JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Published: October 16, 2019
doi:
10.3791/59859
,
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science,RIKEN, 2Senior Adviser’s Office, Center for Brain Science,RIKEN

Summary

I noen genet-manipulert dyr, ved hjelp av en enkelt protokoll kan mislykkes i å indusere LTD i lillehjernen Purkinje celler, og det kan være et avvik mellom LTD og motor læring. Flere protokoller er nødvendig for å vurdere LTD-induksjon i genet-manipulert dyr. Standard protokoller vises.

Abstract

Synaptic plastisitet gir en mekanisme for læring og hukommelse. For lillehjernen motor læring, langsiktig depresjon (LTD) av Synaptic sendinger fra parallelle fibre (PF) til Purkinje celler (PC) regnes som grunnlag for motor læring, og mangler av både LTD og motor læring er observert i ulike Gen-manipulert dyr. Vanlige motoriske lære sett, slik som tilpasning av optokinetic refleks (OKR), Vestibular-øyerefleks (VOR), og rotarod test ble brukt til evaluering av motoriske læringsferdigheter. Resultatene fra GluA2-carboxy Terminus modifiserte knock-in-mus viste imidlertid normal tilpasning av VOR og OKR, til tross for manglende PF-LTD. I den rapporten, induksjon av LTD ble bare forsøkt å bruke en type stimulering protokoll ved romtemperatur. Dermed forhold til å indusere lillehjernen LTD ble utforsket i samme knock-in mutanter ved hjelp av ulike protokoller ved nær fysiologisk temperatur. Til slutt fant vi stimulering protokoller, der LTD kunne bli indusert i disse genet-manipulert mus. I denne studien foreslås et sett av protokoller for å evaluere LTD-induksjon, som vil mer nøyaktig tillate undersøkelse av årsakssammenheng mellom LTD og motor læring. Som konklusjon, eksperimentelle forhold er avgjørende når man evaluerer LTD i genet-manipulert mus.

Introduction

Den Synaptic organiseringen av utarbeidet neuronal nettverk av lillehjernen cortex, bestående av PCer, molekylær lag interneurons (kurv og Stel celler), Golgi celler, PFs fra granule celler, mosegrodd fibre og klatring fibre (CFs), har vært belyst i form av eksitasjon/hemming og avvik/konvergens, og godt organisert kretser diagram har antydet at lillehjernen er en “neuronal maskin”1, men det var tidligere ingen anelse om hensikten med denne “maskinen”. Senere foreslo Marr at PFs-inngangen til PCer utgjør et trippel lag assosiativ lærings nettverk2. Han foreslo også at hver CF formidler en cerebral instruksjon for elementær bevegelse2. Han antok at samtidig aktivering av PFs og CF ville forbedre PF-PC-synapse aktivitet, og forårsake langsiktige potensiering (LTP) av PF-PC-synapse. På den annen side antok Albus at synkron aktivering av PFs og CF resulterte i LTD ved PF-PC-synapser3. Begge de ovennevnte studiene tolke lillehjernen som en unik minneenhet, inkorporering av som i lillehjernen kortikale nettverket fører til dannelsen av Marr-Albus modell læring maskinmodell.

Etter disse teoretiske spådommer, tyder to linjer av bevis tilstedeværelsen av Synaptic plastisitet i lillehjernen. Den første linjen av bevis ble foreslått av den anatomiske organiseringen av flocculus; Her MF trasé av Vestibular orgel opprinnelse og CF trasé av retinal opprinnelse møtes på PCer4. Denne unike konvergens mønster antyder at en Synaptic plastisitet forekommer i flocculus forårsaker bemerkelsesverdig tilpasningsdyktighet av vestibulo-øyerefleks. For det andre, innspillingen av PCene respons i flocculus og lesioning av flocculus også støttet ovenfor hypotesen5,6,7. Videre PC utslipp mønster under tilpasningen av en ape hånd bevegelse8 støttet Synaptic plastisitet hypotesen, spesielt Albus ‘ s Ltd-hypotese3.

For å bestemme arten av Synaptic plastisitet direkte, gjentatt konjunktiv stimulering (CJS) av en bunt av PFs og CF som spesifikt innerverer PC in vivo ble vist å indusere LTD for overføring effekten av PF-PC synapser9, 10,11. I den påfølgende in vitro utforskningen ved hjelp av en lillehjernen Slice12 og kultivert stk, sammen med co-kultivert granule celle stimulering og oliven celle stimulering13 eller forbindelse av iontophoretically brukt glutamat og somatiske depolarizationforårsaket Ltd Signal Transduction mekanismen under den Ltd-induksjon ble også intensivt undersøkt ved hjelp av in vitro forberedelser16,17.

Tilpasninger av VOR og OKR ble ofte brukt til kvantitativ evaluering av gen-manipulasjon effekter på lillehjernen motor læring, fordi vestibylen-lillehjernen cortex ble påvist å være den essensielle opprinnelsen i adaptiv læring av VOR18 ,19,20 og OKR19,21 sammenhengen mellom svikt i Ltd-induksjon og svekkelse av atferdsdata motor læring har blitt tatt som bevis på at Ltd spiller en viktig rolle i motor lærings mekanismer22. Disse synspunktene er kollektivt referert til som Ltd hypotesen om motor læring, eller Marr-Albus-Ito hypotese23,24,25,26.

Adaptiv læring av øyebevegelser ble målt ved hjelp av lignende protokoller, mens ulike eksperimentelle forhold ble brukt til å indusere Ltd i Slice forberedelse27,28,29,30,31 . Nylig rapporterte Schonewille et al.26 at noen genet-manipulert mus demonstrerte normal motor læring, men lillehjernen skiver VISTE ikke Ltd, og dermed konkluderte med at Ltd ikke var avgjørende for motor læring. Imidlertid var induksjon av LTD bare forsøkt å bruke en type protokoll ved romtemperatur. Derfor brukte vi flere typer LTD-inducing protokoller under opptaksforholdene på rundt 30 ° c, og vi bekreftet at LTD ble pålitelig indusert i genet-manipulert mus ved å bruke disse protokollene ved nær fysiologiske temperaturer32.

Men det er fortsatt noen spørsmål om de grunnleggende egenskapene til konjunktiv stimulering. Den første er forholdet mellom den komplekse Spike form og amplitude av LTD. Sekund, i forbindelse med PF-stimulering og somatiske depolarization, om antall stimuli som brukes var nødvendig eller ikke var unnvikende. I denne studien ble disse spørsmålene undersøkt ved hjelp av Wild-mus (WT).

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av RIKEN komiteen for omsorg og bruk av dyr i eksperimenter. Mus ble holdt i dyret anlegget av RIKEN Center for Brain Science under godt kontrollert temperatur (23-25 ° c) og luftfuktighet (45%-65%) Forhold. Både mannlige og kvinnelige WT mus (C57BL/6, 3 – 6 måneder) ble brukt. 1. utarbeidelse av løsninger som brukes i eksperimenter Merk: Alle løsninger bør gjøres i ultrarent vannfri for metaller (…

Representative Results

Fire protokoller ble brukt i denne studien for å indusere lillehjernen LTD. I de to første protokollene (protokoll 1 og 2) ble forbindelsen mellom PF-stimulering og CF-stimulering påført under gjeldende-klemme-forhold. I de to andre protokollene (protokoll 3 og 4) ble somatiske depolarization erstattet av CF-stimulering under spennings-klemme-forhold. Spenning-spor eller strøm-spor under konjunktiv stimulering ble sammenlignet (figur 2). Kombinasjon av 1 PF-s…

Discussion

Forskjeller mellom de fire protokollene

I LTD-inducing protokoller 1 og 2, CJS 300 ganger ved 1 Hz er tilstrekkelig til å indusere lillehjernen LTD. stimulering frekvensen av CF syntes å være i et fysiologisk område, fordi den komplekse Spike avfyring rate i våken voksen mus (P60) ble rapportert å være 1,25 Hz36. Men CF-stimulering alene forårsaket ikke langsiktig plastisitet i PF-CF-synapse, som brukt i protokoller 1 og 2 (Figur 4, <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker A. OBA for hennes teknisk assistanse. Denne forskningen ble delvis støttet av Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (C) 17K01982 til K.Y.

Materials

Amplifier Molecular Devices-Axon Multiclamp 700B
Borosilicate glass capillary Sutter BF150-110-10
Digitizer Molecular Devices-Axon Digidata1322A
Electrode puller Sutter Model P-97
Isoflurane FUJIFILM Wako Pure Chemical 26675-46-7
Isolator A.M.P.I. ISOflex
Linear slicer Dosaka EM PRO7N
Microscope NIKON Eclipse E600FN
Peristaltic pump Gilson MP1 Single Channel Pump
Picrotoxin Sigma-Aldrich P1675
Pure water maker Merck-Millipore MilliQ 7000
Software for experiment Molecular probe-Axon pClamp 10
Software for statistics KyensLab KyPlot 5.0
Stimulator WPI DS8000
Temperature controller Warner TC-324B
Tetrodotoxin Tocris 1078
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. . The Cerebellum as a Neuronal Machine. , (1967).
  2. Marr, D. A theory of cerebellar cortex. Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).
  3. Albus, J. S. Theory of cerebellar function. Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).
  4. Maekawa, K., Simpson, J. I. Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system. Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).
  5. Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus. Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).
  6. Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation. Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).
  7. Robinson, D. A. Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum. Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).
  8. Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. Purkinje cell activity during motor learning. Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).
  9. Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells. Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).
  10. Ito, M., Kano, M. Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex. Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).
  11. Ekerot, C. F., Kano, M. Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres. Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).
  12. Sakurai, M. Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices. Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).
  13. Hirano, T. Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture. Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).
  14. Linden, D. J. A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons. Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).
  15. Linden, D. J., Connor, J. A. Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture. Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).
  16. Ito, M. Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  17. Ito, M. The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).
  18. Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits. Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).
  19. Nagao, S. Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits. Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).
  20. Watanabe, E. Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus. Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).
  21. van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit. Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).
  22. Ito, M. Mechanism of motor learning in the cerebellum. Brain Research. 886, 237-245 (2000).
  23. De Schutter, E. Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis. Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).
  24. Hansel, C., Linden, D. J. Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse. Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).
  25. Safo, P., Regehr, W. G. Timing dependence of the induction of cerebellar LTD. Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).
  26. Schonewille, M., et al. Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning. Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).
  27. Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells. Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).
  28. Hartell, N. A. Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors. Neuroreport. 5, 913-916 (1994).
  29. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79, 377-388 (1994).
  30. Steinberg, J. P., et al. Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression. Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).
  31. Koekkoek, S. K., et al. Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome. Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).
  32. Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).
  33. De Schutter, E., Bower, J. M. An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses. Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).
  34. Swensen, A. M., Bean, B. Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons. Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).
  35. Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones. Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).
  36. Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development. Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).
  37. Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo. eLife. 4, e12916 (2015).
  38. Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).
  39. Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release. Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).
  40. Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).
  41. Wang, W., et al. Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).
  42. Inoshita, T., Hirano, T. Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response. eLife. 27, 36209 (2018).
  43. Belmeguenai, A., et al. Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells. Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).
  44. Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 75, 108-120 (2012).

Tags

LTD InductionCerebellar SlicesGene ManipulationMotor LearningACSFTetrodotoxinBrain DissectionPurkinje CellsCerebellum SlicingCutting ACSFOxygen-carbon Dioxide Gas

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yamaguchi, K., Ito, M. Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices. J. Vis. Exp. (152), e59859, doi:10.3791/59859 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image