尖峰和触发信号之间的时间延迟约为 13 ms（最小 9 ms;最大 15 ms）。时间延迟的分布如图4A所示。对于此延迟测试，Arduino 用于将人工峰值发送到采集系统（通过头级）。延迟被记录为从运行闭环 Matlab 脚本的采集 PC 的尖峰和触发信号之间的时间。用于生成峰值的 Arduino 设置的示意图如图4B所示。
此处介绍的方法在软件中实现，因此可能无法提供具有专用硬件的系统的时间准确性的刺激。例如，TDT（塔克-戴维斯技术）提供用于尖峰触发刺激的系统，可在几毫秒内提供刺激。但是，此处介绍的 Matlab 解决方案的优点是，对于拥有 Cheetah 录制硬件的用户而言，其成本较低，在定义触发刺激的活动模式时具有灵活性，以及定义神经元模板的灵活性。此外，许多实验中不需要单毫秒精度，因此这种方法的实现简便性可以提供一个主要优势。
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Disclosures
作者与本作品没有任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NSERC发现公司对AL和AG的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | Bayer, Mississauga, CA | DIN 02169428 | antibiotic; 50 mg/mL |
| Cheetah 6.4 | NeuraLynx, Tucson, AZ | 6.4.0.beta | Software interfaces for data acquisition |
| Digital Lynx 4SX | NeuraLynx, Tucson, AZ | 4SX | recording equipment |
| Headstage transmitter | TBSI | B10-3163-GK | transmits the neural signal to the receiver |
| Isoflurane | Fresenius Kabi, Toronto, CA | DIN 02237518 | inhalation anesthetic |
| Jet Denture Powder & Liqud | Lang Dental, Wheeling, US | 1230 | dental acrylic |
| Lacri-Lube | Allergan, Markham, CA | DIN 00210889 | eye ointment |
| Lido-2 | Rafter 8, Calgary | DIN 00654639 | local anesthetic; 20 mg/mL |
| Matlab | Mathworks | R2018b | software for signal processing and triggering external events |
| Metacam | Boehringer, Ingelheim, DE | DIN 02240463 | analgesic; 5 mg/mL |
| Netcom | NeuraLynx | v1 | Application Programming Interface (API) that communicates with Cheetah |
| Silicone probe | Cambridge Neurotech | ASSY-156-DBC2 | implanted device |
| SpikeSort 3D | NeuraLynx, Tucson, AZ | SS3D | spike waveform-to-cell classification tools |
| Wireless Radio Receiver | TBSI | 911-1062-00 | transmits the neural signal to the Digital Lynx |
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