Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59821
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4,5
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.

Abstract

De darm is de thuisbasis van het grootste aantal immuuncellen in het lichaam. De kleine en grote intestinale immuun systemen politie blootstelling aan exogene antigenen en moduleren reacties op krachtige microbieel afgeleide immuun stimuli. Om deze reden, de darm is een belangrijke doelsite van immuun disregulatie en ontsteking bij vele ziekten, met inbegrip van maar, niet beperkt tot inflammatoire darmziekten zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, transplantaat-versus-host ziekte (GVHD) na bot beenmergtransplantatie (BMT), en vele allergische en infectieuze aandoeningen. Murine modellen van gastro-intestinale ontsteking en colitis worden intensief gebruikt voor het bestuderen van GI complicaties en vooraf klinisch optimaliseren strategieën voor preventie en behandeling. Gegevens uit deze modellen via isolatie en fenotypische analyse van immuuncellen uit de darm is van cruciaal belang voor verder immuun begrip dat kan worden toegepast op het verzachten van gastro-intestinale en systemische inflammatoire aandoeningen. Dit rapport beschrijft een zeer effectief protocol voor de isolatie van mononucleaire cellen (MNC) van de dikke darm met behulp van een gemengde dichtheidsgradiënt interface op basis van silica. Deze methode reproduceert een significant aantal levensvatbare leukocyten, terwijl het contaminerende vuil minimaliseert, waardoor daaropvolgende immuunfenotyping door Flowcytometrie of andere methoden mogelijk is.

Introduction

Hoewel de gastro-intestinale (GI) tractus is voornamelijk gewijd aan de verwerking en reabsorptie van voedingsstoffen uit voedsel, het GI-tractus onderhoudt ook centrale rollen in de integriteit van de vasculaire, lymfatische, en zenuwstelsel en van tal van andere organen via het mucosale en submucosale immuunsysteem1. Het GI-immuunsysteem heeft een invloedrijke rol in zowel de gastro-intestinale en systemische gezondheid als gevolg van de constante blootstelling aan buitenlandse antigenen uit voedsel, commensale bacteriën, of binnenvallende pathogenen1,2. Zo moet het GI-immuunsysteem een delicaat evenwicht behouden waarin het niet-pathogene antigenen tolereert terwijl het adequaat reageert op pathogene antigenen1,2. Wanneer de balans van tolerantie en verdediging wordt verstoord, gelokaliseerde of systemische immuun disregulatie en ontsteking kan optreden resulterend in een groot aantal ziekten1,2,3.

De darm herbergt ten minste 70% van alle lymfoïde cellen in het lichaam4. De meeste primaire immunologische interacties betreffen ten minste één van de drie immuunstations in de darm: 1) Peyer's patches, 2) Intraepitheliale lymfocyten (IEL) en 3) lamina propria lymfocyten (LPL). Elk van deze bestaat uit een complex verbonden netwerk van immuuncellen die snel reageren op normale immuunproblemen in de darm5. Beperkt tot de stroma boven de Muscularis mucosae, de losjes gestructureerde lamina propria is het bindweefsel van het darm slijmvlies en omvat steigers voor de villus, de vasculatuur, lymfedrainage, en mucosale zenuwstelsel, evenals vele aangeboren en adaptieve immune deelverzamelingen6,7,8,9. LPL bestaat uit CD4+ -en CD8+ T-cellen in een geschatte verhouding van 2:1, plasmacellen en myeloïde Lineage cellen, waaronder dendritische cellen, mestcellen, eosinofielen en macrofagen6.

Er is een groeiende belangstelling voor het begrijpen van de immuun disregulatie en ontsteking van de darm als het betrekking heeft op verschillende ziektetoestanden. Dergelijke aandoeningen als de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa manifesteren alle verschillende niveaus van Colon ontsteking10,11,12. Bovendien kunnen patiënten met maligne of niet-maligne aandoeningen van het merg of het immuunsysteem die een allogene beenmergtransplantatie ondergaan (Allo-BMT) verschillende vormen van colitis ontwikkelen, waaronder 1) directe toxiciteit van conditionerings regimes vóór BMT, 2) infecties veroorzaakt door immunosuppressie na BMT en 3) Graft-versus-hostziekte (gvhd) die wordt aangedreven door donor-type T cellen die reageren op donor Allo-antigenen in de weefsels na BMT13,14,15. Al deze complicaties na BMT resulteren in significante veranderingen in het immuunmilieu van de darmen16,17,18. De voorgestelde methode maakt een betrouwbare beoordeling van de accumulatie van immune cellen in de muis Colon mogelijk en, wanneer toegepast op muriene ontvangers na BMT, vergemakkelijkt een efficiënte assay van zowel donor-als ontvangende immuuncel die betrokken zijn bij transplantatie tolerantie19 ,20. Extra oorzaken van ontsteking van de darm zijn maligniteiten, voedselallergieën, of verstoring van het microbioom van de darmen. Dit protocol biedt toegang tot de darm mononucleaire cellen van de dikke darm en, met wijzigingen, aan leukocyten van de dunne darm in een van deze preklinische Murine modellen.

Een PubMed zoeken met behulp van de zoektermen "darm en immune cel en isolatie" onthult meer dan 200 publicaties beschrijven methoden voor de spijsvertering van de dunne darm om immune cellen te extraheren. Echter, een soortgelijke literatuur zoeken naar Colon levert geen goed afgebakende protocollen specificeren isolatie van immune cellen van de dikke darm. Dit kan zijn omdat de dikke darm meer gespierde en interstitiële lagen heeft, waardoor het moeilijker om volledig te verteren dan de dunne darm. In tegenstelling tot bestaande protocollen, gebruikt dit protocol specifiek Collagenase E van Clostridium histolyticum zonder andere bacteriële collagenasen (Collagenase D/Collagenase I). We tonen aan dat, met behulp van dit protocol, de vertering van het Colon weefsel kan worden bereikt met behoud van de kwaliteit van geïsoleerde gut mononucleaire immuuncellen (MNC) zonder toevoeging van anti klonter reagentia zoals natrium versenate (EDTA), Dispase II, en deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Dit protocol is geoptimaliseerd om toe te staan reproduceerbare robuuste extractie van levensvatbaar MNC van de Murine Colon voor verdere gerichte studies en moet zich lenen voor de studie van immunologie van de dikke darm of (met modificaties) de dunne darm24, 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd onder onderzoeksprotocollen voor knaagdieren die werden beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami Miller school of Medicine, die voldoet aan de veterinaire normen vastgesteld door de American Association voor laboratoriumdieren Wetenschappen (AALAS).

1. voorbereiding van de oplossingen

  1. Zoals beschreven in tabel 1, bereid de Colon buffer, op silica gebaseerde dichtheids scheiding Media 100%, op silica gebaseerde dichtheids scheiding media 66%, op silica gebaseerde dichtheids scheiding media 44%, Collagenase E-spijsvertering buffer en FACS-buffer.
    1. Bereid de Colon buffer voor op de dag voorafgaand aan de procedure en bewaar deze 's nachts bij 4 °C.
    2. Bereid 100% dichtheid scheidings media op basis van silica de dag voorafgaand aan de procedure en opgeslagen op 4 °C, op kamertemperatuur de ochtend van de procedure om te ontdooien.
    3. Bereid 66% en 44% scheidings media op basis van silica in de ochtend van de isolatie, met behulp van kamertemperatuur 100% dichtheid scheidings media op basis van silica en Colon buffer.
    4. Meet de juiste hoeveelheid Clostridium histolyticum-afgeleide Collagenase E en bewaar bij-20 °c 's nachts voorafgaand aan de procedure. De volgende ochtend, oplossen in het juiste volume van de Colon buffer te afleiden Collagenase spijsvertering buffer. Voor alle incubaties met collagenase-Vergistings buffer op de dag van de procedure, Verwarm de oplossingen voor op 37 °C.
  2. Houd voor de hele Protocol stappen één centrifuge bij 20 °C en de rotatiesnelheid van 859 x g, met remmen geïnactiveerd (0 vertraging) bij gradiënt centrifugeren. Zet een andere op 4 °C en rotatiesnelheid van 859 x g, met de standaard vertraging, voor wasstappen.

2. de dikke darm oogsten

  1. De muis euthanaseren via co2 verstikking gevolgd door een door aalac goedgekeurde bevestigingsmethode.
  2. Plaats de muis in rugligging en spuit de vacht met 70% ethanol. Met behulp van grote weefsel schaar, maak een verticale middenlijn incisie en bloot het intact peritoneum.
  3. Met behulp van fijne dissectie schaar, open het peritoneum. Gebruik de tang om de dunne darm naar een kant te bewegen en de aflopende dikke darm bloot te leggen. Trek een beetje omhoog op de aflopende dikke darm om het rectale gedeelte van de dikke darm maximaal bloot te stellen. Snijd het distale rectum diep in het bekken en ontleden en verwijder de gehele dikke darm als één eenheid, van het distale rectum tot de cecal-dop.
  4. Breng de dikke darm in 20 mL gekoelde Colon buffer in een polypropyleen buis van 50 mL.

3. het Colon schoonmaken

  1. Plaats de dikke darm op een vochtige papieren handdoek en extraheer de stevige ontlasting door milde druk toe te passen op de darmwand met het stompe uiteinde van een schaar of een tang.
  2. Plaats de Colon in een Petri schaaltje en spoel de darm met 10 mL gekoelde Colon buffer met een 10 mL spuit met 18 G botte vulnaald.
  3. Breng de dubbele punt over in een dubbele Colon buffer met een vochtige papieren handdoek en verwijder het mesenterie en vet met het scherpe uiteinde van de schaar.
  4. Plaats de Colon in een Petri schaaltje gevuld met 5-10 ml gekoelde Colon buffer roeren handmatig te wassen overgebleven Colon inhoud. Herhaal 2-3 keer.
  5. Snijd de dikke darm longitudinaal van zijn meer gespierde rectale uiteinde naar de proximale Colon (het genereren van een enkele rechthoekige open Colon stuk) in een Petri schaaltje gevuld met verse gekoelde Colon buffer. Gooi bestaande media weg en vul aan met een schone, gekoelde Colon buffer.
  6. Was de darm 3 keer door deze krachtig in de Petri schaal te zwengelen en de 5-10 mL gekoelde Colon buffer na elke wasbeurt te vervangen.
  7. Plaats het rechthoekige Colon weefsel op een papieren handdoek bevochtigd met de Colon buffer en snijd het door het horizontaal te snijden en vervolgens in kleine fragmenten (3 mm x 3 mm secties).
  8. Verzamel de dubbele punt fragmenten voorzichtig met behulp van fijne Tang in 20 mL gekoelde Colon buffer in een 50 mL polypropyleen conische buis.
  9. Was de dubbele punt fragmenten 3 keer, elke was in 20 mL Colon buffer, door krachtig wervelende de buis voor 30 s. tussen elke agitatie, laat de weefsel fragmenten te vestigen op de bodem van de buis. Decanteren of vacuüm aspireren de supernatant terwijl het voorkomen van weefsel fragment verlies in het aspiratie proces tussen elke wasbeurt.
    Opmerking: Het is niet nodig om de buis na elke wasbeurt te veranderen.

4. de spijsvertering van Collagenase 1

  1. Voeg 20 mL van de Collagenase-Vergistings buffer toe aan de gewassen Colon fragmenten in de polypropyleen conische buis van 50 mL.
  2. Plaats de gesloten 50 mL Tube bij 37 °C in een geïnineerd orbitaal shaker met de rotatiesnelheid ingesteld op 2 x g gedurende 60 min. Zorg ervoor dat de weefsel fragmenten constant in beweging zijn tijdens het schudden; Verhoog indien nodig de rotatiesnelheid stapsgewijs om er zeker van te zijn dat er geen weefsel fragmenten op de bodem van de buis komen te zitten.

5. bereid op silica gebaseerde scheiding van media gradiënten

  1. Bereid 66% en 44% op silica gebaseerde dichtheids scheidings media, met behulp van 100% dichtheid scheidings media op basis van silica bij 20 °C (kamertemperatuur) en Colon buffer.
  2. Giet 5 mL 66% dichtheid scheidings media op basis van silica in elk van de 3 afzonderlijke polypropyleen buizen van 15 mL. Bereid 3 tubes per dikke darm. Dit vormt de hogere dichtheids basis van de verloop isolatie procedure, waarop de scheidings media met een lagere dichtheid zullen worden gelaagd om het scheidings verloop te creëren.
  3. Bewaren bij 20 °C tot gebruik.

6. verzameling van supernatant van de spijsvertering 1

  1. Verzamel alleen de supernatant met een serologische Pipet van 25 mL en filtreer het supernatant door een 40 μm porie filtratie weefsel celzeef in een schone polypropyleen conische buis van 50 mL, nadat Collagenase spijsvertering 1 is voltooid. Wees voorzichtig dat u geen bestaande weefsel fragmenten aspireren.
    Opmerking: Resterende zichtbare weefsel fragmenten in de buis behouden. Deze zullen tweede Collagenase-spijsvertering ondergaan (stap 8).

7. afschrikken Collagenase spijsvertering buffer

  1. Vul de polypropyleen buis van 50 mL volledig met gekoelde Colon buffer.
    Opmerking: Collagenase is actief bij 37 °C; Vandaar dat de gekoelde buffer dit enzym inactiveert.
  2. Centrifugeer de buis bij 4 °C bij 800 x g gedurende 5 min.
    1. Gooi het supernatant weg via vacuüm aspiratie. Spoel cellen met 25 mL verse Colon buffer en centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 minuten.
    2. Respendeer de pellet in minder dan 1 mL verse gekoelde Colon buffer.
    3. Plaats de polypropyleen conische buis van 50 mL op ijs.

8. de spijsvertering van Collagenase 2

  1. Herhaal stap 4 (spijsvertering 1) met de resterende weefsel fragmenten die van stap 6,1 worden bewaard.

9. weefsel aggregatie na de spijsvertering 2

  1. Spoel de weefsel fragmenten krachtig heen en weer tussen de buis en een spuit van 10 mL door een 18 G botte-end naald.
  2. Herhaal deze flush voor minimaal 7-8 complete passages, doorgaan tot er geen grove weefsel fragmenten of vuil zichtbaar zijn.

10. filter cellen

  1. Passeer de weefsel uitsplitsing suspensie via een 40 μm-Pore filtratie stof celzeef in een schone polypropyleen buis van 50 mL.
  2. Was de filtratie stof celzeef met 10 mL gekoelde Colon buffer om alle cellen die in het filter zijn verstrikt te herstellen.

11. afschrikken Collagenase spijsvertering

  1. Vul de polypropyleen conische buis van 50 mL op de velg met gekoelde Colon buffer.
    Opmerking: De temperatuur van de Colon buffer is van cruciaal belang om te zorgen voor het afschrikken van Collagenase-activiteit.
  2. Spin bij 4 °C en 800 x g gedurende 5 min.
  3. Gooi het supernatant weg via vacuüm aspiratie.
  4. Wassen door hersuspendiging in 25 mL verse gekoelde Colon buffer, gevolgd door centrifugeren bij 4 °c, 800 x g gedurende 5 min.
  5. Gooi het supernatant weg via vacuüm aspiratie.
  6. Zwembad de geresuspendeerde pellet van Collagenase spijsvertering 1 (stap 7) naar de bijbehorende buis uit stap 11,4.
  7. Herhaal stap 11,4 (wassen en centrifugeren).

12. op silica gebaseerde dichtheids scheiding media gradiënt scheiding

Opmerking: Voer stappen 12-18 zo snel mogelijk uit om een snelle demping van Collagenase-activiteit te garanderen.

  1. Volgende stap 11,7, respendeert elke pellet in 24 mL totaal van 44% silica-gebaseerde dichtheid scheidings media per dikke darm.
  2. Langzaam laag 8 mL van de media uit stap 12,1 op elk van de drie buizen bereid bij stap 5,2 (met 66% dichtheid scheiding media op basis van silica), met behulp van een 10 mL serologische pipet. Handhaaf een stabiele en langzame stroom van de 44% dichtheids scheidings media terwijl u het verloop in lagen plaatst om verstoring van de interface te voorkomen.
  3. Weeg alle buisjes in de centrifuge bakken zorgvuldig af met een weegschaal of een balans.
  4. Draai de buisjes 20 min bij 859 x g in een centrifuge zonder remmen bij 20 °c. Laat de rotors tot rust komen voordat u buizen verwijdert, zorg ervoor dat u de cellen niet verstoort in de gradiënt interface.

13. Verzamel mononucleaire cellen uit de gradiënt interface

  1. Visualiseer de gradiënt interface (in de buurt van de 5 mL markering), waar meestal een 1-2 mm dikke witte band (met MNC) aanwezig is.
    Opmerking: Een witte band kan wel of niet worden weergegeven. Echter, MNC zal zijn op deze interface en moet Cloud de duidelijkheid van de gradiënt interface.
  2. Vacuüm aspireren en gooi de Top 7 mL van de bovenste gradiënt om gemakkelijker pipet toegang tot de interface te maken.
  3. Met behulp van continue handmatige zuigkracht en stabiele roterende pols beweging, verzamelt u de interface laag van cellen in een schone polypropyleen conische buis van 50 mL. Verzamelen totdat de interface tussen de 2 gradiënten duidelijk is en refractile (vrij van cellen).
  4. Vul de opvang buis met 50 mL gekoelde FACS buffer. Spin bij 4 °C, 800 x g gedurende 5 min.
  5. Aspireren de supernatant via vacuüm aspiratie en respenderen de pellet in 1 mL FACS buffer.
  6. Tel de cellen op een hemocytometer bij een verdunning van 1:2 met behulp van geschikte dode celuitsluitings methoden.
  7. Ga verder met FACS kleuring of andere assays met vers geïsoleerde Colon MNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bij het werken met Murine Colon ziekte modellen, het is nuttig om te kunnen zowel kwantificeren en kwalitatief beoordelen, onder de MNC van de dikke darm, meerdere immuuncelsubgroepen betrokken bij het ontstekingsproces. De eencellige suspensie van MNC verkregen door toepassing van dit protocol vergemakkelijkt dergelijke fenotypische karakterisering op een robuuste en reproduceerbare manier. Als een bewijs van principe voor de toepassing van deze isolatiemethode onder diverse experimentele instellingen, we opgehaald Colon mnc met behulp van deze methode en uitgevoerd Multi-parameter flow flowcytometrieonderzoeken op cellen geïsoleerd van muizen met (Figuur 1 en Figuur 2 , allogene BMT) en zonder (Figuur 2a, syngene BMT) significante immuungemedieerde Colon schade na BMT.

Flowcytometrie en gegevensanalyses werden uitgevoerd om de fracties van apoptotische en necrotische dode lymfocyten te vergelijken bij gebruik van Collagenase E of D voor de isolatie, met of zonder behandeling met DNase 1. De gating-strategie die wordt gebruikt tijdens flow-cytometrie is beschikbaar in Figuur 1a.  Na annexin V (apoptosis marker) en corrigeerbare Live/Dead Blue Dye (necrose marker) kleuring op eencellige suspensies na elke isolatie toonde Collagenase E zonder DNase een significant hoger percentage annexin VNEG Levende/dode blauweNEG -levende cellen (mediaan 43,3%, bereik 26,5%-59,9%, n = 3) na isolatie in vergelijking met collagenase D zonder DNAse (mediaan 8,7%, bereik 3,6%-10,2%, n = 3), zelfs in vergelijking met collagenase E + DNase (mediaan 8,18%, bereik 4,7%-20,4%, n = 3) of Collagenase D + DNAse (mediaan 15.10%, bereik 9,9%-21,4%, n = 3). Bovendien, we identificeerden Annexin VNEGLive/Dead Blue + necrotische cellen met een mediaan percentage van 41,0% in de Collagenase E-groep (bereik 37.1%-58,8%, n = 3) versus 90,0% in de Collagenase D-groep (bereik 69.7%-95,5%, n = 3), 75,9% in de Collagenase e + DNAse groep, en 80,3% in de groep Collagenase D + DNAse, respectievelijk (bereik 65.7%-79,5%, bereik 54,9%-89,9%, n = 3). Representatieve FACS plots van n = 1 dier in elke groep wordt afgebeeld Figuur 1b).

Als verder bewijs van het principe van de consistentie en het rendement van levensvatbare MNC met behulp van deze procedure bij zieke muizen, werd multi-parametrische flow cytometrie toegepast op de MNC geïsoleerd van CD 45,2 BALB/c ontvanger muizen op dag 7 na ontvangst van BMT van ofwel allogene (CD 45,1 C57BL/6 donor) of syneneïsche (cd 45,1 Balb/c donor) BMT modellen. Het gebruik van absolute MNC-getallen vermenigvuldigd met percentage gated immuunsubgroepen verkregen door Flowcytometrie analyses, gemiddelde absolute aantallen van de CD4+ van de donor en CD8+ T cellen geëxtraheerd uit de dubbele punt van de ontvanger van de BMT kan worden berekend en vergeleken (n = 4 per groep, Figuur 2a). Aangezien het belangrijk kan zijn om zeldzame immuuncelpopulaties in dergelijke Muismodellen te identificeren en/of te kwantificen, beoordeelden we zeldzame deelverzamelingen, waaronder donor afgeleide (CD 45,1+) Foxp3+ T regulatoire cellen (Treg) in zowel syngene als allogene BMT-modellen. De gating-strategie om donor Treg-cellen te bereiken (CD4+CD25+FoxP3+) uit de suspensie met antilichaam-gekleurd eencellige wordt getoond (volgorde van poorten afgebakend door een rode pijl; Figuur 2b). Met deze methode kunnen zelfs zeldzame deelverzamelingen zoals donor-afgeleide Colon Treg infiltrerende ontvangende muis dubbelpunt na BMT geanalyseerd worden (figuur 2c, representatieve plot; n = 1).

Figuur 3 toont een uitgebreide toepassing van deze methode in historische gegevens van onze groep met behulp van het gepresenteerde protocol om de accumulatie van gvhd-inducerende CD8 + versus CD4 +-donor-afgeleide T-cellen in het Colon van Balb/c-muizen ofwel beschermd of niet beschermd te vergelijken van GVHD door de pre-BMT behandeling preparatief (conditionerings) regime20. De geteste preparatieve regimes waren 800 cGy/myeloablatieve totale lichaams bestraling (TBI800) of niet-myeloablatieve TBI (400TBI), evenals niet-myeloablatieve conditionering met totale lymfoïde bestraling (TLI) waarin bestraling werd afgeleverd aan de lymfe knopen, thymus en milt met afscherming van de schedel, longen, ledematen, bekken en staart. Alle conditionering werd gecombineerd met anti-thymocyte serum (ATS), een immunomodulerend middel. Al vanaf dag 6, na BMT, resulteerde dit Colon-MNC-isolatie protocol in robuuste Flow-cytometrische analysen vergeleken met identieke analyses op meer met lymfocyten verrijkte GVHD-doelorganen zoals milt en mesenterische lymfeklieren (MLN) (Figuur 3a)20 . Reproduceerbare isolatie van Colon MNC over BMT-ontvangers (n = 7-10 per behandelingsgroep) toegestaan voor een robuuste statistische vergelijking van absolute aantallen donor CD8+ Effector T-cellen tussen verschillende voor transplantatie conditionerings groepen ( Figuur 3b), die belangrijke gegevens over immuunfenotypes oplevert die hebben geleid tot belangrijke onderzoeken waarin de aangeboren immuunmechanismen van gvhd-bescherming van TLI werden onthuld in tegenstelling tot TBI pre-BMT-conditionering. 20

Figure 1
Figuur 1: flowcytometrische analyse van Colon MNC op dag 7 na BMT in allogene muizen modelsystemen wanneer geïsoleerd met collagenase E en D met en zonder DNAse 1. Wild type (WT) (CD 45,2+) Balb/c (h2k brandweerd +) muizen KREGEN BMT van CD45 congenic (cd 45,1+) C57BL/6 donor muizen (allogene BMT, n = 3 per groep). WT (CD 45,2+) Balb/c ontvanger muizen werden toegediend 800cGy TBI (Balb/c) 1 dag voor BMT. Op dag 7 na BMT, eencellige suspensies van de ontvangende Colon werden bereid volgens de methoden van dit manuscript met het gebruik van Collagenase E (100 U/mL), Collagenase E (100 U/mL) met DNAse 1 (500 μg/mL), Collagenase D (500 μg/mL), of Collagenase D (500μg/mL) met DNAse 1 (500μg/mL) (n = 3 per groep). Cellen werden gekleurd met Live/Dead-UV450 (Live/Dead Blue), Annexin V-APC, H-2Kd-PE, cd 45,1-BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue, en CD11B-PE-Cy7 antilichamen. A) strategie voor FACS-analyses. Gate 0, forward SCATTER (FSC-a) en side SCATTER (SSC-a) op de eencellige suspensie van mnc gebruikt om leukocyten te identificeren; Gate 1, uitsluiting van niet-enkelvoudige cellen met SSC-A; Gate 2, uitsluiting van niet-enkelvoudige cellen met FSC-A; Gate 3, identificatie van annexin v-positieve (apoptotic) en corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof levende/Dead-UV450+annexin v-Negative (necrotic) celsubgroepen. B) representatieve FACS percelen van annexin V en corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof kleuring van gated leukocyten onder mnc voor de 4 experimentele groepen. N = 1 representatieve muis per groep in groepen: Collagenase E (100 U/mL), Collagenase E (100 U/ml) + DNAse 1 (500 μg/mL), Collagenase D (500 μg/mL) en Collagenase D (500 μg/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: flowcytometrische karakterisering van Colon MNC op dag 7 na BMT in allogene en syngene muismodel systemen. WT (CD 45,2+) C57BL/6 (h2k brandweerd-NEG) en Balb/c (h2k brandweerd +) muizen kregen BMT van CD45-congenic (cd 45,1+) C57BL/6 en Balb/c donor muizen (syngene of allogene BMT, n = 4 per experimentele groep). C57BL/6 en BALB/c ontvangende muizen ontvingen preparatieve conditionerings schema's van 950cGy (C57BL/6) en 800cGy (BALB/c) myeloablatieve TBI, die één dag voor BMT werden afgeleverd. Op dag 7 na BMT werden eencellige suspensies van de ontvanger Colon MNC voorbereid volgens de methoden van dit manuscript. Cellen werden bevlekt met Live-Dead-BV510, H-2Kd-PE, cd 45,1-BV605, CD4-FITC, CD8-APC-CY7, CD25-PacificBlue, FOXP3-AF647, en CD11B-PE-Cy7 antilichamen, N = 4 muizen per groep. A) gemiddelde ± SEM absolute getal (log 10) cd 45,1+ h-2kd-NEG of cd 45,1+ h-2kd + (donor-type, in elk geval) CD11bNEGCD4+ en CD8+ T cellen geïsoleerd van de ontvanger Colon op dag 7 Na conditionering en CD 45,1 C57BL/6 (donor) → CD 45,2 BALB/c (ontvanger) BMT. N = 4 per groep. B) strategie voor FACS-analyses. Gate 0, forward SCATTER (FSC-a) en side SCATTER (SSC-a) op de eencellige suspensie van mnc gebruikt om leukocyten te identificeren; Gate 1, uitsluiting van niet-enkelvoudige cellen met SSC-A; Gate 2, uitsluiting van niet-enkelvoudige cellen met FSC-A; Gate 3, Live Cell Selection Gate 4, scheiding van hematopoietische cellen van BMT donor versus BMT ontvanger oorsprong; Gate 5, selectie van niet-myeloïde Lineage cellen van de donor; Poort 6, selectieve gating van CD4+ T-cellen; Poort 7, gescheiden gating van CD4+CD25+FoxP3+ T regelgevende (Treg) cellen. De rode pijl geeft een drilldownstrategie aan. C) representatieve FACS PLOTS van CD25 en FoxP3 kleuring met behulp van de gating-strategie in (B) op dag 7 na conditionering en BMT in het Colon van een Balb/c-ontvanger van allogene BMT (C57BL/6 → Balb/c). Het percentage cellen in elke poort wordt binnen de poort gegeven. WT = wild type; TBI = totale lichaams bestraling; BM = 10 x 106 cd 45,1+ congene C57BL/6 of Balb/c donor beenmergcellen; Teff = T Effector cellen; Treg = Foxp3+ T regulatoire cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: niet-myeloablatieve TLI/ATS maar niet TBI/ATS conditionering vermindert donor TCRαβ+CD8+ Effector T celaccumulatie. A) representatieve FACS plots van CD4-en CD8 kleuring van gated h-2kb +tcrαβ+ cellen van donor h-2kb + C57BL/6 muizen in de milt (bovenste rij), mesenterische lymfeklier (mln) (middelste rij), en Colon (onderste rij) van ontvangers op dag 6 na conditionering en transplantatie. Het percentage cellen in elke poort wordt boven de poort gegeven. B) gemiddeld ± SEM absoluut getal (log 10) H-2kB +tcrαβ+CD8+ cellen in de milt (bovenste deelvenster), mln (middelste paneel) en Colon (onderste paneel) van ontvangers op dag 6 na conditionering en BMT. WT = wild-type; TBI = totale lichaams bestraling; TLI =: totale lymfoïde bestraling; ATS = anti-thymocyte serum; BM = 50 x 106 WT C57BL/6 beenmergcellen van het donor water; SPL = 60 x 106 WT C57BL/6 donor milt cellen; TBI800, TBI400 = cGy doses van myeloablatief (TBI800) of niet-myeloablatief (TBI400) TBI. * Dit cijfer is gewijzigd van van der Merwe et al.20. Copyright 2013. De Amerikaanse vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Oplossing Formule
Colon buffer 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (Heat-geïnactiveerd bij 56oC gedurende 60 minuten, pH aangepast naar 7,3)
Dichtheidsgradiënt op silica basis Media 100% (per Colon) 22,5 mL op silica gebaseerde dichtheidsgradiënt media + 2,5 ml van 10x PBS.
Dichtheidsgradiënt op silica basis Media 66% (per Colon) 10,72 mL op silica gebaseerde dichtheidsgradiënt Media 100% + 5,28 ml Colon buffer
Dichtheidsgradiënt op silica basis Media 44% (per Colon) 11 mL op silica gebaseerde dichtheidsgradiënt Media 100% + 14 ml Colon buffer
Spijsvertering buffer Collagenase (per Colon) 100 U/mL Collagenase E van Clostridium histolyticum, opgelost in 40 ml Colon buffer
FACS-buffer 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g natrium azide

Tabel 1: tabel met oplossings voorbereiding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit visuele protocol beschrijft goed getolereerde methoden voor de isolatie van Colon mononucleaire cellen, waaronder lamina propria lymfocyten (LPL). Gezien het feit dat dit protocol is geoptimaliseerd in de evaluatie van ernstige post-transplantatie muis colitis modellen waar inflammatoire cytokines en weefsel letsel lenen zich voor een slechte levensvatbaarheid van teruggewonnen MNC, we verwachten dat deze methoden kunnen worden vertaald naar andere toepassingen die fenotypische analyse van Colon MNC vereisen. Deze omvatten maar, zijn niet beperkt tot het beoordelen van de darmontsteking in muismodellen van inflammatoire darmziekte, studies van immuunresponsen van colitis gerichte behandelingen, en colitis geproduceerd door infectieuze pathogenen. Bovendien geven onze gegevens met behulp van isolaties in gezonde (syngene BMT) muizen aan dat de isolatie procedure geen significant inflammatoire infiltreren vereist om immuunceldetectie in de MNC-isolaten mogelijk te maken. Inderdaad, soortgelijke gegevens zijn verkregen met behulp van onbehandelde gezonde (niet-BMT) muizen (gegevens niet weergegeven).

Verschillende belangrijke stappen van dit protocol onderscheiden het van andere gepubliceerde methoden en dragen bij tot een hoge opbrengst en levensvatbaarheid. Bijvoorbeeld, optimalisatie van Clostridium histolyticum-afgeleide Collagenase E activiteit (100 U/ml definitieve activiteitsniveau) maakt consistente berekeningen voor verschillende veel enzym over lange-afstand experimenten26. Er zijn 28 verschillende leden van de collageen familie, die samen bijna 30% van alle eiwitten in het zoogdier lichaam27vormen. Bovendien, verschillende weefsels hebben verschillende distributies van collageen subtypen, elk vereisen unieke collagenasen voor de spijsvertering28. Collagenase van C. histolyticum bevat 6 verschillende eiwitten ingedeeld in twee klassen29,30. Het specifieke type Collagenase gebruikt kan de levensvatbaarheid en de algehele kwaliteit van de cellen geïsoleerd van de Colon31veranderen. Eerdere studies hebben aangetoond dat Collagenase type C-2139 (Collagenase E) een hoge opbrengst van lymfocyten toestaat onder MNC geïsoleerd uit de dunne darm25. Echter, deze protocollen niet gericht op de vertering van Colon, een veel meer gespierde orgel met aanzienlijk meer complexe collageen samenstelling dan de dunne darm.

Toereikendheid en betrouwbaarheid van enzymatische weefsel degradatie is een gevestigde factor die invloed heeft op de totale celopbrengst en levensvatbaarheid door het minimaliseren van de noodzaak voor terugkerende mechanische verstoring (die verhoogde mechanische trauma aan het weefsel induceert). Door adequate enzymatische vertering van de interstitiële en mucosale collageen met behulp van een E-specifiek Collagenase Protocol (in vergelijking met collagenase D-gemedieerde vergistings protocollen bij standaard gebruik), minimaliseert dit protocol de hoeveelheid mechanische manipulatie van de weefsel fragmenten die nodig zijn om het interstitium te verstoren en de immuuncelsubgroepen in suspensie te brengen. Dit verhoogt verder de levensvatbaarheid van geïsoleerde MNC voor daaropvolgende assays. Zoals aangetoond in de gegevens (Figuur 1b), elimineert dit de noodzaak voor DNAse en andere chemische of mechanische anti-clumping manoeuvres buiten de standaard filtratie van een enkele celsuspensie door een zeef. Andere rapporten die de isolatie van intestinale lymfoïde cellen schetsen, hebben dithiotreïtol (DTT) en EDTA gebruikt als mucolytische middelen om zowel de opbrengst als de levensvatbaarheid van de geïsoleerde mononucleaire leukocyten24te verbeteren.

Een ander uniek aspect van dit protocol dat de celopbrengst verbetert, is de toepassing van een fijngestemde op silica gebaseerde dichtheids scheiding met media gradiënt. Andere gistings methoden papers die tot nu toe zijn gepubliceerd, maken geen gebruik van een dergelijke dichtheids scheiding van21,31. Echter, in de ervaring van de auteurs en die van medewerkers met behulp van dit protocol om functioneel actieve lymfoïde cellen te isoleren, verbetert dichtheidsgradiënt zuivering zowel de levensvatbaarheid als de zuiverheid van MNC teruggewonnen na de spijsvertering19 , 20 , 32.

Hoewel niet een focus van dit manuscript, vermeldenswaardig voor degenen die werken met intestinale ontsteking modellen in muizen is dat de methoden in dit manuscript kan worden gewijzigd om soortgelijke hoge kwaliteit isolatie van levensvatbare MNC uit de dunne darm. De wijziging van de primaire Colon protocol vereist om dit te bereiken is het gebruik van een enkele 90-min spijsvertering (in plaats van 2 60-min digestons), met alle andere stappen (met inbegrip van enzymactiviteit niveau en dorst lessen stappen) identiek aan die getoond. Deze modificatie levert meestal een bereik van 0,8-4 x 106 mnc per dunne darm zonder of 1.5-2.5 x 106 mnc met de opname van de Terminal ileum inclusief de leukocyten rijke cecal Cap. Daarom, een nieuwigheid van dit protocol is dat het toepassen van het primaire protocol op de dikke darm en het gewijzigde protocol aan de dunne darm, kan men MNC met hoge reproduceerbaarheid en goede levensvatbaarheid van zowel de dunne darm en de dikke darm van individuele proefdieren in hetzelfde experiment.

Samenvattend, het protocol beschreven maakt efficiënte en reproduceerbare isolatie van mononucleaire cellen uit de dikke darm of, met wijzigingen, de dunne darm. Met 2 bekwame operators die samenwerken, kunnen maar liefst 10 afzonderlijke dubbele punten op één dag worden verwerkt en geanalyseerd, en suspensies van één cel kunnen klaar zijn voor daaropvolgende fenotypische en functionele analyse binnen 6-8 h van weefsel oogst. Toepassing van dit protocol kan waardevol blijken voor andere onderzoeksdoelen die immuun beoordeling van Colon ontsteking nodig hebben, waardoor andere onderzoekers het immuunsysteem van de muis Colon op een rigoureuze en reproduceerbare manier kunnen karakteriseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies #1K08HL088260 en #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), en de Batchelor Foundation voor pediatrisch onderzoek (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 en BALB/c muizen die in deze studie werden gebruikt, werden ofwel gefokt in onze faciliteit of geleverd door Jackson Labs of Taconic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm Petri DIsh Thermo Scientific 150288
1x PBS Corning 21-040-CV
10x PBS Lonza BioWhittaker BW17-517Q
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4100
10 mL Syringe Becton Dickinson 302995
15 mL Non-Sterile Conical Tubes TruLine TR2002
18 G Blunt Needle Becton Dickinson 305180
25 mL Disposable Serological Pipette Corning 4250
40 μm pore size Cell Strainer Corning 352340
50 mL Falcon Tube Corning 21008-951
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503-1KG
Fixation Buffer Biolegend 420801
E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum Sigma C2139
EDTA, 0.5 M Sterile Solution Amresco E177-500ML
Fetal Bovine Serum Thermo /Fisher Scientific -HyCLone SV30014.03
HEPES GE Healthcare-HyClone SH30237.01
Percoll GE Healthcare-Life Sciences 1708901
RPMI Medium Corning 17-105-CV
Sodium Azide VWR Life Science Amresco 97064-646
Trypan Blue Lonza BioWhittaker 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Tags

Immunologie en infectie afgifte 151 lymfocyten Colon Murine lamina propria colitis transplantatie Flowcytometrie enzymatische spijsvertering ontsteking mononucleaire cellen
Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, … More

McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E. J. Vis. Exp. (151), e59821, doi:10.3791/59821 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter