Summary
Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].
Abstract
L'ampio sequenziamento dell'intero genoma ha identificato molti Open Reading Frame (ORF) che forniscono molte potenziali proteine. Queste proteine possono avere ruoli importanti per la cellula e possono svelare nuovi processi cellulari. Tra le proteine, le chinasi sono i principali attori in quanto appartengono ai percorsi di segnalazione cellulare e hanno la capacità di attivare o disattivare molti processi cruciali per il destino della cellula, come la crescita cellulare, la divisione, la differenziazione, la motilità e la morte.
In questo studio, ci siamo concentrati su una nuova potenziale proteina della chinasi, LIMK2-1. Abbiamo dimostrato la sua esistenza da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico. Abbiamo valutato la sua interazione con una proteina a monte che regola utilizzando esperimenti di coimmunoprecipitazioni. La coimmunoprecipitazione è una tecnica molto potente in grado di rilevare l'interazione tra due proteine bersaglio. Può anche essere utilizzato per rilevare nuovi partner di una proteina esca. La proteina esca può essere purificata tramite un tag progettato alla sua sequenza o tramite un anticorpo che la ridestina specificamente. Questi complessi proteici possono quindi essere separati da SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) e identificati utilizzando la spettrometria di massa. Immunoprecipitato LIMK2-1 è stato utilizzato anche per testare la sua attività di chinasi in vitro da z[32P] ETICHETTAtura ATP. Questo saggio ben consolidato può utilizzare molti substrati diversi, e versioni mutate dell'esca possono essere utilizzate per valutare il ruolo di residui specifici. Gli effetti degli agenti farmacologici possono anche essere valutati poiché questa tecnica è sia altamente sensibile che quantitativa. Ciò nonostante, la manipolazione della radioattività richiede particolare cautela. L'attività della chinasi può anche essere valutata con anticorpi specifici che prendono di mira il gruppo di fosforo dell'amminoacido modificato. Questi tipi di anticorpi non sono disponibili in commercio per tutti i residui modificati al fosforo.
Introduction
Per molti decenni, sono state chiarite numerose vie di segnalazione e il loro coinvolgimento in processi cellulari cruciali come la divisione cellulare, la differenziazione, la motilità, la morte cellulare programmata, l'immunità e la neurobiologia, è stato dimostrato. Le chinasi svolgono un ruolo significativo in questi percorsi di segnalazione in quanto spesso regolano finemente la loro attivazione o inattivazione e fanno parte di complessi versatili transitori che rispondono agli stimoli esterni1,2,3. La mutazione e la disregolazione delle chinasi spesso portano a malattie nell'uomo, e quindi sono diventate uno dei più importanti obiettivi farmacologici negli ultimi quarant'anni4.
In questo contesto, è importante essere in grado di rilevare l'interazione della chinasi con le loro autorità di regolamentazione a monte o conto rizzate a valle e identificare nuovi partner. La purificazione dell'affinità e l'immunoprecipitazioni sono tecniche molto potenti per l'isolamento dei complessi proteici5. La proteina o chinasi dell'esca può essere etichettata con una specifica sequenza di peptidi che consente l'uso di perline commerciali accoppiate covalentmente con anticorpi che colpiscono il peptide. Questo materiale permette un'elevata riproducibilità negli esperimenti6,7,8. Le proteine endogene possono anche essere immunoprecipitate utilizzando anticorpi che colpiscono direttamente la proteina esca. Gli anticorpi possono essere collegati in modo incrociato alle perle proteiche A o Agarose proteiche o semplicemente incubati con queste perline prima di aggiungere il lisato. I buffer di lisi devono essere ottimizzati per consentire la solubilità delle proteine senza perdere l'interazione ed evitare la degradazione delle proteine. Uno svantaggio principale di questo approccio è che l'interazione viene rilevata sulla lisi cellulare; pertanto, le interazioni transitorie o deboli, insieme a quelle che richiedono il contesto subcellulare possono essere perse. Altre tecniche possono essere utilizzate per lavorare direttamente nella cella come Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) o F Trasferimento (FRET)11,12. Inoltre, l'immunoprecipitazioni non è appropriata per determinare le costanti termodinamiche dell'attacco, per le quali sono necessarie tecniche fisiche come la risonanza del Plasmona di superficie, la calorimetria della frequenza isotermale o la termofore microscala 13,14.
L'attività della chinasi può essere valutata utilizzando più tecniche. Qui, ci siamo concentrati sugli anticorpi specifici per il fosforo e in vitro:[32P] ATP (Adenosine TriPhosphate) etichettatura. Gli anticorpi specifici per il fosforo prendono di mira la modifica del fosfato di un particolare residuo all'interno di una proteina. Possono essere utilizzati in Western Blot o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dopo la lisi cellulare, per l'immunohistochimica, e anche su cellule intatte utilizzando citometria di flusso o immunofluorescenza. I loro inconvenienti possono includere la loro mancanza di specificità, che può essere valutata utilizzando una versione mutata della proteina bersaglio, e non sono disponibili commercialmente per tutte le proteine. L'etichettaturaATP in vitro[32 P] è un metodo molto robusto, consolidato e altamente sensibile15. Possono essere utilizzate proteine immunoprecipitate o ricombinanti e possono essere testati diversi substrati. Gli effetti delle droghe possono anche essere valutati in quanto questo metodo è quantitativo. Il suo principale inconveniente è che la radioattività associata all'approccio richiede una gestione con cautela. Sono possibili anche metodi alternativi basati sulla misurazione dei substrati peptidi fluorescenti o luminescenti e sfruttando le proprietà fluorescenti/luminescenti alterate al fosforo. Tali metodi consentono anche un'elevata produttività, che è necessaria, ad esempio, nello screening di molecole che possono essere potenziali inibitori della chinasi bersaglio. Infatti, le chinasi rappresentano una delle più grandi classi di bersagli farmacologici perseguiti dalle aziende farmaceutiche16.
In questo studio, ci siamo concentrati sulla proteina LIMK2-1 (LIMK2-1 sta per Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). La proteina della chinasi LIMK2 è stata descritta per la prima volta nel 199517. Tre isoformi di LIMK2 sono prodotti da giunzioni alternative: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Attualmente, LIMK2-1 è stato descritto solo a livello di mRNA in un singolo studio18. Qui, caratterizziamo questa potenziale nuova proteina della chinasi a livello molecolare usando approcci biochimici robusti. In primo luogo, dimostriamo che LIMK2-1 è effettivamente sintetizzato. Simile alle sue due controparti, LIMK2a e LIMK2b, interagisce con la chinasi a monte ROCK (chinasi proteica associata a Rho). Mostriamo che LIMK2-1 ha un'attività di chinasi sulle proteine di base mielina (MBP), ma non sulla cofilina, il substrato canonico delle chinasi LIM.
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Protocol
1. Preparazione cellulare per la trasfezione
DESTRA: Tutti i passi della coltura cellulare devono essere eseguiti in un laboratorio dedicato e le cellule vengono manipolate all'interno di un mobile microbiologico di classe 2.
- Cellule di semi HEK-293 (Rene embrionale umano) in piastre da 10 cm in 10 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) completate con siero di vitello fetale al 10%. Coltura per 3-5 giornisotto il 5% di CO 2, a 37 gradi centigradi, fino a raggiungere il 90% di confluenza.
- Trattare le lastre di 10 cm con il collagene R per aumentare l'adesione cellulare alle piastre di plastica.
- Aggiungere 5 mL di una soluzione di Collagen R, 200 volte diluita in Fosfato Saline Buffer (PBS) in una piastra di 10 cm. Sovrapporre il liquido su tutta la superficie della piastra.
- Incubare a temperatura ambiente per almeno 1 h all'interno dell'armadio di biosicurezza.
- Rimuovere la soluzione di collagene e scartarla. Aggiungere 5 mL di PBS, stenderlo su tutta la superficie della piastra, rimuoverlo e scartarlo. Ripetere questo lavaggio una volta.
- Aggiungere 8 mL di DMEM integrato con 10% siero di vitello fetale. Mantenere le piastre preparate all'interno dell'armadio di biosicurezza.
- Prendere le piastre HEK-293 dal punto 1.1 all'interno dell'armadio di biosicurezza. Togliere il mezzo dai piatti e scartarlo in un cestino candeggina dedicato. Aggiungere 2 mL di DMEM integrato e scovare le cellule per staccarle utilizzando il flusso di una micropipetta da 1 mL, avendo cura di evitare di produrre schiuma.
- Raccogliere le celle in un tubo da 15 mL e aggiungere 4 mL di DMEM integrato. Omogeneizzare con una pipetta da 10 mL, pipettando su e giù 3 volte.
- Prendere 2 mL di questa soluzione cellulare e aggiungerli a piatti trattati con collagene contenenti DMEM integrati dal passaggio 1.2.4.
- Crescere per 24 ore in incubatrice al 5% di CO2 e 37 gradi centigradi. Le cellule devono essere 50-80% confluente al momento della trasfezione.
2. Trafetti transitori
- Rimuovere il mezzo dalle piastre, scartarlo in un cestino candeggina dedicato e aggiungere 10 mL di DMEM fresco integrato. Rimettere le piastre nell'incubatrice a 37 gradi centigradi mentre si prepara la miscela di trasfezione.
- In un tubo da 15 mL, aggiungere 450 gradi di una soluzione di 10 m Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris sta per Tris(idxymethyl)aminomethane, e EDTA per l'acido etiletilinitrilotetraacetica) e 50 -L di una soluzione CaCl2 da 2,5 M. Mescolare per inversione.
- Aggiungere 10 g di DNA plasmidico (acido deossiribonucleico) preparati da una preparazione midi su una coltura liquida di batteri trasformati con il plasmide dedicato. Mescolare per inversione.
- Sotto agitazione liscia su un vortice, aggiungere 500 L di BES tampomato concentrato salina 2x (composizione: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16.0 g/L, Na2HPO4, 0.27 g/L; BES è l'acronimo di N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurina) lentamente goccia dopo goccia.
- Incubare per almeno 15 min (fino a 45 min) a temperatura ambiente all'interno dell'armadio di biosicurezza. Non vortice, non mescolare! Spostare i tubi con molta attenzione per non disturbare la formazione complessa tra DNA e fosfato di calcio.
- Portare le piastre dal punto 2.1 all'armadietto di sicurezza. Aggiungere i complessi di DNA con molta attenzione, goccia dopo goccia, sulle cellule su tutta la superficie della piastra.
- Incubare per 24-72 ore in incubatrice a 37 gradi centigradi. Di solito la massima espressione proteica viene raggiunta entro 48 ore.
3. Lisi
NOTA: Lavorare sul ghiaccio e con tamponi freddi per prevenire la degradazione delle proteine.
- Preparare il buffer di lisi: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM di sodio pirofosfato, 1 mM 4 VO4, 20 mM p-nitrophenyl fosfato, 20 mM -glycerofosfato, 10 g/mL aprotinin, 0.05 acido/mL okadic , 1 legaeptina g/mL e 1 mM PMSF (fluoruro di fenilmethylsulfonyl). Per ogni piastra trastratta sono necessari circa 4 mL di tampone di lisi.
- Rimuovere le piastre con cellule trasfette dall'incubatrice. Mettili sul ghiaccio.
NOTA: Da questo passaggio, è possibile lavorare su una panca "normale". - Rimuovere il supporto e eliminarlo in un cestino candeggina dedicato.
- Lavare due volte con 3 mL di PBS freddo: aggiungere 3 mL di PBS sul lato della piastra cadere a goccia per evitare di staccare le cellule trasfette, diffondersi su tutta la superficie della piastra, rimuovere PBS e scartarlo; ripetere questo passaggio ancora una volta. Alla fine, rimuovere con attenzione il resto del PBS inclinando la piastra per evitare la diluizione del tampone di lisi per la fase successiva.
- Aggiungere 500 l di lisi fredda tampone sulle cellule lavate trasinate. Stendere su tutta la superficie della piastra.
- Incubare per 10 min sul ghiaccio. Di tanto in tanto (almeno due volte), stendere nuovamente il buffer su tutta la superficie della piastra.
- Raschiare le cellule e raccoglierle in un tubo di microcentrismo.
- Centrifuga per 10 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi.
- Raccogliere supernatali in un nuovo tubo di microcentrifuga. Questa frazione corrisponde al lisato (estratto di cella intera). Scartare il pellet che corrisponde ai detriti della membrana cellulare.
- Raccogliere un'aliquota di questa frazione in un nuovo tubo di microcentrifuga (circa 50 -L). Questa frazione corrisponde alla "frazione TOTALE" o "Cell Lysate" o "Whole Cell Extract" permettendo l'analisi se le proteine trasfette sono espresse da Blot occidentale.
NOTA: A questo punto, i campioni possono essere utilizzati direttamente per le analisi Western Blot. Il buffer Laemmli deve essere aggiunto al campione, che viene poi riscaldato a 95 gradi centigradi per 5 min, centrifugato a 10.000 x g per 5 min e caricato su SDS-PAGE appropriato. I campioni possono anche essere conservati a -80 gradi centigradi.
4. Immunoprecipitazioni
- Revista delicatamente le perline di agarose accoppiate con l'anticorpo appropriato: HA (Human influenza emagglutinin), Flag, or GFP (Green Fluorescent Protein) per inversione liscia.
- Tagliare la fine di una punta di 200 l'l da una micropipetta per consentire alle perline di entrare nella punta. Pipette le perline su e giù più volte per saturare la punta per garantire di prendere il volume corretto di perline.
- Prendere 40 l di perline in un tubo di microcentrifuga.
- Aggiungere 500 l di TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) buffer. Mescolare per inversione. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione supernatante e scartarlo. Aggiungere 500 l di TENET. Incubare per almeno 1 ora a 4 gradi centigradi su una ruota rotante.
NOTA: questa fase di pre-incubazione in TENET consente di ridurre le interazioni non specifiche e quindi di ridurre il segnale di fondo. - Lavare le perline due volte con 500 l di lis tampone.
- Centrifuga 2 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere con attenzione buffer supernatante, e scartarlo.
NOTA: Non fare attenzione a non aspirare perline durante questi passaggi di lavaggio. - Aggiungere 500 l di buffer di lisi. Omogeneizzare invertendo il tubo.
- Ripetere i passaggi da 4.5.1 a 4.5.3.
- Centrifuga per 2 min a 1.000 x g a 4oC. Rimuovere con attenzione il buffer supernatante e scartarlo.
- Incubare perline con il lisa dal passo 3.9 per 2 a 4 ore a 4 gradi centigradi su una ruota rotante.
- Lavare perline immunoprecipitate.
NOTA: A questo punto, le perle immuno precipitate possono essere lavate cinque volte con il buffer di lisi e quindi eluite con buffer Laemmli. L'eluato può essere utilizzato per l'analisi Western Blot o immagazzinato a -80 gradi centigradi. In alternativa, le perline possono essere lavate due volte con il tampone dilisi e poi tre volte con il tampone di chinasi per eseguire l'etichettatura ATP.
5. Analisi della coimmunoprecipitazioni
- Lavare le perle immunoprecipitate dal punto 4.7 con il tampone di lisi.
- Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo.
- Aggiungere 500 l di buffer di lisi. Omogeneizzare invertendo il tubo.
- Ripetere i passaggi 5.1.1.1-5.1.3 quattro volte.
- Eluizione
- Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Rimuovere le ultime gocce di supernatante con una siringa Hamilton al fine di evitare l'aspirazione delle perline, e scartare il super-attardato.
- Aggiungere 40 l di 4x Laemmli buffer (200 mMM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glicerolo, 0,5 M-mercaptoetanolo, 0,02% blu bromophenolo). Omogeneizzare toccando delicatamente il tubo.
- Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifuga per 5 min a 10.000 x g a temperatura ambiente.
- Con una siringa Hamilton, rimuovere il supernatante e raccoglierlo in un nuovo tubo di microcentrifuga. Questa frazione corrisponde al "Eluate", che può essere immagazzinato a -80 gradi centigradi, o analizzato direttamente da Western Blot.
6. Assay di Kinase
- Preparare il buffer di chinasi: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES sta per 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanethanethanfonic acid), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM MM-glicerofossfato, 1 g/mL leupeptina e 1 mM PMSF. Per ogni condizione di immunoprecipitazioni è necessario circa 2 mL del tampone di chinasi.
- Lavare le perle immunoprecipitate dal punto 4,7 due volte con 500 l di lis tampone.
- Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Aggiungere 500 l di buffer di lisi. Omogeneizzare per inversione.
- Ripetere i passaggi 6.2.1 e 6.2.2.
- Lavare le perle immunoprecipitate tre volte con 500 litri di tampone di chinasi.
- Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Aggiungere 500 l di tampone di chinasi. Omogeneizzare per inversione.
- Ripetere i passaggi 6.3.1 e 6.3.2 due volte.
- Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Rimuovere le ultime gocce di supernatante con una siringa Hamilton al fine di evitare l'aspirazione delle perline, e scartare il super-attardato.
- Aggiungere 40 l di tampone di chinasi alle perline immunoprecipitate. Risospendere le perline toccando delicatamente il tubo.
- Preparare il mix perl'etichettatura ATP (il volume finale è di 22,5 l, completo di cuscinetto di chinasi) in un tubo di blocco sicuro.
- Aggiungere il volume richiesto del buffer di chinasi per raggiungere un volume finale di 22,5 l.
- Tagliare l'estremità di una punta di 20 l di una micropipetta. Risospendere le perline immunoprecipitate dal passaggio 6.6 pipetting su e giù più volte. Raccogliere 10 l di queste perline nel tubo di sicurezza.
- Aggiungere l'ATP da una soluzione di 10 M per raggiungere i 50 mM di concentrazione finale. In base al numero di campioni trattati, viene suggerita una diluizione della soluzione di riserva di ATP nel tampone della chinasi per consentire la pipetta da 1 a 2 - per essere sicuri che il volume sia corretto.
- Aggiungete 2,5 g di substrato (cofilina o proteine di base della mielina, MBP nel caso di studio attuale).
- Aggiungete 5 -Ci di ATP (3.000 Ci/mmol) per avviare la reazione. Mescolare pipetting su e giù lentamente.
AVVISO: Da questo punto, il lavoro deve essere svolto in un luogo di sicurezza dedicato alle manipolazioni della radioattività con cautela precauzione, protezioni dedicate e controlli appropriati (scudi radioattivi, contatore Geiger, raccolta differenziata dei rifiuti, impronte per rilevare l'esposizione radioattiva, le punte dei filtri). - Incubare per 20 min a 30 gradi centigradi.
- Fermare la reazione con 6 l'l di 5x buffer Laemmli.
- Riscaldare a 95o C per 5 minuti.
- Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Caricare su un SDS-PAGE. Procedere alla migrazione.
NOTA: Fare attenzione che la prima linea di libero - [32P] ATP non esce dal gel per evitare la contaminazione del serbatoio di migrazione. - Macchiare il gel a temperatura ambiente.
- Rimuovere il gel dalle lastre di vetro.
- Procedere con tre bagni in acqua a temperatura ambiente.
- Macchiare il gel durante la notte con Coomassie Blue a temperatura ambiente.
- Demacchiare il gel con diversi bagni di lavaggio con acqua a temperatura ambiente.
- Avvolgere il gel con pellicola trasparente.
- Esporre per una notte o più su uno schermo fosforpoimmagine.
- Leggere lo schermo su un fosforoimmagine per rilevare bande etichettate.
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Representative Results
LA proteina LIMK2-1 è sintetizzata
LIMK2-1 è menzionato nelle banche dati, ma finora solo un documento ha dimostrato l'esistenza del suo mRNA18. Rispetto ai suoi due omologhi, LIMK2a e LIMK2b, LIMK2-1 ha un dominio aggiuntivo di terminale C identificato come dominio inibitorio della proteina fosfogio 1 (PP1i). Abbiamo progettato un anticorpo che si rivolge a un peptide di questo dominio, aminoacidi 671-684 (Figura 1A).
La ricerca BLAST contro i database di proteine umane ha dimostrato che solo una proteina, PHI-1 (Phosphatase holoenzyme inhibitor 1), ha una forte somiglianza di sequenza con questa sequenza di 12 amminoacidi. Tuttavia, PHI-1 migra a 23 kDa su gel SDS-PAGE, lontano da LIMK2-1, che si prevede migrerà intorno 75 kDa (cioè, i due non dovrebbero interferire). Abbiamo convalidato questo anticorpo in primo luogo per le cellule HEK-293 trafitte con LIMK2-1, LIMK2a o LIMK2b e abbiamo dimostrato che l'anticorpo anti-PP1i era in grado di riconoscere LIMK2-1 trascurato (pCMV-LIMK2-1) e LIMK2-1 con tag HA, ma non ha reagito trasinfezione di HA LIMK2a o LIMK2b (Figura1B). Abbiamo osservato una banda di LIMK2-1 endogeni nelle cellule HEK trascate con versioni contrassegnate con HA delle isoforme LIMK2 (indicate da una freccia nella macchia anti-PP1i; Figura 1B). In secondo luogo, abbiamo verificato se il segnale indotto dall'anticorpo anti-PP1i fosse specifico di LIMK2-1 usando il siRNA che mirava alle tre varianti spliced di LIMK2 (Figura 1C). In presenza del siRNA LIMK2, è stata osservata una diminuzione riproducibile e significativa della banda di interesse (indicata da una freccia nella Figura 1C) rispetto alle condizioni di controllo, suggerendo che l'anticorpo è specifico di LIMK2-1. In seguito, abbiamo usato l'anticorpo anti-PP1i per rilevare LIMK2-1 in diversi estratti della linea cellulare: HEK-293 (cellule reni embrionali umane), HeLa (cellule cervice epiteliali umane) e C6 (cellule Glial del cervello di ratto). Queste cellule vengono interrotte nel buffer di lisi contenente 1% Triton X-100. Utilizzando nell'analisi in silico, LIMK2-1 ha dimostrato di essere Hominidae primate-specific19. L'analisi Western Blot utilizzando l'anticorpo anti-PP1i ha mostrato che LIMK2-1 sembrava essere espresso in HEK-293 e HeLa, ma non nelle linee cellulari C6 come previsto dagli studi in silico (Figura 1D). Questi esperimenti sono stati ripetuti con vari tessuti umani, dimostrando che i livelli di proteina LIMK2-1 variavano a seconda del tessuto: i livelli più alti sono stati trovati nel fegato, livelli minori nel pancreas, e il più basso nel testicolo e nel polmone. LIMK2-1 non era rilevabile nel tessuto cerebrale (Figura 1E). Abbiamo osservato bande di peso molecolare inferiori in tutti i campioni di tessuto ad eccezione del fegato, suggerendo la degradazione dell'intera proteina probabilmente a causa delle condizioni di lisi di questi campioni commerciali (questo tampone di lisi contiene un cocktail di inibitori non specificati sul scheda tecnica, che può essere meno efficiente dei numerosi inibitori di proteasi e fosfosi che stiamo usando nel nostro buffer fatto in casa). Questi dati mostrano che la proteina umana LIMK2-1 è sintetizzata ed espressa in modo diverso nei tessuti testati.
LIMK2-1 interagisce con la sua chinasi upstream ROCK
Gli omologhi LIMK2-1, LIMK2a e LIMK2b, sono stati descritti come regolamentati dalla chinasi a monte ROCK. Abbiamo valutato l'interazione di LIMK2-1 con ROCK utilizzando esperimenti di coimmunoprecipitazioni. Le cellule HEK sono state co-trascate con vettori che codificavano rock1 con tag cMyc e una delle versioni con tag HA degli isoformi LIMK2 o la proteina Larp6 non correlata con etichetta HA. Larp6 funge da controllo negativo, consentendo il rilevamento di interazioni non specifiche. Le cellule sono state lised ed è stata eseguita l'immunoprecipitazioni anti-HA. Lisati (estratti di cellule intere) e immunoprecipitati sono stati analizzati da Western Blot, usando anticorpi anti-HA e anti-cMyc. Come illustrato nella Figura 2 (pannelli di sinistra; Lisati), ognuna delle diverse proteine codificate dai vettori trasfettati sono ben espresse. I tre isoformi di LIMK2, così come Larp6, sono immunoprecipitati in modo efficiente (Figura 2, pannello in basso a destra; Elua). Negli eluati, ROCK viene rilevato e quindi coimmunoprecipitato con i tre isoformi di LIMK2, ma non con Larp6 (Figura 2, pannello in alto a destra; Elua). Questo dimostra che ROCK interagisce con i tre isoformi di LIMK2, specialmente con la nuova isoforme LIMK2-1. Questa interazione è specifica poiché il controllo negativo (Larp6) non interagisce con ROCK.
Qui, presentiamo i dati per l'immunoprecipitazioni eseguite con anticorpi anti-HA; tuttavia, l'interazione può essere testata nella direzione opposta immunoprecipitando ROCK con perline coniugate con anticorpi cMyc e analizzando gli eluati con anticorpi HA per rilevare la coimmunoprecipitazionazione LIMK.
Attività di Kinase
Fosforo-cofilina in cellule intatte
Gli omologhi di LIMK2-1, LIMK2a e LIMK2b, hanno dimostrato di fosforillacare la cofilina, un fattore di dispolitizzazione dell'atto in apolimerazione, sulla sua Serine3. Utilizzando un anticorpo che prende di mira specificamente il fosfo-Serine3 della cofilina, abbiamo studiato l'attività della chinasi LIMK2 misurando il livello di fosforo-cofilina endogena nelle cellule HEK sovraesprimendo una delle isoformi LIMK2. Le cellule HEK sono state trascate con vettori che codificavano uno degli isoformi LIMK2 con tag HA o il vettore vuoto corrispondente come controllo negativo. Le cellule sono state lismilate, e le diverse listisono sono state analizzate dalla membrana occidentale usando l'anticorpo cofilino anti-phospho-Serine3. La sovraespressione di LIMK2a e LIMK2b ha indotto un aumento significativo e riproducibile dei livelli di fosforo-cofilina rispetto alle condizioni di controllo, mentre la presenza di LIMK2-1 non ha avuto alcun effetto rilevabile (Figura 3, pannello sinistro).
Abbiamo ripetuto lo stesso esperimento con una versione con tag YFP (Yellow Fluorescent Protein) dei tre isoformi LIMK2 e una versione senza tag di LIMK2-1 per escludere possibili interferenze da parte del tag HA N-terminal. I risultati sono stati identici a quelli ottenuti utilizzando le versioni con tag HA dei tre isoformi (Figura3, pannello destro che mostra la versione con tag YFP). L'efficienza della trasfezione è stata valutata per la versione con tag YFP delle isoforme LIMK usando la citometria di flusso per escludere che questo risultato potrebbe essere dovuto alla differenza di espressione proteica. I tre isoformi hanno mostrato un'efficienza di trasfezione simile: 54% per LIMK2-1, 49% per LIMK2b e 43% per LIMK2b.
Test in vitro della chinasi
Abbiamo poi studiato l'attività della chinasi degli isoformi LIMK2 con l'etichettatura in vitro con l'ATP. La figura 4A mostra lo schema generale di questa etichettatura in vitro. Le cellule HEK sono state trascate con una delle versioni contrassegnate con HA degli isoformi LIMK2 o con la proteina non correlata, Larp6, che è stata utilizzata come controllo negativo. L'attività della chinasi degli immunoprecipitati anti-HA è stata misurata utilizzando la GST-cofilinaricombinante come substrato in presenza dell'ATP . Il Larp6 immunoprecipitato dall'HA non ha mostrato alcuna attività di chinasi sulla cofilina. la cofilina con immunoprecipita di HAK2a e LIMK2b, mentre LIMK2-1 non lo ha fatto (Figura4B). Abbiamo ottenuto risultati simili utilizzando versioni con tag YFP delle tre isoforme immunoprecipitate con perline GFP-trapin presenza di cofilina ricombinante e ATP (Figura 4D).
Abbiamo quindi verificato se LIMK2-1 non avesse attività di chinasi o se la sua attività sulla cofilina era compromessa. Abbiamo ripetuto l'esperimento di etichettatura in vitro usando la Myelin Basic Protein (MBP), un substrato efficiente per numerose chinasi proteiche, invece di cofilina. C'era un alto segnale di fondo nella condizione di controllo quando il saggio è stato eseguito in presenza di versioni con etichetta TURA HA: il controllo negativo, Ha-immunoprecipitato Larp6, ha prodotto un forte segnale di MBP fosforato, anche se non è una chinasi ( Figura 4C). Abbiamo superato questo problema utilizzando la versione con etichetta YFP di queste proteine. In queste condizioni, il background nel controllo (solo YFP) era basso, consentendo di condurre studi più specifici. YFP-LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1, intrappolati da GFP, LIMK2b e LIMK2-1 hanno mostrato un'attività di chinasi verso MBP, anche se l'attività di LIMK2-1 era inferiore (Figura 4D). Tuttavia, LIMK2-1 è stato anche meno efficienteimmunoprecipitato in queste condizioni (vedi Coomassie Brilliant Blue (CBB) colorazione e Western Blotting). Pertanto, i tre isoformi hanno mostrato un'attività comparabile su MBP quando il fosforo-MBP è stato normalizzato ai livelli di LIMK2 immunoprecipitati dalla colorazione CBB (Figura 4D, pannello inferiore). Gli immunoprecipitati sono stati analizzati anche da Western Blot usando anticorpi anti-ROCK per verificare se l'attività su MBP potesse essere dovuta alla presenza di ROCK, che sarebbe stato coimmunoprecipitato con i LIMK2. Non siamo riusciti a rilevare alcun segnale ROCK negli immunoprecipitati LIMK2. Quindi la fosfororylazione MBP non è dovuta a ROCK ma a LIMK2s di per sé.
Nel complesso, questi dati mostrano che LIMK2a e LIMK2b hanno attività simili su cofilin e MBP. Anche se LIMK2-1 mostra un'attività della chinasi verso MBP paragonabile a quella degli altri due isoformi, la cofilina non è un buon substrato per esso.
Figura 1: Prove dell'esistenza della proteina LIMK2-1. (A) Diagramma schematico delle tre isoforme dell'uomo LIMK2. Gli isoformi LIMK2 sono descritti in Gene di Entrez: LIMK2-1 (NP_001026971.1), LIMK2a (NP_005560.1), LIMK2b (NP_057952.1). Vengono mostrati i vari domini di LIMK2: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM' (dominio LIM più breve), PD, PD , Dlg1, zo-1), S/P (Serine Proline rich), Kinase' (dominio della china più breve) e PP1i (Protein Phosphatase 1 inibizione). La sequenza scelta per la progettazione dell'anticorpo anti-PP1i è mostrata in rosso. (B e C) Convalida dell'anticorpo anti-LIMK2-1. (B) Le cellule HEK-293 sono state trascate con LIMK2-1 senza tag (pCMV-LIMK2-1) o una delle isoforme con tag HA di LIMK2. I lisati sono stati analizzati dal Western Blotting usando gli anticorpi indicati. (C) Le cellule HEK-293 sono state trascate con siRNA LIMK2 o siRNA di controllo. I lisati sono stati analizzati da Western Blot. LIMK2-1 è espresso in varie linee cellulari umane (D) e tessuti (E). HEK-293, le cellule HeLa e C6 sono state interrotte nel buffer di lisi Triton-X100 dell'1%. Sono stati acquistati estratti di tessuto e i relativi campioni sono stati analizzati mediante Western Blotting. Questa cifra è stata modificata da Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I tre isoformi di LIMK2 interagiscono con ROCK1. Le cellule HEK-293 sono state co-trascate con ROCK1 con tag cMyc e uno dei tre isoformi LIMK2 con etichetta HA (2-1, 2a, 2b) o la proteina non correlata, Larp6. Lisci e immunoprecipitati anti-HA sono stati sottoposti a gonfiore occidentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: LIMK2-1 non ha alcuna attività di chinasi verso la cofilina nelle cellule intatte. Le cellule HEK-293 sono state trascate con uno dei tre isoformi LIMK2 con tag HA (1, 2a, 2b) o il vettore parentale vuoto, pcDNA3 (pannello sinistro), o con uno dei tre isoformi LIMK2 con tag YFP o YFP da solo (pannello destro). I Lisati sono stati sottoposti a gonfiore occidentale. La quantificazione del rapporto tra fosforo-cofilina e cofilina è mostrata nel grafico a destra. Il rapporto fosforo-cofilina contro cofilina delle cellule trasfetate finte è stato normalizzato a 100. Ogni valore rappresenta la media di tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da Vallee et al., The Biochemical Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: LIMK2-1 non ha alcuna attività di chinasi in vitro verso la cofilina, anche se fa fosforilata MBP. (A) Schema generale di s[32 P] ATP in vitro etichettatura. (B) LIMK2-1 non fa fosforiliare la cofilina in vitro. Le cellule HEK-293 sono state trascate con uno dei tre isoformi LIMK2 con etichetta ha (2-1, 2a, 2b) o una proteina con marcatura HA non imparentata, Larp6, come controllo negativo. Le proteine immunoprecipitate anti-HA e la GST-cofilina sono state utilizzate nel saggio della chinasi. Gli immunoprecipitati anti-HA sono stati anche sottoposti a immunoblotting anti-HA e colorazione blu Coomassie. (C) L'immunoprecipitazioni con etichettatura HA ha un forte segnale di fondo quando la MBP viene utilizzata come substrato. Le cellule HEK-293 sono state trascate con uno dei tre isoformi LIMK2 con etichetta ha (2-1, 2a, 2b) o una proteina con marcatura HA non imparentata, Larp6, come controllo negativo. Le proteine immunoprecipitate anti-HA e la MBP sono state utilizzate nel saggio della chinasi. Gli immunoprecipitati anti-HA sono stati anche sottoposti a immunoblotting anti-HA e colorazione blu Coomassie. (D) I tre isoformi LIMK2 hanno un'attività della chinasi verso la proteina di base mielina (MBP). Le cellule HEK-293 sono state trascate con uno dei tre isoformi LIMK2 con tag YFP (2-1, 2a, 2b) o YFP da soli. Gli isoformi LIMK2 immunoprecipitati anti-GFP e la cofilina o MBP sono stati utilizzati nel saggio della chinasi. Gli immunoprecipitati anti-GFP sono stati anche sottoposti a immunoblotting anti-GFP e colorazione blu Coomassie. La quantificazione del fosforo-cofilina e del fosforo-MBP è mostrata nel grafico inferiore. I livelli di fosforo-cofilina ottenuti con LIMK2a immunoprecipitato anti-GFP sono stati normalizzati a 100. Ogni valore rappresenta la media di tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo usato robusti strumenti biochimici per caratterizzare a livello molecolare una nuova proteina, LIMK2-1, che si ritiene sia una chinasi basata sulla sua sequenza e sui suoi omologhi, LIMK2a e LIMK2b20.
In primo luogo, abbiamo dimostrato l'esistenza di LIMK2-1 a livello proteico usando l'analisi Western Blot con un anticorpo specifico. In seguito, abbiamo valutato la sua interazione con la chinasi a monte ROCK1, che è nota per regolare LIMK2a e LIMK2b, gli omologhi di LIMK2-1. Infine, abbiamo valutato la potenziale attività della chinasi di LIMK2-1 attraverso l'etichettatura ATP in vitro [[32P] e in cellulo da Western Blot utilizzando uno specifico fosforo-anticorpo.
Composizione del buffer di lisi
Quando si studiano le proteine per analizzarle da Western Blot, è necessaria una particolare cura per quanto riguarda la composizione del buffer di lisi. Devono essere considerati diversi parametri: (i) tipo di detergente e concentrazione21e (ii) inibitori della proteasi.
La composizione del tampone di lisi deve essere adattata alla proteina bersaglio per facilitarne la solubilizzazione quasi completa al fine di estrarla il più possibile e per consentirne la rilevazione da parte di Western Blot. Per le proteine solubili, le condizioni miti (ad esempio, un detergente delicato a bassa concentrazione) sono spesso sufficienti per raggiungere questo obiettivo. Per le proteine della membrana, in genere sono spesso necessarie condizioni più forti. Esistono diverse categorie di detergenti: (i) ionico, come etere di sodio dodecyl (SDS), bromuro di cetltrimethylliponio (CTAB), (ii) non igienico come Polyethylene glicole hexadecyl (BRIJ), Triton, ottuoso (OG), doDecylMalto (DD), eD iii) zwitterionic come 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) o zwittergents. Detergenti forti possono interrompere le interazioni e complessi possono andare persi. Inoltre, per gli esperimenti di immunoprecipitazioni, gli anticorpi possono essere sensibili a condizioni gravi. Allo stesso modo, l'attività enzimatica può essere disturbata dalla presenza di detergenti che possono dispiegarsi o denaturare la proteina studiata. Sia il tipo che la quantità del detergente utilizzato possono influenzare le proprietà e l'attività di una proteina. Per alcune proteine, una gamma molto limitata di concentrazione di detergenti è tollerata per preservare l'attività della proteina. Al di sotto di questa gamma la proteina rimane insolubile mentre al di sopra di questo intervallo di concentrazione, la proteina non è più attiva.
Gli inibitori della proteasi devono essere aggiunti al buffer di lisi per prevenire la degradazione della proteina bersaglio mediante proteasi endogene. I cocktail inibitori della proteasi sono disponibili in commercio. Possono essere utilizzati come punto di partenza di uno studio. Se si verificano problemi, si può considerare l'uso di una miscela di inibitori estemporaneamente preparati da soluzioni di stock immagazzinate a -20 gradi centigradi. Questi inibitori devono bersagliare proteasi di serini e cisteine. PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoruro) è comunemente usato, tuttavia è molto instabile nella soluzione acquosa e deve essere aggiunto appena prima dell'estrazione. Metalloproteases dovrebbero anche essere inibiti: reagenti di chelating metallico, come EDTA (Ethylenedinitrilotetraacetic acid) o EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-acido tetraacetico), che si legano a Mg2 ,sono utilizzati a questo scopo. Per mantenere le proteine nella loro forma fosforolata e quindi attivata, si raccomanda anche di aggiungere inibitori di fosforasi al buffer di lisi. Questi inibitori devono colpire alcalina, acido, serino, treonina, e tirosina. Si raccomanda inoltre di lavorare a bassa temperatura (4 gradi centigradi) per rallentare il tasso di proteolisi.
Proteine bersaglio
Qui, ci siamo concentrati sulle proteine marcate con epitope. I tag (Flag, HA, cMyc, GFP, ecc.) sono molto utili per rilevare e purificare le proteine, poiché anticorpi e anticorpi sono disponibili in commercio e sono materiali facilmente riproducibili. Tuttavia, le dimensioni e la posizione del tag devono essere considerate in quanto ciò può influenzare l'attività, la localizzazione o la funzione della proteina bersaglio6,7,8. È anche possibile lavorare con proteine endogene. In questo caso, devono essere utilizzati anticorpi mirati a questa particolare proteina. Essi possono essere accoppiati a perline (Protein A o Protein G) in modo covalente (collegamento incrociato) o essere incubato con il lisa e poi con le perline. Quando si lavora con proteine taggate, il cui gene è espresso su un plasmino, è facile passare a una versione mutata di questa proteina per mutagenesi del gene. È quindi possibile lavorare su diversi mutanti per valutare le funzioni biologiche.
Immunoprecipitazione
L'immunoprecipitazioni è una tecnica molto potente per isolare i partner della proteina bersaglio5. La composizione del tampone di lisi (in particolare il detersivo) deve essere attentamente stabilita per preservare le interazioni (vedi sopra). È possibile rilevare l'interazione tra due proteine identificate. Può essere proteine endogene o proteine sovraespresse. Quando le proteine sono espresse a bassa abbondanza, potrebbe essere necessario sovraesprimerle per avere segnali più forti. Per rimuovere proteine o contaminanti non specificamente interagenti sono necessari fustigioni di perline immunoprecipitate. Prima di determinare l'efficienza dell'immunoprecipitazioni o la presenza co-immunoprecipitaziona del partner, è importante verificare che i diversi partner siano ben espressi e presenti nel lisato analizzando l'intera cellula lisato o la frazione di input da parte occidentale macchia. Inoltre, utilizzando esperimenti di immunoprecipitazioni, è anche possibile identificare nuovi partner di una proteina bersaglio e isolare nuovi complessi. Questi nuovi partner possono essere identificati dalla spettrometria di massa.
Tali partner possono svolgere un ruolo importante in quanto attivatori della proteina bersaglio permettendo la sua piena attività per ulteriori test biologici. D'altra parte, le proteine indesiderate copurificate possono essere utilizzate come argomento che non c'è un'interazione diretta tra due partner identificati, ma invece che l'interazione rilevata per co-immunoprecipitazioni è dovuta a un altro partner sconosciuto. In questo caso specifico, per essere sicuri di un'interazione diretta, è necessario un altro dispositivo sperimentale, come lavorare sulle proteine dei mammiferi purificate dai batteri.
Attività di Kinase
L'attività della chinasi può essere valutata con tecniche diverse. Qui, ci siamo concentrati sull'analisiin vitro mediante l'etichettatura ATP di z[32 P] e sull'analisi dell'estratto di cellule intere da Western Blot utilizzando uno specifico fosforo-anticorpo. L'etichettatura ATP è una tecnica molto sensibile e quantitativa che consente di rilevare l'attività della chinasi debole15. L'incorporazione di radioattività dall'ATP al substrato bersaglio consente di fare una misura diretta dell'attività enzimatica. È possibile lavorare con diversi substrati per valutare l'attività della chinasi della proteina studiata su diversi obiettivi. È anche possibile identificare gli amminoacidi cruciali per l'attività della chinasi mutandoli quando la proteina è sovraespressa. L'attività di kinasiana richiede una cation divalente come Mg2, che deve essere presente nel buffer della chinasi.
Il principale svantaggio di questo approccio è la gestione della radioattività, che richiede strutture dedicate per gli esperimenti e per la raccolta dei rifiuti. Esistono metodi alternativi, come i kit fluorescenti o luminescenti che rilevano i sottoprodotti della reazione, come ADP (adenosina difosfato)16. La fosforolante delle proteine può anche essere studiata dalla spettrometria di massa, tuttavia, è necessaria una maggiore quantità di materiali per queste analisi. Nel nostro caso, abbiamo cercato di valutare l'attività della chinasi LIMK2 usando l'elettroforesi capillare per aumentare la nostra efficienza, ma questo è stato purtroppo infruttuoso.
Gli anticorpi fosforici sono un ulteriore strumento per studiare la fosforo lamiera di una proteina. Esistono ampi anticorpi generali antifoso Serino e Tirosofina, in grado di riconoscere fosfo-Ser o fosforo-Tyr di qualsiasi proteina. Negli ultimi anni, gli anticorpi che prendono di mira uno specifico sito di fosforo di una proteina bersaglio sono stati ampiamente sviluppati e di solito riconoscono sia il gruppo del fosforo che gli amminoacidi circostanti. Particolare attenzione è necessaria quando si inizia a lavorare con tali anticorpi, in quanto la loro specificità deve essere controllata ad esempio con un controllo negativo, come la proteina bersaglio mutata sul sito del fosforo. Quando si sonda una macchia con un anticorpo antifoso, la soluzione di blocco non deve essere il latte, in quanto contiene fosforeproteine che possono interagire con l'anticorpo. Si raccomanda l'inibitore del siero bovino (BSA) e gli inibitori del fosfosi possono essere aggiunti nella soluzione di blocco per prevenire il rilascio di fosfato. I campioni non devono essere congelati e scongelati, ma piuttosto preparati come aliquote che sono tenuti a -80 gradi centigradi. In effetti, le modifiche al fosforo sono labiali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen e il Région Centre Val de Loire. Molte grazie ad Aurélie Cosson e Déborah Casas per i dati sulla citometria di flusso, e a Keyron Hickman-Lewis per una lettura approfondita del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for γ[32P] labeling |
| γ[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for γ[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for γ[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for γ[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
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