Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Bu protokolün amacı kollajenaz kullanarak dokunun enzimatik sindirimi ile kolon lamina propria bulunan mononükleer hücreleri izole etmektir. Bu protokol, mononükleer hücrelerin verimli bir şekilde izolasyonuna olanak sağlar ve bu da sağlam immünhenototipleme için kullanılabilir tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır.

Abstract

Bağırsak vücutta bağışıklık hücrelerinin en çok sayıda ev sahipliği yapmaktadır. Küçük ve kalın bağırsak bağışıklık sistemleri polis eksojen antijenlere maruz kalma ve güçlü mikrobiyal türetilmiş bağışıklık uyaranları yanıtları modüle. Bu nedenle bağırsak, crohn hastalığı ve ülseratif kolit, kemik sonrası greft-versus-host hastalığı (GVHD) gibi inflamatuar barsak hastalıkları ile sınırlı olmamak üzere birçok hastalıkta immün disregülasyon ve iltihabın önemli bir hedef alanıdır. ilik nakli (BmT) ve birçok alerjik ve enfeksiyöz durum. Gastrointestinal inflamasyon ve kolit Murine modelleri yoğun GI komplikasyonları çalışma ve ön klinik önleme ve tedavi için stratejiler optimize etmek için kullanılır. Bağırsaktan bağışıklık hücrelerinin izolasyon ve henotipik analizi ile bu modellerden toplanan veriler, gastrointestinal ve sistemik inflamatuar hastalıkların iyileştirilmesiiçin uygulanabilecek daha fazla bağışıklık anlayışı için önemlidir. Bu rapor, karışık silika bazlı yoğunluk gradyan arabirimi kullanarak kolondan mononükleer hücrelerin (MNC) izolasyonu için son derece etkili bir protokol açıklanmaktadır. Bu yöntem, önemli sayıda canlı lökositi izole ederken, enkazı kirleten enkazı en aza indirir, akış sitometrisi veya diğer yöntemlerle sonraki immün fenotitiplemesağlar.

Introduction

Gastrointestinal (GI) yolu öncelikle gıda besin işleme ve reabsorbsiyon adanmış olmasına rağmen, GI sistemi de vasküler bütünlüğü merkezi rolleri korur, lenfatik, ve sinir sistemleri ve çok sayıda diğer organların aracılığıyla mukozal ve submukozal bağışıklık sistemi1. GI bağışıklık sistemi gıda yabancı antijenlere sürekli maruz kalma nedeniyle hem gastrointestinal ve sistemik sağlık etkili bir role sahiptir, kommensal bakteriler, ya da işgal patojenler1,2. Böylece, GI bağışıklık sistemi patojenik antijenler uygun yanıt verirken patojenik olmayan antijenler tolere hangi hassas bir denge korumak gerekir1,2. Tolerans ve savunma dengesi bozulduğunda, lokalize veya sistemik immün disregülasyon ve inflamasyon hastalıkların sayısız neden oluşabilir1,2,3.

Bağırsak, vücuttaki tüm lenfoid hücrelerin en az %70'ini barındırır4. En primer immünolojik etkileşimler bağırsakta üç bağışıklık istasyonlarıen en az birini içerir: 1) Peyer's Patches, 2) İntraepitelyal lenfositler (IEL) ve 3) lamina propria lenfositler (LPL). Bunların her biri hızlabağırsak5 normal bağışıklık sorunlarına yanıt bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir birbirine bağlı ağ oluşur . Muscularis mukoza üzerinde stroma sınırlı, gevşek yapılandırılmış lamina propria bağırsak mukozasının bağ dokusu ve villus için iskele içerir, vaskülatür, lenfatik drenaj, ve mukozal sinir sistemi, yanı sıra birçok doğuştan ve adaptif bağışıklık alt kümeleri6,7,8,9. LPL 2:1 yaklaşık oranda CD4+ ve CD8+ T hücrelerinden, plazma hücreleri ve miyeloid soy hücreleri, dendritik hücreler, mast hücreleri, eozinofiller ve makrofajlar6dahil olmak üzere oluşur.

Çeşitli hastalık durumları ile ilgili olarak bağışıklık disregülasyonu ve bağırsak iltihabı anlamada artan bir ilgi vardır. Crohn hastalığı ve ülseratif kolit gibi koşullar tüm kolonik inflamasyon10,11,12değişen düzeylerde tezahür . Ayrıca, allojenik kemik iliği nakli (allo-BMT) geçiren ilik veya bağışıklık sisteminin malign veya malign olmayan bozuklukları olan hastalar, klima rejimlerinden doğrudan toksisite dahil olmak üzere çeşitli kolit formları gelişebilir. BMT önce, 2) BMT ve 3 sonra immünsupresyon neden enfeksiyonları) greft-versus-host hastalığı (GVHD) BMT sonra dokularda donör allo-antijenlere tepki donör tipi T hücreleri tarafından tahrik13,14,15. Tüm bu post-BmT komplikasyonları bağırsakların bağışıklık ortamında önemli değişikliklere neden16,17,18. Önerilen yöntem fare kolon bağışıklık hücre birikiminin güvenilir bir değerlendirme sağlar ve, BMT sonra murin alıcılara uygulandığında, organ toleransı dahil hem donör ve alıcı bağışıklık hücreleri etkili bir tahsin kolaylaştırır19 ,20. Bağırsak iltihabı ek nedenleri maligniteler dahil, gıda alerjileri, ya da bağırsak mikrobiyom bozulması. Bu protokol kolon dan bağırsak mononükleer hücrelerin inerişimini sağlar ve değişiklikler ile, bu preklinik murine modellerinin herhangi bir ince bağırsak lökositler için.

