Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av lamina propria mononukleære celler fra murine Colon bruke Kollagenase E

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Målet med denne protokollen er å isolere mononukleære celler som ligger i lamina propria i tykktarmen ved enzymatisk fordøyelse av vevet ved hjelp av kollagenase. Denne protokollen gjør det mulig for effektiv isolering av mononukleære celler som resulterer i en enkelt celle suspensjon som i sin tur kan brukes til robuste immunfenotyping.

Abstract

Tarmen er hjemmet til det største antall immunceller i kroppen. Det liten og stor intestinal immun systemer politiet avsøring å eksogene antigener og modulere Svar å potent mikrobielt avledet immun stimuli. Av denne grunn er tarmen et viktig målområde for immun feilregulering og betennelse i mange sykdommer, inkludert men, ikke begrenset til inflammatoriske tarm sykdommer som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, pode-versus-host sykdom (GVHD) etter bein marg transplantasjon (BMT), og mange allergiske og smittsomme tilstander. Murine-modeller av gastrointestinal betennelse og kolitt er mye brukt til å studere GI komplikasjoner og til pre-klinisk optimalisere strategier for forebygging og behandling. Data samlet fra disse modellene via isolasjon og fenotypiske analyse av immunceller fra tarmen er avgjørende for ytterligere immun forståelse som kan anvendes for å forbedre Gastrointestinal og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne rapporten beskriver en svært effektiv protokoll for isolering av mononukleære celler (MNC) fra kolon ved hjelp av en blandet silica-basert tetthet gradient grensesnitt. Denne metoden reproduserbar isolerer et betydelig antall levedyktige leukocytter samtidig minimere forurensende rusk, slik at påfølgende immune bestemmelse av fenotype ved flyt flowcytometri eller andre metoder.

Introduction

Selv om Gastrointestinal (GI)-kanalen er primært dedikert til behandling og reabsorpsjon av næringsstoffer fra mat, opprettholder GI veiene også sentrale roller i integriteten av vaskulære, lymfatisk, og nervøse systemer og av mange andre organer gjennom sin slimhinne og submucosal immunsystem1. GI immune systemet har en innflytelsesrik rolle i både Gastrointestinal og systemisk helse på grunn av sin konstante eksponering for utenlandske antigener fra mat, Commensal bakterier, eller invadere patogener1,2. Dermed må gi immunforsvaret opprettholde en delikat balanse der det tåler ikke-patogene antigener mens svarer hensiktsmessig til patogene antigener1,2. Når balansen av toleranse og forsvar er forstyrret, lokaliserte eller systemisk immune feilregulering og betennelse kan oppstå som resulterer i en myriade av sykdommer1,2,3.

Tarmen havner minst 70% av alle lymfoide celler i kroppen4. De fleste primære Immunologic interaksjoner innebære minst én av tre uimottakelig stasjoner i tarmen: 1) Peyer ' s patcher, 2) intraepithelial-lymfocytter (IEL) og 3) lamina propria-lymfocytter (LPL). Hver av disse består av et komplekst sammenhengende nettverk av immunceller som raskt reagerer på normale immun utfordringer i tarmen5. Begrenset til stroma over muscularis mucosae, løst strukturert lamina propria er bindevev i tarmen mucosa og inkluderer stillas for villus, den blodkar, lymfatisk drenering, og slimhinnen nervesystemet, samt mange medfødt og adaptive immune undergrupper6,7,8,9. LPL består av CD4+ og CD8+ T celler i et omtrentlig forhold på 2:1, plasma celler og myelogen avstamning celler inkludert, dendrittiske celler, mastceller, eosinofile og makrofager6.

Det er en økende interesse i å forstå immun feilregulering og betennelse i tarmen som det gjelder ulike sykdomstilstander. Slike forhold som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt manifesterer alle varierende nivåer av colonic betennelse10,11,12. I tillegg kan pasienter med ondartede eller ikke-ondartede forstyrrelser i margen eller immunsystemet som gjennomgår en allogene benmarg transplantasjon (Allo-BMT) utvikle ulike former for kolitt inkludert 1) direkte toksisitet fra condition regimer før BMT, 2) infeksjoner forårsaket av immunsuppresjon etter BMT og 3) pode-versus-host sykdom (GVHD) drevet av donor-type T-celler reagerer på donor Allo-antigener i vevet etter BMT13,14,15. Alle disse post-BMT komplikasjoner resultere i betydelige endringer i immun miljøet i tarmen16,17,18. Den foreslåtte metoden gjør det mulig for en pålitelig vurdering av immun celle akkumulering i musen kolon, og når den brukes til murine mottakere etter BMT, forenkler en effektiv analyse av både donor og mottaker immunceller involvert i transplantasjon toleranse19 ,20. Ytterligere årsaker til tarmbetennelse inkluderer ondartet, matallergier, eller forstyrrelse av tarmen mikrobiomet. Denne protokollen gir tilgang til gut mononukleære celler fra kolon og, med modifikasjoner, til leukocytter av tynntarmen i noen av disse prekliniske murine modeller.

