Summary
Мы охарактеризовали новый белок киназы, используя надежные биохимические подходы: анализ Western Blot с выделенным специфическим антителом на различных клеточных линиях и тканях, взаимодействие экспериментов по коиммунопреции, активность киназы, обнаруженная вестерном Помарка с использованием фосфо-специфических антител и по маркировке АТФ32P.
Abstract
Обширное секвенирование всего генома выявило множество открытых кадров чтения (ORF), предоставляющих много потенциальных белков. Эти белки могут иметь важную роль для клетки и могут распутать новые клеточные процессы. Среди белков, киназы являются основными субъектами, поскольку они принадлежат к клеточной сигнализации путей и имеют возможность включения или выключения многих процессов, имеющих решающее значение для судьбы клетки, таких как рост клеток, деление, дифференциация, подвижность, и смерть.
В этом исследовании мы сосредоточились на новом потенциальном белке киназы, LIMK2-1. Мы продемонстрировали его существование Western Blot с помощью специфического антитела. Мы оценили его взаимодействие с восходящим регуляющим белком с помощью экспериментов по коиммунопреционированию. Coimmunoprecipitation является очень мощным методом, способным обнаружить взаимодействие между двумя белками цели. Он также может быть использован для обнаружения новых партнеров белка приманки. Белок приманки может быть очищен либо с помощью тега инженерии его последовательности или через антитела специально ориентации его. Эти белковые комплексы могут быть разделены SDS-PAGE (Натрий Dodecyl Сульфат Полиаккриламид гель) и определены с помощью масс-спектрометрии. Иммунопрецицифицированный LIMK2-1 также использовался для проверки своей киназы в пробирке по маркировке АТФ32P. Этот устоявшийся асссможет использовать множество различных субстратов, а мутившие версии приманки могут использоваться для оценки роли конкретных остатков. Эффекты фармакологических агентов также могут быть оценены, поскольку этот метод является высокочувствительным и количественным. Тем не менее, обработка радиоактивности требует особой осторожности. Активность киназы также может быть оценена с помощью специфических антител, нацеленных на фосфо-группу модифицированной аминокислоты. Эти виды антител не являются коммерчески доступными для всех фосфо модифицированных остатков.
Introduction
На протяжении многих десятилетий, многочисленные сигнальные пути были выяснены и их участие в важнейших клеточных процессов, таких как деление клеток, дифференциация, подвижность, запрограммированная гибель клеток, иммунитет и нейробиологии, было показано. Киназы играют значительную роль в этих сигнальных путей, поскольку они часто тонко регулируют их активацию или инактивацию и являются частью переходных универсальных комплексов, которые реагируют на внешние раздражители1,2,3. Мутация и дисрегуляция киназы часто приводят к заболеваниям у людей, и поэтому они стали одной из наиболее важных целей наркотиков за последние сорок лет4.
В этом контексте важно иметь возможность обнаруживать взаимодействие киназы с их регуляторами или субстратами вниз по течению и выявлять новых партнеров. Очищение аффинита и иммунопрецит очень мощные методы изоляции белковых комплексов5. Белок приманки или киназы могут быть помечены с конкретной последовательности пептида позволяет использовать коммерческие бусы ковалентно в сочетании с антителами ориентации пептида. Этот материал позволяет высокую воспроизводимость в экспериментах6,7,8. Эндогенные белки также могут быть иммунопреципиципированы с помощью антител, нацеленных непосредственно на белок приманки. Антитела могут быть связаны с протеином А или белок G агарозных бусин или просто инкубируются этими бусинами до добавления лизата. Лисис буферы должны быть оптимизированы, чтобы позволить растворить белок, не теряя взаимодействия и избежать деградации белка. Основным недостатком этого подхода является то, что взаимодействие обнаруживается при клеточном лисисе; поэтому, преходящее или слабое взаимодействие, вместе с теми, которые требуют субклеточного контекста могут быть пропущены. Другие методы могут быть использованы для работы непосредственно в клетке, таких как Близость Ligation Assay (PLA)9, в vivo кросс-ссылок сродство очистки (XAP)10, Биолюминесценция Резонансная передача энергии (BRET) или Фюрстер Резонанс энергии Трансфер (FRET)11,12. Кроме того, иммунопрецитифиция не подходит для определения термодинамических констант привязки, для которых требуются физические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс, истермальная калорийность или микромасштабная термофорез 13,14.
Активность киназы может быть оценена с помощью нескольких методов. В этом, мы сосредоточились на фосфо-специфических антител и in vitro No32P » ATP (Аденозин ТриФосфат) маркировки. Фосфо-специфические антитела нацелены на модификацию фосфатов определенного остатка белка. Они могут быть использованы в Западной помарки или ELISA (Фермент-связанных иммуносорбентных асссе) после лизиса клеток, для иммуногистохимии, а также на неповрежденных клеток с использованием цитометрии потока или иммунофлуоресценции. Их недостатки могут включать в себя их отсутствие специфичности, которые могут быть оценены с помощью мутировавшей версии целевого белка, и их не коммерчески доступны для всех белков. Маркировка In vitro No32P' ATP является очень надежным, хорошо зарекомендовавшим себя и высокочувствительным методом15. Можно использовать иммунопромилиациированные или рекомбинантные белки, а также различные субстраты. Воздействие лекарств также может быть оценено, поскольку этот метод является количественным. Его основным недостатком является то, что радиоактивность, связанная с подходом, требует осторожного обращения. Возможны также альтернативные методы, основанные на измерении флуоресцентных или люминесцентных пептидных субстратов и пользующихся измененными флуоресцентными/люминесцентными свойствами при фосфорилировании. Такие методы также позволяют высокую пропускную связь, что требуется, например, при скрининге молекул, которые могут быть потенциальными ингибиторами мишени киназы. Действительно, киназы представляют собой один из крупнейших классов наркотиков целей, проводимых фармацевтическими компаниями16.
В этом исследовании мы сосредоточились на белке LIMK2-1 (LIMK2-1 означает Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). Белок киназы LIMK2 был впервые описан в 1995году 17. Три изоформы LIMK2 производятся с помощью альтернативного сплайсинга: LIMK2a, LIMK2b и LIMK2-1. В настоящее время LIMK2-1 описан только на уровне мРНК в одном исследовании18. В этом мы характеризуем этот потенциальный новый белок киназы на молекулярном уровне, используя надежные биохимические подходы. Во-первых, мы демонстрируем, что LIMK2-1 действительно синтезируется. Как и два своих аналога, LIMK2a и LIMK2b, он взаимодействует с восходящей киназы ROCK (Rho-связанных белка киназы). Мы показываем, что LIMK2-1 имеет активность киназы на Myelin Basic Protein (MBP), но не на кофилине, каноничном субстрате киназы LIM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток для трансфекции
ВНИМАНИЕ: Все шаги клеточной культуры должны выполняться в специальной лаборатории, и клетки манипулируются в микробиологическом кабинете класса 2.
- Семенные клетки HEK-293 (Эмбриональная почка человека) в 10 см пластин в 10 мл DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) дополнены 10% сыворотки плода теленка. Культура в течение 3 до 5 дней под 5% CO2, при 37 градусах По Цельсию, пока клетки не достигнут 90% слияния.
- Лечить 10 см пластин с коллагеном R для увеличения клеточной сливки к пластиковым пластинам.
- Добавьте 5 мл раствора коллагена R, 200 раз раз разбавленного фосфатным соленовым буфером (PBS) в пластине 10 см. Наложите жидкость на всю поверхность пластины.
- Инкубировать при комнатной температуре не менее 1 ч в шкафу биобезопасности.
- Удалите раствор коллагена и отбросьте его. Добавьте 5 мл PBS, разложите его по всей поверхности пластины, удалите ее и отбросите. Повторите эту стирку один раз.
- Добавьте 8 мл DMEM, дополненную 10% сыворотки плода икры. Храните подготовленные пластины в шкафу биобезопасности.
- Возьмите пластины HEK-293 со ступени 1.1 в шкафу для биобезопасности. Удалите средство из пластин и выбросить его в специальный мусор отбеливателя. Добавьте 2 мл дополненного DMEM и промойте клетки, чтобы отсоединить их с помощью потока микропайпета 1 мл, заботясь о том, чтобы избежать пены.
- Соберите клетки в трубке 15 мл и добавьте 4 мл дополненного DMEM. Гомогенизировать с 10 мл пипетки, путем pipetting вверх и вниз в 3 раза.
- Возьмите 2 мл этого клеточного раствора и добавьте их в обработанные коллагеном пластины, содержащие дополнение DMEM от шага 1.2.4.
- Расти в течение 24 часов в инкубаторе при 5% CO2 и 37 градусов по Цельсию. Клетки должны быть 50-80% конфих во время трансфекции.
2. Переходные преображания
- Удалите средство из пластин, отбросьте его в специальный мусор отбеливателя, и добавить 10 мл свежего дополненного DMEM. Положите обратно пластины в инкубатор при 37 градусах По Цельсию при подготовке трансфекционной смеси.
- В трубке 15 мл добавьте 450 л раствора 10 мм Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA (Tris означает Tris (гидроксиметил) аминометана и EDTA для этиленитритритрилотетраацетической кислоты) раствора и 50 мл раствора 2,5 М. Смешайте инверсией.
- Добавьте 10 мкг плазмидной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), приготовленной из препарата миди на жидкой культуре бактерий, преобразованных с помощью выделенной плазмиды. Смешайте инверсией.
- При плавном возбуждении вихря добавьте 500 л буферизированного соленого 2x концентрата (состав: BES, 10,7 г/л, NaCl, 16,0 г/л, Na2HPO4, 0,27 г/л; BES означает N,N-Bis (2-гидроксиэтил)-2-аминоэтесульфоновая кислота, N,N-Bis (2-гидроксиэтил)taurine) медленно падают за каплей.
- Инкубировать не менее 15 мин (до 45 мин) при комнатной температуре в шкафу для биобезопасности. Не вихрь, не смешивайте! Перемещение труб очень осторожно, чтобы не нарушать комплекс образования между ДНК и фосфатом кальция.
- Возьмите пластины от шага 2.1 к шкафу безопасности. Добавляйте комплексы ДНК очень осторожно, капля за каплей, на клетки по всей поверхности пластины.
- Инкубировать от 24 до 72 часов в инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Обычно максимальное выражение белка достигается в течение 48 часов.
3. Лисис
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте на льду и с холодными буферами для предотвращения деградации белка.
- Подготовить лисис буфер: 50 мм Tris-HCl, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0,1% Тритон X-100, 50 мМNaF, 10 мкм пирофосфат, 1 мКм Na3,20 мм p-nitrophenyl фосфат, 20 мМ-г-г-г/мЛ. , 1 мкг/мл лейпептина и 1 мМ PmSF (фтор феодосий феолор феолор фенилметилсулфонил). Для каждой трансинфицированной пластины требуется около 4 мл буфера изли.
- Удалите пластины с трансинфицированными клетками из инкубатора. Положи их на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага можно работать на «нормальной» скамейке. - Удалите средства массовой информации, и выбросить его в специальный мусор отбеливателя.
- Вымойте дважды с 3 мл холодного PBS: добавить 3 мл PBS на стороне пластины капля за каплей, чтобы избежать отсоединения транс-инфицированных клеток, распространение по всей поверхности пластины, удалить PBS и отказаться от него; повторить этот шаг еще раз. В конце, тщательно удалить остальную часть PBS, наклонив пластину, чтобы предотвратить разбавление буфера лисиса для следующего шага.
- Добавьте 500 л холодного буфера лисиса на трансfected промытые клетки. Распространение его по всей поверхности пластины.
- Инкубировать 10 мин на льду. Время от времени (по крайней мере дважды), снова распространение буфера по всей поверхности пластины.
- Очистите клетки и соберите их в микроцентрифуге трубки.
- Центрифуга в течение 10 мин при 10 000 х г при 4 градусах Цельсия.
- Соберите супернатант в новой микроцентрифуговой трубке. Эта фракция соответствует лизату (экстракту целых клеток). Откажитесь от гранул, которые соответствуют мусору клеточной мембраны.
- Соберите аликвот этой фракции в новую микроцентрифуговую трубку (около 50 л). Эта фракция соответствует "TOTAL фракции" или "Cell Lysate" или "Whole Cell экстракт", позволяющий анализ ли транс-инфицированных белков выражаются Западной пятно.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент образцы могут быть непосредственно использованы для анализа Western Blot. Буфер Laemmli должен быть добавлен в образец, который затем нагревается при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин, центрифугирован при 10 000 х г в течение 5 минут и загружается на соответствующие SDS-PAGE. Образцы также могут храниться при -80 градусов по Цельсию.
4. Иммунопрецистом
- Аккуратно resuspend агарозные бусы в сочетании с соответствующими антителами: HA (человеческий грипп гемагглютинин), Флаг, или GFP (Зеленый флуоресцентный белок) путем гладкой инверсии.
- Вырежьте конец кончика 200 л от микропипетты, чтобы шарики вошел в кончик. Пипетка бисер вверх и вниз несколько раз, чтобы насытить кончик, чтобы обеспечить правильный объем бисера.
- Возьмите 40 л бусин в микроцентрифуговой трубке.
- Добавьте 500 кЛ буфера TENET (30 мм Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl, 5 мМ EDTA, 1% Triton X-100). Смешайте инверсией. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 градусах По Цельсию. Удалите тщательно супернатант и отбросьте его. Добавьте 500 зл TENET. Инкубировать не менее 1 часа при 4 градусах Цельсия на вращающемся колесе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот прединкубационный шаг в TENET позволяет уменьшить неспецифические взаимодействия и тем более уменьшить фоновый сигнал. - Вымойте бисер дважды с 500 зл и сбуфером лиза.
- Центрифуга 2 мин при 1000 х г при 4 градусах Цельсия.
- Удалите тщательно супернатант буфер, и отбросить его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы не аспирировать бусы во время этих шагов стирки. - Добавьте 500 л люсис буфера. Гомогенизировать путем инвертирования трубки.
- Повторите шаги 4.5.1- 4.5.3.
- Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант буфер, и отбросить его.
- Инкубировать бусы с лисатом от шага 3.9 в течение 2 до 4 часов при 4 градусах По Цельсию на вращающемся колесе.
- Вымойте иммунопромилитированные бусины.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент, иммунопрористого бисера можно мыть пять раз с буфером лисиса, а затем eluted с буфером Laemmli. Элуат может быть использован для анализа Western Blot или хранится при -80 градусах Цельсия. Кроме того, бисер можно мыть дважды с буфером лисиса, а затем три раза с буфером киназы для выполнения маркировки АТФ32P.
5. Анализы коиммунопреционных
- Вымойте иммунопрористированные бусы со ступени 4.7 буфером лиза.
- Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его.
- Добавьте 500 л люсис буфера. Гомогенизировать путем инвертирования трубки.
- Повторите шаги 5.1.1-5.1.3 4 раза.
- Элуцион
- Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Удалите последние капли супернатанта шприцем Гамильтона, чтобы избежать устремления бисера, и отбросьте супернатант.
- Добавьте 40 qL 4x буфера Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% глицерола, 0.5 M-mercaptoethanol, 0.02% bromophenol голубой). Гомогенизировать, аккуратно нажав трубку.
- Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Центрифуга в течение 5 мин при температуре 10 000 х г при комнатной температуре.
- С шприцем Гамильтона, удалить супернатант и собрать его в новой трубке микроцентрифуга. Эта фракция соответствует "Eluate", который может храниться при -80 градусов по Цельсию, или непосредственно проанализированы Western Blot.
6. Кинасе асссе
- Подготовка буфера киназы: 50 мМ HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES означает 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеетанетанесульфоновая кислота), 150 мМ NaCl, 5 мМ МГCl2, 5 мМ MnCl2, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4, 20 мм з-глицерофосфат, 1 мкг/мл лейпептина и 1 мМ ПМСФ. Для каждого состояния иммунопреприностии требуется около 2 мл буфера киназы.
- Вымойте иммунопрористированные бусы со ступени 4,7 дважды с 500 зл и с буфером лиза.
- Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Добавьте 500 л люсис буфера. Гомогенизация путем инверсии.
- Повторите шаги 6.2.1 и 6.2.2.
- Вымойте иммунопреципибилные бусы три раза с 500 зл иназовых буфера.
- Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Добавьте 500 кл. буфера киназы. Гомогенизация путем инверсии.
- Повторите шаги 6.3.1 и 6.3.2 дважды.
- Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г в охлажденной центрифуге при 4 градусах Цельсия.
- Аккуратно удалите супернатант и отбросьте его. Удалите последние капли супернатанта шприцем Гамильтона, чтобы избежать устремления бисера, и отбросьте супернатант.
- Добавьте 40 qL буфера киназы к иммунопреципицированных бусинах. Приостановите бисер, осторожно нажав трубку.
- Подготовьте смесь длямаркировки АТФ (окончательный объем составляет 22,5 л, в комплекте с буфером киназы) в безопасной блокировке-трубке.
- Добавьте необходимый объем буфера киназы, чтобы достичь конечного объема в 22,5 л.
- Вырезать конец 20 л кончик микропайпета. Отрежь иммунопромилитированные бусы со ступени 6.6 трубачом вверх и вниз несколько раз. Соберите 10 юрб из этих шариков в трубку с безопасным замком.
- Добавьте АТФ из раствора запаса 10 мкм, чтобы достичь 50 мМ концентрации конечного. В соответствии с количеством обработанных образцов, разбавление запасного раствора АТФ в буфере киназы предлагается, чтобы позволить пипетке от 1 до 2 л, чтобы убедиться, что объем правильный.
- Добавьте 2,5 мкг субстрата (кофилин или миелин основной белок, MBP в данном случае исследования).
- Добавьте 5 «Ci из» 32P» АТФ (3000 Ci/mmol), чтобы инициировать реакцию. Смешайте трубачи вверх и вниз медленно.
ВНИМАНИЕ: С этого момента, работа должна быть проделана в месте безопасности, предназначенных для радиоактивных манипуляций с осторожностью, специальная защита и соответствующие средства контроля (радиоактивный щит, счетчик Гейгера, конкретные отходы сбора, личная грудь и значки для обнаружения радиоактивного воздействия, советы по фильтру). - Инкубировать в течение 20 мин при 30 градусах По Цельсию.
- Остановите реакцию с помощью 6-й буфер 5x Laemmli.
- Нагрейте при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
- Центрифуга при температуре 10 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Нагрузка на SDS-PAGE. Приступай к миграции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы передняя линия свободного АТФа No32P не выходила из геля, чтобы избежать загрязнения цистерны для миграции. - Попятнать гель при комнатной температуре.
- Снимите гель со стеклянных пластин.
- Продолжить с тремя ванными в воде при комнатной температуре.
- Пятно гель на ночь с Coomassie Blue при комнатной температуре.
- Destain гель с несколькими ванны мыть с водой при комнатной температуре.
- Оберните гель полиэтиленовой пленкой.
- Выставляется на одну ночь или более на экранфосора.
- Прочитайте экран на фосформагере, чтобы обнаружить помеченные полосы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Синтезируется белок LIMK2-1
LIMK2-1 упоминается в банках данных, но пока только одна бумага показала существование его мРНК18. По сравнению с двумя омологами, LIMK2a и LIMK2b, LIMK2-1 имеет дополнительный C-терминальный домен, идентифицированный как ингибизорный домен protein Phosphatase 1 (PP1i). Мы разработали антитела, которые нацелены на пептид этого домена, аминокислоты 671-684(рисунок 1A).
BLAST исследования против человеческих белковых баз данных показали, что только один белок, PHI-1 (ингибитор голокеназора Фосфатазы 1), имеет сильное сходство последовательности с этой 12 аминокислотной последовательности. Тем не менее, PHI-1 мигрирует на 23 kDa на SDS-PAGE гели, далеко от LIMK2-1, который, как ожидается, мигрировать около 75 kDa (т.е., два не должны вмешиваться). Мы подтвердили это антитело во-первых для HEK-293 клеток трансинфицированы либо с LIMK2-1, LIMK2a, или LIMK2b и показали, что анти-PP1i антитела смогли распознать трансинфицированных LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) и HA-помечены LIMK2-1, но не перекрестно реагировать с транс-инфицированы HA-tagged LIMK2a или LIMK2b(рисунок 1B). Мы наблюдали полосу эндогенных LIMK2-1 в клетках HEK, трансфицированных с HA-тегами версий изоформ LIMK2 (показанных стрелой в анти-PP1i пятно; Рисунок 1B). Во-вторых, мы проверили, был ли сигнал, индуцированный антителом anti-PP1i, специфичен для LIMK2-1 с использованием siRNA, нацеленного на три сращивания вариантов LIMK2(рисунок 1C). В присутствии LIMK2 siRNA наблюдалось воспроизводимое и значительное снижение диапазона интереса (указано стрелой на рисунке 1С)по сравнению с условиями контроля, что свидетельствует о том, что антитело характерно для LIMK2-1. После этого мы использовали анти-PP1i антитела для обнаружения LIMK2-1 в различных экстрактов линии клеток: HEK-293 (Человеческие эмбриональные клетки почек), HeLa (клетки эпителиальной цервикса человека), и C6 (Крыса мозга глиальные клетки). Эти клетки нарушаются в буфере лиза, содержащем 1% Triton X-100. Используя в анализе силико, LIMK2-1 было показано, что Hominidae приматов конкретных19. Западный анализ blot с использованием анти-PP1i антитела показали, что LIMK2-1, как представляется, выражается в HEK-293 и HeLa, но не в C6 клеточных линий, как ожидалось из силико исследований (Рисунок 1D). Эти эксперименты были повторены с различными человеческими тканями, показывая, что уровни белка LIMK2-1 варьировались в зависимости от ткани: самые высокие уровни были найдены в печени, меньшие уровни в поджелудочной железе, и самый низкий в яичках и легких. LIMK2-1 не был обнаружен в тканях мозга(рисунок 1E). Мы наблюдали более низкие молекулярные диапазоны веса во всех образцах ткани за исключением печенки, предлагая деградацию полного протеина вероятно из-за условий lysis этих коммерчески образцов (этот буфер lysis содержит коктейль ингибиторов не указано на лист данных, который может быть менее эффективным, чем многочисленные ингибиторы протеазы и фосфатазы, которые мы используем в нашем самодельном буфере). Эти данные показывают, что человеческий белок LIMK2-1 синтезируется и выражается по-разному в испытанных тканях.
LIMK2-1 взаимодействует со своим восходящим киназой ROCK
Омологи LIMK2-1, LIMK2a и LIMK2b, были описаны как регулируемые восходящей киназы ROCK. Мы оценили взаимодействие LIMK2-1 с ROCK с помощью экспериментов по киммунопреционированию. Клетки HEK были совместно трансфицированы с переносчиками, кодирующие cMyc-tagged ROCK1 и либо одной из версии изоформ LIMK2, либо несвязанным и тегами HA белка Larp6. Larp6 служит отрицательным контролем, позволяющим обнаруживать неспецифические взаимодействия. Клетки были лисицированы и анти-HA иммунопреципции было выполнено. Лисаты (экстракты целых клеток) и иммунопрецициты были проанализированы Western Blot, используя анти-HA и анти-cMyc антитела. Как показано на рисунке 2 (левые панели; Лисаты), каждый из различных белков, кодируется транс-инфицированных векторов хорошо выражены. Три изоформы LIMK2, а также Larp6, эффективно иммунопрорисмизированы(рисунок 2, нижняя правая панель; Элуатс). В элятах, ROCK обнаруживается и, таким образом, coimmunoprecipitated с тремя изоформы LIMK2, но не с Larp6(Рисунок 2, верхняя правая панель; Элуатс). Это свидетельствует о том, что ROCK взаимодействует с тремя изоформами LIMK2, особенно с недавно охарактеризованной изоформой LIMK2-1. Это взаимодействие является специфическим, так как отрицательный контроль (Larp6) не взаимодействует с ROCK.
При этом мы представляем данные по иммунопрецитистике, выполняемой анти-Ha антителами; однако, взаимодействие может быть проверено в противоположном направлении путем иммуноподготовки ROCK с бисером, спряженным с антителами cMyc и анализом элютаций с антителами HA для обнаружения limK coimmunoprecipitation.
Кинасе деятельности
Фосфо-кофилин в нетронутых клетках
Омологи LIMK2-1, LIMK2a и LIMK2b, были показаны фосфорилата, фактор деполимеризации, на его Serine3. Используя антитела, специально ориентированные на фосфо-серин3 кофилина, мы изучили активность киназы LIMK2, измерив уровень эндогенного фосфо-кофилина в клетках HEK, перевыражающих одну изоформы LIMK2. Клетки HEK были трансфицированы переносчиками, кодируя либо одну из изоформ LIMK2 с тегами HA, либо соответствующий пустой вектор в качестве отрицательного контроля. Клетки были лизины, и различные лизаты были проанализированы Западной Blotting с помощью анти-фосфо-серин3 кофилина антитела. Переэкспрессия LIMK2a и LIMK2b привела к значительному и воспроизводимому увеличению уровня фосфо-кофилина по сравнению с условиями контроля, в то время как наличие LIMK2-1 не имело заметного эффекта(рисунок 3, левая панель).
Мы повторили тот же эксперимент с C-терминалом YFP-тегами (желтый флуоресцентный белок) версия трех изоформ LIMK2 и непомеченная версия LIMK2-1, чтобы исключить возможные вмешательства n-терминалha HA тега. Результаты были идентичны тем, которые были получены с помощью HA-тегами версии трех изоформ(рисунок 3, правая панель с указанием YFP помечены версии). Эффективность трансфекции была оценена для YFP-тегами версии изоформ LIMK с использованием цитометрии потока, чтобы исключить, что этот результат, возможно, был из-за разницы в экспрессии белка. Три изоформы показали аналогичную эффективность трансфекции: 54% для LIMK2-1, 49% для LIMK2b и 43% для LIMK2b.
In vitro киназы тесты
Затем мы изучили активность киназы изоформ LIMK2 с помощью маркировки in vitro с помощью АТФ32P. На рисунке 4A показана общая схема этой маркировки in vitro. Клетки HEK были трансфицированы либо одной из версий изоформ LIMK2, либо неродственным белком Larp6, который использовался в качестве отрицательного контроля. Активность киназы иммунопреципитатов анти-ХА измерялась с помощью рекомбинантного GST-кофилинав качестве субстрата в присутствии АТФ 32 P. HA-иммунопроцифицированный Larp6 не показал киназы активности на кофилина. HA-иммунопрокурсированный LIMK2a и LIMK2b фосфорилированный кофилин, в то время как LIMK2-1 не(рисунок 4B). Мы получили аналогичные результаты, используя YFP-тегами версии трех изоформ иммунопровидированных с GFP-ловушки бусы в присутствии рекомбинантных cofilin и no32P " АТФ (Рисунок 4D).
Затем мы проверили, не было ли LIMK2-1 киназы деятельности или, если его активность на колилин был нарушен. Мы повторили эксперимент по маркировке in vitro с использованием Myelin Basic Protein (MBP), эффективного субстрата для многочисленных белковых киназ, а не кофилина. Был высокий фоновый сигнал в состоянии управления, когда анализ был выполнен в присутствии HA-тегами версии: отрицательный контроль, HA-иммунопрокипит Larp6, производится сильный сигнал фосфорилированного MBP, хотя это не киназа ( Рисунок 4C). Мы преодолели эту проблему, используя YFP-тегами версии этих белков. В этих условиях фон в области контроля (только YFP) был низким, что позволило проводить более конкретные исследования. GFP-ловушки YFP-LIMK2a, LIMK2b, и LIMK2-1 показали киназу активность по отношению к MBP, хотя активность LIMK2-1 была ниже(рисунок 4D). Тем не менее, LIMK2-1 был также менее эффективно иммуноподготовки в этих условиях (см. Coomassie Блестящий синий (CBB) окрашивания и Западного Blotting). Таким образом, три изоформы показали сопоставимую активность на MBP, когда фосфо-MBP был нормализован до иммунопрорисцифицированных уровней LIMK2 на окрашивание CBB(рисунок 4D, нижняя панель). Иммунопреципитаты были также проанализированы Западной Blot с помощью анти-ROCK антител, чтобы проверить, если активность на MBP может быть связано с наличием ROCK, который был бы coimmunoprecipitated с LIMK2s. Мы не смогли обнаружить какой-либо сигнал ROCK в иммунопреципицитатах LIMK2. Так MBP фосфорилирования не из-за ROCK, но и LIMK2s как таковой.
В целом, эти данные показывают, что LIMK2a и LIMK2b имеют аналогичные мероприятия по cofilin и MBP. Хотя LIMK2-1 показывает активность киназы к MBP, сравнимую с активностью двух других изоформ, кофилин не является хорошим субстратом для него.
Рисунок 1: Доказательства существования белка LIMK2-1. (A) Схемаическая диаграмма трех изоформ человека LIMK2. Изоформы LIMK2 описаны в Entrez Gene: LIMK2-1 (NP-001026971.1), LIMK2a (NP-005560.1), LIMK2b (NP-057952.1). Показаны различные области LIMK2: LIM (Lin11, Isl1, Mec3), LIM' (короткий домен LIM), PD (PSD95, Dlg1, Зо-1), S/P (Serine Proline rich), Kinase' (короткий домен киназы) и PP1i (протеин Фосфатаза 1 ингибитор). Последовательность, выбранная для анти-PP1i антитела дизайн показан красным цветом. (B и C) Проверка антитела анти-LIMK2-1. (B) HEK-293 клетки были трансинфицированы непомеченных LIMK2-1 (pCMV-LIMK2-1) или один изоформы HA-тегами LIMK2. Лисаты были проанализированы Западным Блоттингом с использованием указанных антител. (C) HEK-293 клетки были трансинфицированы либо с LIMK2 siRNA или контроль siRNA. Лисаты были проанализированы Western Blot. LIMK2-1 выражается в различныхклеточных линиях человека (D) и тканях (E ). HeK-293, HeLa и C6 были нарушены в 1% Triton-X100 lysis буфера. Ткани экстракты были закуплены и образцы из них были проанализированы Западной Blotting. Эта цифра была изменена из Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Три изоформы LIMK2 взаимодействуют с ROCK1. HeK-293 клетки были совместно трансфицированы cMyc помечены ROCK1 и либо один из трех HA-тегами LIMK2 изоформы (2-1, 2a, 2b) или несвязанных белка, Larp6. Лисаты и иммунопреципитаты против HA подверглись западному блоттингу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: LIMK2-1 не имеет киназы деятельности по отношению к кофилину в нетронутых клетках. Клетки HEK-293 были трансфицированы либо одной из трех изоформ LIMK2 с маркировкой HA (1, 2a, 2b) или пустым родительским вектором, pcDNA3 (левая панель), либо с одной из трех изоформ LIMK2 с тегами YFP или только YFP (правая панель). Лисаты были подвергнуты Западному Блоттингу. Количественная оценка соотношения фосфо-кофилина против кофилина показана на графике справа. Соотношение фосфо-кофилина и кофилина макет амира трансинфицированных клеток нормализовалось до 100. Каждое значение представляет собой среднее значение SE трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена из Vallee et al., The Biochemical Journal 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: LIMK2-1 не имеет активности in vitro киназы по отношению к колилин, хотя он фосфорилаты MBP. (A) Общая схема маркировки АТС32P. (B) LIMK2-1 не фосфорилат кофилин в пробирке. Клетки HEK-293 были трансинфицированы либо одной из трех изоформ LIMK2 с маркировкой HA (2-1, 2a, 2b), либо несвязанным и тегами HA белка, Larp6, в качестве отрицательного контроля. В анализе киназы использовались иммунопромизированные анти-ХА и GST-кофилин. Иммунопреципитаты против HA также подвергались анти-Ha иммуноблоттинги и Coomassie синий окрашивания. (C) HA-tagged иммунопрецит имеет сильный фоновый сигнал, когда MBP используется в качестве субстрата. Клетки HEK-293 были трансинфицированы либо одной из трех изоформ LIMK2 с маркировкой HA (2-1, 2a, 2b), либо несвязанным и тегами HA белка, Larp6, в качестве отрицательного контроля. В анализе киназы использовались иммунопромированные анти-ХА и MBP. Иммунопреципитаты против HA также подвергались анти-Ha иммуноблоттинги и Coomassie синий окрашивания. (D) Три изоформы LIMK2 имеют активность киназы к myelin Основной белок (MBP). Клетки HEK-293 были трансинфицированы либо одной из трех изоформ LIMK2, помеченных YFP (2-1, 2a, 2b), либо только YFP. В анализе киназы использовались иммунопромцифицированные антигфЭМ LIMK2 и кофилин или МБП. Иммунопрецитаты анти-GFP также подвергались иммуноблоттингу против ГФП и синему окрашиванию Coomassie. Количественная оценка фосфо-кофилина и фосфо-МБП показана на нижнем графике. Уровни фосфо-кофилина, полученные с помощью иммунопрокипилита лиМК2а, были нормализованы до 100. Каждое значение представляет собой среднее значение SE трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена из Vallee et al., The Biochemical Journal, 2018, http://www.biochemj.org/content/475/23/3745.long20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При этом мы использовали надежные биохимические инструменты, чтобы охарактеризовать на молекулярном уровне новый белок, LIMK2-1, который считается киназой на основе его последовательности и его омологов, LIMK2a и LIMK2b20.
Во-первых, мы продемонстрировали существование LIMK2-1 на уровне белка с помощью анализа Western Blot с конкретным антителом. После этого мы оценили его взаимодействие с восходящей киназы ROCK1, которая, как известно, регулирует LIMK2a и LIMK2b, омологи LIMK2-1. Наконец, мы оценили потенциальную активность киназы LIMK2-1 с помощью маркировки in vitro No32P, атлетной и в целлюло По Западной Блот с использованием специфического фосфо-антитела.
Буферная композиция Lysis
При изучении белков для того, чтобы проанализировать их по Западной пятно, особый уход требуется в отношении состава буфера лиза. Необходимо учитывать несколько параметров: i) тип моющего средства и концентрация21и ii) ингибиторы протеазы.
Состав буфера лизиса должен быть адаптирован к целевому белку, чтобы облегчить его почти полную растворимость, чтобы извлечь его как можно больше и позволить его обнаружению Западным пятном. Для растворимых белков для достижения этой цели часто бывает легких состояний (например, мягкого моющего средства при низкой концентрации). Для мембранных белков, более сильные условия, как правило, часто требуется. Существуют различные категории моющих средств: i) ionic, такие как сульфат натрия додецил (SDS), цетилтриметилламмоний бромид (CTAB), (ii) неионные, такие как Полиэтилен гликоль гексадеиль эфир (BRIJ), Тритон, октилГлукозид (OG), doDecylMaltoside (DDM), iii) zwitterionic, такие как 3-"3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1-пропанесульфонат (CHAPS) или zwittergents. Сильные моющие средства могут нарушить взаимодействие и комплексы могут быть потеряны. Кроме того, для экспериментов иммунопрецитисции, антитела могут быть чувствительны к тяжелым условиям. Аналогичным образом, активность ферментов может быть нарушена наличием моющих средств, которые могут разворачиваться или денатурации изученного белка. Как тип, так и количество используемого моющего средства может повлиять на свойства и активность белка. Для некоторых белков, очень ограниченный диапазон концентрации моющего средства допускается для сохранения активности белка. Ниже этого диапазона белок остается нерастворимым, в то время как выше этого диапазона концентрации, белок больше не активен.
Ингибиторы протеазы должны быть добавлены в буфер лисиса, чтобы предотвратить деградацию целевого белка эндогенными протеазами. Коктейли-ингибиторы протеазы доступны на коммерческой тарелке. Они могут быть использованы в качестве отправной точки исследования. При возникновении проблем можно рассмотреть возможность использования смеси ингибиторов, временно подготовленных из стоковых растворов, хранящихся при -20 градусов по Цельсию. Эти ингибиторы должны быть нацелены на протеазы серин и цистеин. PMSF (фенилметилсулфонил фторид) широко используется, однако он очень нестабилен в водной раствор и должен быть добавлен непосредственно перед извлечением. Следует также ингибировать металлопротезы: в этой области используются металлические хелататидные реагенты, такие как ЭДТА (этилендитрилотетраацетическая кислота) или EGTA (этиленгликоль-бис (2-аминоэтилет), тетраацетическая кислота, которые связываются с Mg2 . Чтобы сохранить белок в фосфорилированной и, таким образом, активированной форме, также рекомендуется добавлять ингибиторы фосфатазы в буфер лиза. Эти ингибиторы должны быть направлены на щелочные, кислотные, серины, трионин и фосфазы тирозина. Работа при низкой температуре (4 градусов по Цельсию) также рекомендуется для того, чтобы замедлить скорость протеолиза.
Целевые белки
В этом мы сосредоточились на белках с эпитопными метками. Теги (Flag, HA, cMyc, GFP и т.д.) очень полезны для обнаружения и очистки белков, так как антитела и антитела в сочетании бусы коммерчески доступны и легко воспроизводимые материалы. Тем не менее, размер и положение тега должны быть рассмотрены, как это можетповлиять на активность, локализацию или функцию целевого белка 6,7,8. Также можно работать с эндогенными белками. В этом случае необходимо использовать антитела, нацеленные на данный конкретный белок. Они могут быть соединены с бисером (Белок A или Протеин G) ковалентно (перекрестное соединение) или инкубироваться с лизатом, а затем с бисером. При работе с помеченными белками, ген которых выражен на плазмиде, легко перейти на мутагенез гена. Затем можно работать над различными мутантами для оценки биологических функций.
Иммунопрециция
Иммунопрециция является очень мощным методом, чтобы изолировать партнеров целевого белка5. Состав буфера лисиса (особенно моющего средства) должен быть тщательно установлен для сохранения взаимодействий (см. выше). Можно обнаружить взаимодействие между двумя выявленными белками. Это могут быть эндогенные белки или переэкспрессии белки. Когда белки выражаются при низком изобилии, может быть необходимо переэкспрессировать их, чтобы иметь более сильные сигналы. Обширные ямы иммунопрорытых бусин требуется для удаления неспецифических взаимодействующих белков или загрязняющих веществ. Перед определением эффективности иммунопрецитипиции или со-иммунопрорисцифицированного присутствия партнера, важно проверить, что различные партнеры хорошо выражены и присутствуют в лизате, анализируя весь лизат клетки или входную фракцию Западного Пятно. Кроме того, используя эксперименты с иммунопрецитарностью, можно также выявить новых партнеров целевого белка и изолировать новые комплексы. Эти новые партнеры могут быть определены масс-спектрометрией.
Такие партнеры могут играть важную роль в качестве активаторов целевого белка, допуская его полную активность для дальнейших биологических тестов. С другой стороны, copurified нежелательных белков могут быть использованы в качестве аргумента, что нет прямого взаимодействия между двумя выявленными партнерами, но вместо этого, что обнаруженное взаимодействие совместно иммунопрециптом из-за другого неизвестного партнера. В данном конкретном случае, чтобы быть уверенным в прямом взаимодействии, необходимо другое экспериментальное устройство, например, работа над белками млекопитающих, очищенными от бактерий.
Кинасе деятельности
Активность киназы может оцениваться по различным методам. В этом, мы сосредоточились на анализе in vitro по маркировке АТФ32P и анализе экстракта в целом западным пятном с использованием специфического фосфо-антитела. МаркировкаАТФ 32 P- является очень чувствительным и количественным методом, позволяющим обнаруживать слабую активность киназы15. Включение радиоактивности из АТФа в целевой субстрат позволяет сделать прямое измерение активности ферментов. Можно работать с различными субстратами для оценки активности киназы изученного белка на разных мишенях. Можно также определить аминокислоты, имеющие решающее значение для киназы деятельности путем мутации их, когда белок переэкспрессирован. Киназа деятельности требует divalent катион, таких как Mg2", который должен присутствовать в буфере киназы.
Основным недостатком этого подхода является обращение с радиоактивностью, которая требует специальных помещений для проведения экспериментов и сбора отходов. Существуют альтернативные методы, такие как флуоресцентные или люминесцентные наборы, которые обнаруживают побочные продукты реакции, такие как ADP (аденозиндиновый дифосфат)16. Белковая фосфорилирование также может быть изучено масс-спектрометрией, однако для этих анализов требуется большее количество материалов. В нашем случае мы пытались оценить активность киназы LIMK2 с помощью капиллярного электрофорасиса, чтобы повысить нашу эффективность, но это, к сожалению, не увенчалось успехом.
Фосфоспецифические антитела являются еще одним инструментом для изучения фосфорилирования белка. Широкие общие антифосфо-serine и тирозиновые антитела существуют, способные распознавать фосфо-сер или фосфо-тир любых белков. В последние годы антитела, нацеленные на конкретный фосфо-сайт целевого белка, были широко развиты и обычно распознают как группу фосфо, так и окружающие аминокислоты. Особая осторожность необходима при начале работы с такими антителами, так как их специфика должна быть проверена, например, с отрицательным контролем, таким как целевой белок, мутировавший на месте фосфо. При зондировании пятно с антифосфо антитела, блокирующий раствор не должно быть молоко, так как это содержит фосфопротеины, которые могут взаимодействовать с антителами. Рекомендуется бовинс сыворотка Альбумин (BSA), и ингибиторы фосфатазы могут быть добавлены в блокирующий раствор для предотвращения высвобождения фосфатов. Образцы не должны быть заморожены и разморожены, а приготовлены в виде аликвот, которые хранятся при -80 градусов по Цельсию. Действительно, фосфо модификации являются лабораторными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, и La R'Gion Centre Val de Loire. Большое спасибо Орели Коссон и Дебора Касас за данные цитометрии потока, и Кейрон Хикман-Льюис для тщательного проверки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for γ[32P] labeling |
| γ[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for γ[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for γ[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for γ[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
