Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.
Abstract
המעי הוא הבית למספר הגדול ביותר של תאים חיסוניים בגוף. המעי קטן וגדול מערכת חיסונית המשטרה חשיפה לאנטיגנים אקסוגני ולווסת את התגובות החזק מיקרוביואלי החיסון הנגזרות. מסיבה זו, המעי הוא אתר היעד העיקרי של חוסר תקנה חיסונית ודלקת במחלות רבות, כולל אבל, לא מוגבל למחלות מעיים דלקתיות כגון מחלת קרוהן כיבית קוליטיס, השתל-מול-מארח מחלה (GVHD) לאחר העצם השתלת מח עצם (BMT), ומצבים אלרגיים וזיהומיות רבים. מודלים murine של דלקת במערכת העיכול ו קוליטיס משמשים בכבדות כדי לחקור סיבוכים GI ו-קלינית מיטוב אסטרטגיות למניעה וטיפול. נתונים שנאסף מן המודלים האלה באמצעות בידוד וניתוח פנוטימית של תאים חיסוניים מן המעי הוא קריטי כדי הבנה חיסונית נוספת שניתן להחיל על מערכת העיכול שפר הפרעות דלקתיות מערכתית. דו ח זה מתאר פרוטוקול אפקטיבי ביותר לבידוד של תאים מוננועיים (MNC) מהמעי הגס באמצעות ממשק מעבר הדרגתי מעורב בדחיסות מבוססת סיליקה. שיטה זו בונה מבודד מספר משמעותי של לוקיציטים קיימא תוך מזעור פסולת מזהם, ומאפשר פנוטיפים החיסונית הבאים על ידי הזרימה cy, try או שיטות אחרות.
Introduction
למרות מערכת העיכול (GI) במערכת מוקדש בעיקר עיבוד וספיגה חוזרת של חומרים מזינים מזון, במערכת GI גם שומר על תפקידים מרכזיים ביושרה של כלי הדם, הלימפה, והעצבים של איברים רבים אחרים באמצעות המערכת החיסונית שלה submucosal1. מערכת החיסון GI יש תפקיד רב השפעה הן בריאות המערכת העיכול ומערכתית בשל החשיפה המתמדת שלו אנטיגנים זרים ממזון, בקטריה של הקומנדנט, או פולשים פתוגנים1,2. לכן, מערכת החיסון GI חייב לשמור על איזון עדין שבו היא סובלנית אנטיגנים שאינם פתוגניים תוך התגובה בהתאם אנטיגנים פתוגניים1,2. כאשר האיזון של סובלנות והגנה מופרת, מקומי או מערכתית החיסונית חוסר תקנה ודלקת יכול להתרחש כתוצאה מספר עצום של מחלות1,2,3.
המעי נמלים לפחות 70% של כל תאי הלימפה בגוף4. האינטראקציות הראשוניות ביותר במערכת החיסונית כרוכות לפחות באחת משלוש תחנות החיסון במעי: 1. כתמים של Peyer, 2) לימפוציטים האפיתל (אל-על) ו-3) לימפוציטים באופן מרכזי (LPL). כל אלה מורכב רשת מורכבת מחוברים של תאים חיסוניים המגיבים במהירות לאתגרים החיסונית נורמלי בבטן5. מוגבל לסטרומה מעל המוסקולריס mucosae, מובנה לאמינה מובנית היא רקמת החיבור של רירית הבטן וכולל פיגומים על הוויאוס, הוזוקולטורה, ניקוז הלימפה, מערכת העצבים mucosae, כמו גם מולדים רבים ומערכת המשנה החיסונית. האדפטיבית6,7,8,9 LPL הם מורכבים CD4+ ו CD8+ T תאים ביחס משוער של 2:1, תאים פלזמה ותאים השושלת המייאלואידית כולל, תאים דנדריטים, התורן תאים, אאוזיפרפילים ו מקרופאגים6.
יש עניין הולך וגובר בהבנת הדיסתקנה החיסונית ודלקת הבטן כפי שהיא מתייחסת למצבי מחלה שונים. תנאים כגון מחלת קרוהן ו קוליטיס כיבית כל מניפסט רמות שונות של דלקת במעי הגס10,11,12. בנוסף, חולים עם הפרעות ממאירות או שאינן ממאירות של מח או מערכת החיסון אשר עוברים השתלת מח עצם allogeneic (allo-BMT) יכול לפתח צורות שונות של קוליטיס כולל 1) רעילות ישירה מתוך התניה משטרי לפני bmt, 2) זיהומים נגרמת על ידי דיכוי חיסוני לאחר bmt ו 3) השתל-מול-מארח מחלה (gvhd) מונע על ידי מסוג התורם תאים T מגיב התורם allo-אנטיגנים ברקמות לאחר bmt13,14,15. כל אלה post-bmt סיבוכים לגרום שינויים משמעותיים בסביבה החיסונית של המעיים16,17,18. השיטה המוצעת מאפשרת הערכה מהימנה של הצטברות תאים חיסוניים במעי הגס של העכבר, כאשר מוחל על הנמענים murine לאחר BMT, מקלה על היכולת היעילה של שני התאים החיסוניים של התורם והנמען המעורבים סובלנות השתלה19 ,20. גורמים נוספים לדלקות בטן כוללים ממאירות, אלרגיה למזון, או שיבוש מיקרובידום המעיים. פרוטוקול זה מאפשר גישה של תאים מונוליניים המעיים מן המעי הגס, עם שינויים, לוקיציטים של המעי הדק בכל אחד מדגמי murine אלה טרום קלינית.
חיפוש בתוך באמצעות מונחי החיפוש "המעי והתא החיסונית ובידוד" חושף מעל 200 פרסומים המתארים שיטות עיכול קטן כדי לחלץ תאים חיסוניים. עם זאת, החיפוש ספרות דומה לתשואות המעי הגס לא היטב פרוטוקולים המציין בידוד של תאים חיסוניים מן המעי הגס. זה יכול להיות בגלל המעי הגס יש יותר שרירי וביניים בשכבות, עיבוד זה קשה יותר לעכל לחלוטין מאשר המעי הדק. בניגוד לפרוטוקולים קיימים, פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי בקולאגנאז E מתוך קלוסטרידיום hiסטוליום ללא הקולגן האחרים בקטריות (קולאגנאז D/קולאגנאז I). אנו מדגימים כי, באמצעות פרוטוקול זה, העיכול של רקמת המעי הגס ניתן להשיג תוך שמירה על איכות הבטן מבודדים תאים חיסוניים ברורים (MNC) ללא תוספת של ריאגנטים נגד החלקה כגון נתרן versenate (EDTA), Dispase השני, ו ביטול הכרה i (dnase)21,22,23. פרוטוקול זה הוא ממוטב כדי לאפשר הפקת חזקה מיותרת של MNC קיימא מן הנקודתיים murine עבור מחקרים מכוונים נוספים צריך להשאיל את עצמו למחקר של אימונולוגיה של המעי הגס או (עם שינויים) את המעי הדק24, . עשרים וחמש
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים נערכו תחת פרוטוקולי מחקר מכרסמים שנסקרו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי מילר בית הספר לרפואה, אשר עונה על הסטנדרטים הוטרינרים שנקבעו על ידי האגודה האמריקנית עבור מדע בעלי חיים במעבדה (AALAS).
1. הכנת פתרונות
-
כפי שמתואר בטבלה 1, להכין את מאגר המעי הגס, מבוסס סיליקה צפיפות ההפרדה מדיה 100%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 66%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 44%, כגון מאגר העיכול E, ו-FACS מאגר.
- הכן את מאגר המעי הגס ביום שלפני ההליך ואחסן לילה ב -4 ° c.
- להכין 100% סיליקה מבוסס צפיפות מדיה הפרדה ביום לפני ההליך ומאוחסן לילה ב 4 ° c, הצבת טמפרטורת החדר בבוקר של ההליך להפשיר.
- הכינו 66% ו-44% מדיית הפרדה מבוססת סיליקה בבוקר הבידוד, באמצעות טמפרטורת החדר 100% מבוסס על דחיסות סיליקה הפרדה מדיה ומאגר קולון.
- למדוד את הכמות המתאימה של היסטרידיוםהנגזרים-הנגזרת הקולגן וחנות ב-20 ° c לילה לפני ההליך. למחרת בבוקר, מתמוסס את הנפח המתאים של מאגר המעי הגס לגזור מאגר העיכול קולגן. עבור כל incubations עם מאגר העיכול קולגן ביום ההליך, לחמם מראש את הפתרונות 37 ° c.
- עבור כל שלבי הפרוטוקול, לשמור צנטריפוגה אחת ב 20 ° צ' ואת מהירות הסיבוב של 859 x g, עם הבלמים מופעל (0 להאט) עבור הדרגתי צנטריפוגה. הגדר אחר ל -4 ° צ' ומהירות סיבוב של 859 x g, עם ההאטה הסטנדרטית, לשטיפת המדרגות.
2. קצירת המעי הגס
- המתת חסד העכבר באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו aalac מאושר confirmatory שיטה.
- מניחים את העכבר במצב פרקדן ולרסס את הפרווה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים הרקמה הגדולה, לעשות חיתוך קו האמצע אנכית לחשוף את צפק שלם.
- , שימוש במספריים לחיתוך משובח. פתח את הצפק מלקחיים להשתמש כדי להזיז את המעי הקטן בצד אחד ולחשוף את המעי הגס יורד. משוך מעט כלפי מעלה על המעי הגס יורד כדי לחשוף את החלק הרקטלי של המעי הגס. חותכים את הרקטום העמוק באגן ומנתחים ומסירים את המעי הגס כולו כיחידה אחת, מהרקטום המרוחק לכובע cecal.
- העבר את המעי הגס ב 20 mL מקורר מאגר קולון בצינור פוליפרופילן 50 mL.
3. ניקוי המעי הגס
- מניחים את המעי הגס על מגבת נייר לחלח לחלץ את הצואה מוצק על ידי החלת לחץ קל על קיר המעי עם קצה קהה של מספריים או מלקחיים.
- מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי ומרוקן את הבטן עם 10 מ ל של מאגר קולון מקורר באמצעות מזרק 10 מ ל עם 18 גרם מילוי קהה.
- העבר את המעי הגס למאגר של מאגר המעי הגס, והסר את המצע המעי והשומן עם הקצה החד של המספריים.
- מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי מלא 5-10 mL מקורר מאגר המעי הגס מאוד באופן ידני כדי לשטוף את השאר תוכן חוקן. חזור על 2-3 פעמים.
- חותכים את longitudinally המעי הגס מן הקצה שלה שרירי יותר המעי הגס האבובית (יצירת פיסת המעי הגס בודד פתוח מלבני) בצלחת פטרי מלא עם מאגר המעי הגס טרי מקורר. התעלם ממדיה קיימת ומלא מילוי עם מאגר נקודתיים נקי ומקורר.
- לשטוף את המעי 3 פעמים על ידי במרץ מתערבל אותו בצלחת פטרי והחלפת 5-10 mL של מאגר קולון מקורר לאחר עם כל כביסה.
- מניחים את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר שלחלח מאגר המעי הגס וחותכים אותו על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לרסיסים קטנים (3 מ"מ x 3 מ"מ סעיפים).
- לאסוף את שברי המעי הגס בזהירות באמצעות מלקחיים עדין לתוך 20 מ"ל מקורר מאגר קולון בשפופרת פוליפרופילן 50 mL.
- לשטוף את שברי המעי הגס 3 פעמים, כל לשטוף ב 20 מ"ל מאגר המעי הגס, על ידי מתערבל במרץ את הצינור עבור 30 s. בין כל עצבנות, לאפשר שברי הרקמה להתיישב בתחתית הצינור. Decant או ואקום משאוב את supernatant תוך מניעת אובדן של הרקמה בתהליך השאיפה בין כל כביסה.
הערה: אין צורך לשנות את הצינור לאחר כל כביסה.
4. קולגן העיכול 1
- הוסף 20 מ ל של מאגר העיכול קולגן כדי שברי המעי הגס שטוף בצינור 50 mL פוליפרופילן חרוט.
- מניחים את הצינור הסגור 50 mL ב 37 ° c בתוך שייקר מסלולית מודחטת עם קצב הסיבוב להגדיר ב 2 x g עבור 60 דקות. להבטיח את שברי הרקמה בתנועה מתמדת במהלך עצבנות; במידת הצורך, הגדילו את קצב הסיבוב בהדרגה כדי להבטיח שרסיסי רקמות לא יתיישבו לתחתית הצינורית.
5. הכנת מעברי צבע סיליקה מבוססי מדיה הפרדה
- הכינו 66% ו 44% מבוסס על דחיסות סיליקה מדיה הפרדה, באמצעות 100% מבוסס סיליקה צפיפות מדיה הפרדה ב 20 ° צ' (טמפרטורת החדר) ומאגר קולון.
- יוצקים 5 מ ל של 66% מבוסס סיליקה דחיסות הפרדה מדיה לתוך כל אחד 3 שונים 15 מ ל צינורות פוליפרופילן. להכין 3 צינורות לכל המעי הגס. פעולה זו מהווה את בסיס הצפיפות הגבוהה יותר של פרוצדורת הבידוד של מעבר הצבע, שאליה מדיה הפרדה בצפיפות נמוכה יותר תהיה שכבתית כדי ליצור את מעבר הצבע של ההפרדה.
- החנות ב -20 ° c עד השימוש.
6. אוסף של סופרנטאנט מעיכול 1
- לאסוף רק את supernatant באמצעות צינורות 25 מ ל ולסנן את supernatant באמצעות הנקבוביות 40 יקרומטר מסננת תא בד הממוקם לתוך צינור נקי של פוליפרופילן 50 mL, לאחר העיכול מקולגן 1 הושלמה. להיזהר לא לאכול כל שברי רקמה קיימים.
הערה: שמור את כל חלקי הרקמה הגלויים בצינור. אלה יעברו העיכול השני הקולגן (שלב 8).
7. קוצ'ינג מאגר העיכול
- למלא את צינור פוליפרופילן 50 mL לחלוטין עם מאגר קולון מקורר.
הערה: קולאגנאז פעיל ב 37 ° c; מכאן מאגר מקורר מפעיל את האנזים. - צנטריפוגה את הצינור ב 4 ° צ' ב 800 x g עבור 5 דקות.
- השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום. לשטוף תאים עם 25 מ ל של מאגר קולון טריים צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות.
- השהה מחדש את הגלולה בפחות מ-1 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר.
- מניחים את שפופרת פוליפרופילן 50 mL על קרח.
8. מיכל העיכול 2
- חזור על שלב 4 (עיכול 1) עם שברי הרקמה הנותרים שנשמרו משלב 6.1.
9. מצבור רקמות לאחר העיכול 2
- ריקון שברי הרקמה הלוך ושוב בין הצינור ומזרק 10 מ ל דרך מחט 18 G קהה-end.
