Summary
该协议的目标是通过使用胶原酶对组织进行酶消化，分离位于结肠层状的单核细胞。该协议允许对单核细胞进行有效分离，从而产生单个细胞悬浮液，进而可用于强健的免疫分体。
Abstract
肠道是体内免疫细胞数量最多的家庭。小型和大型肠道免疫系统可调节外源抗原，并调节对强效微生物衍生的免疫刺激的反应。因此，肠道是许多疾病中免疫调节和炎症的主要靶点，包括但不限于炎症性肠病，如克罗恩病和溃疡性结肠炎、骨后移植物与宿主疾病 （GVHD）骨髓移植（BMT），和许多过敏和传染性疾病。胃肠道炎症和结肠炎的Murine模型被大量用于研究胃肠道并发症和临床前优化预防和治疗策略。通过对肠道免疫细胞的分离和型板分析从这些模型中收集的数据对于进一步了解可应用于改善胃肠道和全身炎症疾病的免疫理解至关重要。本报告描述了使用混合硅基密度梯度界面将单核细胞（MNC）从结肠分离的高效方案。该方法可重复分离大量可行的白细胞，同时最大限度地减少污染碎片，从而允许随后通过流式细胞仪或其他方法进行免疫型型。
Introduction
虽然胃肠道 （GI） 主要致力于处理和重新吸收来自食物的营养物质，但胃肠道也保持在血管、淋巴和神经系统以及许多其他器官的完整性中的核心作用。其粘膜和亚粘膜免疫系统1。GI免疫系统在胃肠道和全身健康中都具有影响作用，因为它经常接触来自食物、共体细菌或入侵病原体1、2的外来抗原。因此，GI免疫系统必须保持一个微妙的平衡，在其中它容忍非致病性抗原，同时适当响应致病性抗原1，2。当耐受性和防御的平衡被打乱时，局部或全身免疫失调和炎症可能导致无数的疾病1，2，3。
肠中至少有70%的淋巴细胞在体内4。大多数初级免疫学相互作用涉及肠道中三个免疫站中的至少一个：1）佩耶尔的贴片，2）皮内淋巴细胞（IEL）和3）拉米纳表体淋巴细胞（LPL）。其中每一个都由一个复杂的免疫细胞互联网络组成，对肠道5的正常免疫挑战作出快速反应。限于肌肉粘膜上方的频闪，松散的层状膜是肠道粘膜的结缔组织，包括软体、血管、淋巴排水和粘膜神经系统的脚手架，以及许多与生俱来和自适应免疫子集6，7，8，9。LPL由CD4+和CD8+T细胞组成，近似比例为2：1，血浆细胞和骨髓体细胞包括，树突状细胞、乳腺细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞6。
人们越来越有兴趣了解肠道的免疫调节和炎症，因为它涉及到各种疾病状态。克罗恩病和溃疡性结肠炎等疾病都表现出不同程度的结肠炎10，11，12。此外，接受异体骨髓移植（Allo-BMT）的骨髓或免疫系统的恶性或非恶性疾病患者可以发展各种形式的结肠炎，包括1）从调理方案直接毒性在BMT之前，2）由BMT和3）移植-宿主疾病（GVHD）后由供体型T细胞驱动，在BMT13、14、15之后对组织中的供体异抗原作出反应，由免疫抑制引起的感染。所有这些后BMT并发症导致肠道的免疫环境显著改变16，17，18。该方法允许对小鼠结肠中的免疫细胞积累进行可靠的评估，在BMT之后应用于小鼠受体时，有助于对参与移植耐受性中的供体和受体免疫细胞进行有效检测19 ，20.肠道炎症的其他原因包括恶性肿瘤、食物过敏或肠道微生物群的中断。该协议允许从结肠进入肠道单核细胞，并经修改后，在临床前小鼠模型中访问小肠的白细胞。
使用搜索词"肠道和免疫细胞和分离"的PubMed搜索揭示了200多个出版物，描述了小肠消化提取免疫细胞的方法。然而，对结肠的类似文献搜索没有产生指定免疫细胞与结肠分离的精心划定的协议。这可能是因为结肠有更肌肉和间质层，使其更难完全消化比小肠。与现有协议不同，该协议专门使用不含其他细菌胶原酶（胶原酶 D/胶原酶 I）的胶原酶 E。我们证明，使用该协议，可以在保持分离的肠道单核免疫细胞（MNC）质量的同时，实现结肠组织的消化，而无需添加抗结块试剂，如醋酸钠（EDTA）、Dispase II和脱氧核糖核酸I（脱氧核糖核酸I）21，22，23 。该协议经过优化，允许从鼠结肠中可重复的强健提取可存活的MNC，以便进一步定向研究，并应有助于研究结肠的免疫学或（有修改）小肠24，25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有研究均根据迈阿密大学米勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的啮齿动物研究规程进行，该委员会符合美国协会制定的兽医标准实验室动物科学（AALAS）。
1. 准备解决方案
-
如表1所述，制备结肠缓冲液、硅基密度分离介质100%、硅基密度分离介质66%、硅基密度分离介质44%、胶原酶E消化缓冲液和FACS缓冲液。
- 在手术前一天准备结肠缓冲液，并在4°C储存过夜。
- 在手术前一天准备100%硅基密度分离介质，在4°C下储存过夜，在程序解冻的早晨置于室温下。
- 在隔离的早晨，使用室温100%硅基密度分离介质和结肠缓冲液，制备66%和44%硅基分离介质。
- 测量适当量的梭菌性溶酶-衍生的胶原酶E，并在手术前一夜之间储存在-20°C。第二天早上，溶解在适当的结肠缓冲液体积中，以派生胶原酶消化缓冲液。对于在手术当天使用胶原酶消化缓冲液进行的所有孵育，将溶液预热至37°C。
- 对于整个协议步骤，将一台离心机保持在20°C，旋转速度为859 x g，制动器灭活（0减速），用于梯度离心。将另一个设置为 4 °C，旋转速度为 859 x g，标准减速，用于洗涤步骤。
2. 收获结肠
- 通过CO2窒息使小鼠安乐死，然后采用AALAC批准的确认方法。
- 将鼠标置于一个苏皮的位置，用 70% 乙醇喷洒毛皮。使用大型组织剪刀，做一个垂直的中线切口，并暴露完整的围肠。
- 使用精细解剖剪刀，打开围肠。使用钳子将小肠移到一侧，并露出降序。在降序上稍微向上拉，以最大程度地暴露结肠的直肠部分。切离骨盆深处的远端直肠，解剖并切除整个结肠作为一个单元，从远端直肠到头盖。
- 在 50 mL 聚丙烯管中将结肠在 20 mL 冷冻结肠缓冲液中转移。
3. 清洁结肠
- 将结肠放在湿润的纸巾上，用剪刀或钳子的钝端对肠壁施加温和压力，提取固体粪便。
- 将结肠放入培养皿中，使用 10 mL 的注射器用 18 G 钝填充针冲洗肠道，并冲洗 10 mL 的冷冻结肠缓冲液。
- 转移结肠到结肠缓冲湿纸巾，并删除与剪刀的锋利端的吸血和脂肪。
- 将结肠放入装有 5-10 mL 冷冻结肠缓冲液的培养皿中，手动搅拌以清洗剩余的结肠内容物。重复2-3次。
- 在充满新鲜冷冻结肠缓冲液的培养皿中纵向切割结肠，从其更肌肉的直肠末端到近端结肠（生成单个矩形开放结肠片）。丢弃现有介质，用清洁的冷冻结肠缓冲液重新填充。
- 洗肠3次，在培养皿中大力旋转，每次洗涤后更换5-10 mL的冷冻结肠缓冲液。
- 将矩形结肠组织放在用结肠缓冲液湿润的纸巾上，然后水平切片，然后切成小碎片（3 毫米 x 3 毫米部分）。）。
- 在50mL聚丙烯锥形管中小心地用细钳子将结肠碎片收集到20mL的冷冻结肠缓冲液中。
- 洗3次结肠碎片，每次洗在20mL结肠缓冲液中，通过大力旋转管30s。每次搅拌之间，让组织碎片沉降到管的底部。脱脂或真空吸出上清液，同时防止每次洗涤之间的吸入过程中组织片段丢失。
注：每次清洗后无需更换管子。
4. 胶原酶消化 1
- 在 50 mL 聚丙烯锥形管中洗涤的结肠碎片中加入 20 mL 的胶原酶消化缓冲液。
- 将封闭的50 mL管置于37°C的孵育轨道摇床中，旋转速率设定在2 x g60分钟。确保组织碎片在搅拌过程中保持恒定运动;如有必要，逐步提高旋转速率，以确保没有组织碎片沉降到管底部。
5. 准备基于硅的分离介质梯度
- 在 20°C（室温）和结肠缓冲液下使用 100% 硅基密度分离介质制备 66% 和 44% 硅基密度分离介质。