"Bağırsak ve bağışıklık hücresi VE izolasyon" arama terimlerini kullanarak bir PubMed arama bağışıklık hücreleri ayıklamak için ince bağırsak sindirim yöntemleri açıklayan 200'den fazla yayınlar ortaya koymaktadır. Ancak, kolon için benzer bir literatür arama kolon bağışıklık hücrelerinin izolasyon belirten iyi kalibre protokolleri verir. Kolon daha kas ve interstisyel tabakaları vardır, çünkü bu daha zor tamamen ince bağırsak daha sindirimi için render olabilir. Mevcut protokollerin aksine, bu protokol özellikle diğer bakteriyel kollajenazlar olmadan Clostridium histolyticum kollajenaz E kullanır (Kollajenaz D / Kollajenaz I). Bu protokol kullanılarak, izole bağırsak mononükleer bağışıklık hücrelerinin (MNC) kalitesini koruyarak, sodyum versenaton (EDTA), Dispase II ve deoksiribonuklease I (DNAse I)21,22,23. Bu protokol daha fazla yönlendirilmiş çalışmalar için murine kolon canlı MNC tekrarlanabilir sağlam çıkarma sağlamak için optimize edilmiş ve kolon immünoloji sinması çalışmasına kendini ödünç vermelidir veya (modifikasyonlar ile) ince bağırsak24, 25. yıl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm çalışmalar, Amerikan Derneği tarafından belirlenen veterinerlik standartlarını karşılayan Miami Miller Tıp Fakültesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan kemirgen araştırma protokolleri kapsamında yürütülmüştür. Laboratuvar Hayvan Bilimi (AALAS) için.

1. Çözümlerin Hazırlanması

  1. Tablo 1'de açıklandığı gibi, Kolon Tamponu, Silika Tabanlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %100, Silika Tabanlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %66, Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %44, Kollajenaz E Sindirim Tamponu ve FACS Tamponu hazırlayın.
    1. Kolon Tampon'u işlemden bir gün önce hazırlayın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
    2. İşlemden bir gün önce %100 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı hazırlayın ve bir gece boyunca 4 °C'de saklayın ve prosedürün sabahı çözülmek için oda sıcaklığına yerleştirin.
    3. Oda sıcaklığında %100 Silika Bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı ve Kolon Tamponu kullanarak izolasyon sabahı %66 ve %44 Silika Bazlı Ayırma Ortamı hazırlayın.
    4. Uygun miktarda Clostridium histolyticum türetilmişKollajenaz E'yi ölçün ve işlemden önce bir gecede -20 °C'de saklayın. Ertesi sabah, Kollajenaz Sindirim Tampon türetmek için Kolon Tampon uygun hacimde çözünür. İşlem günü Kollajenaz Sindirim Tamponu ile tüm kuluçkalarda çözeltileri 37 °C'ye ısıtın.
  2. Protokol adımlarının tamamı için, bir santrifüjü 20 °C'de ve 859 x gdönüş hızını, frenler gradyan santrifüj için (0 yavaşlama) inaktive edilmiş olarak tutun. Yıkama adımları için standart yavaşlama ile 4 °C ve 859 x gdönüş hızı ayarlayın.

2. Kolon Hasat

  1. Fareyi CO2 boğulma yoluyla ötanazi yaparak AALAC onaylı onaylayıcı yöntemi uygulayın.
  2. Fareyi bir supine pozisyonda yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk sprey. Büyük doku makası kullanarak, dikey bir orta hat kesi yapmak ve bozulmamış periton ortaya çıkarmak.
  3. İnce diseksiyon makası kullanarak peritonu açın. Bir tarafa ince bağırsak taşımak ve azalan kolon ortaya çıkarmak için forceps kullanın. Kolonrek en üst üste rektal kısmını maksimum olarak ortaya çıkarmak için azalan kolon üzerinde hafifçe yukarı çekin. Pelvis derin distal rektum kesin ve diseksiyon ve tek bir birim olarak tüm kolon kaldırmak, sekal kapak distal rektum dan.
  4. 50 mL polipropilen tüp içinde 20 mL soğutulmuş Kolon Tampon kolon aktarın.