- חזור על רצף זה למינימום של 7-8 מעברים מלאים, והמשך עד שלא ניתן לראות שברי רקמה ברוטו או פסולת.
10. סנן תאים
- להעביר את הבולם את הרקמה השעיה דרך מסננת מ40 μm-הנקבוביות תא בדים במרקם לתוך שפופרת נקי של פוליפרופילן 50 mL.
- לשטוף את הסינון תא בד מסננת עם 10 mL מקורר מאגר קולון כדי לשחזר את כל התאים הנסנרות במסנן.
11. קוצ'ינג קולינג העיכול
- ממלאים את צינור 50 mL פוליפרופילן חרוט לחישוק עם מאגר קולון מקורר.
הערה: הטמפרטורה של מאגר המעי הגס הוא קריטי כדי להבטיח מקוצ'ינג של פעילות הקולגן. - ספין ב 4 ° צ' ו 800 x g עבור 5 דקות.
- השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.
- לשטוף על ידי השעיית מחדש 25 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר, ואחריו צנטריפוגה ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.
- השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.
- הבריכה את הגלולה מושעה מ העיכול הקולגן 1 (שלב 7) לצינור המקביל שלה משלב 11.4.
- חזור על שלב 11.4 (שטוף וצנטריפוגה).
12. הפרדת מדיה בצפיפות סיליקה מבוססת הפרדה
הערה: בצע את שלבים 12-18 במהירות האפשרית, כדי להבטיח מהירות מהירה של פעילות הקולגן.
- לאחר שלב 11.7, השהה מחדש כל גלולה ב-24 מיל סך של 44% מדיית הפרדה בדחיסות מבוססת סיליקה לכל נקודתיים.
- שכבה איטית 8 מ ל של התקשורת משלב 12.1 על כל אחד משלושת הצינורות המוכנים בשלב 5.2 (המכיל 66% הפרדה בצפיפות ההפרדה מדיה), באמצעות צינורות 10 מ"ל. שמור על זרימה יציבה ואיטית של 44% מדיית הפרדת הצפיפות באמצעות שכבות המילוי על מנת למנוע הפרעה של הממשק.
- איזון בזהירות כל הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות קנה מידה או שיווי משקל.
- ספין את הצינורות 20 דקות ב 859 x g בצנטריפוגה ללא בלם ב 20 ° c. אפשר לרוטורי להגיע למנוחה מוחלטת לפני הסרת הצינורות, ומטפלים לא לשבש את התאים בממשק מעבר הצבע.
13. לאסוף תאים מונמונומנט מתוך ממשק מעבר צבע
- המחש את ממשק מעבר הצבע (קרוב ל-5 מ"ל), שם בדרך כלל להקה לבנה בעובי 1-2 מ"מ (המכילה MNC) קיימת.
הערה: אחד יכול או לא יכול לראות להקה לבנה. עם זאת, MNC יהיה בממשק זה, צריך לענן את הבהירות של ממשק מעבר הצבע. - ואקום משאוב ולהשליך את העליון 7 מ ל של מעבר הצבע העליון כדי לאפשר הפיפטה קל גישה לממשק.
- באמצעות יניקה ידני שאיבה רציפה תנועה יציבה מסתובבת, לאסוף את שכבת הממשק של תאים לתוך צינור נקי 50 mL פוליפרופילן חרוט. לאסוף עד הממשק בין 2 הדרגתיות הוא ברור ו שבירה (ניקוי של תאים).
- ממלאים את צינור האוסף עם 50 mL של מאגר FACS מקורר. ספין ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.
- לשאוב את הסופר באמצעות שאיפה ואקום ולהשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר FACS.
- לספור את התאים על הומוציטוטומטר בדילול 1:2 באמצעות שיטות אי הכללה של תא מת מתאים.
- המשך לצביעת FACS או מספר אחר עם המעי הגס מבודד טרי MNC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר עובדים עם מחלת המעי הגס מודל מודלים, זה מועיל להיות מסוגל להעריך הן לכמת באיכות איכותית, בין MNC של המעי הגס, מספר קבוצות מערכות החיסון מעורב בתהליך דלקתי. השעיית תא יחיד של MNC שהושג באמצעות היישום של פרוטוקול זה מאפשר אפיון פנוסטילי כזה בצורה איתנה וללא שימוש. כהוכחה לעיקרון היישום של שיטת בידוד זו תחת הגדרות ניסיוני מגוונות, החזרנו את המעי הגס באמצעות שיטה זו וביצעו מרובת פרמטרים זרימה cy, לנסות על תאים מבודדים מעכברים עם (איור 1 ו איור 2 , אלוגנאית BMT) וללא (איור 2A, SYNGENEIC bmt) משמעותי החיסון בתיווך המעי הגס לאחר bmt.