- 将 5 mL 的 66% 硅基密度分离介质倒入 3 个独立的 15 mL 聚丙烯管中。每结肠准备3管。这构成了梯度隔离过程的高密度基础，将低密度分离介质分层以创建分离梯度。
- 储存在20°C，直到使用。
6. 从消化1收集上清液
- 在胶原酶消化1完成后，仅使用25 mL血清学移液器收集上清液，并通过40μm孔过滤织物细胞滤网过滤液过滤液，放入干净的50 mL聚丙烯锥管中过滤上清液。小心不要吸出任何现有的组织碎片。
注：保留管中剩余的可见组织片段。这些将经历第二胶原酶消化（步骤8）。
7. 淬火胶原酶消化缓冲液
- 用冷冻结肠缓冲液完全填充 50 mL 聚丙烯管。
注：胶原酶在37°C时活性;因此，冷冻缓冲液使这种酶失去活性。 - 在 4°C 下将管在 800 x g下离心 5 分钟。
- 通过真空吸气丢弃上清液。用25 mL的新鲜结肠缓冲液和800 x g的离心机清洗细胞5分钟。
- 在1mL以下的新鲜冷冻结肠缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 将 50 mL 聚丙烯锥形管放在冰上。
8. 胶原酶消化 2
- 重复步骤 4（消化 1），从步骤 6.1 保留剩余的组织片段。
9. 消化后组织分解 2
- 通过18 G钝端针头在管子和10 mL注射器之间剧烈地冲洗组织碎片。
- 重复此刷新至少 7-8 个完整的通道，直到看不到毛组织碎片或碎片为止。
10. 过滤单元格
- 将组织分解悬浮液通过40μm孔过滤织物细胞过滤器放入清洁的50 mL聚丙烯管中。
- 用 10 mL 冷冻结肠缓冲液清洗过滤织物细胞过滤器，以回收过滤器中任何包裹的细胞。
11. 淬火胶原酶消化
- 用冷冻结肠缓冲液将 50 mL 聚丙烯锥形管填充到边缘。
注：结肠缓冲液的温度对于确保胶原酶活性的淬火至关重要。 - 在 4 °C 和 800 x g下旋转 5 分钟。
- 通过真空吸气丢弃上清液。
- 在25 mL的新鲜冷冻结肠缓冲液中重新悬浮洗涤，随后在4°C下离心，800 x g，5分钟。
- 通过真空吸气丢弃上清液。
- 从步骤 11.4 将从胶原酶消化 1（步骤 7）的重新悬浮颗粒汇集到相应的管中。
- 重复步骤 11.4（洗涤和离心）。
12. 硅基密度分离介质梯度分离
注：尽快执行步骤12-18，以确保胶原酶活性的快速淬火。
- 按照步骤11.7，将每粒颗粒重新悬浮在24 mL中，每结肠的硅基密度分离介质为44%。
- 使用 10 mL 血清移液器将介质从步骤 12.1 缓慢地分层到步骤 5.2 中制备的三根管中每个管（包含 66% 硅基密度分离介质）。保持 44% 密度分离介质的稳定缓慢流动，同时对渐变进行分层，以避免接口中断。
- 使用称重秤或天平仔细平衡离心机铲斗内的所有管。
- 在离心机中，在 859 x g下旋转管 20 分钟，在 20°C 下不制动。在拆卸管子之前，让转子完全休息，注意不要破坏梯度界面上的细胞。
13. 从梯度界面收集单核细胞
- 可视化渐变界面（靠近 5 mL 标记），其中通常存在 1-2 mm 厚的白色带（包含 MNC）。
注：一个人可能看到也可能看不到白色带。但是，MNC 将位于此接口中，并且应云化渐变接口的清晰度。 - 真空吸气并丢弃顶部渐变的顶部 7 mL，以便更容易地将移液器访问接口。
- 使用连续手动吸力和稳定的手腕旋转运动，将细胞的界面层收集到干净的 50 ml 聚丙烯锥形管中。收集，直到两个梯度之间的界面是清晰和折射（清除细胞）。
- 在收集管中填充 50 mL 的冷冻 FACS 缓冲液。在 4 °C 下旋转，800 x g旋转 5 分钟。
- 通过真空吸气吸气吸气上清液，在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 使用适当的死细胞排除方法，以1：2稀释计算血细胞仪上的细胞。