En PubMed søk ved hjelp av søkeordene "tarmen og immun celle og isolasjon" avslører over 200 publikasjoner som beskriver metoder for tynntarmen fordøyelsen å trekke ut immunceller. Men en lignende litteratursøk for kolon gir ingen godt avgrenset protokoller spesifisere isolering av immunceller fra kolon. Dette kan være fordi kolon har mer muskuløse og interstitiell lag, rendering det vanskeligere å fullstendig fordøye enn tynntarmen. I motsetning til eksisterende protokoller, bruker denne protokollen spesifikt Kollagenase E fra histolyticum uten andre bakterielle Collagenases (kollagenase D/kollagenase I). Vi viser at ved hjelp av denne protokollen, fordøyelsen av colonic vev kan oppnås samtidig bevare kvaliteten på isolerte gut mononukleære immunceller (MNC) uten tilsetning av anti-klumper reagenser som natrium versenate (EDTA), Dispase II, og deoxyribonuclease i (DNAse i)21,22,23. Denne protokollen er optimalisert for å tillate reproduserbar robust utvinning av levedyktige MNC fra murine kolon for videre rettet studier og bør låne seg til studiet av immunologi av kolon eller (med modifikasjoner) i tynntarmen24, 25på.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studier var gjennomførte under gnager forskning protokoller anmelder og anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av universitetet av Miami møllen skolen av medisin, hvilke møter det Veterinary standarder sette av amerikaneren forening for laboratorium dyr vitenskap (AALAS).

1. utarbeidelse av løsninger

  1. Som beskrevet i tabell 1, forberede Colon buffer, silica-baserte Density separasjon Media 100%, silica-basert tetthet separasjon Media 66%, silica-baserte Density separasjon Media 44%, Kollagenase E fordøyelsen buffer, og FACS buffer.
    1. Forbered kolon buffer dagen før prosedyren og lagre over natten ved 4 ° c.
    2. Forbered 100% silica-basert tetthets separasjon Media dagen før prosedyren og lagres over natten ved 4 ° c, plassere ved romtemperatur morgenen av prosedyren for å tine.
    3. Forbered 66% og 44% silica-basert separasjon Media i morgen av isolasjonen, ved hjelp av romtemperatur 100% silica-baserte Density separasjon Media og kolon buffer.
    4. Mål riktig mengde av histolyticum-avledet kollagenase E og lagre ved-20 ° c over natten før prosedyren. Neste morgen, oppløses i riktig volum av kolon buffer for å utlede Kollagenase fordøyelse buffer. For alle incubations med Kollagenase fordøyelsen buffer på dagen av prosedyren, pre-varme løsninger til 37 ° c.
  2. For hele protokoll trinnene må du holde en sentrifuge ved 20 ° c og rotasjonshastigheten til 859 x g, med bremser deaktivert (0 retardasjon) for graderings sentrifugering. Sett en annen til 4 ° c og rotasjonshastighet på 859 x g, med standard retardasjon, for vask trinn.

2. høsting av Colon

  1. Euthanize musen via CO2 kvelning ETTERFULGT av AALAC-godkjent bekreftende metode.
  2. Plasser musen i en liggende posisjon og spray pelsen med 70% etanol. Ved hjelp av store vev saks, lage en vertikal midtlinjen snitt og utsette intakt peritoneum.
  3. Ved hjelp av fine disseksjon saks, åpne peritoneum. Bruk tang til å flytte tynntarmen til den ene siden og utsett synkende kolon. Litt trekke oppover på synkende kolon til maksimalt eksponere rektal delen av kolon. Skjær den fjerne endetarmen dypt i bekkenet og analysere og fjerne hele kolon som en enhet, fra den fjerne endetarmen til cecal cap.
  4. Overfør kolon i 20 mL kjølt kolon buffer i en 50 mL polypropylen tube.

