Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا أحادية النووية التي توجد في بروبريا لامينا القولون عن طريق الهضم الأنزيمي للأنسجة باستخدام الكولاجين. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا أحادية النووية بكفاءة مما يؤدي إلى تعليق خلية واحدة والتي بدورها يمكن استخدامها للنماذج المناعية القوية.
Abstract
الأمعاء هي موطن لأكبر عدد من الخلايا المناعية في الجسم. أجهزة المناعة المعوية الصغيرة والكبيرة الشرطة التعرض للمستضدات الخارجية وتعديل الاستجابات للمحفزات المناعية المستمدة من الميكروبات قوية. لهذا السبب، الأمعاء هي موقع الهدف الرئيسي من خلل التنظيم المناعي والتهاب في العديد من الأمراض بما في ذلك، ولكن، لا تقتصر على أمراض الأمعاء الالتهابية مثل مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، ومرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) بعد العظام زرع نخاع (BMT)، والعديد من الحالات التحسسية والمعدية. وتستخدم نماذج مورين من التهاب الجهاز الهضمي والتهاب القولون بشكل كبير لدراسة مضاعفات GI ولتحسين استراتيجيات ما قبل السريرية للوقاية والعلاج. البيانات التي تم جمعها من هذه النماذج عن طريق العزلة والتحليل الفينوتي للخلايا المناعية من الأمعاء أمر بالغ الأهمية لمزيد من الفهم المناعي التي يمكن تطبيقها لتحسين اضطرابات الجهاز الهضمي والالتهابات الجهازية. يصف هذا التقرير بروتوكولًا عالي الفعالية لعزل الخلايا أحادية النووية (MNC) عن القولون باستخدام واجهة تدرج تدرج ية مختلطة قائمة على السيليكا. هذه الطريقة reproducibly يعزل عددا كبيرا من الكريات البيض قابلة للحياة مع التقليل من تلوث الحطام، مما يسمح اللاحقة الفينول المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي أو غيرها من الأساليب.
Introduction
على الرغم من أن الجهاز الهضمي (GI) مخصص في المقام الأول لمعالجة وإعادة امتصاص المواد الغذائية من المواد الغذائية، فإن الجهاز الهضمي يحافظ أيضا على أدوار مركزية في سلامة الأوعية الدموية، اللمفاوية، والجهاز العصبي والعديد من الأجهزة الأخرى من خلال في الغشاء المخاطي والجهاز المناعي تحت المخاطية1. الجهاز المناعي GI له دور مؤثر في كل من الجهاز الهضمي والصحة الجهازية بسبب تعرضه المستمر للمستضدات الأجنبية من الغذاء، والبكتيريا commensal، أو مسببات الأمراض الغازية1،2. وهكذا، يجب على الجهاز المناعي GI الحفاظ على توازن دقيق الذي يتسامح مع المستضدات غير المسببة للأمراض في حين تستجيب بشكل مناسب للمستضدات المسببة للأمراض1،2. عندما يتم تعطيل توازن التسامح والدفاع، يمكن أن يحدث خلل التنظيم المناعي الموضعي أو الجهازي والالتهاب مما يؤدي إلى عدد لا يحصى من الأمراض1،2،3.
الأمعاء تأوي ما لا يقل عن 70٪ من جميع الخلايا اللمفاوية في الجسم4. معظم التفاعلات المناعية الأولية تنطوي على واحدة على الأقل من ثلاث محطات المناعة في الأمعاء: 1) بقع باير، 2) الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IEL) و 3) الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). يتكون كل من هذه من شبكة معقدة مترابطة من الخلايا المناعية التي تستجيب بسرعة للتحديات المناعية الطبيعية في الأمعاء5. يقتصر على ستروما فوق الغشاء المخاطي العضلي، وpropria لامينا منظم بشكل فضفاض هو النسيج الضام من الغشاء المخاطي للمعوة الأمعاء ويشمل السقالات للزغب، والأوعية الدموية، والصرف اللمفاوي، والجهاز العصبي المخاطي، فضلا عن العديد من الفطرية والمجموعات الفرعية المناعيةالتكيفية6و7و8و9. وتتألف LPL من CD4+ وCD8+ T الخلايا في نسبة تقريبية من 2:1، خلايا البلازما وخلايا النسب النخاعي بما في ذلك، الخلايا التقشرية، والخلايا الصاري، الحمضات والضامة6.
هناك اهتمام متزايد في فهم خلل التنظيم المناعي والتهاب الأمعاء لأنها تتعلق بحالات المرض المختلفة. مثل أمراض كرون والتهاب القولون التقرحي كل ذلك يظهر مستويات متفاوتة من التهاب القولون10،11،12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرضى الذين يعانون من اضطرابات خبيثة أو غير خبيثة في النخاع أو الجهاز المناعي الذين يخضعون لزراعة نخاع العظم الالوجيني (allo-BMT) تطوير أشكال مختلفة من التهاب القولون بما في ذلك 1) السمية المباشرة من أنظمة تكييف قبل BMT، 2) العدوى الناجمة عن كبت المناعة بعد BMT و 3) الكسب غير المشروع مقابل مرض المضيف (GVHD) مدفوعا الخلايا T من النوع المانح ة رد فعل على المستضدات المانحة في الأنسجة بعد BMT13،14،15. كل هذه المضاعفات ما بعد BMT يؤدي إلى تغييرات كبيرة في الوسط المناعي للأمعاء16،17،18. تسمح الطريقة المقترحة بتقييم يمكن الاعتماد عليه لتراكم الخلايا المناعية في القولون الفأر، وعندما تطبق على متلقي المورين بعد BMT، تسهل فحص كفاءة لكل من الخلايا المناعية المانحة والمتلقية المشاركة في تحمل زرع19 ،20. وتشمل الأسباب الإضافية لالتهاب الأمعاء الأورام الخبيثة، والحساسية الغذائية، أو اضطراب ميكروبيوم الأمعاء. يسمح هذا البروتوكول بالوصول إلى الخلايا أحادية النووية في الأمعاء من القولون، ومع التعديلات، إلى الكريات البيض في الأمعاء الدقيقة في أي من هذه النماذج المارين قبل السريرية.