- 使用新鲜分离的结肠MNC进行FACS染色或其他检测。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
当使用鼠结肠疾病模型时，能够量化和定性评估结肠的MNC中涉及炎症过程的多个免疫细胞子集是有帮助的。通过应用该协议获得的MNC的单细胞悬浮液，有助于以稳健且可重复的方式进行表型表征。作为在各种实验环境下应用这种分离方法的原理证明，我们使用这种方法检索了结肠MNC，并在从小鼠身上分离的细胞上进行了多参数流细胞测定（图1和图 2，异体BMT）并且没有（图2A，合成BMT）在BMT之后出现明显的免疫介导结肠损伤。
在使用胶原酶 E 或 D 进行分离时，对使用或不使用 DNase 1 治疗的细胞学和数据分析进行了流动细胞学和数据分析，以比较凋亡和坏死淋巴细胞的成分。图1A提供了流式细胞测量中使用的浇注策略。 继附件五（凋亡标记）和可修复的活/死蓝染料（坏死标记）染色单细胞悬浮液后，每次分离后，不含脱氧核糖核酶的胶原酶E显示附件五的显著高百分比与不含脱氧核酶的胶原酶 D 相比，活体/死蓝内生细胞（中位数 43.3%，范围 26.5%-59.9% = 3），与不含脱氧核酶的胶原酶 D 相比（中位数为 8.7%，范围为 10.2%，n = 3），即使与胶原酶 E + 脱氧核酶 （中位数 8.18%、范围 4.7%-20.4%、n = 3） 相比，也未与 DNA 酶相比，也无DNA酶。胶原酶 D = 脱毛酶 （中位数 15.10%，范围 9.9%-21.4%，n = 3）。此外，我们在胶原酶 E 组中以 41.0% 的中位数（范围 37.1%-58.8%，n = 3）和胶原酶 D 组（范围 69.7%-95.5%，n = 3）、75.9% 的胶原酶 E + DNAe 中 90.0% 的中位数确定了附件一号 Vneg活/死蓝® 坏死细胞组，和80.3%在胶原酶D + 脱发酶组，分别（范围65.7%-79.5%，范围54.9%-89.9%，n = 3）。代表 FACS 图从 n ^1 动物在每组图1B所示。
为了进一步证明在病小鼠中使用此程序的可行MNC的一致性和产量的原理，在接受同源性BMT（CD45.1）后，对从CD45.2 BALB/c受体小鼠分离的MNC应用了多参数流细胞测定法。C57BL/6 供体）或合成 （CD45.1 BALB/c 供体） BMT 型号。使用绝对 MNC 数乘以流量细胞学分析获得的百分比门控免疫子集，可以计算和比较从 BMT 受体结肠中提取的供体 CD4+和 CD8+ T 细胞的平均绝对数（n = 4每组，图 2A。由于在此类小鼠模型中识别和/或定量化稀有免疫细胞群非常重要，我们评估了稀有的子集，包括合成和异体 BMT 模型中的供体衍生物 （CD45.1+） Foxp3+ T 调节细胞 （Treg）。显示从抗体染色的单细胞悬浮液中到达供体Treg细胞（CD4+ CD25+FoxP3+）的浇注策略（用红色箭头描绘的门序列;图 2B.使用这种方法，甚至罕见的子集，如捐赠者衍生的结肠Treg渗透受体小鼠结肠后，BMT可以进行分析（图2C，代表性图;n = 1）。
图 3显示了该方法在历史数据中的扩展应用，使用所呈现的协议比较了在 BALB/c 小鼠结肠中保护或未受保护的 GVHD 诱导 CD8+ 与 CD4+ 供体衍生的 T 细胞的积累从GVHD由BMT前治疗准备（调理）方案20。测试的先天方案包括800 cGy/骨髓性全身照射（TBI800）或非骨髓性TBI（400TBI），以及使用淋巴照射（TLI）进行照射的非骨髓性调理。节点，胸腺和脾脏与头骨，肺，四肢，骨盆和尾巴的屏蔽。所有调理与抗血细胞血清（ATS）相结合，一种免疫调节剂。早在BMT之后第6天，这种结肠MNC分离方案就产生了强大的流细胞学分析，与对脾脏和淋巴淋巴结（MLN）（图3A）等更富含淋巴细胞的GVHD靶器官的相同分析相比，20.在BMT受体（n = 7-10每个治疗组）中，结肠MNC的可重复分离允许对不同移植前条件治疗组之间供体CD8+效应器T细胞的绝对数量进行强有力的统计比较（图3B），产生重要的免疫表型数据，导致关键研究揭示GVHD保护的先天免疫机制，从TLI，而不是TBI前BMT调理。20
图1：流式细胞测定分析结肠MNC在第7天后BMT在异体小鼠模型系统时，与胶原酶E和D分离与脱热酶1。野生型 （WT） （ CD45.2+） BALB/c （H2Kd+） 小鼠从 CD45 基因 （CD45.1+） C57BL/6 供体小鼠 （异体 BMT， n = 每组 3） 接收 BMT。WT （CD45.2+） BALB/c 受体小鼠在 BMT 前 1 天施用 800cGy TBI （BALB/c）。在 BMT 之后的第 7 天，按照本手稿的方法制备接收结肠的单细胞悬浮液，使用胶原酶 E （100 U/mL）、胶原酶 E （100 U/mL） 和脱毛剂 1 （500 μg/mL）、胶原酶 D （500 μg/mL） 或胶原酶 D （500μg/mL）带脱发酶 1 （500μg/mL） （n = 3 每组）。细胞被染色的活/死UV450（活/死蓝），附件V-APC，H-2K d-PE，CD45.1-BV605，CD3-FITC，CD4-BV711，CD8-APC-Cy7，FoxP3-太平洋蓝，和CD11b-PE-Cy7抗体。（A） FACS 分析的加控策略.门 0，前散射 （FSC-A） 和侧散射 （SSC-A） 上的 MNC 用于识别白细胞的单细胞悬浮液;门1，禁止使用SSC-A的非单细胞;门2，禁止使用FSC-A的非单细胞;门3，识别附件五阳性（凋亡）和可修复的可活性染料活/死-UV450+附件五阴性（坏死）细胞子集。（B） 4个实验组在MNC中代表FACS地块的附件五和可修复的可修复性染料染色的封闭白细胞。N =1代表性小鼠每组：胶原酶E（100 U/mL），胶原酶E（100 U/mL）+脱发酶1（500微克/mL），胶原酶D（500微克/mL），胶原酶D（500微克/升）+脱核酶1（500微克/mL）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：在异体小鼠模型系统中，在BMT之后第7天对结肠MNC进行流动细胞测量。WT （CD45.2+） C57BL/6 （H2Kd-neg）和 BALB/c （H2Kd+） 小鼠从 CD45-共性 （CD45.1+） C57BL/6 和 BALB/c 供体小鼠 （合成或异体 BMT， n = 4 每个实验组） 接收 BMT。C57BL/6和BALB/c受体小鼠接受950cGy（C57BL/6）和800cGy（BALB/c）骨髓性TBI的先天调节方案，在BMT前一天提供。在BMT之后的第7天，按照本手稿的方法准备了受体结肠式MNC的单细胞悬浮液。细胞被染色活死-BV510，H-2K d-PE，CD45.1-BV605，CD4-FITC，CD8-APC-Cy7，CD25-太平洋蓝，FoxP3-AF647和CD11b-PE-Cy7抗体，每组N = 4只小鼠。（A） 均值 = SEM 绝对数 （日志 10） CD45.1= H-2kd-neg或 CD45.1= H-2kd= （捐助型，在每种情况下） CD11bnegCD4+和 CD8= T 细胞从第 7 天从接收者结肠分离调理后和CD45.1 C57BL/6（捐赠） = CD45.2 BALB/c （接收者） BMT。N = 每组 4 个。（B） FACS 分析的加控策略.门 0，前散射 （FSC-A） 和侧散射 （SSC-A） 上的 MNC 用于识别白细胞的单细胞悬浮液;门1，禁止使用SSC-A的非单细胞;门2，禁止使用FSC-A的非单细胞;门3，活细胞选择门4，BMT供体细胞分离与BMT受体来源分离;门5，选择供体非骨髓性细胞;门6，CD4+T细胞的选择性门控;门 7，CD4 +CD25+FoxP3+ T 调节 （Treg） 单元的单独门控。红色箭头表示向下钻取浇注策略。（C） 代表 FACS 地块 CD25 和 FoxP3 染色使用门控策略在 （B） 在条件后的第 7 天和 BMT 在 BALB/c 收带体 BMT （C57BL/6 _B/c） 的结肠中。每个门中的细胞百分比在门内给出。WT = 野生类型;TBI = 全身照射;BM = 10 x 106 CD45.1=基因 C57BL/6 或 BALB/c 供体骨髓细胞;Teff = T 效应细胞;Treg = Foxp3= T 调节细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：非骨髓性TLI/ATS，但不TBI/ATS调理降低供体TCR+++CD8+效应细胞积累。（A） 代表性FACS图的CD4和CD8染色门的H-2Kb+TCR++细胞从供体H-2Kb+ C57BL/6小鼠在脾脏（上行），淋巴淋巴结（MLN）（中行），和结肠（下排）的受体在白天6 调理和移植后。每个门中的单元百分比在门上方给出。（B） 均值 = SEM 绝对数 （日志 10） H-2Kb +TCR ++CD8+脾脏细胞（顶部面板），MLN（中间面板）和结肠（底部面板）的受体在条件调节和BMT 后的第6天。WT = 野生型;TBI = 全身照射;TLI =：淋巴照射总量;ATS = 抗血细胞血清;BM = 50 x 106 WT C57BL/6 供体骨髓细胞;SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 供体脾细胞;TBI800，TBI400 = cGy剂量的骨髓化（TBI800）或非骨髓性（TBI400）TBI。*这个数字已由范德梅尔韦等人20修改。版权所有 2013.美国免疫学家协会，公司请点击这里查看这个数字的较大版本。
| 解决 方案 | 公式 |
| 冒号缓冲区 | 500 mL RPMI = 10mM HEPES = 10% FBS（在 56oC 下热灭60分钟，pH 被调整至 7.3） |
| 硅基密度梯度介质 100%（每个冒号） | 22.5 mL的硅基密度梯度介质= 2.5 mL 的 10x PBS。 |
| 硅基密度梯度介质 66%（每个冒号） | 10.72 mL硅基密度梯度介质100% = 5.28 mL结肠缓冲液 |
| 硅基密度梯度介质 44%（每个冒号） | 11 mL硅基密度梯度介质100% = 14 mL结肠缓冲液 |
| 胶原酶消化缓冲液（每个冒号） | 100 U/mL 的胶原酶 E 从梭菌溶化物， 溶解在 40 mL结肠缓冲液中 |
| FACS 缓冲区 | 500 mL 1x PBS = 5 g BSA = 1 mm EDTA = 0.2 g Azide 钠 |
表1：溶液制备表。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
此视觉协议描述了用于分离结肠单核细胞（包括拉米那体淋巴细胞 （LPL）的耐受性好的方法。鉴于此方案在评估严重的移植后小鼠结肠炎模型时进行了优化，其中炎症细胞因子和组织损伤导致恢复的MNC生存能力较差，我们预计这些方法可以转化为其他需要结肠MNC的型态分析的应用程序。这些包括，但不限于评估炎症性肠病小鼠模型中的结肠炎症，研究结肠炎靶向治疗的免疫反应，以及传染性病原体产生的结肠炎。此外，我们在健康（合成BMT）小鼠中使用分离的数据表明，分离程序不需要明显的炎症渗透，以允许在MNC分离物中检测免疫细胞。事实上，类似的数据是使用未经治疗的的健康（非BMT）小鼠获得的（数据未显示）。
该协议的几个关键步骤使其区别于其他已发布的方法，并有助于提高产量和可行性。例如，优化梭菌组织溶化酶衍生胶原酶E活性（100 U/mL最终活性水平）允许对不同批次的酶进行一致的计算，在远距离实验中26。胶原蛋白家族中有28个不同的成员，它们加起来占哺乳动物体内所有蛋白质的近30%。27。此外，不同的组织有不同的胶原蛋白亚型分布，每个需要独特的胶原蛋白细胞消化28。来自C.性溶酶的胶原酶包括6种不同的蛋白质，分为两类29，30。所使用的胶原酶的特定类型可以改变从结肠31分离的细胞的生存能力和整体质量。先前的研究表明，胶原酶型C-2139（胶原酶E）允许从小肠25分离的MNC中高产量淋巴细胞。然而，这些协议没有解决结肠的消化，一个比小肠更复杂的胶原蛋白组成更肌肉的器官。
酶组织降解的充分性和可靠性是影响细胞整体产量和生存能力的既定因素，它最大限度地减少了反复发生机械损伤的需要（这会导致组织机械创伤增加）。由于使用胶原酶E特异性协议对间质和粘膜胶原蛋白进行充分的酶消化（与标准使用的胶原酶D介导消化协议相比），该协议最大限度地减少了破坏间质和释放免疫细胞子集到悬浮状态所需的组织片段。这进一步提高了隔离的MNC进行后续检测的可行性。如数据（图1B）所示，这消除了DNAE和其他化学或机械防结块操作的需要，超出了通过滤网对单个细胞悬浮液的标准过滤。其他报告概述肠道淋巴细胞的分离使用二硫磷脂醇（DTT）和EDTA作为粘解剂，以提高分离的单核白细胞24的产量和生存能力。
提高细胞产量的该协议的另一个独特方面是应用微调的硅基密度分离介质梯度。其他消化方法论文迄今发表的不使用这样的密度分离梯度21，31。然而，根据作者的经验和合作者利用该协议分离功能活跃的淋巴细胞的经验，密度梯度纯化提高了消化后恢复的MNC的生存能力和纯度19,20,32.
虽然不是本手稿的重点，但值得一提的是，那些使用小鼠肠道炎症模型的人可以修改本手稿中的方法，以便从小肠中类似高质量地分离可存活的 MNC。实现此目的所需的主要结肠协议的修改是使用单个 90 分钟消化（而不是两个 60 分钟消化），所有其他步骤（包括酶活性水平和淬火步骤）与所示步骤相同。这种修饰通常产生范围 0.8-4 x 106 MNC 每个小肠没有或 1.5-2.5 x 106 MNC 与包括端膜，包括富含白细胞的阴囊帽。因此，该协议的一个新颖之处是，将主协议应用于结肠和修改的协议到小肠，可以分离MNC具有高可重复性和良好的生存能力从小肠和结肠的个体实验动物在同一实验。
总之，所述协议允许从结肠或小肠中有效和可重复地分离单核细胞。在2名熟练的操作者共同工作下，一天内可以处理和分析多达10个单独的结肠，单细胞悬浮液可以在组织收获后6-8小时内进行后续型型和功能分析。该协议的应用可能证明有价值的其他研究目标需要免疫评估结肠炎症，允许其他研究者描述小鼠结肠的免疫系统以严格和可重复的方式。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了#1K08HL088260和#1R01HL133462-01A1（NHLBI）（A.B.P.，H.N.，S.J.）和巴切洛尔儿科研究基金会（D.M.，H.N.，S.J.，A.A.H.，A.B.P.）的支持。本研究中使用的C57BL/6和BALB/c小鼠要么在我们的工厂中繁殖，要么由杰克逊实验室或塔科尼奇提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B.
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J.
- Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F.
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M.
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
