Summary
Vi preget et nytt kinase protein ved hjelp av robuste biokjemiske tilnærminger: Western Blot analyse med et dedikert spesifikt antistoff på ulike cellelinjer og vev, interaksjoner av coimmunoprecipitation eksperimenter, kinase aktivitet oppdages av vestlig Blot bruke et fosfat-spesifikt antistoff og ved γ [32P] ATP merking.
Abstract
Omfattende hele Genova sekvensering har identifisert mange Open Reading rammer (ORFs) gir mange potensielle proteiner. Disse proteinene kan ha viktige roller for cellen og kan løse nye cellulære prosesser. Blant proteiner, kinaser er store aktører som de tilhører celle signalering trasé og har evnen til å slå på eller av mange prosesser avgjørende for skjebnen til cellen, for eksempel cellevekst, divisjon, differensiering, motilitet og død.
I denne studien, fokuserte vi på en ny potensiell kinase protein, LIMK2-1. Vi demonstrerte dens eksistens ved Western Blot ved hjelp av et spesifikt antistoff. Vi evaluerte sin interaksjon med en oppstrøms regulere protein ved hjelp coimmunoprecipitation eksperimenter. Coimmunoprecipitation er en meget kraftfull teknikk i stand til å oppdage samspillet mellom to mål proteiner. Det kan også brukes til å oppdage nye partnere av et agn protein. Agn proteinet kan bli renset enten via en tag konstruert til sin sekvens eller via et antistoff spesielt rettet mot det. Disse protein komplekser kan da skilles med SDS-side (Sodium Natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel) og identifisert ved hjelp av masse massespektrometri. Immunoprecipitated LIMK2-1 ble også brukt til å teste sin kinase aktivitet in vitro av γ [32P] ATP merking. Denne veletablerte analysen kan bruke mange forskjellige underlag, og mutert versjoner av agnet kan brukes til å vurdere rollen til bestemte rester. Effekten av farmakologiske midler kan også evalueres siden denne teknikken er både svært følsom og kvantitativ. Likevel krever radioaktivitet særlig forsiktighet. Kinase aktivitet kan også vurderes med spesifikke antistoffer rettet mot fosfat gruppen av modifisert aminosyre. Slike antistoffer er ikke kommersielt tilgjengelige for alle fosfat modifiserte rester.
Introduction
For mangetiår, har mange signalering trasé vært belyst og deres engasjement i avgjørende cellulære prosesser som celledeling, differensiering, motilitet, programmert celle død, immunitet og nevrobiologi, har blitt vist. Kinaser spille en betydelig rolle i disse signalnettverk trasé som de ofte fint regulere deres aktivisering eller inaktive og er en del av transient allsidige komplekser som reagerer på eksterne stimuli1,2,3. Mutasjon og feilregulering av kinaser ofte føre til sykdommer hos mennesker, og de har derfor blitt en av de viktigste stoffet mål de siste 40 år4.
I denne sammenhengen er det viktig å være i stand til å oppdage kinase interaksjon med oppstrøms regulatorer eller nedstrøms underlag og for å identifisere nye partnere. Affinitet rensing og immunutfelling er svært kraftige teknikker for isolering av protein komplekser5. Agnet protein eller kinase kan være merket med en bestemt peptid sekvens tillater bruk av kommersielle perler covalently kombinert med antistoffer rettet mot peptid. Dette materialet tillater høy reproduserbarhet i eksperimenter6,7,8. Endogene proteiner kan også være immunoprecipitated ved hjelp av antistoffer rettet mot direkte agn protein. Antistoffene kan være tverrbundet til protein A eller protein G agarose perler eller bare inkubert med disse perlene før du legger lysat. Lyse Rings buffere må optimaliseres for å tillate protein oppløseliggjøringen uten å miste interaksjon og for å unngå protein degradering. En stor ulempe med denne tilnærmingen er at interaksjonen oppdages ved cellelyse; Derfor kan forbigående eller svake interaksjoner, sammen med de som krever subcellulære kontekst, bli oversett. Andre teknikker kan brukes til å arbeide direkte i cellen som nærhet ligation analysen (PLA)9, in vivo Cross-Linking-assistert affinitet rensing (XAP)10, bioluminesens RESONANS Energy Transfer (BRET) eller Förster resonans Energy Overføring (bånd)11,12. Videre er immunutfelling ikke hensiktsmessig å bestemme termodynamisk konstantene av bindingen, for hvilke fysiske teknikker som Surface Plasmon resonans, isotermiske titrering Reaksjonskalorimetri eller Mikroskala Thermophoresis er nødvendig 13,14.
Kinase aktivitet kan vurderes ved hjelp av flere teknikker. Heri, fokuserte vi på fosfat-spesifikke antistoffer og in vitro γ [32P] ATP (adenosin trifosfat) merking. Fosfat-spesifikke antistoffer rettet mot fosfat modifikasjon av en bestemt rest i et protein. De kan brukes i Western Blot eller ELISA (enzym-knyttet Immunosorbentanalyse analysen) etter cellelyse, for immunhistokjemi, og også på intakte celler ved hjelp av Flow flowcytometri eller immunofluorescence. Deres ulemper kan omfatte deres mangel på spesifisitet, som kan evalueres ved hjelp av en mutert versjon av målet protein, og deres ikke er kommersielt tilgjengelig for alle proteiner. In vitro γ [32P] ATP merking er en meget robust, veletablert og svært følsom metode15. Immunoprecipitated eller rekombinant proteiner kan brukes, og ulike underlag kan testes. Virkningene av rusmidler kan også bli vurdert som denne metoden er kvantitativ. Dens store ulempen er at radioaktiviteten knyttet til tilnærmingen krever håndtering med forsiktighet. Alternative metoder er også mulig basert på måling av fluorescerende eller selvlysende peptid underlag og dra nytte av endrede fluorescerende/selvlysende egenskaper ved fosforylering. Slike metoder tillater også høy gjennomstrømming, som er nødvendig, for eksempel i screening av molekyler som kan være potensielle hemmere av målet kinase. Faktisk, kinaser representerer en av de største klassene av narkotika mål forfulgt av farmasøytiske selskaper16.
I denne studien, fokuserte vi på LIMK2-1 protein (LIMK2-1 står for Lin11, Isle1, Mec3 kinase isoformen 2-1). Den LIMK2 kinase protein ble først beskrevet i 199517. Tre isoformene av LIMK2 er produsert av alternative skjøting: LIMK2a, LIMK2b og LIMK2-1. I dag har LIMK2-1 bare blitt beskrevet på mRNA nivå i en enkelt studie18. Heri, karakteriserer vi dette potensialet nye kinase protein på molekylnivå ved hjelp av robuste biokjemiske tilnærminger. For det første viser vi at LIMK2-1 er faktisk syntetisert. I likhet med sine to kolleger, LIMK2a og LIMK2b, samhandler den med oppstrøms kinase ROCK (Rho-assosiert protein kinase). Vi viser LIMK2-1 har en kinase aktivitet på myelin Basic protein (MBP), men ikke på cofilin, det kanoniske underlaget av LIM-kinaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse for transfeksjoner
FORSIKTIG: alle trinnene i celle kulturen må utføres i et dedikert laboratorium, og cellene manipuleres i et klasse 2 mikrobiologisk kabinett.
- Seed HEK-293 (Human embryonale nyre) celler i Ø 10 cm plater i 10 mL DMEM (Dulbecco ' s modifisert Eagles medium) supplert med 10% fosterets kalv serum. Kultur for 3 til 5 dager under 5% CO2, ved 37 ° c, inntil cellene nå ~ 90% samløpet.
- Unn Ø 10 cm plater med kollagen R for å øke celle vedheft til plast platene.
- Tilsett 5 mL av en oppløsning av collagen R, 200 fortynnet i fosfat Saline buffer (PBS) i en Ø 10 cm plate. Overlapp væsken over hele overflaten av platen.
- Ruge ved romtemperatur i minst 1 time i biosafety skapet.
- Fjern kollagen løsning, og kast den. Tilsett 5 mL PBS, spre det hele over overflaten av platen, fjerne den og forkaste den. Gjenta denne vasken én gang.
- Tilsett 8 mL DMEM supplert med 10% fosterets kalv serum. Oppbevar de preparerte platene i biosafety skapet.
- Ta HEK-293 plater fra trinn 1,1 i biosafety skapet. Fjern mediet fra platene og kast det i en egen bleke søppel. Tilsett 2 mL supplert DMEM, og skyll cellene for å løsne dem ved hjelp av flyten av en 1 mL micropipette, ta vare for å unngå å lage skum.
- Samle cellene i et 15 mL rør og tilsett 4 mL supplert DMEM. Homogenisere med en 10 mL pipette, ved pipettering opp og ned 3 ganger.
- Ta 2 mL av denne cellen løsning og legge dem til kollagen-behandlet plater som inneholder supplert DMEM fra trinn 1.2.4.
- Vokse i 24 timer i inkubator ved 5% CO2 og 37 ° c. Celler bør være 50-80% confluent på tidspunktet for transfeksjoner.
2. transient transfections
- Fjern mediet fra platene, kast det i en dedikert bleke papir, og tilsett 10 mL fersk supplert DMEM. Sett platene tilbake i inkubator ved 37 ° c mens du klargjør den transfeksjoner blandingen.
- I et 15 mL rør, tilsett 450 μL av en 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA (Tris står for Tris (hydroksymetyl) aminometan, og EDTA for ethylenedinitrilotetraacetic syre) løsning og 50 μL av en 2,5 M CaCl2 -løsning. Bland ved inversjon.
- Tilsett 10 μg av plasmidic DNA (deoksyribonukleinsyre acid) fremstilt fra en MIDI-forberedelse på en flytende kultur av bakterier forvandlet med den dedikerte plasmider. Bland ved inversjon.
- Under glatt omrøring på en Vortex, tilsett 500 μL av BES bufret saltvann 2x konsentrat (sammensetning: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na2HPO4, 0,27 g/l; BES står for N, N-BIS (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid, N, N-BIS (2-hydroxyethyl) taurin) langsomt dråpe for dråpe.
- Ruge i minst 15 min (opptil 45 min) ved romtemperatur i biosafety skapet. Ikke Vortex, ikke bland! Flytt rørene svært nøye for ikke å forstyrre den komplekse formasjonen mellom DNA og kalsium fosfat.
- Ta platene fra trinn 2,1 til sikkerhets skapet. Tilsett DNA komplekser veldig nøye, dråpe for dråpe, på cellene over hele overflaten av platen.
- Ruge i 24 til 72 timer i inkubator ved 37 ° c. Vanligvis maksimalt protein uttrykk nås innen 48 timer.
3. lyse
Merk: arbeid på isen, og med kaldt buffere for å hindre protein degradering.
- Klargjør lyseringsbuffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM natrium geranylpyrofosfat, 1 mM na3VO4, 20 mm p-Nitrophenyl fosfat, 20 mm β-glycerophosphate, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidic syre , 1 μg/mL leupeptin, og 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluor). Det kreves ca. 4 mL lyseringsbuffer for hver transfekterte plate.
- Fjern platene med transfekterte celler fra inkubator. Sett dem på is.
Merk: fra dette trinnet, er det mulig å arbeide på en "normal" benk. - Fjern Media, og kast den i en dedikert bleke papir.
- Vask to ganger med 3 mL kald PBS: tilsett 3 mL PBS på siden av platen dråpe for dråpe for å unngå frakobling transfekterte celler, spredt over hele overflaten av platen, fjerne PBS og forkaste det; Gjenta dette trinnet en gang til. På slutten, fjerne forsiktig resten av PBS ved å vippe platen for å hindre lyseringsbuffer fortynning for neste trinn.
- Tilsett 500 μL av kald lyseringsbuffer på de transfekterte, vasket cellene. Spre det hele på overflaten av platen.
- Ruge for 10 min på isen. Fra tid til annen (minst to ganger), spre igjen buffer over hele overflaten av platen.
- Skrap cellene og samle dem i en mikrosentrifugen tube.
- Sentrifuger for 10 min ved 10 000 x g ved 4 ° c.
- Samle supernatanten i et nytt mikrosentrifugen rør. Denne fraksjonen tilsvarer lysat (hele celle ekstrakt). Kast pellet som tilsvarer celle membran rusk.
- Samle en alikvot av denne fraksjonen til en ny mikrosentrifugen Tube (rundt 50 μL). Denne fraksjonen tilsvarer "TOTAL brøk" eller "Cell Lysat" eller "hele celle ekstrakt" som tillater analyse av om transfekterte proteiner uttrykkes av Western Blot.
Merk: på dette punktet, kan prøvene brukes direkte for Western Blot analyser. Laemmli buffer må legges til prøven, som deretter varmes opp ved 95 ° c i 5 min, sentrifugert ved 10 000 x g i 5 min, og lastet på riktig SDS-side. Prøvene kan også oppbevares ved-80 ° c.
4. immunutfelling
- Forsiktig resuspend agarose perler kombinert med riktig antistoff: HA (Human influensa hemagglutinin), Flag, eller GFP (grønn fluorescerende protein) ved jevn inversjon.
- Klipp enden av en 200 μL-spiss fra en micropipette slik at perlene kan komme inn i spissen. Pipetter perlene opp og ned flere ganger for å mette spissen for å sikre å ta riktig volum av perler.
- Ta 40 μL av perler i et mikrosentrifugen rør.
- Tilsett 500 μL av grunnsetning (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) buffer. Bland ved inversjon. Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g ved 4 ° c. Fjern forsiktig supernatanten og kast den. Tilsett 500 μL av grunnsetning. Ruge i minst 1 time ved 4 ° c på et roterende hjul.
Merk: Denne pre-inkubasjons trinn i grunnsetning gjør det mulig å redusere ikke-spesifikke interaksjoner og så å redusere bakgrunns signal. - Vask perlene to ganger med 500 μL av lyseringsbuffer.
- Sentrifuger 2 min ved 1 000 x g ved 4 ° c.
- Fjern forsiktig supernatanten buffer, og kast den.
Merk: Pass på at du ikke aspirer perlene under disse vaske trinnene. - Tilsett 500 μL av lyseringsbuffer. Homogenisere ved å invertere røret.
- Gjenta trinn 4.5.1-4.5.3.
- Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g ved 4 ° c. Forsiktig fjerne supernatanten buffer, og kast den.
- Ruge perler med lysat fra trinn 3,9 i 2 til 4 timer ved 4 ° c på et roterende hjul.
- Vask immunoprecipitated perler.
Merk: på dette punktet, kan immunoprecipitated perlene vaskes fem ganger med lyseringsbuffer, og deretter eluert med Laemmli buffer. Eluatet kan brukes til Western Blot-analyser eller oppbevares ved-80 ° c. Alternativt kan perler vaskes to ganger med lyseringsbuffer og deretter tre ganger med kinase buffer for å utføre γ [32P] ATP merking.
5. Coimmunoprecipitation analyser
- Vask immunoprecipitated perlene fra trinn 4,7 med lyseringsbufferen.
- Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g i en nedkjølt sentrifuge ved 4 ° c.
- Fjern forsiktig supernatanten, og kast den.
- Tilsett 500 μL av lyseringsbuffer. Homogenisere ved å invertere røret.
- Gjenta trinn 5.1.1-5.1.3 fire ganger.
- Eluering
- Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g i en nedkjølt sentrifuge ved 4 ° c.
- Fjern forsiktig supernatanten, og kast den. Fjern de siste dråper supernatanten med en Hamilton sprøyte for å unngå aspirasjon av perlene, og kast supernatanten.
- Tilsett 40 μL av 4X Laemmli buffer (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glyserol, 0,5 M β-mercaptoethanol, 0,02% bromophenol blå). Homogenisere ved å trykke forsiktig på røret.
- Ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuger for 5 min ved 10 000 x g ved romtemperatur.
- Med en Hamilton sprøyte, fjerne supernatanten og samle den i en ny mikrosentrifugen tube. Denne fraksjonen tilsvarer "Eluatet", som kan lagres ved-80 ° c, eller direkte analysert av Western Blot.
6. kinase analysen
- Klargjør kinase buffer: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES står for 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mm MnCl2, 50 mM NaF, 1 mm na3VO4, 20 mm β-glycerophosphate, 1 μg/ml leupeptin og 1 mM PMSF. Rundt 2 mL av kinase buffer er nødvendig for hver immunutfelling tilstand.
- Vask immunoprecipitated perler fra trinn 4,7 to ganger med 500 μL av lyseringsbuffer.
- Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g i en nedkjølt sentrifuge ved 4 ° c.
- Forsiktig fjerne supernatanten, og kaste den. Tilsett 500 μL av lyseringsbuffer. Homogenisere ved inversjon.
- Gjenta trinn 6.2.1 og 6.2.2.
- Vask immunoprecipitated perler tre ganger med 500 μL av kinase buffer.
- Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g i en nedkjølt sentrifuge ved 4 ° c.
- Forsiktig fjerne supernatanten, og kaste den. Tilsett 500 μL av kinase buffer. Homogenisere ved inversjon.
- Gjenta trinn 6.3.1 og 6.3.2 to ganger.
- Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g i en nedkjølt sentrifuge ved 4 ° c.
- Forsiktig fjerne supernatanten, og kaste den. Fjern de siste dråper supernatanten med en Hamilton sprøyte for å unngå aspirasjon av perlene, og kast supernatanten.
- Tilsett 40 μL av kinase buffer til immunoprecipitated perler. Resuspend perlene ved å trykke forsiktig på røret.
- Klargjør miksen for γ [32P] ATP-merking (endelig volum er 22,5 μL, komplett med kinase buffer) i et sikkert låse rør.
- Tilsett det nødvendige volumet av kinase buffer for å nå et endelig volum på 22,5 μL.
- Kutt enden på en 20 μL tupp av en micropipette. Resuspend de immunoprecipitated perlene fra trinn 6,6 ved pipettering opp og ned flere ganger. Samle 10 μL av disse perlene i safe-Lock tube.
- Legg til ATP fra en lagerløsning på 10 μM for å nå 50 mM av finale konsentrasjon. I henhold til antall eksempler behandlet, er en fortynning av aksjen løsning av ATP i kinase buffer foreslått å tillate pipette 1 til 2 μL, for å være sikker på at volumet er riktig.
- Tilsett 2,5 μg av substrat (cofilin eller myelin Basic protein, MBP i den foreliggende studien).
- Legg til 5 μCi av γ [32P] ATP (3 000 CI/mmol) for å starte reaksjonen. Bland med pipettering opp og ned sakte.
FORSIKTIG: fra dette punktet må arbeidet gjøres på et sikkerhets sted dedikert for radioaktivitet manipulasjoner med forsiktig forholdsregel, dedikert beskyttelse og hensiktsmessige kontroller (radioaktive skjold, Geiger teller, bestemt avfall samle, personlig bryst og fingermerker for å oppdage radioaktiv stråling, filter tips). - Ruge for 20 min ved 30 ° c.
- Stopp reaksjonen med 6 μL av 5x Laemmli buffer.
- Heat ved 95 ° C i 5 min.
- Sentrifuger ved 10 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Last på en SDS-side. Fortsett til overføringen.
Merk: Pass på at frontlinjen av gratis γ [32P] ATP ikke gå ut av gel for å unngå forurensning av migrasjon tank. - Beis gelen ved romtemperatur.
- Fjern gelen fra glass platene.
- Fortsett med tre bad i vann ved romtemperatur.
- Stain gelen over natten med Coomassie Blue ved romtemperatur.
- Destain gelen med flere vaske bad med vann ved romtemperatur.
- Pakk gelen med plastfolie.
- Utsett for en natt eller mer på en phosphorimager skjerm.
- Les skjermen på en phosphorimager for å oppdage merkede felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LIMK2-1 protein er syntetisert
LIMK2-1 er nevnt i databanks, men hittil har bare ett papir vist eksistensen av sin mRNA18. Sammenlignet med sine to homologs, LIMK2a og LIMK2b, LIMK2-1 har en ekstra C-terminal domene identifisert som en protein fosfatase 1 hemmende domene (PP1i). Vi utviklet et antistoff som er rettet mot et peptid av dette domenet, aminosyrer 671-684 (figur 1a).
BLAST forskning mot Human protein databaser viste at bare ett protein, PHI-1 (fosfatase holoenzyme inhibitor 1), har en sterk sekvens likhet med denne 12 amino acid sekvens. Men PHI-1 migrerer ved 23 kDa på SDS-PAGE gels, langt borte fra LIMK2-1, som forventes å migrere rundt 75 kDa (dvs. de to skal ikke forstyrre). Vi validerte dette antistoff først for HEK-293 celler transfekterte enten med LIMK2-1, LIMK2a eller LIMK2b og viste at anti-PP1i antistoff var i stand til å gjenkjenne transfekterte LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) og HA-Tagged LIMK2-1, men ikke kryss-reagere med transfekterte HA-Tagged LIMK2a eller LIMK2b (figur 1B). Vi observerte et band av endogene LIMK2-1 i HEK celler transfekterte med HA-Tagged versjoner av LIMK2 isoformene (indikert med en pil i anti-PP1i blot; Figur 1B). Dernest har vi sjekket om signalet indusert av anti-PP1i antistoff var spesifikk for LIMK2-1 ved hjelp av siRNA rettet mot de tre skjøtes variantene av LIMK2 (figur 1C). I nærvær av LIMK2 siRNA ble det observert en reproduserbar og signifikant reduksjon i interesse gruppen (indikert med en pil i figur 1C) sammenlignet med kontroll forholdene, noe som tyder på at antistoff er spesifikk for LIMK2-1. Etter dette brukte vi anti-PP1i antistoff å oppdage LIMK2-1 i forskjellige cellelinje ekstrakter: HEK-293 (Human embryonale nyreceller), HeLa (Human epitel cervix celler), og C6 (Rat Brain gliacellene celler). Disse cellene forstyrres i lyseringsbufferen med 1% Triton X-100. Ved hjelp av silisiummangan analyse ble LIMK2-1 vist å være Hominidae primater-spesifikk19. Western Blot analyse ved hjelp av anti-PP1i antistoff viste at LIMK2-1 syntes å være uttrykt i HEK-293 og HeLa, men ikke i C6 cellelinjer som forventet fra i silisiummangan studier (figur 1d). Disse eksperimentene ble gjentatt med ulike menneskelige vev, viser at nivåer av LIMK2-1 protein varierte avhengig av vevet: de høyeste nivåene ble funnet i leveren, mindre nivåer i bukspyttkjertel, og den laveste i testikkel og lunge. LIMK2-1 ble ikke synlig i hjernevevet (figur 1e). Vi observerte lavere molekylvekt bånd i alle vevsprøver unntatt leveren, noe som tyder på nedbrytning av det fulle proteinet sannsynligvis på grunn av lyse Rings forholdene i disse kommersielle prøvene (denne lyseringsbufferen inneholder en cocktail av hemmere som ikke er spesifisert på datablad, som kan være mindre effektive enn de mange protease og fosfatase hemmere vi bruker i vår hjemmelaget buffer). Disse dataene viser at humant LIMK2-1 protein er syntetisert og uttrykt annerledes i testet vev.
LIMK2-1 samhandler med sin oppstrøms kinase ROCK
LIMK2-1 homologs, LIMK2a og LIMK2b, har blitt beskrevet som regulert av oppstrøms kinase ROCK. Vi vurderte samspillet mellom LIMK2-1 og ROCK ved hjelp av coimmunoprecipitation eksperimenter. HEK celler var co-transfekterte med vektorer koding cMyc-Tagged ROCK1 og enten en av HA-Tagged versjon av LIMK2 isoformene, eller urelaterte HA-Tagged protein Larp6. Larp6 fungerer som en negativ kontroll, tillater påvisning av ikke-spesifikke interaksjoner. Celler var lysert og anti-HA immunutfelling ble utført. Lysater (hele celle ekstrakter) og immunoprecipitates ble analysert av Western Blot, ved hjelp av anti-HA og anti-cMyc antistoffer. Som avbildet i figur 2 (venstre panel; Lysater), hver av de forskjellige proteiner kodet av transfekterte vektorer er godt uttrykt. De tre isoformene i LIMK2, samt Larp6, er effektivt immunoprecipitated (figur 2, nederste høyre panel; Eluates). I eluates, er ROCK oppdaget og dermed coimmunoprecipitated med de tre isoformene av LIMK2, men ikke med Larp6 (figur 2, øverst til høyre panel; Eluates). Dette viser at ROCK samhandler med de tre isoformene av LIMK2, spesielt med den nylig preget isoformen LIMK2-1. Denne samhandlingen er spesifikk siden den negative kontrollen (Larp6) ikke samhandler med ROCK.
Heri presenterer vi data for immunutfelling som utføres med anti-HA-antistoffer; Imidlertid kan samspillet testes i motsatt retning av immunoprecipitating ROCK med perler bøyd med cMyc antistoffer og analysere eluates med HA antistoffer for å oppdage LIMK coimmunoprecipitation.
Kinase aktivitet
Fosfat-cofilin i intakte celler
Homologs av LIMK2-1, LIMK2a og LIMK2b, har vist seg å phosphorylate cofilin, en utgangen depolymerisation faktor, på sin Serine3. Ved hjelp av et antistoff spesielt rettet mot fosfat-Serine3 av cofilin, studerte vi LIMK2 kinase aktivitet ved å måle nivået av endogene fosfat-cofilin i HEK celler overexpressing en av de LIMK2 isoformene. HEK celler ble transfekterte med vektorer koding enten en av HA-Tagged LIMK2 isoformene, eller tilsvarende tom vektor som en negativ kontroll. Cellene ble lysert, og de forskjellige lysater ble analysert av Western blotting ved hjelp av anti-fosfat-Serine3 cofilin antistoff. Overuttrykte av LIMK2a og LIMK2b indusert en betydelig og reproduserbar økning i fosfat-cofilin nivåer i forhold til kontroll forhold, mens tilstedeværelsen av LIMK2-1 ikke hadde noen merkbar effekt (Figur 3, venstre panel).
Vi gjentok det samme eksperimentet med en C-terminal YFP-Tagged (Yellow fluorescerende protein) versjon av de tre LIMK2-isoformene og en ikke-kodet versjon av LIMK2-1 for å utelukke mulige forstyrrelser fra N-Terminal HA-taggen. Resultatene var identiske med de som ble innhentet med HA-Tagged versjoner av de tre isoformene (Figur 3, høyre panel som viser YFP tagget versjon). Transfeksjoner effektivitet ble vurdert for den YFP-kodede versjonen av LIMK isoformene ved hjelp av flyt-flowcytometri for å utelukke at dette resultatet kan ha vært på grunn av forskjell i protein uttrykk. De tre isoformene viste tilsvarende transfeksjoner effektivitet: 54% for LIMK2-1, 49% for LIMK2b og 43% for LIMK2b.
In vitro kinase tester
Vi studerte deretter den kinase aktiviteten til LIMK2-isoformene ved in vitro-merking med γ [32P] ATP. Figur 4a viser den generelle ordningen med denne in vitro-merkingen. HEK celler ble transfekterte med enten en av HA-Tagged versjoner av LIMK2 isoformene eller urelaterte protein, Larp6, som ble brukt som en negativ kontroll. Den kinase aktiviteten til anti-HA immunoprecipitates ble målt ved hjelp av rekombinant GST-cofilin som et substrat i nærvær av γ [32P] ATP. HA-immunoprecipitated Larp6 viste ingen kinase aktivitet på cofilin. HA-immunoprecipitated LIMK2a og LIMK2b fosforylert cofilin, mens LIMK2-1 ikke (figur 4b). Vi fikk lignende resultater ved hjelp av YFP-Tagged versjoner av de tre isoformene immunoprecipitated med GFP-Trap perler i nærvær av rekombinant cofilin og γ [32P] ATP (figur 4d).
Vi testet om LIMK2-1 ikke hadde noen kinase aktivitet, eller hvis aktiviteten på cofilin ble svekket. Vi gjentok in vitro merking eksperimentet bruker myelin Basic protein (MBP), et effektivt substrat for mange protein kinaser, i stedet for cofilin. Det var en høy bakgrunn signal i kontroll tilstand når analysen ble utført i nærvær av HA-Tagged versjoner: den negative kontrollen, HA-immunoprecipitated Larp6, produserte et sterkt signal om fosforylert MBP, selv om det ikke er en kinase ( Figur 4C). Vi overvant dette problemet ved hjelp av YFP-Tagged versjon av disse proteinene. Under disse forholdene var bakgrunnen i kontrollen (YFP alene) lav, slik at mer spesifikke studier skal gjennomføres. GFP-fanget YFP-LIMK2a, LIMK2b, og LIMK2-1 viste kinase aktivitet mot MBP, selv om aktiviteten til LIMK2-1 var lavere (figur 4d). Imidlertid var LIMK2-1 også mindre effektivt immunoprecipitated under disse forholdene (se Coomassie brilliant Blue (CBB) farging og Western blotting). Således, det tre isoformene viste sammenlignbare aktivitet opp på MBP når fosfat-MBP var normalisert å immunoprecipitated LIMK2 høyder av CBB flekk (skikkelsen 4d, lavere panel). Immunoprecipitates ble også analysert av Western Blot ved hjelp av anti-ROCK antistoffer for å sjekke om aktiviteten på MBP kan skyldes tilstedeværelsen av ROCK, som ville ha vært coimmunoprecipitated med LIMK2s. Vi kunne ikke oppdage noen ROCK signal i LIMK2 immunoprecipitates. Så MBP fosforylering er ikke på grunn av gynge bortsett fra å LIMK2s per se.
Total, disse data viser det LIMK2a og LIMK2b ha lignende aktivitetene opp på cofilin og MBP. Selv LIMK2-1 viser kinase aktivitet mot MBP sammenlignbare med de to andre isoformene, er cofilin ikke et godt substrat for det.
Figur 1: bevis for eksistensen av LIMK2-1 protein. (A) skjematisk diagram av de tre isoformene av menneskelig LIMK2. LIMK2 isoformene er beskrevet i Entrez Gene: LIMK2-1 (NP_ 001026971.1), LIMK2a (NP_ 005560.1), LIMK2b (NP_ 057952.1). De ulike domenene av LIMK2 er vist: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM ' (kortere LIM domene), PDZ (PSD95, Dlg1, zo-1), S/P (Serine proline rik), kinase ' (kortere kinase domene), og PP1i (protein fosfatase 1 hemmende). Sekvensen valgt for anti-PP1i antistoff design er vist i rødt. (B og C) Validering av anti-LIMK2-1-antistoff. (B) HEK-293 celler ble transfekterte med umerkede LIMK2-1 (PCMV-LIMK2-1) eller en av ha-Tagged ISOFORMENE av LIMK2. Lysater ble analysert av vestlige blotting ved hjelp av indikerte antistoffer. (C) HEK-293 celler ble transfekterte enten med LIMK2 siRNA eller kontroll siRNA. Lysater ble analysert av Western Blot. LIMK2-1 er uttrykt i ulike menneskelige cellelinjer (D) og vev (E). HEK-293, HeLa og C6 celler ble forstyrret i 1% Triton-X100 lyseringsbuffer. Vevs ekstrakter ble kjøpt og prøvene derav ble analysert av Western blotting. Dette tallet ble modifisert fra Vallee et al., The biokjemiske Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: De tre isoformene av LIMK2 samhandle med ROCK1. HEK-293 celler var co-transfekterte med cMyc-Tagged ROCK1 og enten en av de tre HA-Tagged LIMK2 isoformene (2-1, 2a, 2b) eller urelaterte protein, Larp6. Lysater og anti-HA immunoprecipitates ble utsatt for vestlig blotting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: LIMK2-1 har ingen kinase aktivitet mot cofilin i intakte celler. HEK-293 celler ble transfekterte med enten en av de tre HA-Tagged LIMK2 isoformene (1, 2a, 2b) eller den tomme foreldrenes vektor, pcDNA3 (venstre panel), eller med enten en av de tre YFP-Tagged LIMK2 isoformene eller YFP alene (høyre panel). Lysater ble utsatt for vestlig blotting. Kvantifisering av forholdet mellom fosfat-cofilin versus cofilin vises i grafen til høyre. Den fosfat-cofilin versus cofilin ratio av mock transfekterte celler ble normalisert til 100. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SE av tre uavhengige eksperimenter. Dette tallet ble modifisert fra Vallee et al., The biokjemiske Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: LIMK2-1 har ingen in vitro kinase aktivitet mot cofilin, selv om det FOSFORYLERER MBP. (A) generell ordning av γ [32P] ATP in vitro merking. (B) LIMK2-1 ikke phosphorylate cofilin in vitro. HEK-293 celler ble transfekterte med enten en av de tre HA-Tagged LIMK2 isoformene (2-1, 2a, 2b) eller en urelaterte HA-Tagged protein, Larp6, som en negativ kontroll. Anti-HA immunoprecipitated proteiner og GST-cofilin ble brukt i kinase analysen. Anti-HA-immunoprecipitates ble også utsatt for anti-HA-proteinimmunoblotting og Coomassie blå farging. (C) ha-Tagged immunutfelling har en sterk bakgrunn signal når MBP brukes som et substrat. HEK-293 celler ble transfekterte med enten en av de tre HA-Tagged LIMK2 isoformene (2-1, 2a, 2b) eller en urelaterte HA-Tagged protein, Larp6, som en negativ kontroll. Anti-HA immunoprecipitated proteiner og MBP ble brukt i kinase analysen. Anti-HA-immunoprecipitates ble også utsatt for anti-HA-proteinimmunoblotting og Coomassie blå farging. (D) de tre LIMK2 isoformene har kinase aktivitet mot myelin grunnleggende protein (MBP). HEK-293 celler ble transfekterte med enten en av de tre YFP-Tagged LIMK2 isoformene (2-1, 2a, 2b) eller YFP alene. Anti-GFP immunoprecipitated LIMK2 isoformene og cofilin eller MBP ble brukt i kinase analysen. Anti-GFP immunoprecipitates ble også utsatt for anti-GFP proteinimmunoblotting og Coomassie blå farging. Kvantifisering av fosfat-cofilin og fosfat-MBP er vist i den nederste grafen. Fosfat-cofilin nivåer oppnådd med anti-GFP immunoprecipitated LIMK2a ble normalisert til 100. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SE av tre uavhengige eksperimenter. Dette tallet ble modifisert fra Vallee et al., The biokjemiske Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri har vi brukt robuste biokjemiske verktøy for å karakterisere på molekylnivå et nytt protein, LIMK2-1, antas å være en kinase basert på sekvensen og på sin homologs, LIMK2a og LIMK2b20.
For det første viste vi eksistensen av LIMK2-1 på protein nivået ved hjelp av Western Blot-analyse med et spesifikt antistoff. Etter dette evaluerte vi sin interaksjon med oppstrøms kinase ROCK1, som er kjent for å regulere LIMK2a og LIMK2b, homologs av LIMK2-1. Til slutt vurderte vi den potensielle kinase aktiviteten til LIMK2-1 gjennom in vitro-γ [32P] ATP-merking og i Cellulo av Western Blot ved hjelp av et bestemt fosfat-antistoff.
Sammensetning av lyseringsbuffer
Når man studerer proteiner for å analysere dem ved Western Blot, er det behov for spesiell forsiktighet når det gjelder lyseringsbuffer sammensetningen. Flere parametre må vurderes: (i) vaskemiddel type og konsentrasjon21, og (II) protease hemmere.
Sammensetningen av lyseringsbufferen må tilpasses til mål proteinet for å lette dens nær komplette oppløseliggjøringen for å trekke den ut så mye som mulig og for å muliggjøre oppdagelsen av Western Blot. For løselige proteiner er milde forhold (f.eks. et mildt vaskemiddel ved lav konsentrasjon) ofte tilstrekkelige til å oppnå dette. For membran proteiner, sterkere forhold er vanligvis ofte nødvendig. Ulike kategorier av vaskemidler finnes: (i) ioniske, som natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), (II) ikke-ioniske som polyetylen-glykol hexadecyl Eter (BRIJ), Triton, octylGlucoside (OG), doDecylMaltoside (DDM), og ( III) zwitterionic som 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (KARER) eller zwittergents. Sterke vaskemidler kan forstyrre interaksjoner og komplekser kan gå tapt. Videre, for immunutfelling eksperimenter, kan antistoffer være følsomme for alvorlige forhold. Tilsvarende enzym aktivitet kan bli forstyrret av tilstedeværelsen av vaskemidler som kan utfolde seg eller denaturere studerte protein. Både typen og mengden av vaskemiddel som brukes kan påvirke egenskapene og aktiviteten til et protein. For noen proteiner tolereres et svært begrenset spekter av konsentrasjon av vaskemiddel for å bevare aktiviteten til proteinet. Under dette området er proteinet fortsatt uløselig, mens over dette spekteret av konsentrasjon, er proteinet ikke lenger aktiv.
Protease-hemmere må tilsettes til lyseringsbufferen for å hindre nedbrytning av mål proteinet ved endogene proteaser. Protease inhibitor cocktails er kommersielt tilgjengelig. De kan brukes som et utgangspunkt for en studie. Hvis det oppdages problemer, kan man vurdere bruken av en blanding av hemmere extemporarily fremstilt fra lager løsninger lagret ved-20 ° c. Disse hemmere må målrette Serine og cystein proteaser. PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluor) er ofte brukt, men det er veldig ustabil i vandig løsning og må legges like før ekstraksjon. Metalloproteases bør også forhindres: metall chelaterande reagenser, for eksempel EDTA (Ethylenedinitrilotetraacetic acid) eller EGTA (etylen glykol-BIS (2-aminoethylether)-Tetraacetic acid), som binder til mg2 +, brukes i dette formålet. For å holde protein i deres fosforylert og dermed aktivert form, er det også anbefalt å legge fosfatase hemmere til lyseringsbuffer. Disse hemmere må målrette alkaliske, syre, Serine, threonin, og tyrosin phosphatases. Det anbefales også å arbeide ved lav temperatur (4 ° c) for å senke hastigheten på proteinolyse.
Målrett mot proteiner
Her fokuserte vi på epitope proteiner. Tags (Flag, HA, cMyc, GFP, etc.) er svært nyttig for å oppdage og rense proteiner, som antistoffer og antistoff koblet perler er kommersielt tilgjengelig og er lett reproduseres materialer. Men størrelsen og plasseringen av taggen må betraktes som dette kan påvirke aktiviteten, lokalisering eller funksjon av målet protein6,7,8. Det er også mulig å arbeide med endogene proteiner. I dette tilfellet må antistoffer som målrettes mot dette bestemte proteinet brukes. De kan være koplet til perler (protein A eller protein G) covalently (kryss-link) eller være inkubert med lysat og deretter med perlene. Når man arbeider med merkede proteiner, hvis gen er uttrykt på en plasmider, er det lett å bytte til en mutert versjon av dette proteinet ved mutagenese av genet. Det er da mulig å arbeide på ulike mutanter å vurdere biologiske funksjoner.
Immunutfelling
Immunutfelling er en meget kraftfull teknikk for å isolere partnere av målet protein5. Sammensetningen av lyseringsbuffer (spesielt vaskemiddel) må være nøye etablert for å bevare interaksjoner (se ovenfor). Det er mulig å oppdage samspillet mellom to identifiserte proteiner. Det kan være endogene proteiner eller overexpressed proteiner. Når proteiner uttrykkes ved lav overflod, kan det være nødvendig å overekspresjon dem for å få sterkere signaler. Omfattende vask av immunoprecipitated perler er nødvendig for å fjerne ikke-spesifikt samspill proteiner eller forurensninger. Før bestemme immunutfelling effektivitet eller co-immunoprecipitated partner tilstedeværelse, er det viktig å kontrollere at de ulike partnerne er godt uttrykt og tilstede i lysat ved å analysere hele cellen lysat eller input brøkdel av Western Blot. Videre, ved hjelp av immunutfelling eksperimenter, er det også mulig å identifisere nye partnere av et mål protein og å isolere nye komplekser. Disse nye partnerne kan identifiseres ved masse massespektrometri.
Slike partnere kan spille en viktig rolle som aktivator av mål proteinet som tillater sin fulle aktivitet for videre biologiske tester. På den annen side kan copurified uønskede proteiner brukes som et argument om at det ikke er en direkte interaksjon mellom to identifiserte partnere, men i stedet at den oppdagede interaksjonen av co-immunutfelling skyldes en annen ukjent partner. I dette konkrete tilfellet, for å være sikker på en direkte samhandling, en annen eksperimentell enhet er nødvendig, for eksempel arbeider med pattedyr proteiner renset fra bakterier.
Kinase aktivitet
Kinase aktivitet kan vurderes av forskjellige teknikker. Heri, fokuserte vi på in vitro analyse av γ [32P] ATP merking og på hele celle ekstrakt analyse av Western Blot ved hjelp av en bestemt fosfat-antistoff. γ [32P] ATP merking er en svært følsom og kvantitativ teknikk som tillater påvisning av svake kinase aktivitet15. Radioaktivitet innlemmelse fra ATP til målet underlaget tillater et direkte mål på enzym aktivitet som skal gjøres. Det er mulig å arbeide med ulike underlag for å vurdere den kinase aktiviteten til studerte protein på ulike mål. Det er også mulig å identifisere aminosyrer avgjørende for kinase aktivitet ved mutere dem når proteinet er overexpressed. Kinase aktivitet krever en divalent som mg2 +, som må være til stede i kinase buffer.
Den største ulempen med denne tilnærmingen er håndtering av radioaktivitet, som krever dedikerte anlegg for eksperimenter og for innsamling av avfall. Alternative metoder finnes, for eksempel fluorescerende eller selvlysende kits som oppdager biprodukter av reaksjonen, for eksempel ADP (adenosin uridindifosfatglukuronosyltransferase)16. Protein fosforylering kan også bli studert av masse massespektrometri, men en større mengde materialer er nødvendig for disse analysene. I vårt tilfelle forsøkte vi å vurdere LIMK2 kinase aktivitet ved hjelp av kapillær elektroforese for å øke vår effektivitet, men dette var dessverre mislykket.
Phosphospecific antistoffer er et ytterligere verktøy for å studere fosforylering av et protein. Bred General anti-fosfat Serine og tyrosin Antistoffene eksisterer, kjøpedyktig anerkjenne fosfat-ser eller fosfat-Tyr av alle protein. I de senere årene har antistoffer rettet mot en spesifikk fosfat av et mål protein blitt mye utviklet og vanligvis de anerkjenner både fosfat gruppen og de omkringliggende aminosyrer. Spesiell forsiktighet er nødvendig når du begynner å arbeide med slike antistoffer, som deres spesifisitet må sjekkes for eksempel med en negativ kontroll, for eksempel målet protein mutert på fosfat området. Når du undersøker en blott med et anti-fosfat antistoff, må blokkerings løsningen ikke være melk, da dette inneholder fosfoproteiner som kan samhandle med antistoff. Storfe serum albumin (BSA) anbefales, og fosfatase hemmere kan tilsettes i blokkering løsning for å hindre fosfat utgivelse. Prøvene skal ikke fryses og tint, men fremstilles som alikvoter som oppbevares ved-80 ° c. Faktisk, fosfat modifikasjoner er labilt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av La Ligue contre Le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, og la Région Centre Val de Loire. Mange takk til Aurélie Cosson og Déborah Casas for flyt flowcytometri data, og til Keyron Hickman-Lewis for grundig korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for γ[32P] labeling |
| γ[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for γ[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for γ[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for γ[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al.
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