Cytometry זרימה וניתוח נתונים בוצעו כדי להשוות את השברים של לימפוציטים מתים האפוטוטיים ו נקרוטיק בעת שימוש או קולגן או D עבור בידוד, עם או בלי טיפול DNase 1. האסטרטגיה שבה נעשה שימוש במהלך הזרימה cy, try מסופקת באיור 1A. בעקבות המבקר החמישי (ואפופטוזיס) והתקן לתיקון כחול חי/מת (נמק סמן) מכתים על השבלי של תא יחיד בעקבות כל בידוד, קולאגנאז E ללא DNAse הראה אחוז גבוה יותר משמעותית של אנשין Vמינוס חי/מת כחולמינוס תאים חיים (חציון 43.3%, טווח 26.5%-59.9%, n = 3) לאחר בידוד בהשוואה לקולגאז D ללא dnase (חציון 8.7%, טווח 3.6%-10.2%, n = 3), גם כאשר בהשוואה ל-"קולאגנאז E + DNAse" (חציון 8.18%, טווח 4.7%-20.4%, n = 3) או כיצד לעשות זאת (החציון 15.10%, טווח 9.9%-21.4%, n = 3). בנוסף, זיהינו אנשין Vשליליחי/מת כחול + נמק באחוז החציוני של 41.0% בקבוצת הקולגן של הקבוצה (טווח 37.1%-58.8%, n = 3) לעומת 90.0% בקבוצת הקולגן של הקבוצה (טווח 69.7%-95.5%, n = 3), 75.9% בקולגנז ו-DNAse קבוצה, ו 80.3% בקבוצת הקולנדאז D + DNAse, בהתאמה (טווח 65.7%-79.5%, טווח 54.9%-89.9%, n = 3). מגרשי FACS מייצגים מ n = 1 בעלי חיים בכל קבוצה מוצג איור 1B).
כמו הוכחה נוספת של העיקרון של עקביות ותשואה של MNC קיימא באמצעות הליך זה בעכברים חולים, הזרימה הרב פרמטרית cy, לנסות הוחל על MNC מבודד CD 45.2 BALB/c עכברים הנמען ביום 7 לאחר קבלת BMT של או אלוגנמית (CD 45.1 C57BL/6 תורם) או syngeneic (CD 45.1 BALB/c תורם) BMT מודלים. שימוש מספרים MNC מוחלטים מוכפל על ידי מערכות המשנה החיסונית מגודרת אחוז שהתקבלו על ידי הניתוח cy, ממוצע המספרים המוחלט של התורם CD4+ ו CD8+ T תאים שחולצו מן המעי הגס של הנמען bmt יכול להיות מחושב ובהשוואה (n = 4 לכל קבוצה, איור 2A). כיוון שהוא יכול להיות חשוב לזהות ו/או בקוונט אוכלוסיות נדירות תא החיסונית במודלים עכבר כגון, אנו העריכו קבוצות משנה נדירות כולל התורם נגזר (CD 45.1+) Foxp3+ T תאים רגולציה (treg) בשני מודלים syngeneic ו-allogeneic bmt. האסטרטגיה לאחר הפעולה כדי להגיע תאים Treg התורם (CD4+CD25+FoxP3+) מן ההשעיה מוכתם הנוגדן תא יחיד מוצג (רצף של שערים התחום על ידי חץ אדום; איור 2B). באמצעות שיטה זו, אפילו קבוצות משנה נדירים כגון התורם הנגזר המעי הגס Treg החדירה העכבר המעי הגס לאחר BMT יכול להיות מנותח (איור 2C, העלילה הנציג; n = 1).
איור 3 מציג יישום מורחב של שיטה זו בנתונים היסטוריים מהקבוצה שלנו באמצעות הפרוטוקול המוצג כדי להשוות את הצטברות של gvhd-מCD8 + לעומת CD4 + תורם-נגזר תאים T במעי הגס של balb/c עכברים מוגנים או לא מוגן מ-GVHD על ידי ההכנה לטיפול טרום BMT (התניה) משטר20. משטרי נבדק שנבדקו כללה 800 cGy/myeloablative הקרנה הגוף הכולל (TBI800) או non-myeloablative TBI (400TBI), כמו גם מיזוג nonmyeloablative באמצעות הקרנה הלימפה הכולל (TBI) שבו הקרנה נמסרה ללימפה צמתים, בלוטת התימוס, ואת הטחול עם מיגון של הגולגולת, הריאות, הגפיים, האגן והזנב. כל התניה בשילוב עם סרום אנטי thymocyte (ATS), סוכן אימונומודולטי. מוקדם ככל היום 6 לאחר bmt, זה פרוטוקול בידוד mnc של המעי הביא לניתוח חזק cy, הזרימה לעומת ניתוח זהה על לימפוציטים יותר מועשר באברי היעד gvhd כגון הטחול ובלוטות הלימפה מצע (איור 3a)20 . בידוד הזרע של החוקן MNC על פני נמעני BMT (n = 7-10 לכל קבוצת טיפול) מותר עבור השוואה סטטיסטית חזקה של מספרים מוחלטים של התורם CD8+ אפקטור T תאים בין קבוצות שונות של טיפול טרום השתלת מיזוג ( איור 3B), מניב נתונים חשובים על פנוטיפים החיסונית שהובילו למחקרים מרכזיים החושפים את מנגנוני החיסון המולדת של הגנת gvhd מ tli לעומת tli PRE-bmt מיזוג. מיכל בן 20