3. rengjøring av kolon

  1. Plasser kolon på en fuktet papir håndkle og Pakk den solide avføring ved å bruke mildt trykk til tarmveggen med butt enden av saks eller tang.
  2. Plasser kolon i en Petri parabol og skyll tarmen med 10 mL kjølt Colon buffer ved hjelp av en 10 mL sprøyte med 18 G sløv fyll nål.
  3. Overfør kolon til en kolon buffer fuktet papir håndkle og fjerne mesenterium og fett med den skarpe enden av saks.
  4. Plasser kolon i en Petri parabolen fylt med 5-10 mL kjølt Colon buffer agitating manuelt for å vaske resterende colonic innholdet. Gjenta 2-3 ganger.
  5. Skjær kolon lengderetningen fra sin mer muskuløse rektal ende til proksimale kolon (genererer en enkelt rektangulær åpen kolon stykke) i en Petri parabol fylt med friske kjølt Colon buffer. Forkast eksisterende medier og fyll på med ren kjølt kolon buffer.
  6. Vask tarmen 3 ganger ved kraftig virvlende den i Petri parabolen og erstatte 5-10 mL kjølt kolon buffer etter med hver vask.
  7. Plasser den rektangulære kolon vevet på et papir håndkle fuktet med Colon buffer og skjær den ved å skjære den horisontalt og deretter inn i små fragmenter (3 mm x 3 mm seksjoner).
  8. Samle kolon fragmenter nøye ved hjelp av fine pinsett i 20 mL kjølt Colon buffer i en 50 mL polypropylen konisk tube.
  9. Vask kolon fragmenter 3 ganger, hver vask i 20 mL kolon buffer, ved kraftig virvlende røret for 30 s. mellom hver agitasjon, la vevet fragmenter til å bosette seg til bunnen av røret. Dekanter eller vakuum aspirer supernatanten samtidig som det hindrer vevs fragment tap i aspirasjon prosessen mellom hver vask.
    Merk: Det er ikke nødvendig å bytte røret etter hver vask.

4. kollagenase fordøyelse 1

  1. Tilsett 20 mL av Kollagenase fordøyelsen buffer til vasket kolon fragmenter i 50 mL polypropylen konisk tube.
  2. Plasser den lukkede 50 mL rør ved 37 ° c i en inkubert orbital shaker med rotasjonshastigheten satt til 2 x g for 60 min. sikre at vevs fragmentene er i konstant bevegelse under omrøring; om nødvendig, øke rotasjonshastigheten trinnvis for å sikre at ingen vev fragmenter bosette seg på røret bunnen.

5. Forbered silica-baserte separasjon Media graderinger

  1. Forbered 66% og 44% silica-baserte Density separasjon Media, med 100% silica-baserte Density separasjon Media ved 20 ° c (romtemperatur) og kolon buffer.
  2. Hell 5 mL 66% silica-basert tetthets separasjon i hver av de 3 separate 15 mL polypropylen rørene. Forbered 3 rør per kolon. Dette danner høyere tetthet base av gradient isolasjon prosedyre, på hvilke lavere tetthet separasjon Media vil bli lagdelt å skape separasjon gradient.
  3. Oppbevares ved 20 ° c til bruk.

6. innsamling av Supernatanten fra fordøyelsen 1

  1. Samle bare supernatanten ved hjelp av en 25 mL serologisk pipette og filtrere supernatanten gjennom en 40 μm pore filtrering stoff celle sil plassert i en ren 50 mL polypropylen konisk rør, etter Kollagenase fordøyelse 1 er fullført. Vær forsiktig så du ikke aspirer noen eksisterende vev fragmenter.
    Merk: Behold eventuelle gjenværende synlige vevs fragmenter i slangen. Disse vil gjennomgå andre kollagenase fordøyelsen (trinn 8).

7. slukke Kollagenase fordøyelsen buffer

  1. Fyll 50 mL polypropylen rør helt med kjølt Colon buffer.
    Merk: Kollagenase er aktiv ved 37 ° c. dermed kjølt buffer inaktiverer Dette enzymet.
  2. Sentrifuger røret ved 4 ° c ved 800 x g i 5 min.
    1. Kast supernatanten via vakuum aspirasjon. Vask celler med 25 mL fersk kolon buffer og sentrifuger ved 800 x g i 5 min.
    2. Resuspend pellet i mindre enn 1 mL fersk kjølt Colon buffer.
    3. Plasser 50 mL polypropylen koniske rør på is.

Åttende kollagenase fordøyelse 2

  1. Gjenta trinn 4 (fordøyelse 1) med de resterende vevs fragmentene beholdt fra trinn 6,1.

9. tissue Disaggregation etter fordøyelsen 2

  1. Skyll vevs fragmentene kraftig frem og tilbake mellom røret og en 10 mL sprøyte gjennom en 18 G stump ende nål.
  2. Gjenta denne flush for et minimum av 7-8 komplette passasjer, fortsetter inntil ingen brutto vevs fragmenter eller rusk er synlige.

10. Filtrer celler

  1. Pass vevet Disaggregation suspensjon gjennom en 40 μm-pore filtrering stoff celle sil i en ren 50 mL polypropylen tube.
  2. Vask filtrerings stoffet celle sil med 10 mL kjølt kolon buffer for å gjenopprette eventuelle celler fanget i filteret.

11. slukke Kollagenase fordøyelse

  1. Fyll 50 mL polypropylen konisk rør til felgen med kjølt Colon buffer.
    Merk: Temperaturen på kolon buffer er avgjørende for å sikre slukking av kollagenase aktivitet.
  2. Spin ved 4 ° c og 800 x g i 5 min.
  3. Kast supernatanten via vakuum aspirasjon.
  4. Vask ved blanding i 25 mL fersk kjølt Colon buffer, etterfulgt av sentrifugering ved 4 ° c, 800 x g i 5 min.
  5. Kast supernatanten via vakuum aspirasjon.
  6. Pool den resuspendert pellet fra Kollagenase fordøyelse 1 (trinn 7) til tilsvarende rør fra trinn 11,4.
  7. Gjenta trinn 11,4 (vask og sentrifugering).

12. silica-baserte Density separasjon Media gradient separasjon

Merk: Utfør trinn 12-18 så raskt som mulig, for å sikre rask slukking av kollagenase aktivitet.

  1. Etter trinn 11,7, resuspend hver pellet i 24 mL totalt 44% silica-baserte Density separasjon Media per kolon.
  2. Langsomt lag 8 mL av Media fra trinn 12,1 på hver av tre rør utarbeidet på trinn 5,2 (inneholder 66% silica-baserte Density separasjon Media), ved hjelp av en 10 mL serologisk pipette. Opprettholde en jevn og langsom flyt av 44% Density separasjon Media mens lagene i gradient for å unngå avbrudd i grensesnittet.
  3. Balansere alle rør i sentrifuge bøtter nøye med en veie skala eller en balanse.
  4. Snurr rørene 20 min på 859 x g i en sentrifuge uten brems ved 20 ° c. La slangene kommer til å fullføre hvile før du fjerner rør, ta vare ikke å forstyrre cellene ved gradient grensesnittet.

13. samle mononukleære celler fra gradient Interface

  1. Visualiser gradient grensesnittet (nær 5 mL merke), hvor vanligvis en 1-2 mm tykt hvitt bånd (som inneholder MNC) er til stede.
    Merk: En kan eller ikke kan se et hvitt bånd. Imidlertid vil MNC være på dette grensesnittet og bør Sky klarhet i gradient grensesnittet.
  2. Vakuum aspirer og Forkast topp 7 mL av den øverste graderingen for å gi enklere pipette tilgang til grensesnittet.
  3. Ved hjelp av kontinuerlig manuell sug og jevn roterende håndleddet bevegelse, samle grensesnitt laget av celler til en ren 50 mL polypropylen konisk rør. Samle inn til grensesnittet mellom de 2 graderinger er klar og refractile (klar av celler).
  4. Fyll samlingen rør med 50 mL kjølt FACS buffer. Spin ved 4 ° c, 800 x g i 5 min.
  5. Aspirer supernatanten via vakuum aspirasjon og resuspend pellet i 1 mL FACS buffer.
  6. Telle cellene på en hemocytometer ved en 1:2 fortynning ved hjelp av egnede Dead Cell eksklusjon metoder.
  7. Fortsett til FACS farging eller andre analyser med fersk isolert colonic MNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når du arbeider med murine Colon sykdom modeller, er det nyttig å kunne både kvantifisere og kvalitativt vurdere, blant MNC i tykktarmen, flere immun celle delsett involvert i den inflammatoriske prosessen. Den single-celle suspensjon av MNC innhentet gjennom anvendelsen av denne protokollen Letter slike fenotypiske karakterisering i en robust og reproduserbar måte. Som et bevis på prinsippet for anvendelsen av denne isolasjons metoden under diverse eksperimentelle innstillinger, vi hentet colonic MNC bruke denne metoden og utførte multi-parameter Flow flowcytometri på celler isolert fra mus med (figur 1 og Figur 2 , ALLOGENE BMT) og uten (figur 2a, syngeneic BMT) signifikant immune-MEDIERT colonic skade etter BMT.

Flow flowcytometri og dataanalyser ble utført for å sammenligne fraksjoner av apoptotisk og nekrotisk døde lymfocytter når du bruker enten Kollagenase E eller D for isolasjon, med eller uten DNase 1 behandling. Den gating strategien som brukes under strømnings flowcytometri, er gitt i figur 1a.  Følgende Annexin V (apoptose markør) og fixable Live/Dead Blue Dye (nekrose markør) farging på enkelt celle suspensjoner etter hver isolasjon, kollagenase E uten DNAse viste en betydelig høyere prosentandel av Annexin Vneg Live/Dead Blueneg Live-celler (median 43,3%, område 26.5%-59,9%, n = 3) etter isolering sammenlignet med kollagenase D uten DNAse (median 8.7%, rekkevidde 3,6%-10,2%, n = 3), selv sammenlignet med kollagenase E + DNAse (median 8,18%, rekkevidde 4,7%-20,4%, n = 3) eller Kollagenase D + DNAse (median 15.10%, område 9.9%-21,4%, n = 3). I tillegg identifiserte vi Annexin VnegLive/Dead Blue + nekrotisk celler med en median prosentandel på 41,0% i kollagenase E-gruppen (område 37.1%-58,8%, n = 3) versus 90,0% i kollagenase D-gruppen (område 69.7%-95,5%, n = 3), 75,9% i kollagenase E + DNAse gruppe, og 80,3% i henholdsvis Kollagenase D + DNAse-gruppen (område 65.7%-79,5%, område 54.9%-89,9%, n = 3). Representative FACS tomter fra n = 1 dyr i hver gruppe vises figur 1B).

Som ytterligere bevis på prinsippet om konsistens og utbytte av levedyktig MNC bruke denne prosedyren i syke mus, multi-parametrisk Flow flowcytometri ble brukt til MNC isolert fra CD 45.2 BALB/c mottaker mus på dag 7 etter å ha mottatt BMT av enten allogene (CD 45.1 C57BL/6 donor) eller syngeneic (CD 45.1 BALB/c donor) BMT modeller. Bruke absolutte MNC tall multiplisert med prosent gated uimottakelig delsett innhentet av Flow flowcytometri analyser, mener absolutt antall donor CD4+ og CD8+ T celler Hentet fra BMT mottakerens kolon kunne beregnes og sammenlignes (n = 4 per gruppe, figur 2a). Siden det kan være viktig å identifisere og/eller quantitate sjeldne immun celle populasjoner i slike mus modeller, vurderte vi sjeldne delsett inkludert donor avledet (CD 45.1+) Foxp3 regulatoriske celler (treg) i både syngeneic og allogene BMT modeller. Den gating strategi for å nå donor treg celler (CD4+CD25+FoxP3+) fra antistoff-farget enkelt celle suspensjon vises (sekvens av porter avgrenset av en rød pil; Figur 2b). Ved hjelp av denne metoden, selv sjeldne delsett som donor avledet colonic treg infiltrere mottaker mus kolon etter BMT kunne analyseres (figur 2C, representative plot; n = 1).

Figur 3 viser en utvidet anvendelse av denne metoden i historiske data fra vår gruppe ved hjelp av presenterte protokollen for å sammenligne AKKUMULERING av GVHD-inducing CD8 + versus CD4 + donor-avledet T-celler i tykktarmen av BALB/c mus enten beskyttet eller ikke beskyttet fra GVHD av pre-BMT behandling preparativ (condition) regime20. Testet preparativ regimer inkludert 800 cGy/myeloablativ total Body bestråling (TBI800) eller ikke-myeloablativ TBI (400TBI), samt nonmyeloablative condition med total lymfoide bestråling (TLI) der bestråling ble levert til lymfe noder, thymus, og milt med skjerming av skallen, lunger, lemmer, bekken og hale. Alle condition ble kombinert med anti-thymocyte serum (ATS), en immunmodulatorer agent. Så tidlig som dag 6 etter BMT resulterte denne colonic MNC isolasjons protokollen i robuste strømnings analytiske analyser sammenlignet med identiske analyser på flere lymfocytter beriket GVHD målorganer som milt og chrezbryzheechno lymfeknuter (MLN) (figur 3a)20 . Reproduserbar isolering av colonic MNC over BMT mottakere (n = 7-10 per behandlingsgruppe) tillatt for en robust statistisk sammenligning av absolutte antall donor CD8+ effektor T-celler mellom ulike pre-transplantasjon condition behandling grupper ( Figur 3b), gir viktige data om uimottakelig fenotyper som førte til viktige studier avslørende medfødte immun MEKANISMER av GVHD beskyttelse fra tli i MOTSETNING til TBI pre-BMT condition. 20 priser og

Figure 1
Figur 1: Flow analytiske analyse av COLONIC MNC på dag 7 etter BMT i allogene mus modellsystemer når isolert med Kollagenase E og D med og uten DNAse 1. Vill-type (WT) (CD 45.2+) BALB/c (H2Kd +) mus mottok BMT fra CD45 congenic (CD 45.1+) C57BL/6 giver mus (allogene BMT, n = 3 per gruppe). BALB/c-mottakere av WT (CD 45.2+) ble ADMINISTRERT 800cGy TBI (BALB/c) 1 dag før BMT. På dag 7 etter BMT ble enkelt celle suspensjoner av mottaker kolon utarbeidet etter metodene for dette manuskriptet med bruk av Kollagenase E (100 U/mL), Kollagenase E (100 U/mL) med DNAse 1 (500 μg/mL), Kollagenase D (500 μg/mL), eller Kollagenase D (500μg/mL) med DNAse 1 (500μg/mL) (n = 3 per gruppe). Celler ble farget med live/Dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE, CD 45.1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue, og CD11B-PE-Cy7 antistoffer. (A) gating strategi for FACS analyser. Gate 0, Forward SCATTER (FSC-a) og side SCATTER (SSC-a) på single-Cell suspensjon av MNC brukes til å identifisere leukocytter; Gate 1, utelukkelse av ikke-enkeltceller ved hjelp av SSC-A; Gate 2, utelukkelse av ikke-enkeltceller ved hjelp av FSC-A; Gate 3, identifisering av Annexin V-positive (apoptotisk) og fixable levedyktighet Dye Live/Dead-UV450+Annexin V-negative (nekrotisk) celle delsett. (B) representative FACS plott av Annexin V og fixable levedyktighet fargestoff farging av gated LEUKOCYTTER blant MNC for de 4 eksperimentelle grupper. N = 1 representativ mus per gruppe i grupper: Kollagenase E (100 U/ml), Kollagenase E (100 U/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL), Kollagenase D (500 μg/mL) og Kollagenase D (500 μg/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Flow analytiske karakterisering av COLONIC MNC på dag 7 etter BMT i allogene og syngeneic mus modellsystemer. WT (CD 45.2+) C57BL/6 (H2Kd-neg) og BALB/c (H2Kd +) mus mottok BMT fra CD45-congenic (CD 45.1+) C57BL/6 og BALB/c giver mus (syngeneic eller allogene BMT, n = 4 per eksperimentell gruppe). C57BL/6 og BALB/c mottaker mus mottatt preparativ condition regimer av 950cGy (C57BL/6) og 800cGy (BALB/c) myeloablativ TBI, levert en dag før BMT. På dag 7 etter BMT, en-celle suspensjoner av mottaker colonic MNC var forberedt på å følge metodene for dette manuskriptet. Celler ble farget med live-Dead-BV510, H-2Kd-PE, CD 45.1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-CY7, CD25-PacificBlue, FOXP3-AF647, og CD11B-PE-Cy7 antistoffer, N = 4 mus per gruppe. (A) MEAN ± SEM absolutte tall (log 10) CD 45.1+ h-2kd-neg eller CD 45.1+ h-2kd + (giver-type, i hvert tilfelle) CD11bnegCD4+ og CD8+ T celler isolert fra mottaker Colon på dag 7 etter condition og CD 45.1 C57BL/6 (giver) → CD 45.2 BALB/c (mottaker) BMT. N = 4 per gruppe. (B) gating strategi for FACS analyser. Gate 0, Forward SCATTER (FSC-a) og side SCATTER (SSC-a) på single-Cell suspensjon av MNC brukes til å identifisere leukocytter; Gate 1, utelukkelse av ikke-enkeltceller ved hjelp av SSC-A; Gate 2, utelukkelse av ikke-enkeltceller ved hjelp av FSC-A; Gate 3, Live celleutvalg gate 4, separasjon av blodkreft celler BMT donor versus BMT mottaker opprinnelse; Gate 5, valg av donor ikke-myelogen avstamning celler; Gate 6, selektiv GATING av CD4+ T celler; Gate 7, separate GATING av CD4+CD25+FoxP3+ T Regulatory (treg) celler. Den røde pilen betegner drill-down gating strategi. (C) representative FACS plott av CD25 og FoxP3 farging ved hjelp av gating strategi i (B) på dag 7 etter condition og BMT i kolon av en BALB/c mottaker av allogene BMT (C57BL/6 → BALB/c). Prosentandel av celler i hver gate er gitt i porten. WT = Wild type; TBI = total kropps bestråling; BM = 10 x 106 CD 45.1+ congenic C57BL/6 eller BALB/c donor benmargceller; Teff = T Effektor celler; Treg = Foxp3+ T regulatoriske celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: ikke-myeloablativ TLI/ATS men ikke TBI/ATS condition minsker donor TCRαβ+CD8+ effektor T celle akkumulering. (A) representant FACS TOMTER CD4 og CD8 farging av gated h-2kb +TCRαβ+ celler fra donor h-2kb + C57BL/6 mus i milten (øverste rad), chrezbryzheechno lymfe node (MLN) (midtre rad), og kolon (nederste rad) av mottakere på dagen 6 etter condition og transplantasjon. Prosentandel av cellene i hver gate er gitt over porten. (B) MEAN ± SEM absolutt nummer (log 10) H-2kB +TCRαβ+CD8+ celler i milten (top panel), MLN (midtre panel), og kolon (nederste panel) av mottakere på dag 6 etter condition og BMT. WT = vill-type; TBI = total kropps bestråling; TLI =: Total lymfoide bestråling; ATS = anti-thymocyte serum; BM = 50 x 106 WT C57BL/6 donor benmargceller; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 donor milt celler; TBI800, TBI400 = cGy doser av myeloablativ (TBI800) eller ikke-myeloablativ (TBI400) TBI. * Dette tallet har blitt modifisert fra Van der Merwe et al.20. Opphavsrett 2013. The American Association of Immunologer, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Løsning Formel
Kolon buffer 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (varme-deaktivert ved 56oC i 60 minutter, pH justert til 7,3)
Silica-basert tetthet gradient Media 100% (per kolon) 22,5 mL av silica-baserte Density gradient Media + 2,5 ml 10x PBS.
Silica-basert tetthet gradient Media 66% (per kolon) 10,72 mL silika-basert tetthet gradient Media 100% + 5,28 ml kolon buffer
Silica-basert tetthet gradient Media 44% (per kolon) 11 mL silica-basert tetthet gradient Media 100% + 14 ml kolon buffer
Kollagenase fordøyelse buffer (per kolon) 100 U/mL av Kollagenase E fra histolyticum, oppløst i 40 ml kolon buffer
FACS-buffer 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g natrium Natriumazid

