Summary

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Published: June 30, 2019
doi:

Summary

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Abstract

Die umfangreiche Sequenzierung des gesamten Genoms hat viele Open Reading Frames (ORFs) identifiziert, die viele potenzielle Proteine liefern. Diese Proteine können wichtige Rollen für die Zelle spielen und neue zelluläre Prozesse entwirren. Unter den Proteinen sind Kiinasen wichtige Akteure, da sie zu Zellsignalwegen gehören und die Fähigkeit haben, viele Prozesse ein- oder auszuschalten, die für das Schicksal der Zelle entscheidend sind, wie Zellwachstum, Teilung, Differenzierung, Beweglichkeit und Tod.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf ein neues potenzielles Kinase-Protein, LIMK2-1. Wir haben seine Existenz durch Western Blot mit einem spezifischen Antikörper demonstriert. Wir haben seine Wechselwirkung mit einem vorgelagerten regulierenden Protein anhand von Coimmunopräzipitationsexperimenten bewertet. Coimmunoprecipitation ist eine sehr leistungsfähige Technik, die in der Lage ist, die Wechselwirkung zwischen zwei Zielproteinen zu erkennen. Es kann auch verwendet werden, um neue Partner eines Köderproteins zu erkennen. Das Köderprotein kann entweder über ein auf seine Sequenz konstruiertes Tag oder über einen Antikörper gereinigt werden, der speziell auf es abzielt. Diese Proteinkomplexe können dann durch SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidE Gel) getrennt und mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Immunpräzipitor LIMK2-1 wurde auch verwendet, um seine Kinase-Aktivität in vitro durch die ATP-Kennzeichnung zu testen. Dieser etablierte Assay kann viele verschiedene Substrate verwenden, und mutierte Versionen des Köders können verwendet werden, um die Rolle spezifischer Rückstände zu beurteilen. Die Wirkung pharmakologischer Wirkstoffe kann ebenfalls bewertet werden, da diese Technik sowohl hochsensibel als auch quantitativ ist. Dennoch erfordert die Behandlung von Radioaktivität besondere Vorsicht. Die Kinase-Aktivität kann auch mit spezifischen Antikörpern bewertet werden, die auf die Phosphogruppe der modifizierten Aminosäure abzielen. Diese Arten von Antikörpern sind nicht für alle phosphomodifizierten Rückstände kommerziell erhältlich.

Introduction

Seit vielen Jahrzehnten werden zahlreiche Signalwege aufgeklärt und ihre Beteiligung an entscheidenden zellulären Prozessen wie Zellteilung, Differenzierung, Beweglichkeit, programmiertem Zelltod, Immunität und Neurobiologie gezeigt. Kinasen spielen eine wichtige Rolle in diesen Signalwegen, da sie oft ihre Aktivierung oder Inaktivierung fein regulieren und Teil vorübergehender vielseitiger Komplexe sind, die auf äußere Reize reagieren1,2,3. Mutation und Dysregulation von Kiinasen führen oft zu Krankheiten beim Menschen, und sie sind daher zu einem der wichtigsten Drogenziele in den letzten vierzig Jahrengeworden 4.

In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Kinase-Wechselwirkung mit ihren vorgelagerten Regulatoren oder nachgelagerten Substraten erkennen zu können und neue Partner zu identifizieren. Affinitätsreinigung und Immunpräzipitation sind sehr leistungsfähige Techniken zur Isolierung von Proteinkomplexen5. Das Köderprotein oder die Ködernase kann mit einer bestimmten Peptidsequenz markiert werden, die die Verwendung von kommerziellen Perlen kovalent gekoppelt mit Antikörpern ermöglicht, die auf das Peptid abzielen. Dieses Material ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit in den Experimenten6,7,8. Endogene Proteine können auch mit Antikörpern immunpräzipiert werden, die direkt auf das Köderprotein abzielen. Die Antikörper können mit Protein A oder Protein G Agarose Perlen vernetzt oder einfach mit diesen Perlen vor der Zugabe von Lysat inkubiert werden. Lysepuffer müssen optimiert werden, um eine Proteinlösung ohne Wechselwirkung zu ermöglichen und den Proteinabbau zu vermeiden. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass die Wechselwirkung bei der Zelllyse erkannt wird; daher können vorübergehende oder schwache Wechselwirkungen zusammen mit solchen, die einen subzellulären Kontext erfordern, übersehen werden. Andere Techniken können verwendet werden, um direkt in der Zelle zu arbeiten, wie Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) oder Förster Resonance Energy Transfer (FRET)11,12. Darüber hinaus ist die Immunpräzipitation nicht geeignet, die thermodynamischen Konstanten der Bindung zu bestimmen, für die physikalische Techniken wie Surface Plasmon Resonance, Isothermale Titrationskalorimetrie oder Mikroskalige Thermophorese erforderlich sind. 13,14.

Die Kinase-Aktivität kann mit mehreren Techniken bewertet werden. Dabei konzentrierten wir uns auf phosphospezifische Antikörperund in vitro-ATP-Etikettierung (Adenosin-TriPhosphat). Phosphospezifische Antikörper zielen auf die Phosphatmodifikation eines bestimmten Rückstands innerhalb eines Proteins ab. Sie können in Western Blot oder ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) nach der Zelllyse, für die Immunhistochemie und auch auf intakten Zellen mit Durchflusszytometrie oder Immunfluoreszenz verwendet werden. Ihre Nachteile können ihr Mangel an Spezifität sein, die mit einer mutierten Version des Zielproteins bewertet werden kann, und sie sind nicht kommerziell für alle Proteine verfügbar. Die In-vitro-ATP-Kennzeichnung ist eine sehr robuste, etablierte und hochempfindliche Methode15. Immunpräzipierte oder rekombinante Proteine können verwendet werden, und verschiedene Substrate können getestet werden. Die Wirkung von Arzneimitteln kann auch bewertet werden, da diese Methode quantitativ ist. Sein Hauptnachteil ist, dass die Radioaktivität, die mit dem Ansatz verbunden ist, einen vorsichtigen Umgang erfordert. Alternative Methoden sind auch möglich, basierend auf der Messung von fluoreszierenden oder lumineszierenden Peptidsubstraten und unter Ausnutzung veränderter fluoreszierender/lumineszierender Eigenschaften bei phosphorylierter Phosphorylierung. Solche Methoden ermöglichen auch einen hohen Durchsatz, der z. B. beim Screening von Molekülen erforderlich ist, die potenzielle Inhibitoren der Zielkinase sein können. Tatsächlich stellen Kinasen eine der größten Klassen von Arzneimittelzielen dar, die von Pharmaunternehmen verfolgt werden16.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf das LIMK2-1 Protein (LIMK2-1 steht für Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Das LIMK2-Kinase-Protein wurde erstmals1995 17 beschrieben. Durch alternatives Spleißen werden drei Isoformen von LIMK2 hergestellt: LIMK2a, LIMK2b und LIMK2-1. Derzeit wurde LIMK2-1 nur auf mRNA-Ebene in einer einzigen Studie18beschrieben. Hierbei charakterisieren wir dieses potentielle neue Kinase-Protein auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen. Erstens zeigen wir, dass LIMK2-1 tatsächlich synthetisiert ist. Ähnlich wie seine beiden Pendants LIMK2a und LIMK2b interagiert es mit der vorgelagerten Kinase ROCK (Rho-assoziierte Proteinkinase). Wir zeigen, dass LIMK2-1 eine Kinase-Aktivität auf Myelin Basic Protein (MBP) hat, aber nicht auf Cofilin, dem kanonischen Substrat von LIM-Kinasen.

Protocol

1. Zellvorbereitung zur Transfektion VORSICHT: Alle Schritte der Zellkultur müssen in einem speziellen Labor durchgeführt werden, und Zellen werden in einem mikrobiologischen Schrank der Klasse 2 manipuliert. Samen HEK-293 (Human Embryonic Kidney) Zellen in 10 cm Platten in 10 ml DMEM (Dulbecco es Modified Eagles Medium) ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum. Kultur für 3 bis 5Tage unter 5% CO2 , bei 37 °C, bis die Zellen 90% Zusammenfluss erreichen. Behandel…

Representative Results

LIMK2-1 Protein wird synthetisiertLIMK2-1 wird in Datenbanken erwähnt, aber bisher hat nur ein Papier die Existenz seiner mRNA18gezeigt. Im Vergleich zu seinen beiden Homologen LIMK2a und LIMK2b verfügt LIMK2-1 über eine zusätzliche C-Terminal-Domäne, die als Proteinphosphatase 1 Inhibitory Domain (PP1i) identifiziert wurde. Wir haben einen Antikörper entwickelt, der auf ein Peptid dieser Domäne abzielt, Aminosäuren 671-684 (<strong cla…

Discussion

Hierbei haben wir robuste biochemische Werkzeuge eingesetzt, um auf molekularer Ebene ein neues Protein, LIMK2-1, zu charakterisieren, von dem angenommen wird, dass es sich um eine Kinase handelt, die auf ihrer Sequenz und ihren Homologen LIMK2a und LIMK2b20basiert.

Erstens haben wir die Existenz von LIMK2-1 auf Proteinebene anhand der Western Blot-Analyse mit einem spezifischen Antikörper nachgewiesen. Anschließend evaluierten wir seine Wechselwirkung mit der vorgela…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von La Ligue contre le Cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen und la Région Centre Val de Loire. Vielen Dank an Aurélie Cosson und Déborah Casas für Flow-Zytometrie-Daten und an Keyron Hickman-Lewis für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts.

Materials

Antibody anti-actin Sigma-Aldrich A1978 for Western Blot
Antibody anti-c-Myc Invitrogen MA1-21316 for Western Blot
Antibody anti-cofilin Cell signaling Technology 3312/5175 for Western Blot
Antibody anti-GFP Santa Cruz sc-9996 for Western Blot
Antibody anti-HA Roche Applied Science 11687423001 for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin Cell signaling Technology 3313 for Western Blot
Antibody Anti-PP1i Eurogentec designed for this study for Western Blot
Aprotinin Euromedex A-162B for lysis buffer
ATP Invitrogen PV3227 for g[32P] labeling
g[32P] ATP Perkin Elmer NEG502A for g[32P] labeling
BES buffered saline Sigma-Aldrich 14280 for transfection
b-glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422 for lysis and kinase buffer
b-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 for Laemmli
BSA Sigma-Aldrich A3059 for blocking buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 for Laemmli
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 for transfection
Centrifuge Sigma 111-541
Collagen R Pan Biotech P06-20166 for transfection
Control siRNA Ambion AM4611 for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution Thermo-Fisher 24620 for gel staining
EDTA Sigma-Aldrich 3690 for lysis buffer
Electrophoresis Unit Biorad Mini-Protean for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel Sigma-Aldrich E6779 for immunoprecipitation
GeneSys software Ozyme for Western Blot acquisition
GeneTolls software Ozyme for Western Blot quantification
GFP-trap beads Chromtek for immunoprecipitation
Glycine Euromedex 26-128-6405 for transfer buffer
GST-cofilin Upstate Cell signaling 12-556 for g[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL Hamilton 710 to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES Sigma-Aldrich H3375 for kinase buffer
ImageQuant TL software GE Healthcare for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA Ambion s8191 for PP1i antibody specificity
Leupeptin Sigma-Aldrich SP-04-2217 for lysis and kinase buffer
MBP Upstate Cell signaling 13-173 for g[32P] labeling
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 for kinase buffer
MnCl2 Sigma-Aldrich 244589 for kinase buffer
NaCl Euromedex 1112 for lysis and kinase buffer
NaF Sigma-Aldrich S-1504 for lysis and kinase buffer
Okaidic acid Euromedex 0-2220 for lysis buffer
PMSF Sigma-Aldrich 78830 for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate Euromedex 1026 for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P Merck-Millipore IPVH00010 pore size 0,45 mm for Western Blot
Rotating wheel Labinco for bead incubation
Safe lock eppendorf Eppendorf 0030120.086 for kinase assay
SDS Sigma-Aldrich 5030 for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate LC Laboratories S8507 for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate Fluka 71501 for lysis buffer
Super Signal West Dura Protein Biology 34075 for Western Blot
Syngene Pxi Ozyme for Western Blot
Tissue extracts

 
Biochain

 
P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis
for Western Blot analysis

 
Transfer Unit Biorad Mini-Trans-Blot for Western Blot
Tris Euromedex 26-128-3094 B for lysis buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949 for blocking buffer
Typhoon FLA9500 GE Healthcare to read autoradiography
Typhoon Trio Amersham Bioscience to read autoradiography
Whatman paper GE Healthcare 3030-672 for Western Blot

References

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Cite This Article
Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. J. Vis. Exp. (148), e59820, doi:10.3791/59820 (2019).

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