بحث PubMed باستخدام مصطلحات البحث "الأمعاء والخلية المناعية والعزلة" يكشف أكثر من 200 منشورات تصف أساليب هضم الأمعاء الدقيقة لاستخراج الخلايا المناعية. ومع ذلك، فإن البحث عن الأدب مماثلة للقولون لا تسفر عن بروتوكولات محددة جيدا تحديد عزل الخلايا المناعية من القولون. قد يكون هذا لأن القولون لديه طبقات أكثر العضلات والخلالية، مما يجعل من الصعب هضم تماما من الأمعاء الدقيقة. على عكس البروتوكولات القائمة، يستخدم هذا البروتوكول على وجه التحديد كولاجيناز E من الهتستيك Clostridium دون الكولاجين البكتيرية الأخرى (Collagenase D / Collagenase I). نحن نثبت أنه، باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تحقيق هضم الأنسجة القولونية مع الحفاظ على نوعية الخلايا المناعية أحادية النووية الأمعاء المعزولة (MNC) دون إضافة الكواشف المضادة للتكتل مثل فيرسنال الصوديوم (EDTA)، Dispase II، و ديوكسيريبونوكليس 1 (DNAse I)21،22،23. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح باستخراج قوي قابل للاستنساخ من MNC قابلة للحياة من القولون مورين لمزيد من الدراسات الموجهة، وينبغي أن تصلح لدراسة المناعة من القولون أو (مع التعديلات) الأمعاء الدقيقة24، 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات بموجب بروتوكولات أبحاث القوارض التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لكلية الطب بجامعة ميامي ميلر، والتي تفي بالمعايير البيطرية التي وضعتها الرابطة الأمريكية لعلوم الحيوانات المختبرية (AALAS).
1. إعداد الحلول
-
كما هو موضح في الجدول 1، وإعداد المخزن المؤقت القولون، والسيليكا القائم على كثافة فصل الوسائط 100٪، والسيليكا القائم على كثافة فصل وسائل الإعلام 66٪، السيليكا القائم على كثافة فصل وسائل الإعلام 44٪، Collagenase E التخزين المؤقت الهضم، وFACS العازلة.
- إعداد المخزن المؤقت للقولون في اليوم السابق للإجراء وتخزينه بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- إعداد 100٪ على أساس السيليكا كثافة فصل وسائل الإعلام في اليوم السابق للإجراء وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، ووضع في درجة حرارة الغرفة صباح الإجراء للذوبان.
- إعداد 66٪ و 44٪ من وسائل الإعلام الفصل القائم على السيليكا في صباح العزلة، وذلك باستخدام درجة حرارة الغرفة 100٪ على أساس السيليكا الكثافة فصل وسائل الإعلام والقولون العازلة.
- قياس الكمية المناسبة من كلوستريديوم الهيستوريكيوم المستمدةمن الكولاجين E وتخزينها في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل الإجراء. في صباح اليوم التالي، تذوب في الحجم المناسب من المخزن المؤقت القولون لاستخلاص الكولاجين الهضم العازلة. لجميع الحضانة مع الكولاجين التخزين المؤقت الهضم في يوم الإجراء، قبل تسخين الحلول إلى 37 درجة مئوية.
- بالنسبة لكامل خطوات البروتوكول، احتفظ بجهاز طرد مركزي واحد عند درجة حرارة 20 درجة مئوية وسرعة دوران 859 × ز،مع تعطيل الفرامل (0 تباطؤ) لتدرج الطرد المركزي. تعيين آخر إلى 4 درجة مئوية وسرعة دوران من 859 × ز،مع التباطؤ القياسية، لخطوات الغسيل.
2. حصاد القولون
- قتل الماوس عن طريق خنق CO2 متبوعاً بطريقة تأكيدية معتمدة من AALAC.
- وضع الماوس في موقف supine ورذاذ الفراء مع الإيثانول 70٪. باستخدام مقص الأنسجة الكبيرة، وجعل شق خط الوسط الرأسي وفضح الصفاق سليمة.
- باستخدام مقص تشريح غرامة، فتح التبلل. استخدام ملقط لنقل الأمعاء الدقيقة إلى جانب واحد وفضح القولون التنازلي. سحب قليلا صعودا على القولون التنازلي لفضح أقصى قدر من الجزء المستقيم من القولون. قطع المستقيم القاصي في عمق الحوض وتشريح وإزالة القولون بأكمله كوحدة واحدة، من المستقيم القاصي إلى غطاء الجحيق.
- نقل القولون في 20 مل المبردة القولون العازلة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل.
3. تنظيف القولون
- ضع القولون على منشفة ورقية مبللة واستخراج البراز الصلب عن طريق تطبيق ضغط خفيف على جدار الأمعاء مع نهاية حادة من مقص أو ملقط.
- ضع القولون في طبق بيتري واغسل الأمعاء بـ 10 مل من المخزن المؤقت للقولون المبرد باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة تعبئة حادة 18 غرام.
- نقل القولون إلى منشفة ورقية مبللة كولون العازلة وإزالة mesentery والدهون مع نهاية حادة من مقص.
- ضع القولون في طبق بيتري مملوء بـ 5-10 مل مبردة بـ Colon Buffer التي تثير التحريك يدويًا لغسل المحتويات القولونية المتبقية. كرر 2-3 مرات.
- قطع القولون طوليا من نهاية المستقيم أكثر العضلات إلى القولون القريب (توليد قطعة واحدة مستطيلة مفتوحة القولون) في طبق بيتري مليئة الطازجة المبردة القولون العازلة. تجاهل الوسائط الموجودة وإعادة تعبئتها باستخدام المخزن المؤقت للنقطتين المبردة النظيفة.
- غسل الأمعاء 3 مرات عن طريق دوامة بقوة في طبق بيتري واستبدال 5-10 مل من المخزن المؤقت القولون المبردة بعد مع كل غسل.
- ضع أنسجة القولون المستطيلة على منشفة ورقية مبللة بالمخزن المؤقت للقولون واقطعها عن طريق تقطيعها أفقياً ثم إلى أجزاء صغيرة (3 مم × 3 مم).
- جمع شظايا القولون بعناية باستخدام ملقط غرامة في 20 مل المبردة القولون العازلة في أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50مل.
- غسل شظايا القولون 3 مرات، كل غسل في 20 مل القولون العازلة، عن طريق دوامة بقوة أنبوب لمدة 30 ث. بين كل التحريض، والسماح لشظايا الأنسجة لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. يستنشق المزيل أو الفراغ المنثقب مع منع فقدان جزء الأنسجة في عملية الطموح بين كل غسل.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لتغيير الأنبوب بعد كل غسل.
4. الكولاجين الهضم 1
- إضافة 20 مل من خزان الهضم Collagenase إلى شظايا القولون غسلها في أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50 مل.
- وضع أنبوب مغلق 50 مل في 37 درجة مئوية في شاكر المدارية الحاضنة مع معدل دوران تعيين في 2 × ز لمدة 60 دقيقة. إذا لزم الأمر، وزيادة معدل دوران تدريجيا لضمان عدم وجود شظايا الأنسجة تسوية إلى أسفل الأنبوب.
5. إعداد التدرجات وسائل الإعلام الفصل القائم على السيليكا
- إعداد 66٪ و 44٪ على أساس السيليكا الكثافة فصل وسائل الإعلام، وذلك باستخدام 100٪ على أساس السيليكا كثافة فصل وسائل الإعلام في 20 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) والقولون العازلة.
- صب 5 مل من 66٪ على أساس السيليكا كثافة فصل وسائل الإعلام في كل من 3 أنابيب البولي بروبلين 15 مل منفصلة. إعداد 3 أنابيب لكل القولون. هذا يشكّل ال [هيغر دنستي] قاعدة من التدرج عزل إجراء, على أيّ [لوور دنستي] فصل أوساط كنت طبقات أن يخلق الفصل تدرج.
- يُحفظ عند درجة حرارة 20 درجة مئوية حتى يُستعمل.
6. جمع سوبرناتانت من الهضم 1
- جمع فقط supernatant باستخدام ماصة المصلية 25 مل وتصفية supernatant من خلال 40 ميكرومتر المسام الترشيح النسيج مصفاة خلية وضعت في أنبوب بولي بروبلين بولي بروبلين نظيفة 50 مل مخروطي، بعد اكتمال الهضم Collagenase 1. يجب الحرص على عدم استنشاق أي شظايا الأنسجة الموجودة.
ملاحظة: الاحتفاظ بأي شظايا الأنسجة المرئية المتبقية في الأنبوب. هذه سوف تخضع الهضم الكولاجين الثاني (الخطوة 8).
7. تبريد الكولاجين الهضم العازلة
- ملء أنبوب البولي بروبلين 50 مل تماما مع المخزن المؤقت القولون المبردة.
ملاحظة: كولاجيناز نشط عند 37 درجة مئوية. وبالتالي العازلة المبردة يعطل هذا الإنزيم. - طرد مركزي الأنبوب في 4 درجة مئوية في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل supernatant عن طريق الطموح فراغ. غسل الخلايا مع 25 مل من المخزن المؤقت القولون الطازجة والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق بيليه في أقل من 1 مل من المخزن المؤقت القولون المبردة الطازجة.
- وضع أنبوب البولي بروبلين البولي بروبلين 50 مل مخروطي على الجليد.
8. الكولاجين الهضم 2
- كرر الخطوة 4 (الهضم 1) مع أجزاء الأنسجة المتبقية التي تم الاحتفاظ بها من الخطوة 6.1.
9. تصنيف الأنسجة بعد الهضم 2
- اغسل شظايا الأنسجة بقوة ذهاباً وإياباً بين الأنبوب وحقنة 10 مل من خلال إبرة 18 G حادة.
- كرر هذا التدفق لمدة لا تقل عن 7-8 ممرات كاملة، وتستمر حتى لا تكون شظايا الأنسجة الإجمالية أو الحطام مرئية.
10. تصفية الخلايا
- تمرير تعليق تصنيف الأنسجة من خلال 40 ميكرومتر المسام مصفاة خلية النسيج الترشيح في أنبوب البولي بروبلين 50 مل نظيفة.