3. Kolon Temizliği

  1. Bir nemlendirilmiş kağıt havlu üzerinde kolon yerleştirin ve makas veya forceps künt ucu ile bağırsak duvarına hafif basınç uygulayarak katı dışkı ayıklayın.
  2. Bir Petri kabına kolon yerleştirin ve 18 G künt dolgu iğnesi ile 10 mL şırınga kullanarak soğutulmuş Kolon Tampon 10 mL ile bağırsak floş.
  3. Bir Kolon Tampon nemlendirilmiş kağıt havlu kolon aktarın ve makas keskin ucu ile mezenter ve yağ kaldırın.
  4. Kalan kolon içeriğini yıkamak için elle ajitasyon 5-10 mL soğutulmuş Kolon Tampon ajitasyon dolu bir Petri kabında kolon yerleştirin. 2-3 kez tekrarlayın.
  5. Taze soğutulmuş Kolon Tampon dolu bir Petri kabında proksimal kolon (tek bir dikdörtgen açık kolon parçası üreten) daha kaslı rektal ucundan kolon longitudinally kesin. Varolan ortamı atın ve temiz soğutulmuş Kolon Arabelleği ile doldurun.
  6. Petri kabında şiddetle girdap ve her yıkama dan sonra soğutulmuş Kolon Tampon 5-10 mL değiştirerek 3 kez bağırsak yıkayın.
  7. Dikdörtgen kolon dokusunu Kolon Tamponu ile nemlendirilmiş bir kağıt havluüzerine yerleştirin ve yatay olarak dilimleyerek ve daha sonra küçük parçalara (3 mm x 3 mm kesitler) kesin.
  8. 50 mL polipropilen konik tüp içinde 20 mL soğutulmuş Kolon Tampon içine ince forceps kullanarak dikkatle kolon parçalarıtoplamak.
  9. Kolon parçaları 3 kez yıkayın, her yıkama 20 mL Kolon Tampon, şiddetle her ajitasyon arasında 30 s. her ajitasyon arasında tüp girdap tarafından, doku parçaları tüpün altına yerleşmek için izin. Dekant veya vakum her yıkama arasında aspirasyon sürecinde doku parçası kaybını önlerken supernatant aspire.
    NOT: Her yıkamadan sonra tüpü değiştirmeye gerek yoktur.

4. Kollajenaz Sindirim 1

  1. 50 mL polipropilen konik tüp içinde yıkanmış kolon parçaları kolajenaz Sindirim Tampon 20 mL ekleyin.
  2. Kapalı 50 mL tüpü 37 °C'de, 60 dk için 2 x g olarak belirlenen dönme hızı ile kuluçkaya yatan bir orbital shaker'a yerleştirin. gerekirse, hiçbir doku parçasının tüp dibine yerleşmemesini sağlamak için dönüş hızını kademeli olarak artırın.

5. Silika bazlı Ayırma Ortamı Gradyanları Hazırlayın

  1. 20 °C 'de (oda sıcaklığında) ve Kolon Tampon'da %100 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı kullanarak %66 ve %44 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı hazırlayın.
  2. 3 ayrı 15 mL polipropilen tüpün her birine %66 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamının 5 mL'sini dökün. Kolon başına 3 tüp hazırlayın. Bu, ayırma degradesini oluşturmak için daha düşük yoğunluklu ayırma ortamının katmanlandığı degrade yalıtım yordamının daha yüksek yoğunluklu tabanını oluşturur.
  3. Kullanıma kadar 20 °C'de saklayın.

6. Sindirimden Supernatant Koleksiyonu 1

  1. Kollajenaz Sindirim 1 tamamlandıktan sonra, 25 mL serolojik pipet kullanarak sadece supernatant toplayın ve temiz bir 50 mL polipropilen konik tüp içine yerleştirilen 40 μm gözenek filtrasyon kumaş hücresüzlük ile supernatant filtre. Mevcut doku parçalarını aspire etmemeye dikkat edin.
    NOT: Tüpte kalan görünür doku parçalarını saklayın. Bu ikinci kollajenaz sindirim (adım 8) geçirecek.

7. Quenching Kollajenaz Sindirim Tampon

  1. 50 mL polipropilen tüpü tamamen soğutulmuş Kolon Tampon ile doldurun.
    NOT: Kollajenaz 37 °C'de aktiftir; bu nedenle soğutulmuş tampon bu enzimin inaktive.
  2. Tüpü 4 °C'de 800 x g'da 5 dk santrifüj edin.
    1. Vakum aspirasyonu ile supernatant atın. Hücreleri 25 mL taze Kolon Tamponu ve santrifüj ile 800 x g'da 5 dk yıkayın.
    2. Taze soğutulmuş Kolon Tampon az 1 mL pelet resuspend.
    3. 50 mL polipropilen konik tüpü buz üzerine yerleştirin.

8. Kollajenaz Sindirim 2

  1. Adım 4 (Sindirim 1) adım 6.1'den kalan doku parçaları ile tekrarlayın.

9. Sindirim Sonrası Doku Ayrışması 2

  1. Doku parçalarını tüp ile 10 mL'lik şırınga arasında 18 G künt uçlu bir iğneyle şiddetle ileri geri temizleyin.
  2. Brüt doku parçaları veya enkaz görünür olana kadar devam, en az 7-8 tam pasajlar için bu floş tekrarlayın.

10. Filtre Hücreleri

  1. Doku ayrıştırma süspansiyonunu 40 m-pore filtrasyon lu kumaş hücresüzden temiz bir 50 mL polipropilen tüpe geçirin.
  2. Filtreye salınan hücreleri kurtarmak için filtrasyon kumaş hücreli süzgeçi 10 mL soğutulmuş Kolon Tamponu ile yıkayın.

11. Quenching Kollajenaz Sindirim

  1. Soğutulmuş Kolon Tampon ile jant 50 mL polipropilen konik tüp doldurun.
    NOT: Kolsonejenaz aktivitesinin söndürülmesini sağlamak için Kolon Tampon sıcaklığı önemlidir.
  2. 4 °C'de ve 800 x g'da 5 dk çevirin.
  3. Vakum aspirasyonu ile supernatant atın.
  4. 25 mL taze soğutulmuş Kolon Tamponu ileyıkayın, ardından 4 °C'de santrifüj, 5 dk için 800 x g.
  5. Vakum aspirasyonu ile supernatant atın.
  6. Havuz Kollajenaz Sindirim gelen resuspended pelet 1 (adım 7) adım 11.4 ilgili tüp.
  7. Tekrar Adım 11.4 (yıkama ve santrifüj).

12. Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortam Gradyan Ayırma

NOT: Kollajenaz aktivitesinin hızlı bir şekilde söndürülmesini sağlamak için mümkün olan en kısa sürede 12-18 adımlarını gerçekleştirin.

  1. 11.7. adımdan sonra, her peletin 24 mL toplam %44'lük silika bazlı Yoğunluk Ayırma Ortamı'nda kolon başına yeniden askıya alınması.
  2. 10 mL serolojik pipet kullanarak, adım 5.2'de (%66 Silika bazlı Yoğunluk Ayırma Aracı içeren) hazırlanan üç tüpün her birine 12.1 adımdan itibaren ortamın 8 mL'sini yavaşça katlayın. Arabirimin bozulmasını önlemek için degradeyi katmanlarken %44 Yoğunluk Ayırma Ortamının sabit ve yavaş akışını koruyun.
  3. Bir tartma terazisi veya bir denge kullanarak santrifüj kovaları içindeki tüm tüpleri dikkatlice dengeleyin.
  4. Tüpleri 20 dk 859 x g'de 20 °C'de frensiz bir santrifüjde döndürün. Degrade arabirimindeki hücreleri bozmamaya dikkat edin, tüpleri çıkarmadan önce rotorların dinlenmeye gelmesine izin verin.

13. Degrade Arabiriminden Mononükleer Hücreleri Topla

  1. Genellikle 1-2 mm kalınlığında beyaz bant (MNC içeren) bulunan degrade arabirimini (5 mL işaretine yakın) görselleştirin.
    NOT: Beyaz bir grup görebilir ya da göremeyebilir. Ancak, MNC bu arabirimde olacak ve degrade arabiriminin netliğini bulutlamalıdır.
  2. Vakum aspire ve arayüze daha kolay pipet erişimi sağlamak için üst degrade üst 7 mL atın.
  3. Sürekli manuel emme ve sürekli dönen bilek hareketi kullanarak, temiz bir 50 mL polipropilen konik tüp içine hücrelerin arayüz tabakası toplamak. 2 degradeler arasındaki arayüz açık ve refractile (hücrelerden temiz) kadar toplayın.
  4. Toplama tüpünü 50 mL soğutulmuş FACS Tampon ile doldurun. 4 °C'de, 800 x g'da 5 dk.
  5. Vakum aspirasyonu ile supernatant aspire ve FACS Tampon 1 mL pelet resuspend.
  6. Uygun ölü hücre dışlama yöntemlerini kullanarak 1:2 seyreltme de bir hemositometre üzerinde hücreleri saymak.
  7. Yeni izole kolonik MNC ile FACS boyama veya diğer tahlillere devam edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Minür kolon hastalığı modelleri ile çalışırken, hem nicel ve nitel değerlendirmek edebilmek için yararlıdır, kolon MNC arasında, inflamatuar süreçte yer alan birden fazla bağışıklık hücresi alt kümeleri. Bu protokolün uygulanması ile elde edilen MNC'nin tek hücreli süspansiyonu, bu tür henotypik karakterizasyonu sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde kolaylaştırır. Bu izolasyon yönteminin farklı deneysel ayarlar altında uygulanması için bir ilke kanıtı olarak, bu yöntemi kullanarak kolon MNC'yi aldık ve farelerden izole edilen hücrelere çoklu parametre akış sitometrisi uyguladık (Şekil 1 ve Şekil 2 , allojenik BmT) ve olmadan (Şekil 2A, syngeneic KT) BmT sonrası önemli immün aracılı kolon yaralanması.

DNase 1 tedavisi olan veya olmayan izolasyon için Kollajenaz E veya D kullanırken apoptotik ve nekrotik ölü lenfositlerin fraksiyonlarını karşılaştırmak için akış sitometrisi ve veri analizleri yapıldı. Akış sitometrisi sırasında kullanılan gating stratejisi Şekil 1A'daverilmiştir.  Annexin V (apoptoz isbelirteci) ve sabitlenebilir Canlı/Ölü Mavi boya (nekroz belirteci) her izolasyondan sonra tek hücreli süspansiyonlarda boyanmasını takiben, DNAE içermeyen Kollajenaz E, Annexin Vneg'in önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesini gösterdi Canlı/Ölü Mavineg canlı hücreler (ortanca %43.3, aralığı 26.5%-59.9% (n = 3) dnaase olmadan Kollajenaz D ile karşılaştırıldığında izolasyon dan sonra (ortanca% 8.7,, aralık 3.6%-10.2%, n = 3), hatta Kollajenaz E + DNAAse (medyan% 8.18, aralık 4.7%-20.4%, n = 3) veya Kollajenaz D + DNAE (ortanca %15.10,aralık %9.9-%21.4, n = 3). Buna ek olarak, Collagenase E grubunda %41.0 ortanca yüzdesinde Annexin VnegLive/Dead Blue+ nekrotik hücreleri tespit ettik (dağılım %37.1-%58.8, n = 3) karşı Kollajenase D grubunda %90.0 (dağılım %69.7-95.5%, n = 3), Kollajenase +DEe %75.9 grup ve Kollajenaz D + DNaase grubunda sırasıyla %80.3 (dağılım %65.7-79.5, dağılım %54.9-%89.9, n = 3). Her gruptaki n =1 hayvanının temsili FACS çizimleri Şekil 1Bolarak gösterilmiştir).

Hastalıklı farelerde bu prosedürü kullanarak uygulanabilir MNC'nin tutarlılığı ve verimi prensibinin bir başka kanıtı olarak, 7. C57BL/6 donör) veya syngeneic (CD45.1 BALB/c donör) BMT modelleri. Akış sitometri analizleri ile elde edilen yüzde geçitli immün alt kümelerle çarpılarak hesaplanan mutlak MNC sayıları kullanılarak, BMT alıcının kolondan çıkarılan donör CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin mutlak sayıları hesaplanabilir ve karşılaştırılabilir (n = 4 grup başına, Şekil 2A). Bu tür fare modellerinde nadir immün hücre popülasyonlarını belirlemek ve/veya quantitate etmek önemli olabileceğinden, hem syngeneik hem de allojenik BmT modellerinde donör türemiş (CD45.1+) Foxp3+ T düzenleyici hücreleri (Treg) dahil olmak üzere nadir alt kümeleri değerlendirdik. Antikor lekeli tek hücreli süspansiyondan donör Treg hücrelerine (CD4+CD25+FoxP3+ )ulaşmak için gating stratejisi gösterilir (kırmızı bir ok ile beline edilmiş kapıların sırası; Şekil 2B). Bu yöntem kullanılarak, BMT'den sonra alıcı fare kolona sızan donör türetilmiş kolon tarıkları gibi nadir alt kümeler bile analiz edilebilir(Şekil 2C, temsili arsa; n = 1).

Şekil 3, BALB/c farelerin kolonlarında GVHD indükleyen CD8+ ile CD4+ donör kaynaklı T hücrelerinin korunması nı ya da korunmadığını karşılaştırmak için sunulan protokolü kullanarak grubumuzdan gelen tarihsel verilerde bu yöntemin genişletilmiş bir uygulamasını göstermektedir GVHD'den bmt öncesi tedavi preparatif (klima) rejimi20. Test edilen preparatif rejimler arasında 800 cGy/miyeloablatif total vücut ışınlaması (TBI800) veya miyeloablatif olmayan TBI (400TBI) ve lenflenfe ışınlama nın ulaştırıldığı toplam lenfoid ışınlama (TLI) kullanılarak nonmiyeloablatif koşullanma yer aldı. düğümleri, timus, ve kafatası, akciğerler, bacaklar, pelvis ve kuyruk kalkan ile dalak. Tüm klima anti-timosit serum (ATS), bir immünomodülatör ajan ile kombine edildi. BMT'den sonra 6. . Kolon MNC'sinin BMT alıcıları arasında tekrarlanabilir izolasyonu (tedavi grubu başına 7-10) donör CD8+ efektör T hücrelerinin mutlak sayılarının farklı nakil öncesi kondisyon tedavi grupları arasında sağlam bir istatistiksel karşılaştırmasına olanak sağladı ( Şekil 3B), TBI öncesi BMT koşullandırmaaksine, TLI'den GVHD korumasının doğuştan gelen bağışıklık mekanizmalarını ortaya çıkaran önemli çalışmalara yol açan immün fenotipler hakkında önemli veriler elde etmektedir. 20.000

Figure 1
Şekil 1: Akış sitometrik analizi kollajenaz E ve D ile izole edildiğinde allojenik fare modeli sistemlerinde BMT sonra Gün 7 kolon MNC ve DNAe 1 olmadan. Yabani tip (WT) (CD45.2+) BALB/c (H2Kd+) fareler CD45 konjenik (CD45.1+) C57BL/6 donör farelerden (allojenik BMT, grup başına n = 3) BMT aldı. WT (CD45.2+) BALB/c alıcı farelere BMT'den 1 gün önce 800cGy TBI (BALB/c) uygulandı. BMT'den sonra 7 gün, alıcı kolon tek hücreli süspansiyonlar Kollajenaz E (100 U / mL), Kollajenaz E (100 U / mL) DNAse 1 (500 μg/mL), Kollajenaz D (500 μg/mL) veya Kollajenaz D (500 μg/mL) veya Kollajenaz D (500μ/mL) kullanımı ile bu el yazması yöntemleri aşağıdaki hazırlanmıştır DNAse 1 (500μg/mL) (grup başına n = 3) ile. Hücreler Live/dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue ve CD11b-PE-Cy7 antikorları ile boyandı. (A) FACS analizleri için gating stratejisi. Lökositleri tanımlamak için kullanılan MNC'nin tek hücreli süspansiyonundaki kapı 0, ileri dağılım (FSC-A) ve yan dağılım (SSC-A); Kapı 1, SSC-A kullanarak tek olmayan hücrelerin hariç tutulması; Kapı 2, FSC-A kullanarak tek olmayan hücrelerin hariç tutulması; Kapı 3, Annexin V-pozitif (apoptotik) ve düzeltilebilir canlıboya Canlı/Ölü-UV450+Annexin V-negatif (nekrotik) hücre alt kümelerinin tanımlanması. (B) 4 deney grubu için MNC arasında kapılı lökositlerin Ek V'nin temsilci FACS parselleri ve düzeltilebilir canlılık boyası boyama. Gruplarhalinde grup başına N =1 temsili fare: Kollajenaz E (100 U/mL), Kollajenaz E (100 U/mL) + DNaAse 1 (500 g/mL), Kollajenaz D (500 μg/mL) ve Kollajenaz D (500 μg/mL) + DNAse 1(500 μg/mL) + DNAse 1(500 μg/mL). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Allojeneik ve syngeneic fare modeli sistemlerinde BMT'den sonra 7. WT (CD45.2+) C57BL/6 (H2Kd-neg)ve BALB/c (H2Kd+) fareler iyeliklerini CD45-congenic (CD45.1+ )C57BL/6 ve BALB/c donör farelerden (syngeneic veya allojen icbmt, n = 4 deney grubu başına) aldılar. C57BL/6 ve BALB/c alıcı fareler, BMT'den bir gün önce teslim edilen 950cGy (C57BL/6) ve 800cGy (BALB/c) miyelolatif TBI preparatif klima rejimleri aldı. BMT'den sonra 7. Hücreler Live-dead-BV510, H-2Kd-PE, CD45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-Cy7, CD25-PacificBlue, FoxP3-AF647 ve CD11b-PE-Cy7 antikorları, Grup başına N = 4 fare ile boyandı. (A) Ortalama ± SEM mutlak sayı (günlük 10) CD45.1+ H-2kd-neg veya CD45.1+ H-2kd+ (donör tipi, her durumda) CD11bnegCD4+ ve CD8+ T hücreleri 7. klima ve CD45.1 C57BL/6 (donör) → CD45.2 BALB/c (alıcı) BMT sonra. Grup başına N = 4. (B) FACS analizleri için gating stratejisi. Lökositleri tanımlamak için kullanılan MNC'nin tek hücreli süspansiyonundaki kapı 0, ileri dağılım (FSC-A) ve yan dağılım (SSC-A); Kapı 1, SSC-A kullanarak tek olmayan hücrelerin hariç tutulması; Kapı 2, FSC-A kullanarak tek olmayan hücrelerin hariç tutulması; Kapı 3, canlı hücre seçimi Kapı 4, BMT donör hematopoetik hücrelerin in ayrılması karşı BMT alıcı kökenli; Kapı 5, donör olmayan miyeloid soy hücrelerinin seçimi; Kapı 6, CD4+ T hücrelerinin seçici gating; Kapı 7, CD4 ayrı gating+CD25+FoxP3+ T düzenleyici (Treg) hücreleri. Kırmızı ok detaylandırma stratejisini gösterir. (C) Temsili FACS cd25 ve FoxP3 boyama (B) gün 7 klima ve BMT allojenik BMT (C57BL/6 →BALB/ c) bir BALB / c alıcı kolon içinde gating stratejisi ni kullanarak çizer. Her kapıdaki hücrelerin yüzdesi kapı içinde verilir. WT = vahşi türü; TBI = toplam vücut ışınlaması; BM = 10 x 106 CD45.1+ konjenik C57BL/6 veya BALB/c donör kemik iliği hücreleri; Teff = T efektör hücreleri; Treg = Foxp3+ T düzenleyici hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: TBI/ATS olmayan miyeloablatif Olmayan TLI/ATS koşullandırma donör TCRαβ+CD8+ effector T hücre birikimini azaltır. (A) Cd4 ve CD8 renkli CD4 ve CD8 boyama kapılı H-2Kb+TCRαβ+ donör H-2Kb+ C57BL/6 fareler de dalak (üst sıra), mezenterik lenf düğümü (MLN) (orta sıra) ve kolon (alt sıra) gün alıcıların hücreleri 6 klima ve transplantasyon sonrası. Her kapıdaki hücrelerin yüzdesi kapının üzerinde verilir. (B) Ortalama ± SEM mutlak sayı (log 10) H-2Kb+TCRαβ+CD8+ dalak hücreler (üst panel), MLN (orta panel) ve kolon (alt panel) gün alıcıların 6 gün klima ve BMT sonra. WT = yabani tip; TBI = toplam vücut ışınlaması; TLI =: total lenfoid ışınlama; ATS = anti-timosit serum; BM = 50 x 106 WT C57BL/6 donör kemik iliği hücreleri; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 donör dalak hücreleri; TBI800, TBI400 = miyeloablatif (TBI800) veya non-miyeloablatif (TBI400) TBI cGy dozları. *Bu rakam van der Merwe ve ark.20'dendeğiştirilmiştir. Telif Hakkı 2013. Amerikan İmmünologlar Derneği, Inc Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çözüm Formül
Kolon Arabellek 500 mL RPMI + 10mM HEPES + %10 FBS (56oC'de 60 dakika ısı yalıtımlı, pH 7,3'e ayarlanmış)
Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortam %100 (kolon başına) 22.5 mL Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortam + 2,5 mL 10x PBS.
Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortam %66 (kolon başına) 10.72 mL Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortam %100 + 5,28 mL Kolon Tampon
Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortam %44 (kolon başına) 11 mL Silika Bazlı Yoğunluk Gradyan Ortam %100 + 14 mL Kolon Tampon
Kollajenaz Sindirim Tampon (kolon başına) Clostridium histolyticumdan Kollajenaz E 100 U / mL , 40 mL Kolon Tampon çözünmüş
FACS Arabellek 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0.2 g Sodyum Azit

Tablo 1: Çözüm Hazırlama Tablosu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu görsel protokol lamina propria lenfositler de dahil olmak üzere kolon mononükleer hücrelerin izolasyon için iyi tolere yöntemleri açıklar (LPL). Bu protokol, inflamatuar sitokinlerin ve doku yaralanmalarının kurtarılan MNC'nin yetersiz canlılığına katkıda bulunduğu ciddi nakil sonrası fare kolit modellerinin değerlendirilmesinde optimize edildiği göz önüne alındığında, bu yöntemlerin diğer kolon MNC'nin henotik analizini gerektiren uygulamalar. Bunlar arasında inflamatuar barsak hastalığının fare modellerinde kolon iltihabının değerlendirilmesi, kolit hedefli tedavilerin immün yanıtlarının çalışmaları ve enfeksiyöz patojenler tarafından üretilen kolit yer almaktadır. Ayrıca, sağlıklı (syngeneic BmT) farelerde izolasyonlar kullanarak verilerimiz izolasyon prosedürü MNC izole bağışıklık hücresi tespiti ne izin vermek için önemli inflamatuar infiltrasyon gerektirmediğini göstermektedir. Gerçekten de, benzer veriler tedavi edilmemiş sağlıklı (BMT olmayan) fareler kullanılarak elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir).

Bu protokolün birkaç önemli adımı onu diğer yayınlanmış yöntemlerden ayırır ve yüksek verim ve canlılığa katkıda bulunur. Örneğin, Clostridium histolyticum-türetilmiş kollajenaz E aktivitesi (100 U/mL son aktivite düzeyi) optimizasyonu uzun menzilli deneyler üzerinde enzim farklı sürü için tutarlı hesaplamalar sağlar26. Kollajen ailesinde 28 farklı üye vardır, birlikte memeli vücudundaki tüm proteinlerin yaklaşık% 30 oluşturan27. Buna ek olarak, farklı dokular kollajen alt tipleri farklı dağılımları var, her sindirim için benzersiz kollajenler gerektiren28. C. histolyticum kollajenaz iki sınıf29,30sınıfa sınıflandırılmış 6 farklı protein içerir. Kullanılan kollajenaz belirli türü kolon izole hücrelerin canlılık ve genel kalitesini değiştirebilir31. Önceki çalışmalar kollajenaz tip C-2139 (Kollajenaz E) ince bağırsaktan izole MNC arasında lenfositlerin yüksek verim sağlar göstermiştir25. Ancak, Bu protokoller kolon sindirim adresi vermedi, ince bağırsak daha önemli ölçüde daha karmaşık kollajen bileşimi ile çok daha fazla kas organı.

Enzimatik doku bozulmasının yeterliliği ve güvenilirliği, tekrarlayan mekanik bozulma ihtiyacını en aza indirerek (dokuda artan mekanik travmaya neden olan) genel hücre verimini ve canlılığını etkileyen yerleşik bir faktördür. Interstisyel ve mukozal kollajenin kollajen E-spesifik protokol kullanılarak yeterli enzimatik sindirimi nedeniyle (standart kullanımda kollajenaz D aracılı sindirim protokollerine göre), bu protokol mekanik manipülasyon miktarını en aza indirir interstitium bozmak ve süspansiyon içine bağışıklık hücresi alt setleri serbest bırakmak için gerekli doku parçaları. Bu daha sonraki tahliller için izole MNC canlılığını artırır. Verilerde(Şekil 1B)gösterildiği gibi, bu durum, tek bir hücre süspansiyonunun standart filtrasyonunun ötesinde, tek bir hücre süspansiyonunun standart filtrasyonunun ötesinde, NASves ve diğer kimyasal veya mekanik kümelenme önleyici manevralara olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bağırsak lenfoid hücrelerinin izolasyon özetleyen diğer raporlar izole mononükleer lökositlerin hem verim ve canlılığını artırmak için mukolitik ajanlar olarak dithiothreitol (DTT) ve EDTA kullandık24.

Bu protokolün hücre verimini artıran bir diğer benzersiz yönü de ince ayarlı silika tabanlı yoğunluk ayırma ortamı degradesi uygulamasıdır. Bugüne kadar yayınlanan diğer sindirim yöntemleri kağıtları böyle bir yoğunluk ayırma gradyankullanmayın 21,31. Ancak, yazarların deneyimlerinde ve işlevsel olarak aktif lenfoid hücreleri izole etmek için bu protokolü kullanan işbirlikçilerin deneyimlerinde, yoğunluk gradyan saflaştırma, sindirim den sonra kurtarılan MNC'nin hem canlılığını hem de saflığını artırır19 , 20.000 , 32. yıl.

Bu el yazmasının odak noktası olmamasına rağmen, farelerde bağırsak iltihabı modelleri ile çalışanlar için söz layık bu el yazması yöntemleri ince bağırsaktan canlı MNC benzer yüksek kaliteli izolasyon sağlamak için değiştirilebilir olmasıdır. Bunu başarmak için gerekli birincil kolon protokolümodifikasyonu tek bir 90-dk sindirim kullanımı (yerine iki 60-dk sindirim), diğer tüm adımlar (enzim aktivite düzeyi ve söndürme adımları dahil) gösterilen ler aynıdır. Bu modifikasyon genellikle lökosit açısından zengin cecal kapak da dahil olmak üzere terminal ileum dahil ile ince bağırsak başına 0.8-4 x 106 MNC bir dizi verir. Bu nedenle, bu protokolün bir yenilik kolon ve ince bağırsak için değiştirilmiş protokol için birincil protokol uygulanması, bir yüksek tekrarlanabilirlik ve bireysel hem de kolon hem de iyi canlılık ile MNC izole olabilir aynı deneyde deneysel hayvanlar.

Özetle, açıklanan protokol, mononükleer hücrelerin kolondan veya modifikasyonlarla ince bağırsaktan verimli ve tekrarlanabilir şekilde izolasyonuna olanak sağlar. Birlikte çalışan 2 uzman operatörile, 10 kadar ayrı kolon tek bir günde işlenebilir ve analiz edilebilir ve tek hücreli süspansiyonlar doku hasadından itibaren 6-8 saat içinde sonraki henotik ve fonksiyonel analiziçin hazır olabilir. Bu protokolün uygulanması diğer araştırma hedefleri için değerli kanıtlayabilir kolon iltihabı bağışıklık değerlendirmesi gerektiren, diğer araştırmacılar titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde fare kolon bağışıklık sistemini karakterize etmek için izin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma #1K08HL088260 ve #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ve Batchelor Pediatrik Araştırmalar Vakfı (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan C57BL/6 ve BALB/c fareleri ya tesisimizde yetiştirildi ya da Jackson Labs veya Taconic tarafından sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 151 Lenfositler kolon murine lamina propria kolit transplantasyon akış sitometrisi enzimatik sindirim inflamasyon mononükleer hücreler
Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, … More

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter