Summary
Denne artikkelen forklarer i detalj en systematisk tilnærming for å vurdere mikromineraltilgjengelighet i atlantisk laks. Metodikken omfatter verktøy og modeller med økende biologisk kompleksitet: (1) kjemisk spesieringsanalyse, (2) in vitro løselighet, (3) opptaksstudier i cellelinjer og (4) in vivo fiskestudier.
Abstract
Å vurdere tilgjengeligheten av mikromineraler i kostholdet er en stor utfordring i mineralernæring av fiskearter. Denne artikkelen tar sikte på å beskrive en systematisk tilnærming som kombinerer ulike metoder for å vurdere tilgjengeligheten av sink (Zn) i atlantisk laks (Salmo salar). Tatt i betraktning at flere Zn kjemiske arter kan være til stede i en atlantisk laksefôr, ble det hypoteset at Zn-tilgjengeligheten påvirkes av Zn kjemiske arter som er tilstede i fôret. I denne studien handler den første protokollen om hvordan man trekker ut de forskjellige Zn-kjemiske artene fra fôret og analyserer dem ved hjelp av en størrelseseksklusjonskromatografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode. Deretter ble det utviklet en in vitro-metode for å evaluere løseligheten av diett Zn i atlantisk laksefôr. Den tredje protokollen beskriver metoden for å studere effekten av å endre Zn kjemisk artsammensetning på Zns opptak i en fisk intestinal epitelial modell ved hjelp av en regnbueørret tarmcellelinje (RTgutGC). Sammen ble funnene fra in vitro-metodene sammenlignet med en in vivo-studie som undersøkte den tilsynelatende tilgjengeligheten av uorganiske og organiske kilder til Zn supplert med atlantisk laksefôr. Resultatene viste at flere Zn kjemiske arter finnes i fôr og effektiviteten til en organisk Zn-kilde avhenger veldig mye av aminosyreligaen som brukes til å chelate Zn. Funnene i in vitro-metodene hadde mindre sammenheng med utfallet av in vivo-studien. Likevel ga in vitro-protokoller beskrevet i denne artikkelen viktig informasjon om Zn-tilgjengelighet og dens vurdering i fiskefôr.
Introduction
Fiskemel og fiskeolje ble tradisjonelt brukt i atlantisk laksefôr. Imidlertid blir disse ingrediensene i økende grad erstattet av plantebaserte ingredienser1. Det nevnte skiftet i fôrsammensetningen har resultert i lav kostholdstilgjengelighet og økt behov for å forbedre mineraltilgjengeligheten i atlantisk laksefôr, spesielt sink (Zn)2. Den reduserte tilgjengeligheten kan være et resultat av en endring i Zn-nivået, Zn kjemiske arter eller / og antinæringsfaktorer som finnes i fôrmatrisen. I dette scenariet har et nytt utvalg av tilsetningsstoffer generisk betraktet som "organiske kilder" dukket opp med potensial for å være en bedre tilgjengelig kilde til diettmineraler til fisk. Derfor er det viktig å forstå grunnleggende kjemi og fysiologi som styrer tilgjengeligheten av mineraler og deres kilder til fisk. Sink er et viktig sporelement for alle levende organismer3. Zns rolle som signalmolekyl er beskrevet både på paracellulært og intracellulært nivå i fisk4. I atlantisk laks har Zn-mangel vært forbundet med skjelettavvik og redusert aktivitet av ulike Zn metalloenzymer5,6.
Denne studien beskriver en systematisk tilnærming for å forstå Zn-tilgjengelighet ved å kategorisere den i fire forskjellige rom med variert kjemisk og biologisk kompleksitet. Metodene som er involvert er beskrevet i fire seksjoner, som det fremgår av figur 1: (1) evaluering av Zn kjemiske arter i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr ved hjelp av en størrelseseksklusjon kromatografi-induktivt koblet plasmamassespektroskopi (SEC-ICP-MS) metode7; (2) in vitro løselighet av supplert Zn i atlantisk laksefôr; (3) evaluering Zn kjemiske arter opptak ved in vitro intestinal modell (RTgutGC)8; og (4) tilsynelatende tilgjengelighet av Zn i atlantisk laks (Salmo salar)9. Lignende protokoller kan utvikles for andre mineraler (f.eks. mangan, selen, kobber) av ernæringsmessig interesse for oppdrettsfiskarter.
Protocol
Fôringsstudien i § 4 ble utført i henhold til norsk (FOR-2015-06 - 18-761) og europeisk lovgivning (direktiv 2010/63/EU).
1. Evaluering av Zn kjemiske arter i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr ved hjelp av en SEC-ICP-MS-metode
- Ekstraksjonsbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
- Forbered ekstraksjonsbufferen ved å oppløse en passende mengde tris (hydroksymetyl)aminometan for å nå ønsket ionstyrke (100 mM) i ultrapure H2O.
- Juster pH-verdien til løsningen til pH 8.5 med HCl-oppløsning, og overse pH-endringen med en pH-måler.
- Forberedelse av fôrprøver
MERK: Fôrprøven som ble brukt ble formulert basert på kommersiell fôr til atlantisk laks, som hovedsakelig inneholder proteinkilder fra plantebaserte ingredienser (dvs. ca. 5% fiskeprotein, 10% fiskeolje, 68% plantebasert protein og 12% plantebasert olje). Sinksulfat ble supplert med fôret.- Grind fôrprøven for hånd ved hjelp av en pestle og en mørtel.
- Sikt fôrprøven for å sikre at ekstraksjonen utføres i en fôrfraksjon med lignende partikkelstørrelse (fra 850 μm til 1,12 mm).
- Fortsett å utføre Zn-utvinningen.
- Sinkutvinning fra en fôrprøve
- Vei ca. 0,5 g fôr i triplikat i 15 ml koniske rør.
- Tilsett ekstraksjonsbufferen (5 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) i prøvene.
- Trekk ut prøvene i en rotator (20 o/min) ved 4 °C i 24 timer.
- Skill de oppløselige og ikke-løselige fraksjonene ved sentrifugering i 10 min ved 3000 x g.
- Bruk et 0,45 μm engangssprøytefilter for å filtrere den løselige fraksjonen.
- Overfør de filtrerte prøvene til rene rør.
- Utfør Zn-spesieringsanalysen i de løselige fraksjonene ved hjelp av SEC-ICP-MS, som beskrevet i trinn 1.6.
MERK: Et sammendrag av prosedyren for Zn-ekstraksjon fra en fôrprøve er beskrevet i figur 2.
- Mobil faseløsning (50 mM Tris-HCl + 3 % MeOH, pH 7,5)
- Forbered den mobile faseløsningen som oppløses 6,057 g tris (hydroksymetyl)aminometan i 1 L av 3 % MeOH-løsning (v/v).
- Juster pH-verdien til løsningen til pH til 7,5 med HCl-oppløsning, og overse pH-endringen med en pH-måler.
- Filtrer den mobile faseløsningen gjennom et 0,45 μm membranfilter.
- Molekylvektkalibrering av SEC-kolonneseparasjonsområdet
- Kalibrer separasjonsområdet ved å utføre en molekylvektkalibrering.
MERK: I denne studien ble tyroglobulin (660 kDa), Zn/Cu superoksid dismutase (32 kDa), myoglobin (17 kDa) og vitamin B12 (1,36 kDa) brukt. - Forbered hver av standardene med en kjent konsentrasjon i ultrapure H2O.
- Forbered et høytytende hetteglass med flytende kromatografi (HPLC) ved å tilsette 250 μL standard til et hetteglass.
- Last hetteglassene med standarder til sekvenskjøringen av prøvene.
- Kjør molekylvektkalibreringen i begynnelsen og på slutten av analytisk sekvens, overvåking 127I (thyroglobulin), 66Zn (Zn / Cu superoksid dismutase), 57Fe (myoglobin) og 59Co (vitamin B12).
MERK: Kalibreringen av molekylvekten utføres samtidig med Zn-spesieringsanalysen.
- Kalibrer separasjonsområdet ved å utføre en molekylvektkalibrering.
- Sinkspesieringsanalyse ved hjelp av SEC-ICP-MS
MERK: Zn-spesieringsanalysen ved SEC-ICP-MS-metoden ble utviklet basert på prinsipper beskrevet andre steder10,11 og videre optimalisering ble utført for analyse av en atlantisk laksefôr7.- Utfør Zn-spesieringsanalysen på de løselige fraksjonene ved hjelp av en SEC-kolonne (size exclusion chromatography) og en HPLC kombinert med induktivt koblet plasmamassespektroskopi (ICP-MS).
- Forbered et HPLC-hetteglass ved å tilsette 250 μL løselig brøkdel til et hetteglass.
- Før analyse, spike alle prøvene med 0,5 μL vitamin B12. Dette trinnet gjør det mulig å korrigere for oppbevaringstider skift, overvåking 59Co.
- Fortynn den løselige fraksjonen med ekstraksjonsbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) og juster til et endelig volum på 1 ml.
- Klargjør sekvenskjøringen av prøvene i tilfeldig rekkefølge.
- Still inn ICP-MS i henhold til produsentens instruksjoner.
- Følg instrumentinnstillingene for HPLC og ICP-MS som utfører Zn-spesieringsanalysen (se tabell 1).
2. In vitro løselighet av supplert Zn i atlantisk laksefôr
MERK: Fôrprøven som ble brukt ble formulert basert på kommersiell fôr til atlantisk laks, som inneholder proteinkilder hovedsakelig fra plantebaserte ingredienser (dvs. ca. 5% fiskemel, 10% fiskeolje, 68% plantebaserte ingredienser og 12% vegetabilsk olje).
- Grind de atlantiske laksefôrprøvene i 10 s ved 3000 o/min ved hjelp av en knivmølle og oppbevar den ved 4 °C inntil videre analyse.
- Vei ~0,2 g av fôrprøvene malt i trinn 2.1 og tilsett Zn radiotracer (65Zn) kjent spesifikk aktivitet i et 5 ml volumprøverør (med hette).
FORSIKTIG: Denne prosedyren må utføres inne i en radionuklidsuite. Personen som utfører dette trinnet, bør være opplært og sertifisert til å håndtere radioisotoper. Sikkerhets- og føre-var-tiltakene som anbefales av instituttets strålesikkerhetsadministrasjon, må følges nøye. - Forbered deretter ferskvanns intestinal luminal bufferløsning som beskrevet nedenfor.
- For saltoppløsning A, vei 11,65 g NaNO3, 0,55 g KNO3 og 0,4 g MgSO4. Løs opp saltene i ultrapure H2O og juster til et endelig volum på 60 ml.
- For saltoppløsning B, vei 0,31 g Ca(NO3)2· 4 H2O. Løs opp saltene i ultrapure H2O og juster til et endelig volum på 10 ml.
- Bruk 500 mM HEPES lagerløsning som saltløsning C.
- For saltoppløsning D, vei 1,2 g MgCl2, oppløs saltet i ultrapure H2O og juster til et endelig volum på 20 ml.
- For saltoppløsning E, vei 0,9 g MgSO4, oppløs saltet i ultrapure H2O og juster til et endelig volum på 20 ml.
- Forbered pyruvatoppløsning ved å oppløse 0,55 g CH3COCOONa i 10 ml ultraren H2O.
- Løs opp 0,9 g galaktose (C6H12O6) i ultrapure H2O.
- Løs opp godt ved hjelp av en magnetisk rører og steriliser saltløsninger A, B, D og E ved autoklavering, og løsning C, pyruvat og galaktose ved filtrering gjennom et 200 μm sprøytefilter.
- Etter tilberedning av de forskjellige lagerløsningene, for å forberede 100 ml arbeidsløsning av bufferen, bland de ovennevnte forberedte løsningene i følgende andel: 6,8 ml saltoppløsning A, 4,14 ml B, 5 ml C, 2,5 ml D, 1,5 ml E og 1,14 ml hver av pyruvat og galaktose. Utgjør volumet til 100 ml ved hjelp av deionisert vann.
MERK: Bufferen ovenfor vil nå representere den ioniske sammensetningen av tarmlumenene som finnes i ferskvannslaksider.
- Forbered seks andre aliquots av bufferen beskrevet i trinn 2.6 og legg til en av følgende aminosyrer (cystein, metionin, glycin, histidin, lysin og arginin) for å nå en endelig molarkonsentrasjon på 5 mM.
- Tilsett ferskvanns intestinal lysbuffer (reaksjonsvolum = 3 ml; pH 7,4) i fôrprøven.
- Gjenta trinn 2.5 med bufferne beskrevet i 2.4 (i nærvær av forskjellige aminosyrer ved 5 mM konsentrasjon).
- Lukk rørene og la dem spinne i en roterende spinner i 30 minutter ved 25 rpm.
- Skill de oppløselige og ikke-løselige fraksjonene ved sentrifugering i 10 min ved 1157 x g.
- Bruk en gamma teller til å måle antall per minutt (cpm) på 65Zn i løselige og ikke-løselige brøker.
- Beregn andelen av radioisotoper av Zn (65Zn) som er tilstede i de oppløselige og ikke-løselige fraksjonene.
3. Evaluering av Zn kjemiske artsopptak ved hjelp av en in vitro tarmmodell (RTgutGC)
- RTgutGC celler kultur
MERK: Alle arbeidsmaterialer som brukes i dette trinnet, skal være sterile.- Gjenoppliv de frosne RTgutGC-cellene forsiktig i et vannbad satt til 20 °C.
- Rør forsiktig ut løsningen som inneholder cellene og suspendere dem i 10 ml L15-medium som inneholder 10% foster bovint serum (FBS).
MERK: 10% FBS brukes bare til å gjenopplive de frosne cellene. For etterfølgende passasje brukes FBS på 5%. Sammensetningen av FBS kan variere mellom partier, så det anbefales å kjøpe og lagre så mye som nødvendig fra en enkelt batch for å unngå variasjoner mellom partier i serumsammensetningen. - Tilsett cellesuspensjonen til 75 cm2 cellekulturflasker og inkuber i en inkubator satt til 19 °C under normal atmosfære.
- Kontroller cellene og når det er sammenfallende (80% samløp, vurder visuelt ved å undersøke tettheten av celleoverflaten under et mikroskop), del cellene til nye kolber (etterfølgende passasje) eller høst for å bruke i eksperimenter.
MERK: Et eksempel på RTgutGC-cellene 1 t og 1 uke etter sådd til cellekulturflaskene vises i figur 3.
- Cellehøsting og forberedelse til eksponeringseksperimenter
- Vask celler to ganger med 1 ml etylendiamintetraketisk syre (EDTA) oppløsning. Etter hver vask, sifon ut EDTA-oppløsningen ved hjelp av et sterilt sugerør.
- Behandle cellene med trypsin (0,7 ml trypsin, i 0,25% i fosfatbufret saltvann [PBS]).
- Roter kolben forsiktig i akutte vinkler for å spre trypsinet langs overflaten av kolben.
- Fortsett rotasjonen i 2 min, mens cellene løsner.
- Etter å ha rotert forsiktig i 2 min, tilsett 10 ml L15/ FBS-medium for å nøytralisere trypsin.
- Dekanter den resulterende cellefjæringen i et konisk nedre sentrifugerør ved hjelp av en steril pipette og sentrifuge i 3 min ved 130 x g.
- Bestem tettheten til de høstede cellene ved manuell telling ved hjelp av hemocytometer.
- Legg til ønsket volum L15/FBS medium for å oppnå en celletetthet på 5 x 104 celler/ml.
- Frø cellene på 24-brønns plater ved pipettering 1 ml celleoppheng per brønn for å oppnå den endelige celletettheten på 5 x 104 celler / brønn.
MERK: Bruk helst pipetter med flere dispenseringer for å minimere variasjon og redusere tiden. - Plasser frøplatene i en inkubator under normal atmosfære ved 19 °C i 48 timer før eksperimenter.
MERK: Trypsin skal oppbevares ved -20 °C; EDTA-oppløsning og L15/FBS-medier ved 4 °C. Juster temperaturen på alle arbeidsløsninger og medier til 19 °C like før bruk.
- Utarbeidelse av eksponeringsmedier
MERK: Dette trinnet må gjøres under avtrekkshetten under aseptiske og sterile forhold.- Forbered L15/ex ved å blande 6,8 ml saltoppløsning A (trinn 2,3,1), 1,14 ml B (trinn 2,3,2), 5 ml C (trinn 2,3,3) og 1,14 ml hver pyruvat (trinn 2.3.6) og galaktose (trinn 2.3.7). Utgjør volumet til 100 ml ved hjelp av sterilt cellekulturelt destillert vann.
- Forbered FW ved å blande 6,8 ml saltoppløsning A (2,3,1), 4,14 ml B (2,3,2), 5 ml C (2,3,3), 2,5 ml D (2,3,4), 1,5 ml E (2,3,5) og 1,14 ml hver av pyruvat (2,3,6) og galaktose (2,3,7). Utgjør volumet til 100 ml ved hjelp av sterilt, cellekulturelt destillert vann.
- Kvantifisere konsentrasjonene av ioner i eksponeringsmediet ved hjelp av ICP-MS som beskrevet andre steder12.
MERK: Ioniske konsentrasjoner analysert i medieforberedelsene er presentert i tabell 2.
- Sink(65Zn) tilstrømningsanalyser
- Frø RTgutGC-cellene på 24-brønnsplater (5 x 104 celler / brønn) i komplett L15 / FBS-medium.
- Inkuber i 48 timer i en inkubator med normal atmosfære ved 19 °C.
- Juster alle eksperimentelle mediepreparater til pH 7,4 ved hjelp av 0,5 M NaOH i nærvær eller fravær av L-metionin (L-Met) eller DL-metionin (DL-Met) ved 2 mM konsentrasjon.
MERK: pH-justeringen av bufferne som er beskrevet i 3.4.3, må gjøres på nytt før behandling av cellene i trinn 3.4.5. - Etter ferdigstillelse av inkubasjonsperioden, fjern mediet fra brønnene, og skyll grundig med PBS.
- Tilsett det pH-justerte FW eksperimentelle mediet, og la det akklimatisere i 20 minutter.
- Utsett RTgutGC-cellene for nominelle konsentrasjoner på 3,07, 6,14, 12,27 og 24,55 μM 65Zn(II) (som ZnCl2; ~4 kBq/ml) i mediet beskrevet i trinn 3.4.3.
- Umiddelbart etter, hold cellene i inkubatoren ved 19 °C i 15 minutter.
- Etter at 15 min inkubasjonen er over, aspirerer kulturen supernatant og fjerner fra brønnen.
- Skyll cellene med iskaldt FW-medium (med 200 μM Zn, pH 7.4) og deretter slukke ved å legge til 5 mM etylenglykol-bis(β-aminoetyl eter)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) buffer (pH 7.4) i 5 min, for å kvitte seg med adsorbert 65Zn(II).
- Utsett cellene for de ovennevnte mediepreparatene i nærvær eller fravær av 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptan-2-karboksylsyre (BCH), en aminosyretransporthemmer.
- Etter eksponeringsperioden på 15 min gjentar du trinn 3.4.8 og 3.4.9.
- RtgutGC-cellene vil bli festet til bunnen av brønnene som monolayer. Fordøye cellene ved hjelp av 0,2% varmt natrium dodecylsulfat (SDS) vaskemiddel (100 μL / brønn).
MERK: SDS-oppløsningen må plasseres i 1 time i et vannbad satt til 90 °C før bruk. - Aspirer og gjenopprett cellen fordøye i et 1,5 ml rør.
- Mål radioaktivitet i cellesammendragene ved hjelp av en gammateller.
MERK: Antallene per minutt (cpm) må korrigeres for radioaktivt forfall, bakgrunnsaktivitet og blir utsatt for spesifikke aktivitetsberegninger etter formelen beskrevet av Glover og Hogstrand13. - For å kvantifisere proteinkonsentrasjonen av cellene, homogeniser cellene med 500 μL 0,5 M NaOH.
- Bruk et Bradford-analysesett til å måle proteinkonsentrasjonen i celleprøven, med bovint serumalbumin (BSA) som standard.
MERK: Når proteinkonsentrasjonen er kvantifisert, kan frekvensen av Zn-opptak av RTgutGC-celler uttrykkes som pmoles Zn min-1 mg-1 protein.
4. Tilsynelatende tilgjengelighet av diett Zn i atlantisk laks (Salmo salar)
MERK: De atlantiske laksefôrene ble formulert basert på kommersielle fôr, som hovedsakelig inneholder proteinkilder fra plantebaserte ingredienser (dvs. ca. 5% fiskeprotein, 10% fiskeolje, 68% plantebasert protein og 12% planteolje). To fôr ble supplert med en uorganisk kilde (Zn-sulfat) eller en organisk kilde (Zn chelat av glycin) for å oppnå en Zn-konsentrasjon på 150 mg / kg fôr. I tillegg ble Yttriumoksid (fôrkvalitet) lagt til fôret på 0,01% som den inert markøren for å muliggjøre beregning av tilsynelatende tilgjengelighetskoeffisient.
- Akklimatiser atlantisk laks (SalmoBreed-stammen, alder 1+ år, blandede kjønnsgrupper) i sine respektive tanker til fisken er vant til de eksperimentelle forholdene.
- Vurder akklimatisering av atlantisk laks ved å overvåke deres daglige fôrinntak.
MERK: Denne studien ble utført i triplikattanker, og dermed ble totalt seks tanker brukt. Under fôringsstudien var vanntemperaturen 11,9 ± 0,3 °C og oppløst oksygenmetning var 101 ± 5 %. - Fôr fisken med eksperimentelle matvarer i 11 dager.
- Avlive fisken ved overdosering ved hjelp av 6 ml trikain metansulfonatbestandsløsning per liter vann.
- Samle en samlet prøve av avføring fra fisken fra samme tank i en tallerken ved å strippe fra ventralfinen til anus.
- Fjern avføringen fra platen med en spatel i et 50 ml konisk rør og oppbevar straks prøvene ved -20 °C.
MERK: Prøvene ble oppbevart ved -20 °C inntil videre analyse. - Frys avføringsprøvene i 72 timer ved -80 °C.
- Homogeniser manuelt avføringsprøven til et fint pulver ved hjelp av en pestle og mørtel.
- Bestem konsentrasjonen av Zn og Yttrium i fôr- og avføringsprøvene ved hjelp av en ICP-MS (som beskrevet andre steder9).
- Bestem tydelig tilgjengelighetskoeffisient (AAC, %) ved hjelp av følgende formel:
Representative Results
Evaluering av Zn kjemiske arter i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr ved hjelp av en SEC-ICP-MS-metode
SEC-ICP-MS-metoden gir data om Zn kjemiske arter som finnes i den løselige brøkdelen av atlantisk laksefôr. Figur 4 illustrerer den kromatografiske profilen til Zn som finnes i den løselige fraksjonen. Dette kromatogrammet ble oppnådd ved hjelp av SEC-ICP-MS-metoden. Fem Zn med topper ble funnet i de løselige fraksjonene av atlantisk laksefôr. Hver topp har forskjellig molekylvekt; topp en (~ 600 kDa), topp to og topp tre (fra 32 til 17 kDa), topp fire (fra 17 til 1,36 kDa) og topp fem (> 1,36 kDa). Topp fire var den mest tallrike, etterfulgt av topp to, tre, fem og en, henholdsvis. Zn kjemiske arter som finnes i den oppløselige fraksjonen kan ha forskjellige kilder fordi fôret som brukes inneholder både marine- og plantebaserte ingredienser, og supplert form (dvs. Zn sulfat). Molekylvektområdet til Zn kjemiske arter antydet at disse forbindelsene kan være metalloproteiner.
In vitro løselighet av supplert Zn i atlantisk laksefôr
Løseligheten av supplert 65Zn økte i nærvær av aminosyrer. Alle de testede aminosyrene økte løseligheten til supplert 65Sn. Metionin, glycin, cystein, histidin og lysin forbedret 65Sn løselighet; høyere løselighet ble funnet med histidin og lysin (Figur 5).
Evaluering av Zn-artsopptak ved hjelp av en in vitro tarmmodell (RTgutGC)
Apikalt sinkopptak i RTgutGC-celler ble signifikant påvirket av tilstedeværelsen av L-Met eller DL-Met ved 2 mM konsentrasjoner. Videre ble virkningen av metionin på Sn-opptak i RTgutGC-celler negativt påvirket av tilstedeværelsen av BCH (en aminosyretransportsystemblokker), sammenlignet med celler ubehandlet med BCH (figur 6).
Tilsynelatende tilgjengelighet av diett Zn i atlantisk laks (Salmo salar)
I praktiske fôr til atlantisk laks var tilsynelatende Zn-tilgjengelighet det samme ved supplering med en uorganisk kilde (Zn-sulfat) eller en organisk kilde (Zn chelat av glycin). De estimerte verdiene for tilsynelatende tilgjengelighet av Zn (%, n = 3) hos atlantisk laks var 31% ± 12% ved supplering med en uorganisk kilde (Zn sulfat) og 31% ± 3% ved tilskudd av en organisk kilde (Zn chelat av glycin).
Figur 1: En oppsummering av den systematiske tilnærmingen for å vurdere mineraltilgjengelighet ved hjelp av komplementære metoder. Denne tilnærmingen ble brukt til å studere sinktilgjengelighet i atlantisk laks, inkludert Zn-spesiering, Zn-løselighet i tarmmiljø, Zn-opptak ved tarmceller og Zn tilsynelatende tilgjengelighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et sammendrag av prosedyren for Zn-ekstraksjon fra en fôrprøve. Sink ekstraheres fra en fôrprøve ved hjelp av milde ekstraksjonsforhold. Utvinningen etterfølges av Zn-spesieringsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et eksempel på RTgutGC-cellene 1 t (venstre) og 1 uke (høyre) etter sådd i cellekulturflaskene.
Figur 4: Et kromatogram som viser de Zn-inneholdende toppene fra den løselige brøkdelen av atlantisk laksefôr og analysert av SEC-ICP-MS. De tre replikkene er preget av de blå, røde og svarte linjene. En molekylvektkalibrering ble utført ved hjelp av tyroglobulin (660 kDa, overvåking 127I), Zn / Cu superoksid dismutase (32 kDa, overvåking 66Zn), myoglobin (17 kDa, overvåking 57Fe), vitamin B12 (1,36 kDa, overvåking 59Co); Topp 1 (P1): ~600 kDa, oppbevaringstid (RT) 8,2 min; Topp 2+3 (P2+3): fra 32 til 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Topp 4 (P4): fra 17 til 1,36 kDa, RT 16,3 min; Peak 5 (P5): > 1.36 kDa, Rt 23.2 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Virkningen av aminosyrer på in vitro løseligheten av supplert Zn i atlantisk laksefôr. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD (n = 3). Data ble analysert gjennom enveis ANOVA, etterfulgt av Dunnets multipareringstest, og sammenlignet gjennomsnittet av hver AA-gruppe med kontrollgruppen (Ingen AA). Stjernene angir signifikansnivået for ANOVA (P-verdier < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) og < 0,0001 (****)). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Påvirkningen av metionin og en aminosyretransporthemmer (2-Aminobicyclo [2.2.1] heptan-2-karboksylsyre, BCH, 10 mM). Data presenteres som gjennomsnittlig ± SD (n = 3). Data ble analysert gjennom toveis ANOVA, etterfulgt av Tukeys multippel sammenligningstest med p < 0,05 nivå av betydning. Post hoc-forskjeller mellom grupper representeres som hevet skrift over stolpene. stolper med forskjellige hevet skrift er statistisk forskjellige (p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| HPLC-innstillinger | |
| Kolonne | SEC-kolonne (30 cm x 7,8 mm, 5 μm partikkelstørrelse) + beskyttelseskolonne (7 μm partikkelstørrelse) |
| Kalibreringsområde | 1,0 × 104 - 5,0 × 105 Da |
| Mobil fase | 50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5) |
| Strømningshastighet | 0,7 ml min−1 |
| Injeksjonsvolum | 50 μL |
| ICP–MS-innstillinger | |
| Fremre kraft | 1550 W |
| Plasmagass strømning | 15,0 l min−1 |
| Gassstrøm for bærer | 0,86 l min−1 |
| Makeup gass strømning | 0,34 l min−1 |
| Oppholdstid | 0,1 s per isotop |
| Isotoper overvåket | 127 Jeg, 66Zn, 59Co, 57Fe |
Tabell 1. En oversikt over instrumentinnstillinger for HPLC og ICP-MS.
| Kjemisk sammensetning (mM) | L15/ex | Eksperimentelt medium (L15/FW) |
| Natriumnitrat | 155 | 155 |
| Kaliumnitrat | 6.2 | 6.2 |
| Magnesiumsulfat | 3.8 | 19.5 |
| Kalsiumnitrat | 1.5 | 5.4 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Magnesiumklorid | - | 15 |
| Natrium pyruvat | 5.7 | 5.7 |
| Galaktose | 5.7 | 5.7 |
| Ph | 7.1 | 7.4 |
| Ionisk styrke | 178 | 258 |
| Ionisk sammensetning (mM) | ||
| Kalsium, Ca2+ * | 1.6 ± 0.1 | 5.3 ± 0,2 |
| Magnesium, Mg2+ * | 3.9 ± 0,3 | 32.5 ± 0,7 |
| Kalium, K+ * | 8.2 ± 1.2 | 8.6 ± 1.1 |
| Natrium, Na+ * | 160 ± 3 | 157 ± 2 |
| Nitrat, NO3- ** | 164 | 172.4 |
| Sulfat, SO4- ** | 3.8 | 18.7 |
| Klorid, cl- ** | 1.5 | 31.5 |
Tabell 2. Den kjemiske og ioniske sammensetningen av eksperimentelle medier testet.
Discussion
Tarmabsorpsjonen av Zn ser ut til å være påvirket av den kjemiske formen til Zn-artene13. I denne forbindelse tillot bruken av protokollene beskrevet i denne artikkelen den sekvensielt studiet av de kjemiske og biologiske aspektene som ligger til grunn for "tilgjengeligheten" av Zn i atlantisk laks.
Denne studien rapporterte bruk av en Zn-spesieringsanalysemetode. SEC-ICP-MS-metoden ga kvalitative data om molekylvekten til Zn kjemiske arter tilstede i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr. Dette ble oppnådd ved sammenligning av oppbevaringstidene for molekylvektkalibreringsstandardene (dvs. tyroglobulin (660 kDa), Zn / Cu superoksid dismutase (32 kDa), myoglobin (17 kDa) og vitamin B12 (1,36 kDa)) med oppbevaringstidene til Zn som inneholder topper. En utfordring som ble funnet i Zn-spesieringsanalysen var identifiseringen av de ukjente Zn-kjemiske artene på grunn av mangel på analytiske standarder. I SEC er separasjonen av molekylene basert på deres størrelser i forhold til porene i den stasjonære fasen. I prinsippet vil større molekyler reise raskere, eluting først, og mindre molekyler vil reise langsommere, eluting senere14. Følgelig kan hver Zn som inneholder topp inneholde flere forbindelser med lignendemolekylvekt 15. Dette bidrar også til utfordringen med å identifisere ukjente Zn kjemiske arter. Videre ble flere milde utvinningsforhold testet for utvinning av Zn. Den ekstraherte Zn var lav (~ 10%). Milde utvinningsforhold ble brukt for å holde Zn kjemiske arter intakte, men dette kan ha kompromittert utvinningseffektiviteten7.
I in vitro løselighetsanalysen indikerte løseligheten til supplert Zn (som radioisotop 65ZnCl2) at aminosyrene, spesielt histidin og lysin, økte oppløseligheten til Zn (figur 5). Bruk av fôrprøver direkte for in vitro løselighetsanalyser under simulerte gastrointestinale tilstander er basert på kunnskapen om at endring i Zn-spesiering er pH-avhengig16. Sure forhold i begynnelsen av GI-kanalen kan imidlertid føre til en viss endring i spesieringen som kan være irreversibel (f.eks. ZnO -> ZnCl2, i nærvær av HCl under sure forhold i magen). Likevel er Zn-kilden som brukes her ZnSO4 og løseligheten som ble forbedret av aminosyrer i mediet. Det neste spørsmålet som skulle besvares var, kan den økte løseligheten oversettes til tilgjengelighet? RTgutGC tarmcellelinjen ble brukt til å studere dette spørsmålet. I sammenheng med mineralernæring hos dyr er begrepet "tilgjengelighet" vanskelig å definere og kan reguleres differensialt i cellene (in vitro) sammenlignet med et dyr (in vivo). Derfor ble begrepet 'opptak' brukt når det gjaldt in vitro-evalueringen ved hjelp av tarmcellelinjen. Cellelinjen ga nyttig informasjon om Zn-opptaksmekanismene ved tarmepitelet som er en del av den komplekse regulatoriske prosessen som styrer mineraltilgjengelighet hos dyr. RTgutGC-cellene fremkalte en bedre kapasitet for apikalt opptak av Sn i nærvær av en aminosyre (dvs. metionin; Figur 6). Den tilsynelatende tilgjengeligheten i vivo var imidlertid ikke signifikant forskjellig mellom uorganiske og organiske Zn-kilder i atlantisk laks. I in vivo tilgjengelighetsstudien ble Zn-kildesammenligningen gjort på diett Zn-nivåer som godt overgikk de kjente Zn-kravene til atlantisk laks17, total Zn-konsentrasjon på 150 mg / kg fôr. Forskjellene i tilgjengelighet visualiseres bedre når de testede diettnivåene faller i det lineære dynamiske området før dyret når metning. I den nåværende in vivo-studien er det mulig at atlantisk laks var godt mettet for å observere forskjell i Zn-absorpsjon mellom brukte kilder.
Oppsummert ga den første metoden kvalitativ informasjon om forskjellige Zn kjemiske arter som finnes i den oppløselige brøkdelen av en atlantisk laksefôr; Den andre metoden, in vitro løselighet av supplert Zn ble forbedret i nærvær av aminosyre ligander; den tredje metoden bekreftet at forbedret løselighet av aminosyrer kan forbedre opptaket ved intestinal epitel; På den annen side klarte ikke den fjerde metoden å finne forskjeller i tilgjengeligheten av Zn fra uorganisk eller organisk kilde til atlantisk laks. For å konkludere, men ikke i tråd med in vivo-funnene, ga in vitro-protokollene interessant innsikt i å forstå de forskjellige komponentene i Zn-tilgjengeligheten.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble utført under prosjektet APREMIA (Tilsynelatende tilgjengelighet og krav til mineraler i atlantisk laks, tilskudd nr. 244490) finansiert av Norges forskningsråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
| 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| 10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
| 1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
| 24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
| 2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
| DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
| D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
| Experimental fish feeds | Skretting | ||
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
| L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
| HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
| Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
| Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
| L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
| L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
| Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
| Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
| Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
| Pasteur pipette | VWR | ||
| pH meter | inoLab | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
| RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
| SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
| Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm) | Retsch | ||
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
| Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
| Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
| Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
| Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
| Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
| Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
| Zinc sulphate | Vilomix |
References
- Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
- Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
- Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).
- Hogstrand, C. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).
- Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
- Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
- Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
- Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
- Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
- Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
- Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
- Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
- Ekman, R. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).