Tabell 1: Forberedelses tabell for løsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne visuelle protokollen beskriver godt tolerert metoder for isolering av colonic mononukleære celler inkludert lamina propria lymfocytter (LPL). Gitt at denne protokollen ble optimalisert i å evaluere alvorlig post-transplantasjon mus kolitt modeller hvor inflammatorisk cytokiner og vevsskade egner seg til dårlig levedyktighet av utvinnes MNC, forventer vi at disse metodene kan oversettes til andre applikasjoner som krever fenotypiske analyse av colonic MNC. Disse inkluderer, men, er ikke begrenset til å vurdere kolon betennelse i musen modeller av inflammatorisk tarmsykdom, studier av immunresponser av kolitt-målrettede behandlinger, og kolitt produsert av smittsomme patogener. I tillegg våre data ved hjelp isolasjoner i sunne (syngeneic BMT) mus indikerer at isolasjonen prosedyren ikke krever betydelig inflammatorisk infiltrere å tillate immun celle deteksjon i MNC isolerer. Lignende data er faktisk innhentet ved bruk av ubehandlede, sunne (ikke-BMT) mus (data ikke vist).

Flere viktige trinn i denne protokollen skiller den fra andre publiserte metoder og bidrar til høy avkastning og levedyktighet. For eksempel tillater optimalisering av histolyticum-avledet kollagenase E-aktivitet (100 U/ml endelig aktivitetsnivå) konsekvente beregninger for ulike mengder enzym over langdistanse eksperimenter26. Det er 28 forskjellige medlemmer i kollagen familien, sammen utgjør nesten 30% av alle proteiner i pattedyr kroppen27. I tillegg har ulike vev har distinkte distribusjoner av kollagen under typer, som hver krever unike collagenases for fordøyelsen28. Kollagenase fra C. histolyticum inkluderer 6 forskjellige proteiner klassifisert i to klasser29,30. Den spesifikke typen kollagenase som brukes kan endre levedyktigheten og generelle kvaliteten på cellene isolert fra kolon31. Tidligere studier har vist at kollagenase type C-2139 (Kollagenase E) gir en høy avkastning av lymfocytter blant MNC isolert fra tynntarmen25. Men disse protokollene ikke adressen fordøyelsen av kolon, en mye mer muskuløs organ med betydelig mer komplekse kollagen sammensetning enn tynntarmen.

Tilstrekkelighet og pålitelighet av enzymatisk vev degradering er en etablert faktor som påvirker samlede celle utbytte og levedyktighet ved å minimere behovet for tilbakevendende mekaniske forstyrrelser (som induserer økt mekaniske traumer til vevet). På grunn av tilstrekkelig enzymatisk fordøyelse av interstitiell og slimhinne kollagen ved hjelp av en kollagenase E-spesifikk protokoll (sammenlignet med kollagenase D-mediert fordøyelse protokoller i standard bruk), minimerer denne protokollen mengden av mekanisk manipulering av vevs fragmentene som kreves for å forstyrre interstitium og frigi immun celle undergrupper til suspensjon. Dette forbedrer levedyktigheten til isolerte MNC for senere analyser. Som demonstrert i data (figur 1B), eliminerer dette behovet for DNAse og andre kjemiske eller mekaniske anti-klumper manøvrer utover standard filtrering av en enkelt celle suspensjon gjennom en sil. Andre rapporter som beskriver isolering av intestinal lymfoide celler har brukt dithiotreitol (DTT) og EDTA som slimløsende agenter for å forbedre både yield og levedyktighet av de isolerte mononukleære leukocytter24.

Et annet unikt aspekt ved denne protokollen som forbedrer celle utbyttet er anvendelsen av en finjustert silica-basert tetthet separasjon Media gradient. Andre fordøyelsen metoder papirer publisert ennå ikke bruke en slik tetthet separasjon gradient21,31. Men i forfatterne erfaring og de av samarbeidspartnere utnytte denne protokollen for å isolere funksjonelt aktive lymfoide celler, forbedrer tettheten gradient rensing både levedyktighet og renheten av MNC utvinnes etter fordøyelsen19 , 20 priser og , i 32.

Selv om ikke et fokus for dette manuskriptet, verdt å nevne for de som arbeider med tarmbetennelse modeller i mus er at metodene i dette manuskriptet kan endres for å tillate lignende høy kvalitet isolering av levedyktige MNC fra tynntarmen. Endringen av den primære colonic protokollen som kreves for å oppnå dette er bruken av en enkelt 90-min fordøyelse (i stedet for 2 60-min digestions), med alle andre trinn (inkludert enzym aktivitetsnivå og slukke trinn) identisk med de som vises. Denne endringen gir vanligvis en rekke 0,8-4 x 106 MNC per tynntarmen uten eller 1.5-2.5 x 106 MNC med inkluderingen av terminalen ileum inkludert leukocytter-rike cecal cap. Derfor er en nyhet av denne protokollen som bruker den primære protokollen til kolon og modifisert protokollen til tynntarmen, kunne man isolere MNC med høy reproduserbarhet og god levedyktighet fra både tynntarmen og kolon av individuelle forsøksdyr i samme eksperiment.

Oppsummert tillater protokollen beskrevet effektiv og reproduserbar isolering av mononukleære celler fra kolon eller, med modifikasjoner, tynntarmen. Med 2 dyktige operatører som arbeider sammen, så mange som 10 separate kolon kan behandles og analyseres på en enkelt dag, og enkelt celle suspensjoner kan være klar for påfølgende fenotypiske og funksjonell analyse innen 6-8 h fra vev innhøsting. Anvendelse av denne protokollen kan være verdifullt for andre forsknings mål som trenger immune vurdering av colonic betennelse, slik at andre etterforskere til å karakterisere immunforsvaret av musen kolon i en streng og reproduserbar måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd #1K08HL088260 og #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), og Batchelor Foundation for pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 og BALB/c mus som brukes i denne studien ble enten avlet i vårt anlegg eller levert av Jackson Labs eller Taconic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Tags

Immunologi og infeksjon lymfocytter kolon murine lamina propria kolitt transplantasjon flyt flowcytometri enzymatisk fordøyelse betennelse mononukleære celler
Isolering av lamina propria mononukleære celler fra murine Colon bruke Kollagenase E
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, … More

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter