Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase
Summary
Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l’etichettatura ATP di z[32 P].
Abstract
L’ampio sequenziamento dell’intero genoma ha identificato molti Open Reading Frame (ORF) che forniscono molte potenziali proteine. Queste proteine possono avere ruoli importanti per la cellula e possono svelare nuovi processi cellulari. Tra le proteine, le chinasi sono i principali attori in quanto appartengono ai percorsi di segnalazione cellulare e hanno la capacità di attivare o disattivare molti processi cruciali per il destino della cellula, come la crescita cellulare, la divisione, la differenziazione, la motilità e la morte.
In questo studio, ci siamo concentrati su una nuova potenziale proteina della chinasi, LIMK2-1. Abbiamo dimostrato la sua esistenza da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico. Abbiamo valutato la sua interazione con una proteina a monte che regola utilizzando esperimenti di coimmunoprecipitazioni. La coimmunoprecipitazione è una tecnica molto potente in grado di rilevare l’interazione tra due proteine bersaglio. Può anche essere utilizzato per rilevare nuovi partner di una proteina esca. La proteina esca può essere purificata tramite un tag progettato alla sua sequenza o tramite un anticorpo che la ridestina specificamente. Questi complessi proteici possono quindi essere separati da SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) e identificati utilizzando la spettrometria di massa. Immunoprecipitato LIMK2-1 è stato utilizzato anche per testare la sua attività di chinasi in vitro da z[32P] ETICHETTAtura ATP. Questo saggio ben consolidato può utilizzare molti substrati diversi, e versioni mutate dell’esca possono essere utilizzate per valutare il ruolo di residui specifici. Gli effetti degli agenti farmacologici possono anche essere valutati poiché questa tecnica è sia altamente sensibile che quantitativa. Ciò nonostante, la manipolazione della radioattività richiede particolare cautela. L’attività della chinasi può anche essere valutata con anticorpi specifici che prendono di mira il gruppo di fosforo dell’amminoacido modificato. Questi tipi di anticorpi non sono disponibili in commercio per tutti i residui modificati al fosforo.
Introduction
Per molti decenni, sono state chiarite numerose vie di segnalazione e il loro coinvolgimento in processi cellulari cruciali come la divisione cellulare, la differenziazione, la motilità, la morte cellulare programmata, l’immunità e la neurobiologia, è stato dimostrato. Le chinasi svolgono un ruolo significativo in questi percorsi di segnalazione in quanto spesso regolano finemente la loro attivazione o inattivazione e fanno parte di complessi versatili transitori che rispondono agli stimoli esterni1,2,3. La mutazione e la disregolazione delle chinasi spesso portano a malattie nell’uomo, e quindi sono diventate uno dei più importanti obiettivi farmacologici negli ultimi quarant’anni4.
In questo contesto, è importante essere in grado di rilevare l’interazione della chinasi con le loro autorità di regolamentazione a monte o conto rizzate a valle e identificare nuovi partner. La purificazione dell’affinità e l’immunoprecipitazioni sono tecniche molto potenti per l’isolamento dei complessi proteici5. La proteina o chinasi dell’esca può essere etichettata con una specifica sequenza di peptidi che consente l’uso di perline commerciali accoppiate covalentmente con anticorpi che colpiscono il peptide. Questo materiale permette un’elevata riproducibilità negli esperimenti6,7,8. Le proteine endogene possono anche essere immunoprecipitate utilizzando anticorpi che colpiscono direttamente la proteina esca. Gli anticorpi possono essere collegati in modo incrociato alle perle proteiche A o Agarose proteiche o semplicemente incubati con queste perline prima di aggiungere il lisato. I buffer di lisi devono essere ottimizzati per consentire la solubilità delle proteine senza perdere l’interazione ed evitare la degradazione delle proteine. Uno svantaggio principale di questo approccio è che l’interazione viene rilevata sulla lisi cellulare; pertanto, le interazioni transitorie o deboli, insieme a quelle che richiedono il contesto subcellulare possono essere perse. Altre tecniche possono essere utilizzate per lavorare direttamente nella cella come Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) o F Trasferimento (FRET)11,12. Inoltre, l’immunoprecipitazioni non è appropriata per determinare le costanti termodinamiche dell’attacco, per le quali sono necessarie tecniche fisiche come la risonanza del Plasmona di superficie, la calorimetria della frequenza isotermale o la termofore microscala 13,14.
L’attività della chinasi può essere valutata utilizzando più tecniche. Qui, ci siamo concentrati sugli anticorpi specifici per il fosforo e in vitro:[32P] ATP (Adenosine TriPhosphate) etichettatura. Gli anticorpi specifici per il fosforo prendono di mira la modifica del fosfato di un particolare residuo all’interno di una proteina. Possono essere utilizzati in Western Blot o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dopo la lisi cellulare, per l’immunohistochimica, e anche su cellule intatte utilizzando citometria di flusso o immunofluorescenza. I loro inconvenienti possono includere la loro mancanza di specificità, che può essere valutata utilizzando una versione mutata della proteina bersaglio, e non sono disponibili commercialmente per tutte le proteine. L’etichettaturaATP in vitro[32 P] è un metodo molto robusto, consolidato e altamente sensibile15. Possono essere utilizzate proteine immunoprecipitate o ricombinanti e possono essere testati diversi substrati. Gli effetti delle droghe possono anche essere valutati in quanto questo metodo è quantitativo. Il suo principale inconveniente è che la radioattività associata all’approccio richiede una gestione con cautela. Sono possibili anche metodi alternativi basati sulla misurazione dei substrati peptidi fluorescenti o luminescenti e sfruttando le proprietà fluorescenti/luminescenti alterate al fosforo. Tali metodi consentono anche un’elevata produttività, che è necessaria, ad esempio, nello screening di molecole che possono essere potenziali inibitori della chinasi bersaglio. Infatti, le chinasi rappresentano una delle più grandi classi di bersagli farmacologici perseguiti dalle aziende farmaceutiche16.
In questo studio, ci siamo concentrati sulla proteina LIMK2-1 (LIMK2-1 sta per Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). La proteina della chinasi LIMK2 è stata descritta per la prima volta nel 199517. Tre isoformi di LIMK2 sono prodotti da giunzioni alternative: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Attualmente, LIMK2-1 è stato descritto solo a livello di mRNA in un singolo studio18. Qui, caratterizziamo questa potenziale nuova proteina della chinasi a livello molecolare usando approcci biochimici robusti. In primo luogo, dimostriamo che LIMK2-1 è effettivamente sintetizzato. Simile alle sue due controparti, LIMK2a e LIMK2b, interagisce con la chinasi a monte ROCK (chinasi proteica associata a Rho). Mostriamo che LIMK2-1 ha un’attività di chinasi sulle proteine di base mielina (MBP), ma non sulla cofilina, il substrato canonico delle chinasi LIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo usato robusti strumenti biochimici per caratterizzare a livello molecolare una nuova proteina, LIMK2-1, che si ritiene sia una chinasi basata sulla sua sequenza e sui suoi omologhi, LIMK2a e LIMK2b20.
In primo luogo, abbiamo dimostrato l’esistenza di LIMK2-1 a livello proteico usando l’analisi Western Blot con un anticorpo specifico. In seguito, abbiamo valutato la sua interazione con la chinasi a monte ROCK1, che è nota per regolare LIMK2a e LIMK2b, gli o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da La Ligue contre le Cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen e il Région Centre Val de Loire. Molte grazie ad Aurélie Cosson e Déborah Casas per i dati sulla citometria di flusso, e a Keyron Hickman-Lewis per una lettura approfondita del manoscritto.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
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