איור 1: ניתוח ציטומטלי זרימה של חוקן MNC ביום 7 לאחר BMT במערכות מודל אלוגנאית העכבר כאשר מבודדים עם קולגן ו-D עם ובלי DNAse 1. פראי סוג (WT) (CD 45.2+) balb/c (H2Kd +) עכברים קיבלו bmt מ CD45 congenic (cd 45.1+) C57BL/6 עכברים תורם (allogeneic bmt, n = 3 לכל קבוצה). WT (CD 45.2+) balb/c עכברים הנמען היו מנוהלים 800cGy tbi (balb/c) 1 יום לפני bmt. ביום 7 לאחר BMT, השעיות של תא בודד של נקודתיים של הנמען הוכנו בעקבות השיטות של כתב יד זה עם השימוש בקולגנאז E (100 U/mL), קולגנאז E (100 U/mL) עם DNAse 1 (500 μg/mL), קולגנאז D (500 μg/mL), או כגון קולגן D (500μg/mL) עם DNAse 1 (500μg/mL) (n = 3 לכל קבוצה). התאים היו מוכתמים חי/מת-UV450 (חי/מת כחול), מנגמ ש V-APC, H-2Kd-PE, cd 45.1-BV605, CD3-fitc, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-פסיפיק כחול, ו CD11B-PE-Cy7 נוגדנים. (א) לעבור על האסטרטגיה עבור ניתוחי facs. שער 0, פיזור קדמי (fsc-a) ופיזור הצד (המטה-מתקדם-א) על השעיית תא בודד של mnc המשמש לזיהוי לוקיציטים; שער 1, אי הכללה של תאים שאינם בודדים באמצעות היחידה למניעת השימוש בהאס. שער 2, הדרה של תאים שאינם בודדים באמצעות fsc-A; שער 3, זיהוי של מערך מערכות המשנה (האפוטוטיק) והיכולת לתקן את היכולת לתקן חיים/DEAD-UV450+אנשין-שלילי (נקרוטיק). (ב) מתווה facs של אנשין V וכתמים לתיקון הכדאיות של הלוקוציטים מגודרת בקרב mnc עבור 4 הקבוצות הנסיוניות. N = 1 עכבר נציג לכל קבוצה בקבוצות: קולאגנאז E (100 U/mL), קולגנאז E (100 U/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL), קולגנאז D (500 μg/mL), וקולגנאז D (500 μg/mL) + DNAse 1 (500 μg/ml). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: האפיון של זרם הציטומטק של המעי הגס MNC ביום 7 לאחר BMT במערכות מודל אלוגנאית ו syngeneic. WT (CD 45.2+) C57BL/6 (H2Kd-מינוס) ו-BALB/c (H2Kd +) עכברים קיבלו bmt מ CD45-congenic (cd 45.1+) C57BL/6 ו balb/c בעכברים תורמים (syngeneic או allogeneic bmt, n = 4 לכל קבוצה ניסיונית). C57BL/6 ו-BALB/c עכברים הנמען קיבלו מיזוג משטרי של 950cGy (C57BL/6) ו 800cGy (BALB/c) myeloablative TBI, נמסר יום אחד לפני BMT. ביום 7 לאחר BMT, השעיות של תא בודד במעי הגס של הנמען הוכנו בעקבות השיטות של כתב היד הזה. תאים היו מוכתם חי-dead-BV510, H-2Kd-PE, cd 45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-CY7, CD25-PacificBlue, FOXP3-AF647, ו CD11B-PE-Cy7 נוגדנים, N = 4 עכברים לכל קבוצה. (א) ממוצע± SEM מספר מוחלט (log 10) cd 45.1+ h-2kd-שלילי או cd 45.1+ h-2kd + (מסוג תורם, בכל מקרה) CD11bשליליCD4+ ו CD8+ T תאים מבודדים מתוך נקודתיים הנמען ביום 7 לאחר התניה ו-CD 45.1 C57BL/6 (תורם) → תקליטור 45.2 BALB/c (הנמען) BMT. N = 4 לכל קבוצה. (ב) המשך אסטרטגיה לניתוחי facs. שער 0, פיזור קדמי (fsc-a) ופיזור הצד (המטה-מתקדם-א) על השעיית תא בודד של mnc המשמש לזיהוי לוקיציטים; שער 1, אי הכללה של תאים שאינם בודדים באמצעות היחידה למניעת השימוש בהאס. שער 2, הדרה של תאים שאינם בודדים באמצעות fsc-A; שער 3, לחיות בחירת תא השער 4, הפרדה של תאים המטפאות של תורם bmt לעומת מוצא הנמען bmt; שער 5, מבחר של תאי