Summary
Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.
Abstract
Geniş tüm genom sıralamasının birçok potansiyel protein sağlayan pek çok açık okuma çerçeveleri (ORFs) belirledi. Bu proteinlerin hücre için önemli rolleri olabilir ve yeni hücresel süreçleri çözebilir. Proteinler arasında, kinazlar, hücre sinyalizasyon yollarına ait olduğu ve hücre büyümesi, bölünme, farklılaşma, motilite ve ölüm gibi hücrenin kaderi için önemli olan birçok işlemi açma veya kapama yeteneğine sahip olduğu için önemli aktörlerdir.
Bu çalışmada, yeni bir potansiyel kinaz proteini, LIMK2-1 üzerinde duruldu. Biz Batı Blot tarafından belirli bir antikor kullanarak varlığını göstermiştir. Biz koimmünoprecipitation deneyler kullanarak upstream düzenleyen protein ile etkileşimi değerlendirdi. Coimmünoprecipitation iki hedef proteinleri arasındaki etkileşimi algılamak mümkün olan çok güçlü bir tekniktir. Ayrıca bir yem proteini yeni ortakları algılamak için kullanılabilir. Yem protein ya kendi sırasına yönelik bir etiket veya özellikle onu hedefleyen bir antikor yoluyla arındırılmış olabilir. Bu protein kompleksleri daha sonra SDS-PAGE (sodyum Dodecyl sülfat Poliakrilamid jel) ile ayrılabilir ve kütle spektrometresi kullanılarak tespit edilebilir. İmmunoprecip, LIMK2-1 de onun kinaz aktivitesini test etmek için kullanıldı in vitro tarafından γ [32P] ATP etiketleme. Bu iyi kurulan tahlil birçok farklı substratlar kullanabilirsiniz, ve yem mutasyonlu sürümleri belirli kalıntıları rolünü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin hem son derece hassas hem de nicel olduğundan farmakolojik ajanların etkileri de değerlendirilebilir. Yine de, radyoaktivite işleme özellikle dikkatli gerektirir. Kinaz aktivitesi de değiştirilmiş amino asit Fosfo grubunu hedefleyen spesifik antikorlar ile değerlendirilebilir. Bu tür antikorlar tüm fosho değiştirilmiş kalıntıları için ticari olarak mevcut değildir.
Introduction
Onlarca yıl boyunca, çok sayıda sinyalizasyon yolları aydınlatılamamıştır ve hücre bölünmesi, farklılaşma, motilite, programlanmış hücre ölümü, bağışıklık ve Nörobiyoloji gibi önemli hücresel süreçlere katılımı gösterildi. Kinazlar, bu sinyal yollarında, aktivasyon veya inaktivasyonunu genellikle ince olarak düzenleyen ve dış uyaranlara1,2,3yanıt veren geçici çok yönlü kompleksleri bir parçası olarak önemli bir rol oynamaktadır. Mutasyon ve kinazlar disregülasyon genellikle insanlarda hastalıklara yol, ve bu nedenle son 40 yıl içinde en önemli uyuşturucu hedefleri biri haline gelmiştir4.
Bu bağlamda, upstream regülatörleri veya aşağı alt substratlar ile kinaz etkileşimi tespit etmek ve yeni ortakları tespit edebilmek için önemlidir. Yakınlık arıtma ve immünoprecipitation protein kompleksleri yalıtımı için çok güçlü tekniklerdir5. Yem protein veya kinaz belirli bir peptit dizisi ile kovalently peptit hedefleyen antikorlar ile birleştiğinde ticari boncuk kullanımına izin etiketli olabilir. Bu malzeme deneyler6,7,8yüksek bir yeniden üretilebilirliği izin verir. Endojen proteinleri de doğrudan yem protein hedefleyen antikorlar kullanarak immünoprecip, olabilir. Antikorlar protein A veya protein G agaroz boncuklar çapraz bağlantılı olabilir ya da sadece lysate eklemeden önce bu boncuklar ile inkübe. Liziz tamponları, etkileşimi kaybetmeden protein çözünmesine izin vermek ve protein bozulmasını önlemek için optimize edilmelidir. Bu yaklaşımın büyük bir dezavantajı, etkileşimin hücre lizisi üzerine algılanması; Bu nedenle, geçici veya zayıf etkileşimler, alt hücre bağlamı gerektiren ile birlikte cevapsız olabilir. Diğer teknikler, Proximity ligasyon tahlil (PLA)9, In vivo çapraz bağlama destekli benzeşme arıtma (xap)10, Bioluminescence rezonans enerji transferi (Bret) veya Förster rezonans enerjisi gibi doğrudan hücrede çalışmak için kullanılabilir Transfer (fret)11,12. Ayrıca, immünoplikoterapi, yüzey plasmon rezonans, Isothermal titrasyon kalorimetri veya Microscale Thermophoresis gibi fiziksel tekniklerin gerekli olduğu bağlayıcı termodinamik sabitler belirlemek için uygun değildir 13,14.
Kinaz aktivitesi birden fazla teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, fosho spesifik antikorlar üzerinde duruldu ve in vitro γ [32P] ATP (adenozin trifosfat) etiketleme. Phospho spesifik antikorlar bir protein içinde belirli bir kalıntı fosfat modifikasyonu hedef. Onlar Batı Blot veya ELISA kullanılabilir (enzim bağlantılı Immünosorbent assay) hücre lizis sonra, immünhistokimya, ve aynı zamanda akış sitometri veya immünofluorescence kullanarak bozulmamış hücreler üzerinde. Bunların dezavantajları, hedef proteinin mutasyona uğramış bir versiyonunu kullanarak değerlendirilebilen ve tüm proteinler için ticari olarak kullanılmaması açısından özgüllük eksikliği içerebilir. In vitro γ [32P] ATP etiketleme çok sağlam, iyi kurulmuş ve son derece hassas bir yöntemdir15. İmmunopmanite veya rekombinant proteinler kullanılabilir ve farklı substratlar test edilebilir. Bu yöntem nicel olduğu için ilaçların etkileri de değerlendirilebilir. Büyük dezavantajı, yaklaşım ile ilişkili radyoaktivite dikkatli işleme gerektirir. Floresan veya ışıldayan peptid substratların ölçümüne dayalı ve fosforilasyon üzerine değiştirilmiş floresan/ışıldayan özelliklerinden yararlanarak alternatif yöntemler de mümkündür. Bu tür yöntemler de, örneğin, hedef kinaz potansiyel inhibitörleri olabilir moleküllerin taramasında gerekli olan yüksek verim, izin verir. Gerçekten de, kinazlar ilaç şirketleri tarafından izlenen uyuşturucu hedefleri en büyük sınıflarından birini temsil16.
Bu çalışmada LIMK2-1 proteini (LIMK2-1 Lin11, Isle1, Mec3 kinase izoformu 2-1) üzerinde duruldu. LIMK2 kinaz proteini ilk olarak 199517' de tanımlanmıştır. LIMK2 üç izoformlarının alternatif birleştirme tarafından üretilir: LIMK2a, LIMK2b ve LIMK2-1. Şu anda, LIMK2-1 sadece tek bir çalışmada18mRNA düzeyinde açıklanmıştır. Burada, bu potansiyel yeni kinaz proteini moleküler düzeyde güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak karakterize ediyoruz. Öncelikle, LIMK2-1 ' in gerçekten sentezlenmiş olduğunu gösteriyoruz. Onun iki karşı benzer, LIMK2a ve LIMK2b, upstream kinaz ROCK ile etkileşime girer (Rho-ilişkili protein kinaz). Biz LIMK2-1 myelin temel protein (MBP) üzerinde bir kinaz aktivite olduğunu göstermek, ama cofilin değil, LIM kinazlar ve kurallı substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transfeksiyon için hücre hazırlığı
DIKKAT: hücre kültürünün tüm adımlarının özel bir laboratuvarda gerçekleştirilmesi gerekir ve hücreler sınıf 2 mikrobiyolojik kabine içinde manipüle edilir.
- Tohum HEK-293 (Insan embriyonik böbrek) Ø 10 cm plaklarda 10 mL DMEM (Dulbecco 'nun modifiye Eagles Medium) hücrelerinde% 10 fetal buzağı serumu ile desteklenmektedir. Kültür 3 ila 5 gün altında 5% CO2, at 37 °c, hücreler ulaşıncaya kadar ~ 90% Confluence.
- Plastik plakalara hücre yapışmasını artırmak için kollajen R ile Ø 10 cm tabakaları tedavi edin.
- Kollajen R bir çözeltisi 5 mL ekleyin, 200-Fold bir Ø 10 cm plaka fosfat tuzlu tampon (PBS) seyreltilmiş. Sıvıyı plakanın tüm yüzeyine bindirin.
- Biyogüvenlik kabininde en az 1 saat oda sıcaklığında inküye yapın.
- Kollajen çözümünü çıkarın ve atın. 5 mL PBS ekleyin, tüm plakanın yüzeyine yayın, çıkarın ve atın. Bu yıkama bir kez tekrarlayın.
- Ekle 8 DMEM mL 10% fetal buzağı serumu ile tamamlayıcı. Hazırlanmış plakaları Biyogüvenlik dolabı içinde saklayın.
- Biyogüvenlik kabine içinde adım 1,1 HEK-293 plakaları alın. Plakalardan orta çıkarın ve özel bir çamaşır suyu çöp içinde atın. Ek DMEM 2 mL ekleyin ve 1 mL mikropipet akışını kullanarak onları ayırmak için hücreleri temizlemek, köpük yapma önlemek için özen.
- Bir 15 mL tüp hücreleri toplayın ve 4 mL tamamlayıcı DMEM ekleyin. 3 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak 10 mL 'Lik pipet ile homojenleştirin.
- Bu hücre çözeltisi 2 mL alın ve adım 1.2.4 tamamlayıcı DMEM içeren kollajen tedavi plakaları ekleyin.
- % 5 CO2 ve 37 °c ' de kuluçvanda 24 saat büyütün. Transfeksiyon sırasında hücreler% 50-80 konfluent olmalıdır.
2. geçici transfeksiyonlar
- Plakalardan orta çıkarın, özel bir çamaşır suyu çöp atmak, ve taze tamamlayıcı DMEM 10 mL ekleyin. Transfeksiyon karışımı hazırlarken, plakaları 37 °C ' de kuluçlmaya geri koyun.
- 15 mL 'Lik bir tüpte, 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA 450 μL (Tris, Tris (hydroxymethyl) aminomethane ve etylenedinitrilotetraacetic asit için EDTA) çözeltisi ve 2,5 M CaCl2 çözeltisi 50 μL 'dir. İnversion ile karıştırın.
- Özel Plasmid ile dönüştürülmüş bir bakteri sıvı kültürü üzerinde bir midi preparat hazırlanan 10 μg plasmik DNA (Deokbüribonükleik asit) ekleyin. İnversion ile karıştırın.
- Bir girdap üzerinde pürüzsüz ajitasyon altında, eklemek 500 μL BES tamponlu tuz 2x konsantre (kompozisyon: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na2HPO4, 0,27 g/l; BES, n-bis (2-hidroksiil) -2-aminoetesulfonik asit, N, N-bis (2-hidroksiilil) Taurin) yavaşça damla ile düşecek.
- Biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında en az 15 dakika (45 dk. kadar) inküye yapın. Girdap yapmayın, karıştırmayın! Borular çok dikkatle DNA ve kalsiyum fosfat arasındaki karmaşık oluşumu rahatsız etmek değil taşıyın.
- 2,1 adımından plakayı emniyet kabinine götürün. DNA kompleksini çok dikkatli bir şekilde ekleyin, damlaya göre bırakın, plakanın yüzeyinin her yerinden hücrelere yerleştirin.
- 37 °C ' de kuluçlatıcında 24 ila 72 saat boyunca Inküye yapın. Genellikle maksimum protein ifadesi 48 saat içinde ulaşılır.
3. Lysis
Not: buz üzerinde çalışma ve protein bozulması önlemek için soğuk tamponlar ile.
- Liziz tamponu hazırlayın: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Sodyum pirofosfat, 1 mM na3VO4, 20 mm p-nitrofenil fosfat, 20 mm β-gliserofosfat, 10 μg/ml aprotinin, 0,05 μg/ml okaidik asit , 1 μg/mL leupeptin ve 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluorid). Her nakil plakası için yaklaşık 4 mL liziz tamponu gereklidir.
- Taşıyıcı hücrelerden nakli olan plakaları çıkarın. Onları buz üzerine koy.
Not: Bu adımda, "normal" bir tezgah üzerinde çalışmak mümkündür. - Medyayı çıkarın ve özel bir çamaşır suyu çöp kutusuna atın.
- 3 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın: nakledilmiş hücreleri ayırma önlemek için damla tarafından plaka damlası tarafında 3 mL PBS ekleyin, plakanın yüzeyine yayılmış, PBS kaldırmak ve atmak; Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Sonunda, bir sonraki adım için lizis tampon seyreltme önlemek için plaka eğerek PBS geri kalanı dikkatle kaldırın.
- Nakledilmiş yıkanmış hücrelere 500 μL soğuk liziz tamponu ekleyin. Her şeyi plakanın yüzeyine yayın.
- Buz üzerinde 10 dakika boyunca inküye. Zaman zaman (en az iki kez), tampon plaka yüzeyinin her yerinde yeniden yayılır.
- Hücreleri hurda ve bir mikrosantrifüj tüp içinde toplamak.
- 10.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjü.
- Yeni bir mikrosantrifüj tüpte süpernatant toplayın. Bu kesir lysate (tüm hücre ekstresi) karşılık gelir. Hücre membranı enkaz karşılık Pelet atın.
- Bu kesir bir kısım yeni bir mikrosantrifüj tüp toplamak (yaklaşık 50 μL). Bu kesir "Toplam kesir" veya "hücre lysate" veya "tüm hücre ekstresi" transfekte proteinler Batı Blot tarafından ifade edilir olup olmadığını analiz izin karşılık gelir.
Not: Bu noktada, örnekler doğrudan Western blot analizleri için kullanılabilir. Laemmli tampon, 5 dakika boyunca 95 °C ' de ısıtılan, 5 dakika boyunca 10.000 x g 'de santrifüçlü ve uygun SDS sayfasına yüklenmiş olan örneğe eklenmelidir. Örnekler de-80 °C ' de depolanabilir.
4. immünopaperasyonu
- Hafifçe pelletini agaroz boncuk uygun antikor ile birleştiğinde: ha (insan grip hemagglutinin), bayrak, veya GFP (yeşil floresan protein) pürüzsüz inversion tarafından.
- Boncuk ucu girmesine izin vermek için bir mikropipet 200 μL ucunun sonunu kesin. Boncuk doğru hacim almak için emin olmak için ucu doyurmak için birkaç kez boncuk yukarı ve aşağı pipet.
- 40 bir mikrosantrifüj tüpünde boncuk μL alın.
- Ekle 500 μL TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) tampon. İnversion ile karıştırın. 1.000 x g 'de 4 °c ' de 2 dakika Santrifüjü. Dikkatle süpernatant kaldırın ve atın. 500 μL TENET ekleyin. Dönen bir tekerlekten 4 °C ' de en az 1 saat boyunca inküye yapın.
Not: TENET bu pre-inkübasyon adım özel olmayan etkileşimleri azaltmak ve böylece arka plan sinyalini azaltmak için izin verir. - 500 μL lizis tampon ile boncukları iki kez yıkayın.
- 4 °C ' de 1.000 x g 'de Santrifüjü 2 dak.
- Dikkatle süpernatant tampon kaldırın ve atın.
Not: Bu yıkama adımları sırasında boncuk Aspire değil dikkat edin. - 500 μL lizis arabelleği ekleyin. Tüp ters çevirme ile homojenize.
- 4.5.1-4.5.3 arasındaki adımları yineleyin.
- 1.000 x g 'de 4 °c ' de 2 dakika Santrifüjü. Dikkatle süpernatant tampon kaldırmak ve atın.
- Geri dönen bir tekerlek üzerinde 4 °C ' de 2 ila 4 saat için 3,9 adımından lysate ile boncuklar inkübe.
- İmmünopmanite edilen boncukları yıkayın.
Not: Bu noktada, immunoprecip, boncuk lizis tampon ile beş kez yıkanabilir ve sonra laemmli tampon ile elüe. Batı Blot analizlerinde veya-80 °C ' de depolanabilir. Alternatif olarak, boncuklar lizis tampon ile iki kez yıkanabilir ve sonra 3 kez kinaz tampon ile γ [32P] ATP etiketleme gerçekleştirmek için.
5. coimmunooprecipitation analizleri
- Imiz tamponu ile adım 4,7 immünoprecip, boncuk yıkayın.
- 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
- Dikkatle supernatant kaldırmak ve atın.
- 500 μL lizis arabelleği ekleyin. Tüp ters çevirme ile homojenize.
- Dört kez 5.1.1-5.1.3 arasındaki adımları yineleyin.
- Elüsyon
- 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
- Dikkatle supernatant kaldırmak ve atın. Boncuk aspirasyonu önlemek ve süpernatant atmak için bir Hamilton şırınga ile süpernatant son damla çıkarın.
- Eklemek 40 μL-in 4X Laemmli tampon (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% gliserol, 0,5 M β-mercaptoetanol, 0,02% bromophenol mavi). Hafifçe tüp dokunarak homojenize.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
- 10.000 x g 'de oda sıcaklığında 5 dk Santrifüjü.
- Bir Hamilton şırınga ile, süpernatant çıkarın ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içinde toplamak. Bu kesir,-80 °C ' de depolanabilir veya Batı Blot tarafından doğrudan analiz edilen "eluate" e karşılık gelir.
6. kinase tahlil
- Kinaz tamponunu hazırlayın: 50 mM HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES 4-(2-hidroksiilil) -1-piperazineethanesulfonik asit), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2,5mm MNCL2, 50 mm NAF, 1 mm na3VO4, 20 mm β-glisofosfat, 1 μg/ml leupeptin ve 1 mM PMSF. Yaklaşık 2 ml kinaz tampon her immünopresipitasyon durumu için gereklidir.
- 500 μL lizis tampon ile iki kez adım 4,7 immunoprecip, boncuk yıkayın.
- 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
- Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. 500 μL lizis arabelleği ekleyin. İnversion tarafından homojenize.
- Adım 6.2.1 ve 6.2.2 yineleyin.
- 500 μL kinaz tamponu ile üç kez immünopmanite boncukları yıkayın.
- 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
- Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. 500 μL kinaz arabelleği ekleyin. İnversion tarafından homojenize.
- 6.3.1 ve 6.3.2 iki kez adımları yineleyin.
- 4 °C ' de soğutulmuş santrifüjde 2 dk 1.000 x g 'de Santrifüjü.
- Dikkatle supernatant kaldırmak ve atmak. Boncuk aspirasyonu önlemek ve süpernatant atmak için bir Hamilton şırınga ile süpernatant son damla çıkarın.
- İmmunoprecip, boncuklar için 40 μL kinaz tampon ekleyin. Hafifçe tüp dokunarak boncuk resuspend.
- İçin mix hazırlayın γ [32P] ATP etiketleme (son hacim 22,5 μL, kinaz tampon ile komple) güvenli bir kilit-tüp.
- 22,5 μL son hacmine ulaşmak için gerekli kinaz tampon hacmini ekleyin.
- Bir mikropipet 20 μL ucunun sonunu kesin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme tarafından adım 6,6 immunoprecip, boncuk resuspend. Bu boncukların 10 μL ' sini güvenli kilit tüpüne toplayın.
- 50 mM final konsantrasyonuna ulaşmak için 10 μM stokta ATP ekleyin. Tedavi numunesi sayısına göre, kinaz tamponunun ATP stok çözeltisi bir seyreltme hacmi doğru olduğundan emin olmak için, 1 ila 2 μL pipet izin önerilir.
- 2,5 μg substrat (cofilin veya myelin temel protein, MBP mevcut çalışma durumunda) ekleyin.
- Reaksiyonu başlatmak için 5 Μcı γ [32P] ATP (3.000 ci/mmol) ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
DIKKAT: Bu noktadan Itibaren, çalışma, dikkatli önlemler, özel korumaları ve uygun kontroller (radyoaktif kalkanları, Geiger sayacı, spesifik atık toplama, kişisel meme ile radyoaktivite manipülasyonları için adanmış bir güvenlik yerinde yapılmalıdır ve parmak rozetleri radyoaktif pozlama, filtre ipuçları) algılamak için. - 30 °C ' de 20 dakika boyunca inkübe.
- 6 μL 5x Laemmli tampon ile reaksiyonu durdurun.
- 95 ° C 'de ısı 5 dk.
- Oda sıcaklığında 5 dakika 10.000 x g Santrifüjü.
- SDS SAYFASıNA yükleyin. Geçiş işlemine devam edin.
Not: ücretsiz γ [32P] ATP ön hattı göç tankının kontaminasyonunu önlemek için jel çıkmaması dikkat edin. - Jeli oda sıcaklığında lekeleyin.
- Jeli cam plakalardan çıkarın.
- Oda sıcaklığında suda üç banyo ile devam edin.
- Oda sıcaklığında Coomassie mavi ile jel gece leke.
- Oda sıcaklığında su ile çeşitli yıkama banyoları ile jel destain.
- Jel plastik wrap ile sarın.
- Bir gece veya daha fazla bir fosforör ekranında açığa.
- Etiketli bantları algılamak için bir fosforör üzerinde ekranı okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LIMK2-1 protein sentezlenmiş
LIMK2-1 databanks belirtilmiştir, ancak şimdiye kadar sadece bir kağıt onun mRNA18varlığını göstermiştir. İki homolog ile karşılaştırıldığında, LIMK2a ve LIMK2b, LIMK2-1 protein fosfataz 1 Inhibitör etki alanı (PP1i) olarak tanımlanan ekstra bir C-Terminal etki alanı vardır. Biz bu alan bir peptit hedefleyen bir antikor tasarladık, amino asitler 671-684 (Şekil 1a).
İnsan proteini veritabanlarına karşı BLAST araştırması, sadece bir protein, PHI-1 (fosfataz holoenzim inhibitörü 1), bu 12 amino asit dizisi ile güçlü bir dizi benzerlik olduğunu gösterdi. Ancak, PHI-1, SDS-PAGE jelleri üzerinde 23 kDa, uzak LIMK2-1, hangi 75 kDa civarında göç bekleniyor (yani, iki müdahale olmamalıdır) içinde göç eder. Biz ilk HEK-293 hücreleri LIMK2-1, LIMK2a veya LIMK2b ile transfekte bu antikor doğrulanmış ve anti-PP1i antikor transfekte LIMK2-1 (pcmv-LIMK2-1) ve ha-Tagged LIMK2-1 tanımak başardı gösterdi, ama çapraz-tepki vermedi transfekte ha-Tagged LIMK2a veya LIMK2b (Şekil 1B). LIMK2 izoformlarının (Anti-PP1i Blot bir ok ile gösterilir) ha-etiketlenmiş versiyonları ile transfekte HEK hücrelerde endojen LIMK2-1 bir grup gözlenen; Şekil 1B). İkincisi, biz sinyal Anti-PP1i antikor tarafından indüklenen olup olmadığını kontrol LIMK2-1 siRNA LIMK2 üç spliced türevleri hedefleme kullanarak (Şekil 1C). LIMK2 siRNA varlığında, ilgi bandında tekrarlanabilir ve önemli bir azalma gözlendi ( Şekil 1C'de bir oka göre belirtilir) kontrol koşullarına kıyasla, ANTIKOR LIMK2-1 ' e özeldir. Bunun ardından, Anti-PP1i antikor farklı hücre hattı özler LIMK2-1 algılamak için kullanılan: HEK-293 (Insan embriyonik böbrek hücreleri), HeLa (Insan epitelyal serviks hücreleri), ve C6 (Rat Brain glial hücreler). Bu hücreler,% 1 Triton X-100 içeren liziz tamponunun içinde kesintiye uğratıldı. Silico analizinde kullanma, LIMK2-1 Hominidae primat özgü19olarak gösterildi. Anti-PP1i antikor kullanarak Western blot Analizi LIMK2-1 HEK-293 ve HeLa ifade edildiğini gösterdi ama C6 hücre hatları silico çalışmalarda beklendiği gibi (Şekil 1D). Bu deneyler çeşitli insan dokularıyla tekrarlanan, LIMK2-1 protein seviyeleri doku bağlı olarak çeşitli gösteren: en yüksek seviyeleri karaciğer bulundu, pankreas daha az seviyeleri, ve testis ve akciğer en düşük. LIMK2-1 beyin dokusunda algılanabilir değildi (Şekil 1E). Biz karaciğer dışında tüm doku örneklerinde düşük moleküler ağırlık bantları gözlenen, muhtemelen bu ticari numunelerin lizis koşulları nedeniyle tam proteinin bozulması düşündürmektedir (Bu lizis tampon belirtilmemiştir inhibitörleri bir kokteyl içerir Veri sayfası, bizim ev yapımı tampon kullanarak çok sayıda proteaz ve fosfataz inhibitörleri daha az verimli olabilir). Bu veriler insan LIMK2-1 proteininin sentezlenmiş olduğunu ve test edilen dokularda farklı ifade edildiğini göstermektedir.
LIMK2-1, upstream kinaz Rock ile etkileşime girer
LIMK2-1 homolog, LIMK2a ve LIMK2b, upstream kinaz Rock tarafından düzenlenmiş olarak tanımlanmıştır. Biz coimmünoprecipitation deneyler kullanarak ROCK ile LIMK2-1 etkileşimi değerlendirildi. HEK hücreleri cMyc-Tagged ROCK1 ve ya LIMK2 isoformlar ya da alakasız HA-Tagged protein Larp6 bir HA-Tagged sürümü kodlamalı vektörler ile Co transfected edildi. Larp6, spesifik olmayan etkileşimlerin algılanmasını izin vererek negatif bir kontrol görevi görür. Hücreleri lysed ve anti-HA immünoprecipitation yapılmıştır. Lysates (tüm hücre özler) ve immünoprecipitates Batı Blot tarafından analiz edildi, Anti-HA ve anti-cMyc antikorları kullanarak. Şekil 2 ' de tasvir edilen (sol paneller; Lysates), her farklı proteinler transfekte vektörler tarafından kodlanmış iyi ifade edilir. LIMK2 üç izoformlarının yanı sıra Larp6, verimli immunoprecip, (Şekil 2, alt sağ panel; Kaçmaktadır). Eluates, rock tespit edilir ve böylece LIMK2 üç izoformlarının ile coimmunoprecip, ama Larp6 ile değil (Şekil 2, üst sağ panel; Kaçmaktadır). Bu, özellikle yeni karakterize izoformu LIMK2-1 ile rock LIMK2 üç izoformlarının ile etkileşime gösterir. Negatif kontrol (Larp6) ROCK ile etkileşime girmiyorsa bu etkileşim özeldir.
Burada, Anti-HA antikorları ile yapılan immünoplikitasyon için veri sunuyoruz; Bununla birlikte, etkileşim, cMyc antikorları ile konjuli boncuk ile immunoprecipitating kaya tarafından ters yönde test edilebilir ve LIMK coimmünoprecipitation algılamak için HA antikorları ile analiz eluates.
Kinase etkinliği
Phospho-cofilin bozulmamış hücrelerde
LIMK2-1, LIMK2a ve LIMK2b homologlarını, Serine3 üzerinde bir aktin depolitasyon faktörü olan fosforylate cofilin gösterildi. Özellikle cofilin phospho-Serine3 hedefleyen bir antikor kullanarak, HEK hücrelerinde LIMK2 isoforms birini aşırı ifade endojen phospho-cofilin seviyesini ölçerek LIMK2 kinaz aktivite okudu. HEK hücreleri, ha-Tagged LIMK2 isoforms ya da negatif kontrol olarak karşılık gelen boş vektör ya bir kodlama vektörler ile transfekte edildi. Hücreler lysed ve farklı endoglikozidazları Anti-phospho-Serine3 cofilin antikor kullanarak Batı blotting tarafından analiz edildi. LIMK2a ve LIMK2b ekspresyonu fosho-cofilin seviyeleri kontrol koşullarına göre önemli ve tekrarlanabilir bir artış indüklenen, LIMK2-1 varlığı algılanamayan etkisi vardı ise (Şekil 3, sol panel).
Biz C-Terminal YFP-Tagged (Sarı floresan protein) sürümü üç LIMK2 izoformlarının ve LIMK2-1 bir etiketsiz sürümü ile aynı deney tekrarlanan N-terminal ha etiketi tarafından olası girişim dışarı kural. Sonuçlar üç izoformlarının (Şekil 3, sağ panel YFP etiketli sürümünü gösteren) ha-Tagged sürümleri kullanılarak elde edilen aynı oldu. Transfeksiyon verimliliği, bu sonucun protein ifadesinin farkından kaynaklanabilecek olduğunu ifade etmek için Akış sitometrisi kullanarak LıMK isoformlarının YFP-Tagged sürümü için değerlendirildi. Üç isoformlar benzer transfeksiyon verimliliği gösterdi: 54 için LIMK2-1, 49% LIMK2b ve 43% LIMK2b için.
In vitro kinaz testleri
Daha sonra LIMK2 isoformlarının kinaz aktivitesini γ [32P] ATP ile in vitro etiketleme ile okudu. Şekil 4A bu in vitro etiketleme genel düzenini gösterir. HEK hücreleri ya LIMK2 izoformlarının ya da ilgisiz protein, Larp6, negatif kontrol olarak kullanılan bir ha-Tagged sürümlerinden biri ile transfekte edildi. Anti-HA immunoprecipitates kinaz aktivitesi γ [32P] ATP varlığında bir substrat olarak rekombinant GST-cofilin kullanılarak ölçülmüştür. HA-immunoprecip, Larp6 cofilin üzerinde hiçbir kinaz aktivite gösterdi. HA-immunoprecip, LIMK2a ve LIMK2b fosforile cofilin, LIMK2-1 değildi ise (Şekil 4b). Biz, rekombinant cofilin ve γ [32P] ATP (Şekil 4d) varlığına Gfp-Trap boncuklar ile immunoprecipitite üç izoformlarının YFP-Tagged sürümlerini kullanarak benzer sonuçlar elde.
Daha sonra LIMK2-1 ' in hiçbir kinaz aktivitesi olup olmadığını ya da cofilin üzerindeki aktivitesinin bozulmadığını test ettik. Biz myelin temel protein kullanarak in vitro etiketleme deneyi tekrarladık (MBP), çok sayıda protein kinazlar için verimli bir substrat, yerine cofilin. Tahlil HA-etiketli sürümleri varlığını gerçekleştirildiğinde kontrol durumunda yüksek bir arka plan sinyali vardı: negatif kontrol, HA-ımmunoprecip, Larp6, fosforilated MBP güçlü bir sinyal üretilen, bir kinaz olmasa da ( Şekil 4C). Bu proteinlerin YFP-Tagged versiyonunu kullanarak bu sorunu üstesinden geldik. Bu koşullarda, denetimdeki arka plan (tek başına YFP) düşük, daha spesifik çalışmalar gerçekleştirilmesine izin. GFP-tuzaklı YFP-LIMK2a, LIMK2b, ve LIMK2-1 MBP doğru kinaz aktivite gösterdi, ancak LIMK2-1 aktivitesi düşük (Şekil 4d). Ancak, LIMK2-1 de daha az verimli bu koşullarda immünoprecip, (Coomassie Brilliant Blue (CBB) boyama ve Batı blotting bakın). Böylece, üç izoformlarının MBP üzerinde karşılaştırılabilir aktivite gösterdi ne zaman phospho-MBP immünoprecip, LIMK2 seviyeleri CBB boyama tarafından normalleştirilmiş (Şekil 4d, alt panel). İmmunoprecipitates de Batı Blot tarafından anti-ROCK antikorları kullanarak analiz edildi MBP üzerinde faaliyet ROCK varlığı nedeniyle olabilir kontrol etmek için, hangi LIMK2s ile coimmunoprecip, olurdu. Biz LIMK2 immunoprecipitates herhangi bir kaya sinyali tespit olamazdı. Yani MBP fosforilasyon ROCK nedeniyle değil LIMK2s per se.
Genel olarak, bu veriler LIMK2a ve LIMK2b cofilin ve MBP üzerinde benzer faaliyetler olduğunu göstermektedir. LIMK2-1 MBP karşı kinaz aktivite gösterir rağmen diğer iki isoforms karşılaştırılabilir, cofilin bunun için iyi bir substrat değildir.
Şekil 1: LIMK2-1 proteininin varlığı Için kanıtlar. (A) insan LIMK2 üç izoformlarının Şematik diyagramı. LIMK2 isoformlar Entrez gene 'de açıklanmıştır: LIMK2-1 (NP_ 001026971.1), LIMK2a (NP_ 005560.1), LIMK2b (NP_ 057952.1). LIMK2 çeşitli etki alanları gösterilir: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM ' (kısa LIM etki), PDZ (PSD95, Dlg1, zo-1), S/P (serine Proline zengin), kinaz ' (kısa kinaz etki), ve PP1i (protein fosfataz 1 inhibitör). Anti-PP1i antikor tasarımı için seçilen sıra kırmızı renkte gösterilir. (B ve C) Anti-LIMK2-1 antikor doğrulama. (B) hek-293 hücreleri ETIKETSIZ LIMK2-1 (PCMV-LIMK2-1) veya LIMK2 ' nın ha-etiketli isoformlarından biri ile transferleştirdi. Lysates Batı blotting tarafından belirtilen antikorlar kullanılarak analiz edildi. (C) HEK-293 hücreleri LIMK2 siRNA veya kontrol siRNA ile nakledildi. Lysates Batı Blot tarafından analiz edildi. LIMK2-1, çeşitli insan hücresi hatları (D) ve dokularda (E) ifade edilir. HEK-293, HeLa ve C6 hücreleri% 1 Triton-X100 liziz tamponunun içinde bozulmuş. Doku ekstraları satın alındı ve örnekleri Batı blotting tarafından analiz edildi. Bu rakam Vallee ve ark., biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: LIMK2 üç izoformlarının rock1 ile etkileşime. HEK-293 hücreleri cmyc-Tagged rock1 ve ya üç ha-Tagged LIMK2 izoformlarının (2-1, 2A, 2B) ya da ilgisiz protein, Larp6 ile Co-nakli edildi. Lysates ve anti-HA immunoprecipitates Batı blotting maruz kalmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: LIMK2-1, bozulmamış hücrelerde cofilin yönünde hiçbir kinaz aktivitesi yoktur. HEK-293 hücreler ya üç ha-Tagged LIMK2 izoformlarının (1, 2A, 2B) ya da boş ebeveyn vektörü, pcDNA3 (sol panel), ya da üç YFP-Tagged LIMK2 izoformlarının veya YFP tek başına (sağ panel) ile transfekte edildi. Lysates Batı blotting maruz kalmıştır. Fosho-cofilin karşı cofilin oranını ölçmek sağdaki grafikte gösterilir. Yalancı transfif hücrelerin fosho-cofilin karşı cofilin oranı 100 için normale döndü. Her değer üç bağımsız deneylerin ortalama ± SE değerini temsil eder. Bu rakam Vallee ve ark., biochemical Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: LIMK2-1 cofilin 'e doğru hiçbir in vitro kinaz aktivitesi yoktur, ancak MBP fosforlanan. (A) genel şeması γ [32P] ATP in vitro etiketleme. (B) LIMK2-1, fosforylate cofilin içinde vitro değildir. HEK-293 hücreler ya üç ha-Tagged LIMK2 izoformlarının (2-1, 2A, 2B) ya da ilgisiz bir ha-etiketli protein, Larp6, negatif bir kontrol olarak transfekte edildi. Kinaz testinde Anti-HA immünopmantibi proteinler ve GST-cofilin kullanılmıştır. Anti-HA immunoprecipitates de anti-HA İmmünoblotting ve Coomassie mavi boyama maruz kaldı. (C) ha-etiketli immünoprecipitation MBP bir substrat olarak kullanıldığında güçlü bir arka plan sinyali vardır. HEK-293 hücreler ya üç ha-Tagged LIMK2 izoformlarının (2-1, 2A, 2B) ya da ilgisiz bir ha-etiketli protein, Larp6, negatif bir kontrol olarak transfekte edildi. Kinaz testinde Anti-HA immünopmantibi proteinler ve MBP kullanılmıştır. Anti-HA immunoprecipitates de anti-HA İmmünoblotting ve Coomassie mavi boyama maruz kaldı. (D) üç LIMK2 izoformlarının myelin temel protein (MBP) doğru kinaz aktivite var. HEK-293 hücreler üç YFP Tagged LIMK2 izoformlarının (2-1, 2A, 2B) ya da tek başına YFP ile transfekte edildi. Kinaz testinde Anti-GFP immünopmanite LIMK2 isoformlar ve cofilin veya MBP kullanılmıştır. Anti-GFP immunoprecipitates de anti-GFP İmmünoblotting ve Coomassie mavi boyama maruz kaldı. Fosho-cofilin ve phospho-MBP miktarında alt grafikte gösterilir. Phospho-cofilin seviyeleri ile elde edilen anti-GFP immunoprecip, LIMK2a normalleştirilmiş 100. Her değer üç bağımsız deneylerin ortalama ± SE değerini temsil eder. Bu rakam Vallee ve ark., biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, moleküler düzeyde yeni bir protein olan LIMK2-1 ' e göre, dizisine ve homologlarında, LIMK2a ve LIMK2b20' ye dayanan bir kinaz olduğuna inanılan sağlam biyokimyasal araçlar kullandık.
Öncelikle, biz belirli bir antikor ile Batı Blot analizi kullanarak protein düzeyinde LIMK2-1 varlığını göstermiştir. Bunun ardından, LIMK2-1 homologlarını LIMK2a ve LIMK2b düzenleyen bilinen upstream kinaz rock1 ile etkileşimi değerlendirildi. Son olarak, LIMK2-1 ' i s vitro γ [32P] ATP etiketleme ve belirli bir fosho-antikor kullanarak Batı Blot tarafından selülit içinde potansiyel kinaz aktivitesini değerlendirdik.
Lysis tampon kompozisyon
Batı Blot tarafından onları analiz etmek için proteinleri okurken, özel bakım liziz tampon kompozisyon açısından gereklidir. Çeşitli parametreler dikkate alınmalıdır: (i) deterjan tipi ve konsantrasyon21, ve (ii) proteaz inhibitörleri.
Lizis tampon kompozisyon mümkün olduğunca ayıklamak ve Batı Blot tarafından tespiti için izin vermek için onun yakın tam çözünme kolaylaştırmak için hedef protein adapte edilmelidir. Çözünür proteinler için, hafif koşullar (örneğin, düşük konsantrasyonda hafif bir deterjan) bunu başarmak için genellikle yeterlidir. Membran proteinleri için daha güçlü koşullar genellikle gereklidir. Deterjanlar farklı kategoriler var: (ı) sodyum Dodesil sülfat (SDS), cetyltrimethylammonium bromür (CTAB), (II) Polietilen glikol hexadecyl eter (Brij), Triton, octylglukoz (OG), dodecylmaltoside (DDM) gibi iyonik olmayan (ı) İyonik ve ( III) Zwitteriyonik gibi 3-[(3-cholayidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (Chaps) veya zwitterbaylar. Güçlü deterjanlar etkileşimleri ve kompleksler kaybolabilir bozabilir. Dahası, immünopresipitasyon deneyler için, antikorlar ciddi koşullara duyarlı olabilir. Benzer şekilde, enzim aktivitesi, araştırılmış proteini açığa çıkabilir veya denebilir deterjanlar varlığı ile rahatsız olabilir. Kullanılan deterjan tipi ve miktarı, bir proteinin özelliklerini ve etkinliğini etkileyebilmektedir. Bazı proteinler için, proteinin aktivitesini korumak için çok kısıtlı bir deterjan konsantrasyonu tolere edilir. Bu aralığın altında protein çözünmez kalır, ancak bu konsantrasyon aralığının üstünde, protein artık aktif değildir.
Endojen proteinler tarafından hedef protein bozulması önlemek için liziz tampona proteaz inhibitörleri eklenmesi gerekir. Proteaz inhibitörü kokteylleri ticari olarak mevcuttur. Bir çalışmanın başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Sorunlara rastlandığı takdirde,-20 °C ' de saklanan stok çözümlerinden oluşan inhibitörlerin karışımı kullanımı göz önünde bulundurulabilir. Bu inhibitörler serin ve sistein proteazları hedef gerekir. PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluorid) yaygın olarak kullanılır, ancak sulu çözelti çok kararsız ve ekstraksiyon hemen önce eklenmesi gerekir. Metalloproteazlar da inhibitör olmalıdır: metal şelat reaktifler, örneğin EDTA (etilen glikol-bis (2-aminoetylether)-Tetraacetic asit), hangi bind mg2 +, bu amaçla kullanılır. Proteini fosforilated ve böylece aktif formda tutmak için, ayrıca liziz tampona fosfataz inhibitörleri eklemenizi tavsiye edilir. Bu inhibitörler alkalin, asit, serin, threonin ve Tirozin fosfatazlar hedef gerekir. Proteoliz hızını yavaşlatmak için düşük sıcaklıkta (4 °C) çalışma da önerilir.
Hedef proteinler
Burada, epitope etiketli proteinlere odaklandık. Etiketler (bayrak, ha, cmyc, Gfp, vb) tespit ve proteinleri arındırmak için çok yararlıdır, antikorlar ve antikor birleştiğinde boncuklar ticari olarak mevcuttur ve kolayca tekrarlanabilir malzemelerdir. Ancak, boyut ve etiket konumu bu etkinlik, yerelleştirme veya hedef protein6,7,8işlevini etkileyebilir olarak dikkate alınmalıdır. Endojen proteinlerle çalışmak da mümkündür. Bu durumda, bu belirli proteini hedefleyen antikorlar kullanılmalıdır. Onlar boncuklar (protein A veya protein G) kovalently (Cross-link) ya da lysate ve sonra boncuklar ile inkütesli olabilir birleştiğinde olabilir. Gen bir Plasmid üzerinde ifade edilen etiketli proteinler ile çalışırken, bu proteinin mutasyona uğramış bir sürümüne genin Mutagenezi ile geçmek kolaydır. Daha sonra biyolojik fonksiyonları değerlendirmek için farklı mutantlar üzerinde çalışmak mümkündür.
İmmünopresipitasyon
Imantioprecipitation hedef protein ortakları izole etmek için çok güçlü bir tekniktir5. Lizis tamponun bileşimi (özellikle deterjan) etkileşimleri korumak için dikkatle kurulmalıdır (yukarıya bakın). Tanımlanan iki protein arasındaki etkileşimi algılamak mümkündür. Endojen proteinleri veya aşırı ifade edilen proteinler olabilir. Proteinlerin düşük bolluk olarak ifade edildiğinde, daha güçlü sinyaller için onları overexpress gerekli olabilir. Özellikle etkileşimsiz proteinleri veya kontaminantları kaldırmak için immünopmanite edilen boncuk geniş yıkımlarda gereklidir. Önce immünopresipitasyon verimliliği veya Co-immunoprecip, ortak varlığı belirlenmesi, farklı ortaklar iyi ifade edilir ve tüm hücre lysate veya Batı tarafından giriş fraksiyonu analiz ederek lysate mevcut kontrol etmek önemlidir Leke. Ayrıca, immünopresipitasyon deneyler kullanarak, bir hedef protein yeni ortakları belirlemek ve yeni kompleksleri izole etmek de mümkündür. Bu yeni ortaklar kütle spektrometresi ile tanımlanabilir.
Bu tür ortaklar, daha fazla biyolojik testler için tam etkinliğini sağlayan hedef proteinin aktibiyörleri olarak önemli bir rol oynayabilirler. Öte yandan, copurified istenmeyen proteinler bir argüman olarak iki tanımlanan ortaklar arasında doğrudan bir etkileşim değildir, ancak bunun yerine Co-immünoprecipitation tarafından algılanan etkileşim başka bir bilinmeyen ortak nedeniyle kullanılabilir olabilir. Bu özel durumda, doğrudan etkileşimden emin olmak için, bakterilerden arındırılmış mammalin proteinleri üzerinde çalışmak gibi başka bir deneysel cihaz gereklidir.
Kinase etkinliği
Kinase aktivitesi farklı tekniklerle değerlendirilebilir. Burada, biz in vitro analiz tarafından γ [32P] ATP etiketleme ve belirli bir fosho-antikor kullanarak Batı Blot tarafından tüm hücre özü Analizi odaklı. γ [32P] ATP etiketleme, zayıf kinaz aktivitesinin algılanmasını sağlayan çok hassas ve nicel bir tekniktir15. ATP 'den hedef substrat 'a radyoaktivite eklenmesi, doğrudan enzim aktivitesinin yapılması için bir tedbir sağlar. Farklı hedefleri üzerinde okudu protein kinaz etkinliğini değerlendirmek için farklı substratlar ile çalışmak mümkündür. Protein aşırı ifade edildiğinde onları mutasyon tarafından kinaz aktivite için önemli amino asitler tanımlamak da mümkündür. Kinaz aktivitesi, kinaz tamponunun içinde bulunmak zorunda olan mg2 +gibi bir divalent kıt gerektirir.
Bu yaklaşımın önemli dezavantajı, deneyler için özel tesisler ve atıkların toplanması için gerekli olan radyoaktivitenin işlenmesi. Örneğin ADP (adenozin difosfat)16gibi reaksiyonda yan ürünleri algılayan floresan veya Işıksaçan setleri gibi alternatif yöntemler var. Protein fosforilasyon da kütle spektrometresi tarafından incelenebilir, ancak bu analizler için daha büyük miktarda malzeme gereklidir. Bizim durumumuzda, biz verimliliğinizi artırmak için kapiller Elektroforez kullanarak LIMK2 kinaz etkinliğini değerlendirmek için çalıştık ama bu maalesef başarısız oldu.
Fosforöz antikorlar, bir proteinin fosforilasyon incelemek için bir başka araçtır. Geniş genel Anti-phospho serine ve Tirozin antikorlar var, herhangi bir protein phospho-ser veya phospho-Tyr tanımak mümkün. Son yıllarda, bir hedef protein belirli bir fosho-site hedefleyen antikorlar yaygın olarak geliştirilmiştir ve genellikle fosho grubu ve çevreleyen amino asitler hem de tanıyacaktır. Bu tür antikorlar ile çalışmaya başladıktan sonra özel bakım gereklidir, örneğin fosho sitesinde mutasyona uğramış hedef protein gibi negatif bir kontrol ile kendi özgüllüğü kontrol edilmelidir. Bir anti-phospho antikor ile bir leke yoklama zaman, bu antikor ile etkileşime girebilir fosfoproteinler içerir gibi engelleme çözümü, süt olmamalıdır. Sığır serum albumin (BSA) tavsiye edilir ve fosfataz inhibitörleri, fosfat salınımı önlemek için engelleme çözeltisi eklenebilir. Numuneler dondurulmuş ve çözülmüş olmamalıdır, ancak-80 °c ' de tutulan plakaya olarak hazırlanmıştır. Nitekim, Fosfo modifikasyonları vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma la Ligue contre le Cancer, l 'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen ve La Région Centre Val de Loire tarafından destekleniyordu. Akış sitometri verileri için Aurélie Cosson ve Déborah Casas ve el yazması tam redaksiyon için keyron Hickman-Lewis çok teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for γ[32P] labeling |
| γ[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for γ[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for γ[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for γ[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al.
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