- غسل مصفاة خلية النسيج الترشيح مع 10 مل المبردة القولون العازلة لاستعادة أي خلايا المحاصرين في مرشح.
11. تبريد الكولاجين الهضم
- ملء أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50 مل إلى الحافة مع المخزن المؤقت القولون المبردة.
ملاحظة: درجة حرارة القولون العازلة أمر بالغ الأهمية لضمان تبريد نشاط الكولاجين. - تدور في 4 درجة مئوية و 800 × ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل supernatant عن طريق الطموح فراغ.
- يغسل عن طريق إعادة تعليق في 25 مل من المخزن المؤقت القولون المبردةالطازجة، تليها الطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 800 × ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل supernatant عن طريق الطموح فراغ.
- تجمع بيليه علقت من الكولاجين الهضم 1 (الخطوة 7) إلى أنبوب المقابلة لها من الخطوة 11.4.
- كرر الخطوة 11.4 (غسل والطرد المركزي).
12. السيليكا القائمة على كثافة فصل الوسائط التدرج الفصل
ملاحظة: تنفيذ الخطوات 12-18 في أسرع وقت ممكن، لضمان التبريد السريع لنشاط الكولاجين.
- بعد الخطوة 11.7، إعادة تعليق كل بيليه في 24 مل المجموع من 44٪ على أساس السيليكا الكثافة فصل وسائل الإعلام لكل القولون.
- طبقة ببطء 8 مل من وسائل الإعلام من الخطوة 12.1 على كل من الأنابيب الثلاثة التي أعدت في الخطوة 5.2 (تحتوي على 66٪ من الوسائط القائمة على كثافة السيليكا الفصل)، وذلك باستخدام ماصة المصلية 10 مل. الحفاظ على تدفق ثابت وبطيء من 44٪ كثافة فصل الوسائط مع طبقات التدرج من أجل تجنب تعطيل واجهة.
- قم بموازنة جميع الأنابيب داخل جرافات الطرد المركزي بعناية باستخدام مقياس وزن أو توازن.
- تدور الأنابيب 20 دقيقة في 859 × ز في جهاز طرد مركزي دون الفرامل في 20 درجة مئوية. السماح للدوارات أن تأتي لاستكمال بقية قبل إزالة الأنابيب، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا في واجهة التدرج.
13. جمع الخلايا أحادية النووية من واجهة التدرج
- تصور واجهة التدرج (بالقرب من علامة 5 مل)، حيث عادة ما يكون هناك نطاق أبيض سمك1-2 مم (يحتوي على MNC).
ملاحظة: قد يرى المرء أو لا يرى فرقة بيضاء. ومع ذلك، سوف MNC يكون في هذه الواجهة وينبغي سحابة وضوح واجهة التدرج. - فراغ يستنشق وتجاهل أعلى 7 مل من التدرج العلوي للسماح أسهل الوصول إلى ماصة إلى واجهة.
- باستخدام الشفط اليدوي المستمر وحركة المعصم الدورية ثابت، وجمع طبقة واجهة من الخلايا في أنبوب بولي بروبلين بولي بروبلين نظيفة 50 مل مخروطي. جمع حتى واجهة بين التدرجات 2 واضحة والحرارية (واضحة من الخلايا).
- ملء أنبوب جمع مع 50 مل من المخزن المؤقت FACS المبردة. تدور في 4 درجة مئوية، 800 × ز لمدة 5 دقائق.
- يستنشق supernatant عن طريق التطلع فراغ وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من FACS العازلة.
- عد الخلايا على مقياس الهيموكيتومات في تخفيف 1:2 باستخدام أساليب استبعاد الخلايا الميتة المناسبة.
- انتقل إلى FACS تلطيخ أو غيرها من الاختبارات مع MNC القولون معزولة حديثا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند العمل مع نماذج مرض القولون المورين، فمن المفيد أن تكون قادرة على كل من القياس الكمي وتقييم نوعيا، بين MNC من القولون، والمجموعات الفرعية متعددة الخلايا المناعية المشاركة في العملية الالتهابية. وييسر تعليق الخلية الواحدة للشركات عبر الوطنية التي تم الحصول عليها من خلال تطبيق هذا البروتوكول هذا الوصف الفينوتي بطريقة قوية ويمكن استنساخها. كدليل على المبدأ لتطبيق طريقة العزل هذه في ظل إعدادات تجريبية متنوعة، استرجعنا MNC القولون باستخدام هذه الطريقة وقمنا بالقياس السيتوميعلى الخلايا المعزولة من الفئران مع (الشكل 1 و الشكل 2 , الأوجينية BMT) وبدون(الشكل 2A،BMT syngeneic)إصابة كبيرة بوساطة المناعة القولون بعد BMT.
تم إجراء قياس التدفق الخلوي وتحليل البيانات لمقارنة كسور الخلايا الليمفاوية الميتة الانبوبية والنخرية عند استخدام إما كولاجيناز E أو D للعزل، مع أو بدون علاج DNase 1. وترد استراتيجية التجشؤ المستخدمة أثناء قياس التدفق في الشكل 1A. بعد Annexin V (علامة المبرمج) وللتثبيت لايف / الميت الأزرق صبغ (علامة نخر) تلطيخ على تعليق خلية واحدة بعد كل عزل، وأظهرت Collagenase E دون DNAse نسبة مئوية أعلى بكثير من الإينجين الخامسneg يعيش / الميت الأزرقNEG الخلايا الحية (متوسط 43.3٪، مجموعة 26.5٪ -59.9٪، ن = 3) بعد العزلة بالمقارنة مع Collagenase D دون DNAsE (متوسط 8.7٪، مجموعة 3.6٪-10.2٪، ن = 3)، حتى عند مقارنتها مع Collagenase E + DNAse (متوسط 8.18٪، والنطاق 4.7٪ -20.4٪، ن = 3) أو كولاجيناز D + DNAse (متوسط 15.10٪، مجموعة 9.9٪ -21.4٪، ن = 3). وبالإضافة إلى ذلك، حددنا الأوجينين الخامسnegلايف / الميت الأزرق + الخلايا النخرية بنسبة متوسطة من 41.0٪ في مجموعة كولاجيناز E (مجموعة 37.1٪-58.8٪، ن = 3) مقابل 90.0٪ في مجموعة كولاجيناز D (مجموعة 69.7٪ - 95.5٪، ن = 3)، 75.9٪ في كولاجيناز E + DNAsee المجموعة، و80.3٪ في مجموعة كولاجيناز D + DNAse، على التوالي (مجموعة 65.7٪ -79.5٪، ومجموعة 54.9٪ -89.9٪، ن = 3). يظهر الشكل 1Bمن قطع الأراضي التمثيلية لـ FACS من n = 1 animal في كل مجموعة.
وكدليل آخر على مبدأ اتساق وغلة الشركات المتعددة الجنسيات القابلة للاستمرار باستخدام هذا الإجراء في الفئران المريضة، طُبق قياس التدفق المتعدد البارامتريعلى السيتوميمي المتعدد البارامترية المعزول عن الفئران المتلقية من طراز CD45.2 BALB/c في اليوم السابع بعد تلقي BMT إما من الأوجينية (CD45.1) C57BL/6 donor) أو نماذج BMT syngeneic (CD45.1 BALB/c donor). باستخدام أرقام MNC المطلقة مضروبة في النسبة المئوية للمجموعات الفرعية المناعية المسورة التي تم الحصول عليها عن طريق تحليلات قياس التدفق، يمكن حساب متوسط الأعداد المطلقة للخلايا المانحة CD4+ وCD8+ T المستخرجة من القولون المتلقي BMT ومقارنتها (n = 4 لكل مجموعة، الشكل 2A). وبما أنه يمكن أن يكون من المهم تحديد و/أو تحديد مجموعات الخلايا المناعية النادرة في نماذج الماوس هذه، فقد قمنا بتقييم مجموعات فرعية نادرة بما في ذلك المانحين المشتقة (CD45.1+) Foxp3+ T الخلايا التنظيمية (Treg) في كل من نماذج BMT المتجانسة والألوجينية. يتم عرض استراتيجية التجصاق للوصول إلى خلايا Treg المانحة (CD4+CD25+FoxP3+) من تعليق خلية واحدة ملطخة بالأجسام المضادة (تسلسل البوابات التي يحددها سهم أحمر. الشكل 2 باء). باستخدام هذه الطريقة، حتى المجموعات الفرعية النادرة مثل المانح ة القولونية المشتقة Treg التسلل القولون الماوس المتلقي بعد BMT يمكن تحليلها(الشكل 2C،مؤامرة تمثيلية؛ ن = 1).
ويبين الشكل 3 تطبيقًا موسعًا لهذه الطريقة في البيانات التاريخية من مجموعتنا باستخدام البروتوكول المقدم لمقارنة تراكم الخلايا T CD8+ التي تحفز GVHD مقابل الخلايا T المشتقة من الجهات المانحة CD4 في القولون من فئران BALB/c المحمية أو غير المحمية من GVHD من قبل قبل BMT العلاج قبل نظام (تكييف)20. وشملت النظم السابقة للأدوية التي تم اختبارها 800 cGy/myeloablative التشعيع الكلي للجسم (TBI800) أو TBI غير النخاعي (400TBI)، فضلا عن تكييف nonmyeloablative باستخدام التشعيع اللمفاوي الكلي (TLI) الذي تم فيه تسليم التشعيع إلى الليمفاوية العقد، الغدة الصعترية، والطحال مع التدريع من الجمجمة والرئتين والأطراف والحوض والذيل. تم الجمع بين جميع التكييف مع مصل مضاد للخلايا الصعترية (ATS)، وهو عامل مناعي. في وقت مبكر من اليوم 6 بعد BMT، أدى بروتوكول عزل MNC القولوني ة إلى تحليلات قوية لقياس التدفق بالمقارنة مع تحليلات متطابقة على المزيد من الأجهزة المستهدفة GVHD التي تثري الخلايا الليمفاوية مثل الطحال والعقد الليمفاوية mesenteric(الشكل 3A)20 . العزل القابل للتكرار من MNC القولونية عبر المتلقين BMT (ن = 7-10 لكل مجموعة العلاج) يسمح بإجراء مقارنة إحصائية قوية من الأرقام المطلقة للمتبرع CD8+ الخلايا T التأثير بين مختلف مجموعات العلاج قبل زرع ( الشكل 3B)،مما أسفر عن بيانات هامة عن الأنماط الظاهرية المناعية التي أدت إلى دراسات رئيسية تكشف عن آليات المناعة الفطرية لحماية GVHD من TLI بدلا من TBI قبل BMT تكييف. 20
الشكل 1: تحليل مقياس التدفق القولون MNC في اليوم 7 بعد BMT في أنظمة نموذج الماوس الأوجينية عندما معزولة مع Collagenase E و D مع وبدون DNAse 1. وقد تلقت الفئران من النوع البري (WT) (CD45.2++) BALB/c (H2Kd+) BMT من CD45 congenic (CD45.1+) C57BL/6 الفئران المانحة (BMT الأوجينية، ن = 3 لكل مجموعة). تم إعطاء WT (CD45.2+) الفئران المتلقية BALB /c 800cGy TBI (BALB/c) قبل يوم واحد BMT. في اليوم 7 بعد BMT، تم إعداد تعليق خلية واحدة من القولون المتلقي باتباع أساليب هذه المخطوطة مع استخدام Collagenase E (100 U/mL)، Collagenase E (100 U/mL) مع DNAse 1 (500 ميكروغرام / مل)، Collagenase D (500 ميكروغرام / مل)، أو Collagenase D (500μg/mL) مع DNAse 1 (500μg/mL) (n = 3 لكل مجموعة). كانت الخلايا ملطخة بـ Live/dead-UV450 (Live/Dead Blue)، الملحقV-APC، H-2K d-PE، CD45.1-BV605، CD3-FITC، CD4-BV711، CD8-APC-Cy7، FoxP3-Pacific Blue، والأجسام المضادة CD11b-PE-Cy7. (أ)استراتيجية تحديد التحليلات التي تقوم بها القوات المسلحة الكونغولية. البوابة 0، مبعثر إلى الأمام (FSC-A) وتشتت الجانب (SSC-A) على تعليق خلية واحدة من MNC المستخدمة لتحديد الكريات البيض؛ البوابة 1، استبعاد الخلايا غير الفردية باستخدام SSC-A؛ البوابة 2، استبعاد الخلايا غير الفردية باستخدام FSC-A؛ البوابة 3، وتحديد الملحقين V إيجابية (أبوبتوتيك) وعملية إصلاح صبغ لايف / الميت UV450+Annexin V-السلبية (نخر) مجموعات فرعية الخلية. (ب)قطع الأراضي ممثل FACS من الملحقين الخامس وصبغ قابلة للإصلاح يمكن إصلاحه تلطيخ الكريات البيض المسورة بين MNC للمجموعات التجريبية 4. N = 1 الماوس التمثيلي لكل مجموعة في مجموعات: Collagenase E (100 U /mL)، Collagenase E (100 U /mL) + DNAse 1 (500 ميكروغرام / مل)، كولاجيناز D (500 ميكروغرام / مل)، وCollagenase D (500 ميكروغرام / مل) + DNAse 1 (500 ميكروغرام / مل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التوصيف السيتومي للحركة القولونية في اليوم السابع بعد BMT في أنظمة نموذج الماوس الأوجيني والتآزري. تلقت الفئران WT (CD45.2++) C57BL/6 (H2Kd-neg)وBALB/c (H2Kd+) BMT من CD45-congenic (CD45.1++) C57BL/6 وبالب/ج الفئران المانحة (المتجانسة أو الأوجينية BMT، n = 4 لكل مجموعة تجريبية). تلقت الفئران المتلقية C57BL/6 وBALB/c أنظمة تكييف مفضي من 950cGy (C57BL/6) و 800cGy (BALB/c) النخاعTBI، التي تم تسليمها قبل يوم واحد من BMT. في اليوم السابع بعد BMT، تم إعداد تعليق خلية واحدة من المستلمين المستعمرة MNC باتباع أساليب هذه المخطوطة. كانت الخلايا ملطخة بالأجسام المضادة Live-dead-BV510 و H-2Kd-PEوCD45.1-BV605 وCD4-FITC وCD8-APC-Cy7 وCD25-PacificBlue وFoxP3-AF647 وCD11b-PE-Cy7 antibodies, N = 4 فئران لكل مجموعة. (أ)متوسط ± SEM الرقم المطلق (سجل 10) CD45.1+ H-2kd-neg أو CD45.1+ H-2k d+ (من نوع donor-type، في كل حالة) CD11bnegCD4+ و CD8+ T الخلايا المعزولة من القولون المتلقي في اليوم 7 بعد تكييف وCD45.1 C57BL/6 (المانح) → CD45.2 BALB /c (المتلقي) BMT. N = 4 لكل مجموعة. (ب)استراتيجية تحديد التحليلات التي تقوم بها القوات المسلحة الكونغولية. البوابة 0، مبعثر إلى الأمام (FSC-A) وتشتت الجانب (SSC-A) على تعليق خلية واحدة من MNC المستخدمة لتحديد الكريات البيض؛ البوابة 1، استبعاد الخلايا غير الفردية باستخدام SSC-A؛ البوابة 2، استبعاد الخلايا غير الفردية باستخدام FSC-A؛ البوابة 3، حي اختيار الخلية بوابة 4 ، والفصل بين خلايا المكونة للدم من متبرع BMT مقابل أصل المتلقي BMT؛ البوابة 5، اختيار خلايا النسب غير النخاعية المانحة؛ بوابة 6، gating انتقائية من CD4+ T الخلايا. بوابة 7، gating منفصلة من CD4+CD25+FoxP3+ T التنظيمية (Treg) الخلايا. السهم الأحمر يدل على استراتيجية الحفر إلى أسفل gating. (C)قطع الأراضي ممثل FACS من CD25 وFoxP3 تلطيخ باستخدام استراتيجية gating في (B) في اليوم 7 بعد تكييف وBMT في القولون من BALB / ج المتلقي من BMT الأوجينية (C57BL/6 → BALB / ج). يتم إعطاء النسبة المئوية للخلايا في كل بوابة داخل البوابة. WT = النوع البري؛ TBI = التشعيع الكلي للجسم؛ BM = 10 × 106 CD45.1+ C57BL/6 أو خلايا نخاع العظم المانحة BALB/c؛ تيف = T المؤثر الخلايا; Treg = Foxp3+ T الخلايا التنظيمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: TLI/ATS غير النقوي غير النقوي ولكن ليس تكييف TBI/ATS يقلل من المانحين TCRαβ+CD8+ المؤثر T تراكم الخلايا. (أ)قطع الأراضي التمثيلية FACS من CD4 و CD8 تلطيخ البوابات H-2Kb+TCRαβ+ خلايا من الفئران المانحة H-2Kb+ C57BL/6 في الطحال (الصف العلوي)، العقدة الليمفاوية mesenteric (MLN) (الصف الأوسط)، والقولون (الصف السفلي) من المتلقين في اليوم 6 بعد التكييف وزرع. يتم إعطاء النسبة المئوية للخلايا في كل بوابة فوق البوابة. (B)متوسط ± SEM العدد المطلق (سجل 10) H-2Kب +TCRαβ+CD8+ الخلايا في الطحال (اللوحة العليا)، MLN (اللوحة الوسطى)، والقولون (لوحة أسفل) من المتلقين في اليوم 6 بعد تكييف وBMT. WT = من النوع البري؛ TBI = التشعيع الكلي للجسم؛ TLI =: التشعيع اللمفاوي الكلي; ATS = مصل مضاد للخلايا الصعترية. BM = 50 × 106 WT C57BL/6 خلايا نخاع العظام المانحة؛ SPL = 60 × 106 WT C57BL/6 خلايا الطحال المانحة؛ TBI800, TBI400 = cGy جرعات من النخاع (TBI800) أو غير النخاعية (TBI400) TBI. * تم تعديل هذا الرقم من فان دير ميروي وآخرون20. حقوق الطبع والنشر 2013. الرابطة الأمريكية لأخصائيي المناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | الصيغه |
| المخزن المؤقت للنقطتين | 500 مل RPMI + 10M HEPES + 10٪ FBS (الحرارة غير معطلة في 56سC لمدة 60 دقيقة، والرقم الهيدروجيني المعدلة إلى 7.3) |
| الوسائط التدرج الكثافة القائمة على السيليكا 100٪ (لكل كولون) | 22.5 مل من الوسائط التدرج الكثافة القائمة على السيليكا + 2.5 مل من 10X PBS. |
| الوسائط التدرج الكثافة القائمة على السيليكا 66٪ (لكل كولون) | 10.72 مل على أساس السيليكا الكثافة التدرج وسائل الإعلام 100٪ + 5.28 مل القولون العازلة |
| الوسائط التدرج الكثافة القائمة على السيليكا 44٪ (لكلالقولون) | 11 مل السيليكا القائم على كثافة التدرج وسائل الإعلام 100٪ + 14 مل القولون العازلة |
| عازل هضم الكولاجين (لكل كولون) | 100 U / مل من Collagenase E من كلوستريديوم هيتوليليكوم،حل في 40 مل القولون العازلة |
| المخزن المؤقت لـ FACS | 500 مل 1x PBS + 5 غرام بكالوريوس + 1 مم EDTA + 0.2 غرام أزيد الصوديوم |
الجدول 1: جدول إعداد الحلول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول البصري الأساليب التي يمكن تحملها بشكل جيد لعزل الخلايا أحادية النووية القولونية بما في ذلك الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). وبالنظر إلى أن هذا البروتوكول تم تحسينه في تقييم نماذج التهاب القولون الماوس بعد زرع شديدة حيث السيتوكينات الالتهابية وإصابة الأنسجة تصلح لضعف قدرة MNC المستردة، ونحن نتوقع أن هذه الأساليب يمكن ترجمتها إلى أخرى التطبيقات التي تتطلب التحليل الفينوتي للملية القولونية. وتشمل هذه ولكن، لا تقتصر على تقييم التهاب القولون في نماذج الماوس من مرض التهاب الأمعاء، ودراسات الاستجابات المناعية للعلاجات التي تستهدف التهاب القولون، والتهاب القولون التي تنتجها مسببات الأمراض المعدية. بالإضافة إلى ذلك، تشير بياناتنا باستخدام العزلات في الفئران السليمة (الsyngeneic BMT) إلى أن إجراء العزل لا يتطلب تسللاً التهابياً كبيراً للسماح بالكشف عن الخلايا المناعية في عزلات MNC. وفي الواقع، تم الحصول على بيانات مماثلة باستخدام فئران صحية غير معالجة (غير BMT) (لم تظهر البيانات).
وهناك عدة خطوات رئيسية في هذا البروتوكول تميزه عن الأساليب المنشورة الأخرى وتسهم في تحقيق غلة عالية وجدوى. على سبيل المثال، تحسين نشاط كولاجيناز E المشتق من كلوستريديوم الهيتوليتيكيوم(مستوى النشاط النهائي 100 U/mL) يسمح بحسابات متسقة لوالكثير من الإنزيمات المختلفة على مدى تجارب طويلة المدى26. هناك 28 عضوا مختلفا في عائلة الكولاجين، وتشكل معا ما يقرب من 30٪ من جميع البروتينات في الجسم الثدييات27. وبالإضافة إلى ذلك، الأنسجة المختلفة لها توزيعات متميزة من الأنواع الفرعية الكولاجين، كل منها يتطلب الكولاجين فريدة من نوعها للهضم28. كولاجيناز من C. histolyticum يتضمن 6 بروتينات مختلفة مصنفة في فئتين29،30. نوع معين من الكولاجين المستخدمة يمكن أن تغير جدوى ونوعية شاملة للخلايا المعزولة من القولون31. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الكولاجين نوع C-2139 (Collagenase E) يسمح بغلة عالية من الخلايا الليمفاوية بين MNC معزولة عن الأمعاء الدقيقة25. ومع ذلك، لم تعالج هذه البروتوكولات هضم القولون، وهو جهاز عضلي أكثر بكثير مع تكوين الكولاجين أكثر تعقيدا بكثير من الأمعاء الدقيقة.
كفاية وموثوقية تدهور الأنسجة الأنزيمية هو عامل ثابت يؤثر على العائد الكلي للخلايا وصلاحيتها عن طريق التقليل إلى أدنى حد من الحاجة إلى التعطيل الميكانيكي المتكرر (مما يؤدي إلى زيادة الصدمات الميكانيكية في الأنسجة). بسبب الهضم الأنزيمي الكافي للكولاجين الخلالي والغشاء المخاطي باستخدام بروتوكول الكولاجين E-محددة (بالمقارنة مع بروتوكولات الهضم D بوساطة الكولاجين في الاستخدام القياسي)، يقلل هذا البروتوكول من كمية التلاعب الميكانيكي ة شظايا الأنسجة اللازمة لتعطيل الانترستيوم وإطلاق المجموعات الفرعية للخلايا المناعية في التعليق. وهذا يزيد من تعزيز قدرة المؤتمر الوطني العام المعزول على البقاء في الاختبارات اللاحقة. كما هو مبين في البيانات(الشكل 1B)،وهذا يلغي الحاجة إلى DNAse وغيرها من المناورات الكيميائية أو الميكانيكية المضادة للتكتل وراء الترشيح القياسية من تعليق خلية واحدة من خلال مصفاة. وقد استخدمت تقارير أخرى تحدد عزل الخلايا اللمفاوية المعوية dithiothreitol (DTT) وEDTA كعوامل المخاطية لتعزيز كل من العائد وصلاحية الكريات البيض أحادية النووية المعزولة24.
جانب فريد آخر من هذا البروتوكول الذي يحسن إنتاجية الخلية هو تطبيق التدرج الوسائط فصل الكثافة المستندة إلى السيليكا ضبطها بدقة. أوراق طرق الهضم الأخرى المنشورة حتى الآن لا تستخدم مثل هذا التدرج فصل الكثافة21،31. ومع ذلك، في تجربة المؤلفين وتلك من المتعاونين باستخدام هذا البروتوكول لعزل الخلايا الليمفاوية النشطة وظيفيا، تنقية تدرج الكثافة يحسن كل من جدوى ونقاء MNC تعافى بعد الهضم19 , 20 , 32.
على الرغم من أن هذه المخطوطة ليست محور تركيز، جديرة بالذكر لأولئك الذين يعملون مع نماذج التهاب الأمعاء في الفئران هو أن الأساليب في هذه المخطوطة يمكن تعديلها للسماح عزل عالية الجودة مماثلة من MNC قابلة للحياة من الأمعاء الدقيقة. تعديل بروتوكول القولون الأساسي المطلوب لتحقيق ذلك هو استخدام هضم واحد 90 دقيقة (بدلا من اثنين من الهضم 60 دقيقة)، مع جميع الخطوات الأخرى (بما في ذلك مستوى نشاط الإنزيم وخطوات التبريد) مماثلة لتلك التي تظهر. هذا التعديل عادة ما ينتج مجموعة من 0.8-4 × 106 MNC لكل الأمعاء الدقيقة دون أو 1.5-2.5 × 106 MNC مع إدراج اللفائفي الطرفي بما في ذلك غطاء cecal الغنية بالكريات البيض. لذلك، واحدة من الجدة من هذا البروتوكول هو أن تطبيق البروتوكول الأساسي للقولون والبروتوكول المعدل على الأمعاء الدقيقة، يمكن للمرء أن يعزل MNC مع استنساخ عالية وجدوى جيدة من كل من الأمعاء الدقيقة والقولون الفردية الحيوانات التجريبية في نفس التجربة.
وباختصار، يسمح البروتوكول الموصوف بعزل الخلايا أحادية النووية بكفاءة واستنساخها من القولون أو الأمعاء الدقيقة مع إدخال تعديلات عليها. مع 2 مشغلي يتقن العمل معا، ما يصل إلى 10 القولون منفصلة يمكن معالجتها وتحليلها في يوم واحد، وتعليق خلية واحدة يمكن أن تكون جاهزة لتحليل الفينوتيبيك والوظيفية اللاحقة في غضون 6-8 ساعة من حصاد الأنسجة. تطبيق هذا البروتوكول قد يثبت قيمة لأهداف البحوث الأخرى التي تحتاج إلى تقييم المناعة لالتهاب القولون، مما يسمح للمحققين الآخرين لتوصيف الجهاز المناعي للقولون الماوس بطريقة صارمة واستنساخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح #1K08HL088260 و #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ومؤسسة Batchelor لبحوث الأطفال (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 وBALB / ج الفئران المستخدمة في هذه الدراسة إما ولدت في منشأتنا أو المقدمة من مختبرات جاكسون أو تاكونيك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B.
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J.
- Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F.
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M.
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