השושלת הבלתי מיאלואידית של התורם; שער 6, בררני של CD4+ T תאים; שער 7, הפרדה נפרדת של CD4+CD25+FoxP3+ T (treg) תאים. החץ האדום מציין מקדחה. לאורך האסטרטגיה (ג) מגרשים הנציג של CD25 ו FoxP3 מכתים באמצעות האסטרטגיה לדון ב (ב) ביום 7 לאחר מיזוג ו bmt במעי הגס של הנמען balb/c של bmt (C57BL/6 → balb/c). אחוז התאים בכל שער ניתן בתוך השער. WT = סוג פראי; TBI = סך הכל הקרנה של הגוף; מוניטור = 10 x 106 cd 45.1+ congenic C57BL/6 או balb/c בתאי מח עצם תורם; Teff = T אפקטור תאים; Treg = Foxp3+ T תאים רגולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: Non-myeloablative TLI/ATS אך לא TLI/ATS מיזוג מקטין את התורם TCRαβ+CD8 הצטברות תא T. (א) מגרשים של facs המייצג CD4 ו CD8 כתמים של h-2kb +TCRαβ+ תאים מ-h-2kb + C57BL/6 עכברים בטחול (בשורה העליונה), צומת הלימפה מצע (mln) (שורהאמצעית), ו נקודתיים (השורה התחתונה) של הנמענים ביום 6 לאחר התניה השתלת. אחוז התאים בכל שער ניתן מעל השער. (ב) כלומר ± SEM מספר מוחלט (log 10) H-2kB +TCRαβ+CD8+ תאים בטחול (הפאנל העליון), mln (הפאנל האמצעי), ו נקודתיים (הפאנל התחתון) של הנמענים ביום 6 לאחר מיזוג ו-bmt. WT = פראי; TBI = סך הכל הקרנה של הגוף; TLI =: הקרנה סה כ הלימפה; הנסיוב האנטי-תימוציט BM = 50 x 106 WT C57BL/6 בתאי מח עצם תורם; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 תאים הטחול תורם; TBI800, TBI400 = cGy מינונים של myeloablative (TBI800) או אי-myeloablative (TBI400) TBI. * הדמות הזאת שונתה מוואן דר Merwe ואח '20. זכויות יוצרים 2013. האגודה האמריקנית לאימונוולוגים, Inc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פתרון | נוסחה |
| מאגר נקודתיים | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (חום מופעל ב 56oC עבור 60 דקות, pH מותאם ל 7.3) |
| מדיית דחיסות מבוססת-סיליקה 100% (לכל נקודתיים) | 22.5 mL של דחיסות מבוססת סיליקה הדרגתי מדיה + 2.5 mL של 10X PBS. |
| מדיית דחיסות מבוססת-סיליקה 66% (לכל נקודתיים) | 10.72 mL מבוסס סיליקה מבוססת מעבר מדיה 100% + 5.28 ML מאגר המעי הגס |
| מדיית דחיסות מבוססת-סיליקה 44% (לכל נקודתיים) | 11 מ"ל מבוסס סיליקה מבוססי מדיה 100% + מאגר המעי הגס של 14 ml |
| מאגר העיכול (לכל נקודתיים) | 100 U/mL של הקולגן של המעי הגס מתוך קלוסטרידיום hiסטוליום, הומס 40 ML מאגר קולון |
| מאגר FACS | 500 מ"ל 1x PBS + 5 גרם BSA + 1 מ"מ EDTA + 0.2 g נתרן עזידה |
טבלה 1: טבלת הכנה לפתרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול חזותי זה מתאר שיטות נסבל היטב עבור בידוד של תאים מוננועיים במעי הגס כולל לימפוציטים קיננה (LPL). בהינתן כי פרוטוקול זה היה אופטימיזציה בהערכת חמור לאחר השתלת מודלים העכבר כאשר ציטוקינים דלקתיים ופציעה רקמות להשאיל את עצמם הכדאיות הירודה של MNC התאושש, אנו מצפים כי שיטות אלה ניתן לתרגם לאחרים יישומים המחייבים ניתוח פנוסטימית של חוקן MNC. אלה כוללים אך, אינם מוגבלים להערכת דלקת המעי הגס במודלים של העכבר של מחלת המעי הגס, מחקרים של תגובות החיסונית של טיפול קוליטיס ממוקד, קוליטיס המיוצר על ידי פתוגנים זיהומיות. בנוסף, הנתונים שלנו באמצעות מבודדים בריאים (syngeneic BMT) עכברים מצביעים על הליך הבידוד אינו דורש לחדור דלקתית משמעותית כדי לאפשר זיהוי התא החיסונית בבידוד MNC. אכן, נתונים דומים הושגו באמצעות עכברים בריאים (non-BMT) לא מטופל (נתונים לא מוצגים).
כמה צעדים מרכזיים של פרוטוקול זה להבדיל אותו משיטות שפורסמו אחרים ולתרום תשואה גבוהה ויכולת קיום. למשל, אופטימיזציה של קלוסטרידיום hiסטוליום-הנגזרת הקולגן בפעילות E (100 U/mL רמת הפעילות הסופית) מאפשר חישובים עקביים עבור המון אנזימים שונים על ניסויים ארוכי טווח26. ישנם 28 חברים שונים במשפחת הקולגן, יחד מהווים כמעט 30% מכלל החלבונים בגוף היונקים27. בנוסף, ברקמות שונות יש הפצות ברורות של תת קולגן, כל אחד המחייב הקולגן הייחודיים לעיכול28. קוליגנאז מ -C. hi, שבמרפסת-הגג כולל 6 חלבונים שונים המסווגים לשתיכיתות 29,30. סוג מסוים של הקולגן בשימוש יכול לשנות את הכדאיות ואת האיכות הכללית של התאים מבודדים מן המעי הגס31. המחקרים הקודמים הוכיחו כי הקולגן בסוג C-2139 (קולאגנאז E) מאפשר תשואה גבוהה של לימפוציטים בין MNC מבודדים מהמעי הקטן25. עם זאת, פרוטוקולים אלה לא כתובת העיכול של המעי הגס, איבר שרירי הרבה יותר עם הרכב קולגן מורכב יותר משמעותית מאשר המעי הדק.
הלימות והמהימנות של השפלה רקמות אנזימטית היא גורם מבוסס המשפיע על התשואה הכוללת של התא והכדאיות על ידי מזעור הצורך בהפרעה מכנית חוזרת (הגורמת לפגיעה מכנית מוגברת ברקמה). בשל העיכול המתאים אנזימטיות של הקולגן ביניים באמצעות מספר הפרוטוקול הספציפי הטכני (בהשוואה לקולגאז D-בתיווך פרוטוקולי העיכול בשימוש רגיל), פרוטוקול זה ממזער את כמות התפעול המכני של שברי הרקמה הנדרשים לשבש את הinterstitium ולשחרר את קבוצות המשנה של התא החיסונית להשעיה. זה עוד מגביר את הכדאיות של MNC מבודדים לאחר assays הבאים אומר. כפי שמתואר בנתונים (איור 1B), זה מבטל את הצורך DNAse וכימיים אחרים או מכני נגד החלקה תמרונים מעבר סינון רגיל של תא בודד השעיה דרך מסננת. דיווחים אחרים לחלוקה לרמות של הבידוד של תאי הלימפה המעי השתמשו dithiopol (DTT) ו EDTA כסוכני mucolytic כדי לשפר את התשואה ואת הכדאיות של המוננורור מבודד לוקיולוציטים24.
היבט ייחודי נוסף של פרוטוקול זה, המשפר את תפוקת התאים, הוא יישום של מעבר הפרדה בין מדיה בצפיפות מבוססת-סיליקה. שיטות עיכול אחרות מסמכים שפורסמו עד היום אינם משתמשים בהפרדה כזו בצפיפות מדרגה21,31. עם זאת, בניסיון של המחברים ואלה של משתפי פעולה ניצול פרוטוקול זה כדי לבודד את התאים פונקציונלית הלימפה פעיל, הדרגתי צפיפות טיהור משפר הן את הכדאיות ואת הטוהר של MNC התאושש בעקבות העיכול19 , מיכל בן 20 , 32.
אם כי לא מוקד של כתב יד זה, ראוי להזכיר את אלה העובדים עם מודלים דלקת במעיים בעכברים היא כי השיטות בכתב היד הזה ניתן לשנות כדי לאפשר בידוד באיכות גבוהה דומה של MNC קיימא מן המעי הדק. השינוי של פרוטוקול החוקן העיקרי הנדרש כדי להשיג זאת הוא השימוש בעיכול יחיד 90-min (במקום 2 60-min מעכל), עם כל השלבים האחרים (כולל רמת פעילות אנזימים ושלבי הכיבוי) זהה לאלה המוצגים. שינוי זה בדרך כלל מניב טווח של 0.8-4 x 106 mnc למעי הדק מבלי או 1.5-2.5 x 106 mnc עם הכללת מעי הטרמינל כולל כובע המעי הגס העשיר. לכן, חידוש אחד של פרוטוקול זה הוא החלת הפרוטוקול העיקרי על המעי הגס ואת הפרוטוקול שהשתנה על המעי הדק, אחד יכול לבודד MNC עם היכולת הגבוהה והכדאיות הטובה של המעי הדק המעי הגס של הפרט חיות נסיוניות באותו ניסוי.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד יעיל וללא שינוי של תאים מונמונומנט מן המעי הגס או, עם שינויים, המעי הדק. עם 2 מפעילי מיומנים לעבוד יחד, כמה שיותר 10 נקודתיים נפרדות ניתן לעבד ומנותח ביום אחד, ו-תא בודד השעיות יכול להיות מוכן ניתוח גמישות פנוטיפית ופונקציונלי הבאים בתוך 6-8 h מקציר הרקמה. יישום פרוטוקול זה עשוי להוכיח ערך למטרות מחקר אחרים הזקוקים להערכה חיסונית של דלקת במעי הגס, ומאפשר לחוקרים אחרים לאפיין את המערכת החיסונית של המעי הגס של העכבר באופן קפדני ומתוכנת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים #1K08HL088260 ו #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., ח, S.J.), ואת הקרן Batchelor למחקר ילדים (D.M., ח, S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 ו-BALB/c עכברים המשמשים במחקר זה היו מונולדו במתקן שלנו או שסופקו על ידי מעבדות ג'קסון או Taconic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B.
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J.
- Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F.
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M.
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
