Summary
Denne artikel forklarer i detaljer en systematisk tilgang til vurdering af mikromineraltilgængelighed hos atlanterhavslaks. Metoden omfatter værktøjer og modeller med stigende biologisk kompleksitet: (1) kemisk spektringsanalyse, (2) in vitro-opløselighed, (3) optagelsesundersøgelser i cellelinjer og (4) in vivofiskeundersøgelser.
Abstract
Vurdering af tilgængeligheden af mikromineraler i kosten er en stor udfordring i mineralernæring af fiskearter. Formålet med denne artikel er at beskrive en systematisk tilgang, der kombinerer forskellige metoder til vurdering af tilgængeligheden af zink (Zn) i atlanterhavslaks (Salmo salar). I betragtning af at flere Zn kemiske arter kan være til stede i et atlanterhavslaksfoder, blev det antaget, at Zn-tilgængelighed påvirkes af Zn-kemiske arter, der er til stede i foderet. I denne undersøgelse handler den første protokol således om, hvordan man udvinder de forskellige Zn-kemiske arter fra foderet og analyserer dem ved hjælp af en størrelsesudelukkelseskromatografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode. Efterfølgende blev der udviklet en in vitro-metode til at evaluere opløseligheden af kosten Zn i atlanterhavslaksfoder. Den tredje protokol beskriver metoden til at undersøge virkningen af at ændre Zn kemiske arter sammensætning på optagelsen af Zn i en fisk intestinal epitel model ved hjælp af en regnbueørred tarm celle linje (RTgutGC). Tilsammen blev resultaterne fra in vitro-metoderne sammenlignet med en in vivo-undersøgelse, der undersøgte den tilsyneladende tilgængelighed af uorganiske og organiske kilder til Zn suppleret med atlanterhavslaksfoder. Resultaterne viste, at flere Zn kemiske arter kan findes i feeds og effektiviteten af en organisk Zn kilde afhænger meget af aminosyren ligand bruges til at chelate Zn. Resultaterne af in vitro-metoderne havde mindre korrelation med dette resultat af in vivo-undersøgelsen. Ikke desto mindre gav in vitro-protokoller, der er beskrevet i denne artikel, vigtige oplysninger om Zn-tilgængelighed og dens vurdering i fiskefoder.
Introduction
Fiskemel og fiskeolie blev traditionelt brugt i atlanterhavslaksfoder. Disse ingredienser erstattes dog i stigende grad af plantebaserede ingredienser1. Ovennævnte skift i fodersammensætningen har resulteret i lav tilgængelighed i kosten og et øget behov for at forbedre mineraltilgængeligheden i atlanterhavslaksfoder, især zink (Zn)2. Den reducerede tilgængelighed kan være et resultat af en ændring i Zn-niveauet, Zn kemiske arter eller / og antinutritional faktorer til stede i foder matrix. I dette scenario er der opstået en ny række tilsætningsstoffer, der generisk betragtes som "organiske kilder", med potentiale til at være en bedre tilgængelig kilde til kostmineraler til fisk. Derfor er det vigtigt at forstå grundlæggende kemi og fysiologi, der styrer tilgængeligheden af mineraler og deres kilder til fisk. Zink er et vigtigt sporstof for alle levende organismer3. Zn's rolle som signalmolekyle er blevet beskrevet på både det paracellulære og intracellulære niveau i fisk4. Hos atlanterhavslaks har Zn-mangel været forbundet med skeletabnormaliteter og reduceret aktivitet af forskellige Zn metalloenzymer5,6.
Denne undersøgelse beskriver en systematisk tilgang til at forstå Zn tilgængelighed ved at kategorisere det i fire forskellige rum af varieret kemisk og biologisk kompleksitet. De anvendte metoder er beskrevet i fire afsnit, som det fremgår af figur 1: 1) vurdering af Zn-kemiske arter i den opløselige del af et atlanterhavslaksfoder ved hjælp af en størrelsesekskludografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode7; 2) in vitro-opløselighed af suppleret Zn i atlanterhavslaksfoder 3) vurdering af Zn-kemiske arters anvendelse ved in vitro intestinal model (RTgutGC)8 og (4) tilsyneladende tilgængelighed af Zn i atlanterhavslaks(Salmo salar)9. Lignende protokoller kan udvikles for andre mineraler (f.eks. mangan, selen, kobber) af ernæringsmæssig interesse for akvakulturfiskearter.
Protocol
Fodringsforsøget i afsnit 4 blev udført i henhold til norsk (FOR-2015-06 - 18-761) og europæisk lovgivning (direktiv 2010/63/EU).
1. Evaluering af Zn kemiske arter i den opløselige brøkdel af et atlanterhavslaksfoder ved hjælp af en SEC-ICP-MS-metode
- Ekstraktionsbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
- Ekstraktionsbufferen forberedes ved at opløse en passende mængde tris(hydroxymethyl)aminomethan for at nå den ønskede ioniske styrke (100 mM) i ultrapur H2O.
- Opløsningens pH-pc justeres til pH 8.5 med HCl-opløsning, og pH-ændringen overvåges med en pH-måler.
- Fremstilling af foderprøver
BEMÆRK: Den anvendte foderprøve er formuleret på grundlag af kommercielt foder til atlanterhavslaks, der hovedsagelig indeholder proteinkilder fra plantebaserede ingredienser (dvs. ca. 5 % fiskeprotein, 10 % fiskeolie, 68 % plantebaseret protein og 12 % plantebaseret olie). Zinksulfat blev suppleret med foderet.- Grind foderprøven i hånden ved hjælp af en støder og en mørtel.
- Sigt foderprøven for at sikre, at ekstraktionen udføres i en foderfraktion med samme partikelstørrelse (fra 850 μm til 1,12 mm).
- Fortsæt med at udføre Zn-ekstraktionen.
- Zinkudvinding fra en foderprøve
- Der vejes ca. 0,5 g foder i tredotel i 15 ML koniske rør.
- Ekstraktionsbufferen (5 mL på 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) til prøverne.
- Prøverne udtages i en rotator (20 omdr./min.) ved 4 °C i 24 timer.
- De opløselige og ikke-opløselige fraktioner adskilles med centrifugering i 10 min ved 3000 x g.
- Brug et engangssprøjtefilter på 0,45 μm til at filtrere den opløselige fraktion.
- Overfør de filtrerede prøver til at rengøre rør.
- Udfør Zn-speciationsanalysen i de opløselige fraktioner ved hjælp af SEC-ICP-MS som beskrevet i trin 1.6.
BEMÆRK: En oversigt over proceduren for Zn-udvinding fra en foderprøve er beskrevet i figur 2.
- Mobilfaseløsning (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5)
- Den mobile faseløsning, der opløser 6,057 g tris(hydroxymethyl)aminomethan i 1 L af 3% MeOH-opløsning (v/v).
- Opløsningens pH-pc justeres til pH til 7,5 med HCl-opløsning, og pH-ændringen overvåges med en pH-måler.
- Den mobile faseløsning filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter.
- Kalibrering af molekylvægt af SEC-kolonneadskillelsesområdet
- Kalibrer adskillelsesområdet ved at udføre en molekylvægtkalibrering.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt thyroglobulin (660 kDa), Zn/Cu-superoxidforgær (32 kDa), myoglobin (17 kDa) og vitamin B12 (1,36 kDa). - Forbered hver af standarderne med en kendt koncentration i ultrapur H2O.
- Forbered et højtydende flydende kromatografi (HPLC) hætteglas ved at tilføje 250 μL standard til et hætteglas.
- Læg hætteglassene med standarder for prøvernes sekvenskørsel.
- Kør molekylvægtkalibreringen i begyndelsen og slutningen af analysesekvensen, overvågning 127I (thyroglobulin), 66Zn (Zn/Cu superoxid dismutase), 57Fe (myoglobin) og 59Co (vitamin B12).
BEMÆRK: Kalibreringen af molekylvægt udføres samtidig med Zn-speciationsanalysen.
- Kalibrer adskillelsesområdet ved at udføre en molekylvægtkalibrering.
- Zink speciation analyse ved hjælp af SEC-ICP-MS
BEMÆRK: Zn-speciationsanalysen ved SEC-ICP-MS-metoden blev udviklet på grundlag af principper, der er beskrevet andetsteds10,11 , og der blev udført yderligere optimering til analyse af et atlanterhavslaksfoder7.- Udfør Zn-speciationsanalysen på de opløselige fraktioner ved hjælp af en SEC-kolonne (Size Exclusion Chromatography) og en HPLC kombineret med induktivt koblet plasmamassespektroskopi (ICP-MS).
- Forbered et HPLC-hætteglas ved at tilføje 250 μL opløselig fraktion til et hætteglas.
- Før analysen skal alle prøverne spikes med 0,5 μL vitamin B12. Dette trin gør det muligt at rette for fastholdelsestider skift, overvågning 59Co.
- Fortynd den opløselige fraktion med ekstraktionsbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) og juster til et endeligt volumen på 1 mL.
- Forbered sekvensen af prøverne i tilfældig rækkefølge.
- Stil ICP-MS i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Følg instrumentindstillingerne for HPLC og ICP-MS, der udfører Zn-speciationanalysen (se tabel 1).
2. In vitro opløselighed af suppleret Zn i Atlanterhavet laksefoder
BEMÆRK: Den anvendte foderprøve er formuleret på grundlag af kommercielt foder til atlanterhavslaks, der hovedsagelig indeholder proteinkilder fra plantebaserede ingredienser (dvs. ca. 5 % fiskemel, 10 % fiskeolie, 68 % plantebaserede ingredienser og 12 % vegetabilsk olie).
- Grind atlanterhavslaksfoderprøverne i 10 s ved 3000 rpm ved hjælp af en knivmølle og opbevares ved 4 °C indtil videre analyse.
- Der vejes ~0,2 g af foderprøverne jorden i trin 2.1, og der tilsættes Zn radiotracer (65Zn) af kendt specifik aktivitet i et prøverør på 5 mL (med hætte).
FORSIGTIG: Denne procedure skal udføres i en radionukleidsuite. Den person, der udfører dette trin, skal trænes og certificeres til at håndtere radioisotoper. De sikkerheds- og forsigtighedsforanstaltninger, der anbefales af instituttets strålingssikkerhedsadministration, skal følges nøje. - Derefter forberede ferskvand tarm luminal buffer opløsning som beskrevet nedenfor.
- Til saltopløsning A vejes 11,65 g NaNO3, 0,55 g KNO3 og 0,4 g MgSO4. Saltene opløses i ultrapur H2O og justers til et endeligt volumen på 60 mL.
- Ved saltopløsning B vejes 0,31 g Ca(NO3)2· 4 H2O. Saltene opløses i ultrapur H2O og justers til et endeligt volumen på 10 mL.
- Brug 500 mM HEPES lageropløsning som saltopløsning C.
- For saltopløsning D vejes 1,2 g MgCl2, saltet opløses i ultrapur H2O og justeres til et endeligt volumen på 20 mL.
- For saltopløsning E skal der vejes 0,9 g MgSO4, saltet opløses i ultrapur H2O og justeres til et endeligt volumen på 20 mL.
- Pyruvatopløsningen opløses ved at opløse 0,55 g CH3COCOONa i 10 mL ultrapur H2O.
- 0,9 g galaktose (C6H12O6)opløses i ultrapur H2O.
- Opløs godt ved hjælp af en magnetisk omrører og sterilisere saltopløsninger A, B, D og E ved autoklavering, og opløsning C, pyruvat og galaktose ved filtrering gennem en 200 μm sprøjte filter.
- Efter tilberedning af de forskellige lageropløsninger blandes de ovennævnte forberedte opløsninger i følgende proportioner: 6,8 mL saltopløsning A, 4,14 mL B, 5 mL C, 2,5 mL D, 1,5 mL E og 1,14 mL af hver pyruvat og galaktose. Opfange volumen til 100 mL ved hjælp af deioniseret vand.
BEMÆRK: Ovenstående buffer vil nu repræsentere den ioniske sammensætning af de tarm lumen findes i ferskvand salmonids.
- Forbered seks andre aliquots af bufferen beskrevet i trin 2.6 og tilsæt en af følgende aminosyrer (cystein, methionin, glycin, histidin, lysin og arginin) for at nå en endelig molarkoncentration på 5 mM.
- Ferskvands intestinal luminal buffer (reaktionsvolumen = 3 mL; pH 7.4) til foderprøven.
- Gentag trin 2.5 med de buffere, der er beskrevet i 2.4 (i nærværelse af forskellige aminosyrer ved 5 mM koncentration).
- Luk rørene og lad dem dreje i en roterende spinner i 30 min ved 25 rpm.
- De opløselige og ikke-opløselige fraktioner adskilles ved centrifugering i 10 min ved 1157 x g.
- Brug en gammatæller til at måle antallet pr. minut (cpm) på 65Zn i de opløselige og ikke-opløselige brøker.
- Den andel af de radioisotoper af Zn (65Zn), der er til stede i de opløselige og ikke-opløselige fraktioner.
3. Evaluering af Zn kemiske arter optagelse ved hjælp af en in vitro intestinal model (RTgutGC)
- RTgutGC celler kultur
BEMÆRK: Alle arbejdsmaterialer, der anvendes i dette trin, skal være sterile.- Genoplive de frosne RTgutGC celler forsigtigt i et vandbad sat til 20 °C.
- Rør forsigtigt opløsningen, der indeholder cellerne, ud, og ophæng dem i 10 mL L15 medium, der indeholder 10% fosterkvægsserum (FBS).
BEMÆRK: 10% FBS bruges kun til at genoplive de frosne celler. Til efterfølgende passage anvendes FBS ved 5%. Sammensætningen af FBS kan variere mellem partier, så det er tilrådeligt at købe og lagerføre så meget som nødvendigt fra et enkelt parti for at undgå inter-batch variationer i serumsammensætningen. - Celleaffjedringen til 75 cm2 cellekulturflasker og inkuberes i en inkubator, der er indstillet til 19 °C under normal atmosfære.
- Kontroller cellerne, og når sammenløb (80% sammenløb, vurdere visuelt ved at undersøge tætheden af celleoverfladen under et mikroskop), opdele cellerne til nye kolber (efterfølgende passage) eller høst til brug i forsøg.
BEMÆRK: Et eksempel på RTgutGC-cellerne 1 h og 1 uge efter såning til cellekulturflaskerne er vist i figur 3.
- Cellehøst og forberedelse til eksponeringseksperimenter
- Vask cellerne to gange med 1 mL ethylendiamintetraacetic syre (EDTA) opløsning. Efter hver vask sifon EDTA-opløsningen ud ved hjælp af et sterilt sugerør.
- Behandl cellerne med trypsin (0,7 mL trypsin, i 0,25% i fosfat-buffered saltvand [PBS]).
- Drej forsigtigt kolben i spidse vinkler for at sprede trypsin langs hele overfladen af kolben.
- Fortsæt rotationen i 2 min, mens cellerne løsnes.
- Efter forsigtigt roterende i 2 min, tilsæt 10 mL L15/FBS medium til at neutralisere trypsin.
- Dekanter den resulterende celleophæng i et konisk bundcentrifugerør ved hjælp af en steril pipette og centrifuge i 3 min ved 130 x g.
- Bestem tætheden af de høstede celler ved manuel optælling ved hjælp af hæmocytometer.
- Tilsæt den nødvendige mængde L15/FBS-medium for at opnå en celletæthed på 5 x 104 celler/mL.
- Frø cellerne på 24-brønds plader ved pipettering 1 mL celle suspension per brønd for at nå den endelige celletæthed på 5 x 104 celler / brønd.
BEMÆRK: Brug helst multidispenserende pipetter for at minimere variation og reducere tiden. - Læg de seedede plader i en inkubator under normal atmosfære ved 19 °C i 48 timer før forsøg.
BEMÆRK: Trypsin opbevares ved -20 °C; EDTA-opløsning og L15/FBS-medier ved 4 °C. Juster temperaturen på alle arbejdsløsninger og medier til 19 °C lige før brug.
- Forberedelse af eksponeringsmedier
BEMÆRK: Dette trin skal udføres under røghætten under aseptiske og sterile forhold.- L15/ex ved blanding af 6,8 mL saltopløsning A (trin 2.3.1), 1,14 mL B (trin 2.3.2), 5 mL C (trin 2.3.3) og 1,14 mL hver af pyruvat (trin 2.3.6) og galactose (trin 2.3.7). Opfange volumen til 100 mL ved hjælp af steril celle kultur-grade destilleret vand.
- FW tilberedes ved blanding af 6,8 mL saltopløsning A (2.3.1), 4,14 mL B (2.3.2), 5 mL C (2.3.3), 2,5 mL D (2.3.4), 1,5 mL E (2.3.5) og 1,14 mL hver pyruvat (2.3.6) og galaktose (2.3.7). Opfange volumen til 100 mL ved hjælp af sterile, celle kultur-grade destilleret vand.
- Kvantificer koncentrationerne af ioner i eksponeringsmedierne ved hjælp af ICP-MS som beskrevet andetsteds12.
BEMÆRK: Ioniske koncentrationer analyseret i mediepræparaterne er præsenteret i tabel 2.
- Zink (65Zn) tilstrømning assays
- Frø RTgutGC-cellerne på 24-brøndsplader (5 x 104 celler/brønd) i komplet L15/FBS medium.
- Inkuberes i 48 timer i en inkubator med normal atmosfære ved 19 °C.
- Juster alle eksperimentelle mediepræparater til pH 7.4 ved hjælp af 0,5 M NaOH i nærvær eller fravær af L-methionin (L-Met) eller DL-methionin (DL-Met) ved 2 mM koncentration.
BEMÆRK: PH-justeringen af de i punkt 3.4.3 beskrevne buffere skal foretages frisk før behandling af cellerne i trin 3.4.5. - Efter afslutningen af inkubationsperioden fjernes mediet fra brøndene og skylles grundigt med PBS.
- Tilføj pH-justerede FW eksperimentelle medier, og gør det muligt at akklimatisere i 20 min.
- RTgutGC-cellerne udsættes for nominelle koncentrationer på 3,07, 6,14, 12,27 og 24,55 μM 65Zn(II) (som ZnCl2; ~4 kBq/mL) i de medier, der er beskrevet i trin 3.4.3.
- Umiddelbart efter skal cellerne opbevares i inkubatoren ved 19 °C i 15 min.
- Når inkubationen på 15 minutter er overstået, aspirer kulturen supernatant og fjernes fra brønden.
- Skyl cellerne med iskoldt FW-medium (med 200 μM Zn, pH 7.4) og sluk derefter ved at tilsætte bufferen 5 mM ethylenglycol-bis(β-aminoethylethher)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) (pH 7.4) i 5 min, for at slippe af med adsorberet 65Zn(II).
- Eksponer cellerne for ovennævnte mediepræparater i nærvær eller fravær af 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] hepane-2-carboxylic syre (BCH), en aminosyretransporthæmmer.
- Efter eksponeringsperioden på 15 min gentages trin 3.4.8 og 3.4.9.
- RtgutGC-cellerne vil blive klæbet til bunden af brøndene som en monolayer. Fordøje cellerne ved hjælp af 0,2% varmt natrium dodecyl sulfat (SDS) vaskemiddel (100 μL/godt).
BEMÆRK: SDS-opløsningen skal placeres i 1 time i et vandbad, der er indstillet til 90 °C før brug. - Aspirere og genvinde cellen fordøje i en 1,5 mL rør.
- Mål radioaktiviteten af cellefordyderne ved hjælp af en gammatæller.
BEMÆRK: Antallet pr. minut (cpm) skal korrigeres for radioaktivt henfald, baggrundsaktivitet og underkastes specifikke aktivitetsberegninger efter de formler, der er beskrevet af Glover og Hogstrand13. - For at kvantificere cellernes proteinkoncentration homogeniseres cellerne med 500 μL på 0,5 M NaOH.
- Brug et Bradford-analysesæt til at måle proteinkoncentrationen i celleprøven med kvægserumalbumin (BSA) som standard.
BEMÆRK: Når proteinkoncentrationen er kvantificeret, kan hastigheden af Zn-optagelse fra RTgutGC-celler udtrykkes som pmoles Zn min-1 mg-1 protein.
4. Tilsyneladende tilgængelighed af Zn i Atlanterhavet(Salmo salar)
BEMÆRK: Atlanterhavslaksfoderene blev formuleret på grundlag af kommercielle foderstoffer, der hovedsagelig indeholder proteinkilder fra plantebaserede ingredienser (dvs. ca. 5 % fiskeprotein, 10 % fiskeolie, 68 % plantebaseret protein og 12 % planteolie). To foderstoffer blev suppleret med en uorganisk kilde (Zn sulfat) eller en organisk kilde (Zn chelat af glycin) for at opnå en Zn-koncentration på 150 mg/kg foder. Derudover blev Yttriumoxid (foderkvalitet) tilsat foderet ved 0,01% som inertmarkøren for at muliggøre beregning af tilsyneladende tilgængelighedskoefficient.
- Akklimatisere atlanterhavslaks (SalmoBreed stamme, alder 1 + år, blandet køn grupper) i deres respektive tanke, indtil fiskene er vant til de eksperimentelle betingelser.
- Vurdere akklimateringen af atlanterhavslaksen ved at overvåge deres daglige foderindtag.
BEMÆRK: Dette forsøg blev udført i trepartstanke, og der blev således brugt i alt seks tanke. Under fodringsforsøget var vandtemperaturen 11,9 ± 0,3 °C og opløst iltmætning var 101 ± 5%. - Foder fisken med eksperimentelle feeds i 11 dage.
- Aflive fisken ved overdosis ved hjælp af 6 mL tricain metan metan bestand opløsning per liter vand.
- Saml en samlet prøve af afføring fra fisken fra samme tank i en plade ved at strippe fra ventralfinnen til anus.
- Afføringen fjernes fra pladen med en spatel i et 50 mL konisk rør, og prøverne opbevares straks ved -20 °C.
BEMÆRK: Prøverne blev opbevaret ved -20 °C indtil videre analyse. - Frys afføringsprøverne i 72 timer ved -80 °C.
- Homogenisere manuelt afføringsprøven til et fint pulver ved hjælp af en støder og mørtel.
- Bestemme koncentrationen af Zn og Yttrium i foder- og afføringsprøverne ved hjælp af en ICP-MS (som beskrevet andetsteds9).
- Bestem den synlige tilgængelighedskoefficient (AAC%) ved hjælp af følgende formel:
Representative Results
Vurdering af Zn kemiske arter i den opløselige brøkdel af et atlanterhavslaksfoder ved hjælp af en SEC-ICP-MS-metode
SEC-ICP-MS-metoden indeholder data om Zn-kemiske arter, der findes i den opløselige del af atlanterhavslaksfoderet. Figur 4 illustrerer den kromatografiske profil af Zn fundet i den opløselige fraktion. Dette kromatogram blev opnået ved hjælp af SEC-ICP-MS-metoden. Fem Zn indeholdende toppe blev fundet i de opløselige fraktioner af atlanterhavet laksefoder. Hver top har en anden molekylvægt; peak one (~ 600 kDa), top to og top tre (fra 32 til 17 kDa), top fire (fra 17 til 1,36 kDa) og top fem (> 1,36 kDa). Top fire var den mest rigelige, efterfulgt af top to, tre, fem og en, henholdsvis. De Zn kemiske arter, der findes i den opløselige fraktion, kan have forskellige kilder, fordi det anvendte foder indeholder både marine og plantebaserede ingredienser og suppleret form (dvs. Zn-sulfat). Den molekylære vægtområde af Zn kemiske arter foreslog, at disse forbindelser kan være metalloproteiner.
In vitro opløselighed af suppleret Zn i Atlanterhavet laksefoder
Opløselighed af suppleret 65Zn steg i nærvær af aminosyrer. Alle de testede aminosyrer øgede opløseligheden af suppleret 65Zn. Methionin, glycin, cystein, histidin og lysin forbedret 65Zn opløselighed; højere opløselighed blev fundet med histidin og lysin (Figur 5).
Evaluering af Zn arter optagelse ved hjælp af en in vitro intestinal model (RTgutGC)
Apisk zinkoptagelse i RTgutGC-celler var signifikant påvirket af tilstedeværelsen af L-Met eller DL-Met ved 2 mM koncentrationer. Desuden blev virkningen af methionin på Zn-optagelse i RTgutGC-celler negativt påvirket af tilstedeværelsen af BCH (en aminosyretransportsystemblokering), sammenlignet med celler, der ikke er behandlet med BCH (Figur 6).
Tilsyneladende tilgængelighed af kosten Zn i Atlanterhavslaks(Salmo salar)
I praktiske foderstoffer til atlanterhavslaks var Zn-tilgængeligheden tilsyneladende den samme, når den supplerede med en uorganisk kilde (Zn-sulfat) eller en organisk kilde (Zn chelat af glycin). De anslåede værdier for tilsyneladende tilgængelighed af Zn (%, n = 3) i atlanterhavslaks var 31% ± 12%, når de supplerede med en uorganisk kilde (Zn sulfat) og 31% ± 3%, når der suppleres en organisk kilde (Zn chelat af glycin).
Figur 1: Et resumé af den systematiske tilgang til vurdering af mineraltilgængelighed ved hjælp af komplementære metoder. Denne fremgangsmåde blev brugt til at studere zink tilgængelighed i atlanterhavslaks, herunder Zn speciation, Zn opløselighed i tarmmiljøet, Zn optagelse af tarmceller og Zn tilsyneladende tilgængelighed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En oversigt over proceduren for Zn-udvinding fra en foderprøve. Zink udvindes fra en foderprøve ved hjælp af milde ekstraktionsforhold. Ekstraktionen efterfølges af Zn speciation analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Et eksempel på RTgutGC-cellerne 1 h (venstre) og 1 uge (højre) efter såning i cellekulturflaskerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Et kromatogram, der viser de Znholdige toppe fra den opløselige del af atlanterhavslaksfoder og analyseret af SEC-ICP-MS. De tre gentagelser er kendetegnet ved de blå, røde og sorte linjer. En molekylvægtkalibrering blev udført ved hjælp af thyroglobulin (660 kDa, overvågning 127I), Zn /Cu superoxid dismutase (32 kDa, overvågning 66Zn), myoglobin (17 kDa, overvågning 57Fe), vitamin B12 (1,36 kDa, overvågning 59Co); Peak 1 (P1): ~600 kDa, opbevaringstid (RT) 8,2 min; Peak 2+3 (P2+3): fra 32 til 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Peak 4 (P4): fra 17 til 1,36 kDa, RT 16,3 min; Peak 5 (P5): > 1,36 kDa, Rt 23,2 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Aminosyrernes indvirkning på in vitro-opløseligheden af suppleret Zn i atlanterhavslaksfoder. Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD (n = 3). Data blev analyseret gennem envejs ANOVA, efterfulgt af Dunnets multiple sammenligningstest, der sammenlignede gennemsnittet for hver AA-gruppe med gennemsnittet for kontrolgruppen (Nr. AA). Stjernerne angiver betydningen af ANOVA (P-værdier < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) og < 0,0001 (****)). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Indflydelsen af methionin og en aminosyretransporthæmmer (2-Aminobicyclo [2.2.1] heptan-2-carboxylic syre, BCH, 10 mM). Data præsenteres som gennemsnitlige ± SD (n = 3). Data blev analyseret gennem tovejs ANOVA, efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest med p < 0,05 niveau af betydning. Post-hoc forskelle mellem grupper er repræsenteret som hævet skrift bogstav over søjlerne; bjælker med forskellige hævet skrift er statistisk forskellige (p < 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
| HPLC-indstillinger | |
| Kolonne | SEC-kolonne (30 cm x 7,8 mm, 5 μm partikelstørrelse) + vagtsøjle (7 μm partikelstørrelse) |
| Kalibreringsområde | 1,0 × 104 - 5,0 × 105 Da |
| Mobil fase | 50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5) |
| Flowhastighed | 0,7 mLmin.000 |
| Injektionsvolumen | 50 μL |
| ICP-MS-indstillinger | |
| Fremadrettet strøm | 1550 W |
| Plasmagasstrøm | 15,0 Lmin.000 |
| Gasstrøm fra transportør | 0,86 Lmin.000 |
| Makeup gas flow | 0,34 L min.000 l.000 |
| Dvæle tid | 0,1 s pr. isotop |
| Isotoper overvåges | 127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe |
Tabel 1. En oversigt over instrumentindstillingerne for HPLC og ICP-MS.
| Kemisk sammensætning (mM) | L15/ex | Eksperimentelt medie (L15/FW) |
| Natriumnitrat | 155 | 155 |
| Kaliumnitrat | 6.2 | 6.2 |
| Magnesiumsulfat | 3.8 | 19.5 |
| Calciumnitrat | 1.5 | 5.4 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Magnesiumchlorid | - | 15 |
| Natrium pyruvat | 5.7 | 5.7 |
| Galactose | 5.7 | 5.7 |
| ph | 7.1 | 7.4 |
| Ionisk styrke | 178 | 258 |
| Ionisk sammensætning (mM) | ||
| Calcium, Ca2+ * | 1.6 ± 0.1 | 5.3 ± 0,2 |
| Magnesium, Mg2+ * | 3.9 ± 0,3 | 32,5 ± 0,7 |
| Kalium, K+ * | 8.2 ± 1.2 | 8.6 ± 1.1 |
| Natrium, Na+ * | 160 ± 3 | 157 ± 2 |
| Nitrat,NR. | 164 | 172.4 |
| Sulfat, SO4- ** | 3.8 | 18.7 |
| Chlorid, Cl- ** | 1.5 | 31.5 |
Tabel 2. Den kemiske og ioniske sammensætning af de eksperimentelle medier testet.
Discussion
Tarmabsorptionen af Zn synes at være påvirket af den kemiske form af Zn-arterne13. I den forbindelse gjorde anvendelsen af de protokoller, der er beskrevet i denne artikel, det muligt sekventielt at undersøge de kemiske og biologiske aspekter, der ligger til grund for »tilgængeligheden« af Zn i atlanterhavslaks.
Denne undersøgelse rapporterede brugen af en Zn speciation analysemetode. SEC-ICP-MS-metoden fremlagde kvalitative data om den kemiske arts molekylvægt, der findes i den opløselige del af et atlanterhavslaksfoder. Dette blev opnået ved at sammenligne retentionstiderne for molekylvægtkalibreringsstandarderne (dvs. thyroglobulin (660 kDa), Zn/Cu superoxidformutase (32 kDa), myoglobin (17 kDa) og vitamin B12 (1,36 kDa)) med retentionstiderne for Zn indeholdende toppe. En udfordring, der blev fundet i Zn-speciationanalysen, var identifikationen af de ukendte Zn-kemiske arter på grund af manglende analytiske standarder. I SEC er adskillelsen af molekylerne baseret på deres størrelser i forhold til porerne i den stationære fase. I princippet vil større molekyler rejse hurtigere, eluting først, og mindre molekyler vil rejse langsommere, eluting senere14. Derfor kan hver Zn indeholdende top indeholde flere forbindelser med lignende molekylvægt15. Dette bidrager også til udfordringen med at identificere ukendte Zn kemiske arter. Desuden blev flere milde ekstraktionsbetingelser testet for udvinding af Zn. Den udvundne Zn var lav (~ 10%). Milde ekstraktionsbetingelser blev anvendt for at holde Zn kemiske arter intakte, men dette kan have kompromitteret ekstraktionseffektiviteten7.
I in vitro-opløselighedsanalysen indikerede opløseligheden af suppleret Zn (som radioisotop 65ZnCl2),at aminosyrerne, især histidin og lysin, øgede opløseligheden af Zn (Figur 5). Brug af foderprøver direkte til in vitro-opløselighedsanalyser under simulerede gastrointestinale tilstande er baseret på viden om, at ændringer i Zn-speciation er pH-afhængige16. Sure forhold i begyndelsen af mave- og tv-traktaten kan dog resultere i en vis ændring i speciationen, som kan være uigenkaldelig (f.eks. ZnO -> ZnCl2, i nærværelse af HCl under sure forhold i maven). Ikke desto mindre er den Zn-kilde, der anvendes her, ZnSO4, og hvis opløselighed blev forbedret af aminosyrer i mediet. Det næste spørgsmål, der skal besvares, var: Kan den øgede opløselighed oversættes til tilgængelighed? RTgutGC intestinal celle linje blev brugt til at studere dette spørgsmål. I forbindelse med mineralernæring hos dyr er udtrykket »tilgængelighed« svært at definere og kan reguleres forskelligt i cellerne (in vitro) sammenlignet med et dyr (in vivo). Derfor blev udtrykket "optagelse" brugt, når det kom til in vitro-evalueringen ved hjælp af tarmcellelinjen. Cellelinjen gav nyttige oplysninger om Zn-optagelsesmekanismerne ved tarmepilet, som er en del af den komplekse lovgivningsproces, der regulerer mineraltilgængelighed hos dyr. RTgutGC-cellerne fremkaldte en bedre kapacitet til apikal optagelse af Zn i nærværelse af en aminosyre (dvs. methionin; Figur 6). Den tilsyneladende tilgængelighed i vivo var imidlertid ikke signifikant forskellig mellem uorganiske og økologiske Zn-kilder i atlanterhavslaks. I in vivo-tilgængelighedsundersøgelsen blev Zn-kildesammenligningen foretaget ved Zn-niveauer i kosten, der var langt over de kendte Zn-krav hos atlanterhavslaks17, i alt Zn-koncentrationen på 150 mg/kg foder. Forskellene i tilgængelighed visualiseres bedre, når de testede kostniveauer falder i det lineære dynamikområde, før dyret når mætning. I denne in vivo-undersøgelse er det muligt, at atlanterhavslaksen var godt mættet til observeret forskel i Zn absorption mellem anvendte kilder.
Sammenfattende gav den første metode kvalitative oplysninger om forskellige Zn-kemiske arter, der findes i den opløselige del af et atlanterhavslaksfoder. den anden metode, in vitro opløselighed af suppleret Zn blev forbedret i nærværelse af aminosyre ligands; den tredje metode bekræftede, at forbedret opløselighed ved aminosyrer kan forbedre optagelsen ved tarmepitele omvendt lykkedes det ikke den fjerde metode at finde forskelle i tilgængeligheden af Zn fra uorganisk eller organisk kilde til atlanterhavslaks. Afslutningsvis, men ikke i overensstemmelse med in vivo resultater, in vitro protokoller gav interessant indsigt i at forstå de forskellige komponenter i Zn tilgængelighed.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført under projektet APREMIA (Tilsyneladende tilgængelighed og krav om mineraler i atlanterhavslaks, tilskud nr. 244490) finansieret af det norske forskningsråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
| 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| 10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
| 1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
| 24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
| 2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
| DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
| D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
| Experimental fish feeds | Skretting | ||
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
| L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
| HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
| Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
| Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
| L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
| L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
| Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
| Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
| Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
| Pasteur pipette | VWR | ||
| pH meter | inoLab | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
| RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
| SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
| Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm) | Retsch | ||
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
| Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
| Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
| Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
| Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
| Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
| Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
| Zinc sulphate | Vilomix |
References
- Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
- Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
- Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).
- Hogstrand, C. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).
- Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
- Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
- Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
- Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
- Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
- Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
- Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
- Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
- Ekman, R. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).
