Summary
इस लेख में विस्तार से अटलांटिक सामन में सूक्ष्म खनिज उपलब्धता का आकलन करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण बताते हैं । पद्धति में बढ़ती जैविक जटिलता के साथ उपकरण और मॉडल शामिल हैं: (1) रासायनिक विशिष्टता विश्लेषण, (2) इन विट्रो घुलनशीलता, (3) सेल लाइनों में तेज अध्ययन, और (4) वीवो मछली अध्ययन में।
Abstract
आहार सूक्ष्म खनिजों की उपलब्धता का आकलन मछली प्रजातियों के खनिज पोषण में एक बड़ी चुनौती है। वर्तमान लेख का उद्देश्य अटलांटिक सामन(साल्मो सालार)में जिंक (जेडएन) की उपलब्धता का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों के संयोजन के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करना है। यह देखते हुए कि कई Zn रासायनिक प्रजातियों एक अटलांटिक सामन फ़ीड में मौजूद हो सकता है, यह परिकल्पना की गई थी कि Zn उपलब्धता फ़ीड में मौजूद Zn रासायनिक प्रजातियों से प्रभावित है । इस प्रकार, इस अध्ययन में, पहला प्रोटोकॉल इस बारे में है कि विभिन्न जेडएन रासायनिक प्रजातियों को फ़ीड से कैसे निकाला जाए और आकार के बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी-प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसईसी-आईसीपी-एमएस) विधि से उनका विश्लेषण किया जाए। इसके बाद, अटलांटिक सामन फीड में आहार जेडएन की घुलनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो विधि विकसित की गई थी। तीसरा प्रोटोकॉल इंद्रधनुष ट्राउट आंत सेल लाइन (आरटगुटजीसी) का उपयोग करके मछली आंतों के एपिथेलियल मॉडल में जेडएन रासायनिक प्रजातियों की संरचना को बदलने के प्रभाव का अध्ययन करने की विधि का वर्णन करता है। एक साथ, इन विट्रो तरीकों से निष्कर्षों की तुलना वीवो अध्ययन में अटलांटिक सामन फीड के पूरक जेडएन के अकार्बनिक और कार्बनिक स्रोतों की स्पष्ट उपलब्धता की जांच के साथ की गई थी । परिणामों से पता चला है कि कई Zn रासायनिक प्रजातियों फ़ीड में पाया जा सकता है और एक कार्बनिक Zn स्रोत की दक्षता अमीनो एसिड ligand के लिए chelate Zn इस्तेमाल पर बहुत ज्यादा निर्भर करता है । इन विट्रो विधियों के निष्कर्षों का वीवो अध्ययन में उस परिणाम से कम संबंध था । फिर भी, इस लेख में वर्णित इन विट्रो प्रोटोकॉल ने जेडएन उपलब्धता और मछली फ़ीड में इसके आकलन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की।
Introduction
मछली भोजन और मछली के तेल पारंपरिक रूप से अटलांटिक सामन फ़ीड में इस्तेमाल किया गया । हालांकि, इन अवयवों को तेजी से पौधे आधारित सामग्री द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा है1। फीड कंपोजीशन में उपरोक्त बदलाव के परिणामस्वरूप आहार की कम उपलब्धता हुई है और अटलांटिक सामन फीड, विशेष रूप से जिंक (जेडएन)2में खनिज उपलब्धता में सुधार की आवश्यकता बढ़ गई है। कम उपलब्धता जेडएन स्तर, जेडएन रासायनिक प्रजातियों या/और आहार मैट्रिक्स में मौजूद कुपोषण कारकों में बदलाव का परिणाम हो सकता है । इस परिदृश्य में, सामान्य रूप से 'कार्बनिक स्रोतों' के रूप में विचार किए जाने वाले एडिटिव्स की एक नई सरणी मछली के लिए आहार खनिजों का एक बेहतर उपलब्ध स्रोत होने की क्षमता के साथ उभरी है। इसलिए, खनिजों की उपलब्धता और मछली के लिए उनके स्रोतों को नियंत्रित करने वाले मौलिक रसायन विज्ञान और शरीर विज्ञान को समझना महत्वपूर्ण है। जिंक सभी जीवों के लिए एक आवश्यक अनु ट्रेस तत्व है3. सिग्नलिंग अणु के रूप में जेडएन की भूमिका का वर्णन मछली4में पैरासेलुलर और इंट्रासेलुलर दोनों स्तर पर किया गया है । अटलांटिक सामन में, जेडएन की कमी कंकाल असामान्यताओं और विभिन्न जेडएन धातुविज्ञान5,6की कम गतिविधि से जुड़ी हुई है।
यह अध्ययन विभिन्न रासायनिक और जैविक जटिलता के चार विभिन्न डिब्बों में वर्गीकृत करके जेडएन उपलब्धता को समझने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करता है। इसमें शामिल तरीकों को चार खंडों में वर्णित किया गया है, जैसा कि चित्र 1 में देखा जा सकता है:(1) एक अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश में Zn रासायनिक प्रजातियों का मूल्यांकन एक आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके-प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसईसी-आईसीपी-एमएस) विधि7; (2) अटलांटिक सामन फ़ीड में पूरक Zn की विट्रो घुलनशीलता; (3) मूल्यांकन Zn रासायनिक प्रजातियों में विट्रो आंतों मॉडल (RTgutGC)8द्वारा तेज; और (4) अटलांटिक सामन(साल्मो सालार)9में Zn की स्पष्ट उपलब्धता । इसी तरह के प्रोटोकॉल जलकृषि मछली प्रजातियों के लिए पोषण हित के अन्य खनिजों (जैसे, मैंगनीज, सेलेनियम, तांबा) के लिए विकसित किए जा सकते हैं।
Protocol
धारा 4 में खिला परीक्षण नार्वे (के लिए-2015-06-18-761) और यूरोपीय कानून (निर्देश 2010/63/EU) के अनुसार किया गया था ।
1. एक अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश में Zn रासायनिक प्रजातियों का मूल्यांकन एक सेकंड-आईसीपी-एमएस विधि का उपयोग कर
- निष्कर्षण बफर (100 mM Tris-HCl, पीएच 8.5)
- अल्ट्रापुरे एच2ओ में वांछित आयनिक ताकत (100 एमएम) तक पहुंचने के लिए ट्राइस (हाइड्रोक्सीमेथिल) अमीनोमेथेन की उचित मात्रा को भंग करके निष्कर्षण बफर तैयार करें।
- पीएच मीटर के साथ पीएच परिवर्तन की निगरानी, एचसीएल समाधान के साथ पीएच 8.5 के समाधान के पीएच समायोजित करें।
- फीड सैंपल तैयार करना
नोट: इस्तेमाल किया फ़ीड नमूना अटलांटिक सामन के लिए वाणिज्यिक फ़ीड के आधार पर तैयार किया गया था, मुख्य रूप से संयंत्र आधारित सामग्री से प्रोटीन स्रोतों युक्त (यानी, लगभग 5% मछली प्रोटीन, 10% मछली का तेल, ६८% संयंत्र आधारित प्रोटीन और 12% संयंत्र आधारित तेल) । जिंक सल्फेट को फीड में सप्लीमेंट किया गया ।- मूसल और मोर्टार का उपयोग करके फ़ीड नमूना को हाथ से पीस लें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए फ़ीड नमूने को छलनी करें कि निष्कर्षण समान कण आकार (850 माइक्रोन से 1.12 मिमी) के साथ फ़ीड अंश में किया जाता है।
- जेडएन निष्कर्षण करने के लिए आगे बढ़ें।
- एक फ़ीड नमूने से जिंक निष्कर्षण
- 15 एमएल शंकु नलियों में ट्रिपलीकेट में लगभग 0.5 ग्राम फ़ीड का वजन करें।
- नमूनों में निष्कर्षण बफर (100 एमएल ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.5 का 5 एमएल) जोड़ें।
- 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर (20 आरपीएम) में नमूनों को निकालें।
- 3000 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए अपकेंद्री द्वारा घुलनशील और गैर-घुलनशील अंशों को अलग करें।
- घुलनशील अंश को फ़िल्टर करने के लिए 0.45 माइक्रोन डिस्पोजेबल सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करें।
- फ़िल्टर किए गए नमूनों को साफ ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
- एसईसी-आईसीपी-एमएस का उपयोग करके घुलनशील अंशों में जेडएन विशिष्टता विश्लेषण करें, जैसा कि चरण 1.6 में वर्णित है।
नोट: एक फ़ीड नमूने से Zn निष्कर्षण के लिए प्रक्रिया का सारांश चित्रा 2में वर्णित है ।
- मोबाइल चरण समाधान (50 m Tris-HCl + 3% MeOH, पीएच 7.5)
- 3% MeOH समाधान (v/v) के 1 एल में 6.057 ग्राम ट्रिज़ (हाइड्रोक्सीमेथाइल) अमीनोमेथेन को भंग करने वाले मोबाइल चरण समाधान तैयार करें।
- पीएच मीटर के साथ पीएच परिवर्तन की निगरानी करते हुए, एचसीएल समाधान के साथ पीएच टू 7.5 के समाधान के पीएच को समायोजित करें।
- 0.45 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से मोबाइल चरण समाधान फ़िल्टर करें।
- एसईसी कॉलम सेपरेशन रेंज का आणविक वजन अंशांकन
- आणविक वजन अंशांकन करके सेपरेशन रेंज को कैलिब्रेट करें।
नोट: इस अध्ययन में थायरोग्लोबुलिन (660 केडीए), जेडएन/सीयू सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटेज (32 केडीए), मायोग्लोबिन (17 केडीए) और विटामिन बी 12 (1.36 केडीए) का उपयोग किया गया था। - अल्ट्रापुरे एच2ओ में एक ज्ञात एकाग्रता के साथ प्रत्येक मानक तैयार करें।
- एक शीशी में मानक के 250 माइक्रोन जोड़कर एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) शीशी तैयार करें।
- नमूनों के अनुक्रम चलाने के लिए मानकों के साथ शीशियों लोड।
- शुरुआत में और विश्लेषणात्मक अनुक्रम के अंत में आणविक वजन अंशांकन चलाएं, निगरानी 127I (थायरोग्लोबुलिन), 66ज़ेन (जेडएन/सीयू सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटेज), 57एफई (मायोग्लोबिन) और 59कंपनी (विटामिन बी 12)।
नोट: आणविक वजन अंशांकन एक साथ Zn विशिष्टता विश्लेषण के साथ किया जाता है।
- आणविक वजन अंशांकन करके सेपरेशन रेंज को कैलिब्रेट करें।
- एसईसी-आईसीपी-एमएस का उपयोग करके जिंक स्पेसाइजेशन विश्लेषण
नोट: एसईसी-आईसीपी-एमएस विधि द्वारा जेडएन विशिष्टता विश्लेषण10, 11 और अटलांटिक सामन फीड7के विश्लेषण के लिए आगे अनुकूलन के लिए वर्णित सिद्धांतों के आधार पर विकसित किया गया था।- आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) कॉलम और एचपीएलसी का उपयोग करके घुलनशील अंशों पर जेडएन विशिष्टता विश्लेषण करें, जिसमें प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-एमएस) शामिल हैं।
- एक शीशी में घुलनशील अंश के 250 माइक्रोन जोड़कर एचपीएलसी शीशी तैयार करें।
- विश्लेषण से पहले, विटामिन बी 12 के 0.5 माइक्रोन के साथ सभी नमूनों को स्पाइक करें। यह कदम प्रतिधारण समय बदलाव के लिए सही करने की अनुमति देता है, ५९कंपनी की निगरानी ।
- निष्कर्षण बफर (100 mM Tris-HCl, पीएच 8.5) के साथ घुलनशील अंश को पतला करें और 1 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
- नमूनों के अनुक्रम रन को यादृच्छिक क्रम में तैयार करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार आईसीपी-एमएस ट्यून करें।
- एचपीएलसी और आईसीपी-एमएस के लिए इंस्ट्रूमेंट सेटिंग्स का पालन करें जो जेडएन स्पेसिफिकेशन एनालिसिस करते हैं (टेबल 1देखें)।
2. अटलांटिक सामन फ़ीड में पूरक Zn की विट्रो घुलनशीलता में
नोट: इस्तेमाल किया फ़ीड नमूना अटलांटिक सामन के लिए वाणिज्यिक फ़ीड के आधार पर तैयार किया गया था, मुख्य रूप से संयंत्र आधारित सामग्री से प्रोटीन स्रोतों युक्त (यानी, लगभग 5% मछली भोजन, 10% मछली का तेल, ६८% संयंत्र आधारित सामग्री और 12% वनस्पति तेल) ।
- एक चाकू मिल का उपयोग कर 3000 आरपीएम पर 10 एस के लिए अटलांटिक सामन फ़ीड नमूनों पीसें और आगे के विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- चरण 2.1 में फ़ीड नमूनों के जमीन के ~ 0.2 ग्राम वजन और एक 5 एमएल वॉल्यूम नमूना ट्यूब (एक टोपी के साथ) में ज्ञात विशिष्ट गतिविधि के Zn रेडियोट्रेसर(65Zn) जोड़ें।
सावधानी: यह प्रक्रिया एक रेडियोन्यूक्लाइड सुइट के अंदर की जानी चाहिए। इस चरण को करने वाले व्यक्ति को रेडियो आइसोटोप को संभालने के लिए प्रशिक्षित और प्रमाणित किया जाना चाहिए। संस्थान के विकिरण सुरक्षा प्रशासन द्वारा सलाह दिए गए सुरक्षा और एहतियाती उपायों का कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए । - फिर नीचे वर्णित मीठे पानी आंतों के चमकदार बफर समाधान तैयार करें।
- नमक समाधान ए के लिए, एनएओ 3 के11.65ग्राम, केनो 3 के 0.55 ग्राम और एमजीएसओ4 के 0.4 ग्राम वजन। अल्ट्रापुरे एच2ओ में लवण को भंग करें और 60 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
- नमक समाधान बी के लिए, सीए (NO 3)2के0.31ग्राम वजन · 4 एच2ओ अल्ट्रापुरे एच2ओ में लवण को भंग करें और 10 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
- नमक समाधान सी के रूप में 500 mM HEPES स्टॉक समाधान का प्रयोग करें।
- नमक समाधान डी के लिए, एमजीसीएल 2 के1.2ग्राम वजन, अल्ट्रापुरे एच2ओ में नमक को भंग करें और 20 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
- नमक समाधान ई के लिए, 0.9 ग्राम एमजीएसओ4का वजन करें, अल्ट्रापुरे एच2ओ में नमक को भंग करें और 20 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
- अल्ट्रापुरे एच2ओ के 10 एमएल में सीएच3कोकूना के 0.55 ग्राम को भंग करके पायरुवेट समाधान तैयार करें।
- अल्ट्रापुरे एच 2 ओ में0.9ग्राम गैलेक्टोज (सी 6 एच12ओ6)को भंग करें।
- एक चुंबकीय उभारक का उपयोग करके अच्छी तरह से भंग करें और 200 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से छानने से नमक समाधान ए, बी, डी और ई को ऑटोक्लेविंग, और समाधान सी, पाइरुवेट और गैलेक्टोज द्वारा स्टरलाइज करें।
- विभिन्न स्टॉक समाधानों को तैयार करने के बाद, बफर के कार्य समाधान के 100 एमएल तैयार करने के लिए, उपरोक्त तैयार समाधानों को निम्नलिखित अनुपात में मिलाएं: नमक समाधान ए के 6.8 एमएल, बी के 4.14 एमएल, सी के 5 एमएल, डी के 2.5 एमएल, ई के 1.5 एमएल, और 1.14 मिलियन एल. डिएकोनाइज्ड पानी का उपयोग करके वॉल्यूम को 100 एमएल तक बनाएं।
नोट: उपरोक्त बफर अब मीठे पानी के साल्मोनिड्स में पाए जाने वाले आंतों के ल्यूमेन की आयनिक संरचना का प्रतिनिधित्व करेगा।
- चरण 2.6 में वर्णित बफर के छह अन्य एलिकोट तैयार करें और 5 एमएम की अंतिम मोलर एकाग्रता तक पहुंचने के लिए निम्नलिखित अमीनो एसिड (सिस्टीन, मेथियोनिन, ग्लाइसिन, हिस्टीडीन, lysine और आर्जिनिन) में से एक जोड़ें।
- फ़ीड नमूने में मीठे पानी की आंतों के चमकदार बफर (प्रतिक्रिया मात्रा = 3 एमएल; पीएच 7.4) जोड़ें।
- 2.4 में वर्णित बफ़र्स के साथ चरण 2.5 दोहराएं (5 एमएम एकाग्रता पर विभिन्न अमीनो एसिड की उपस्थिति में)।
- ट्यूबों को बंद करें और उन्हें 25 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए एक रोटरी स्पिनर में स्पिन करने की अनुमति दें।
- घुलनशील और गैर-घुलनशील अंशों को 1157 x gपर 10 मिनट के लिए अपकेंद्री द्वारा अलग करें।
- घुलनशील और गैर-घुलनशील अंशों में 65जेडएन के प्रति मिनट (सीपीएम) की गिनती को मापने के लिए गामा टेलर का उपयोग करें।
- घुलनशील और गैर-घुलनशील अंशों में मौजूद जेडएन(65जेडएन) के रेडियो आइसोटोप के अनुपात की गणना करें।
3. Zn रासायनिक प्रजातियों का मूल्यांकन एक इन विट्रो आंतों मॉडल (RTgutGC) का उपयोग कर तेज
- RTgutGC कोशिकाओं संस्कृति
नोट: इस चरण में उपयोग की जाने वाली सभी कामकाजी सामग्री बाँझ होनी चाहिए।- 20 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में जमे हुए आरटगुटजीसी कोशिकाओं को धीरे से पुनर्जीवित करें।
- धीरे-धीरे कोशिकाओं वाले समाधान को पिपेट करें और उन्हें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) वाले एल15 माध्यम के 10 एमएल में निलंबित करें।
नोट: 10% एफबीएस का उपयोग केवल जमे हुए कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के लिए किया जाता है। बाद के मार्ग के लिए, एफबीएस का उपयोग 5% पर किया जाता है। एफबीएस की संरचना बैचों के बीच भिन्न हो सकती है, इसलिए सीरम संरचना में अंतर-बैच विविधताओं से बचने के लिए एक बैच से जितना आवश्यक है उतना खरीदने और स्टॉक करने की सलाह दी जाती है। - सामान्य वातावरण के तहत 19 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर सेट में 75 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क और इनक्यूबेट में सेल सस्पेंशन जोड़ें।
- कोशिकाओं की जांच करें और जब कॉन्फ्ल्यूरेंट (80% संगम, एक माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिका की सतह के घनत्व की जांच करके नेत्रहीन का आकलन करें), कोशिकाओं को नए फ्लास्क (बाद में पारित होने) या प्रयोगों में उपयोग करने के लिए फसल में विभाजित करें।
नोट: आरटगुटजीसी कोशिकाओं का एक उदाहरण 1 एच और 1 सप्ताह के बाद सेल संस्कृति फ्लास्क को सीडिंग चित्रा 3में दिखाया गया है ।
- सेल फसल और एक्सपोजर प्रयोगों के लिए तैयारी
- कोशिकाओं को 1 एमएल एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक धोने के बाद, एक बाँझ सक्शन ट्यूब का उपयोग करके EDTA समाधान को बाहर निकालें।
- फास्फेट-बफर खारा [पीबीएस]में 0.25% में ट्रिप्पसिन (ट्राइप्सिन के 0.7 एमएल) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
- फ्लास्क की सतह के साथ ट्राइप्सिन फैलाने के लिए तीव्र कोणों पर फ्लास्क को धीरे-धीरे घुमाएं।
- 2 मिनट के लिए रोटेशन जारी रखें, जबकि कोशिकाओं अलग।
- धीरे से 2 मिनट के लिए घूर्णन के बाद, trypsin बेअसर करने के लिए L15/FBS माध्यम के 10 ml जोड़ें ।
- परिणामस्वरूप कोशिका निलंबन को एक शंकु नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक बाँझ पिपेट और 130 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र का उपयोग करके।
- हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मैनुअल गिनती द्वारा काटी गई कोशिकाओं के घनत्व का निर्धारण करें।
- 5 x 104 कोशिकाओं/एमएल की कोशिका घनत्व प्राप्त करने के लिए L15/FBS माध्यम की आवश्यक मात्रा जोड़ें ।
- 5 x 10 4 कोशिकाओं के अंतिम सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए प्रति अच्छी तरह सेल निलंबन के 1 मिलीएल को पाइपिंग करके24-अच्छी प्लेटों पर कोशिकाओं को बीज करें।
नोट: अधिमानतः भिन्नता को कम करने और समय को कम करने के लिए बहु-वितरण पिपेट का उपयोग करें। - प्रयोगों से पहले 48 घंटे के लिए सामान्य वायुमंडल के तहत एक इनक्यूबेटर में वरीयता प्राप्त प्लेटों को 19 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: ट्रिप्सिन को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाएगा; EDTA समाधान और L15/FBS मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर । उपयोग से ठीक पहले सभी कामकाजी समाधानों और मीडिया के तापमान को 19 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें।
- एक्सपोजर मीडिया की तैयारी
नोट: यह कदम एसेप्टिक और बाँझ परिस्थितियों में धुएं हुड के तहत किया जाना है ।- नमक समाधान ए (चरण 2.3.1), बी के 1.14 एमएल (चरण 2.3.2), 5 एमएल के 6.8 एमएल को मिलाकर L15/ex तैयार करें सी (चरण 2.3.3), और 1.14 एमएल प्रत्येक पायरुवेट (चरण 2.3.6) और गैलेक्टोज (चरण 2.3.7) का। बाँझ सेल संस्कृति ग्रेड आसुत पानी का उपयोग कर 100 एमएल करने के लिए मात्रा बनाओ।
- नमक समाधान ए (2.3.1), बी के 4.14 एमएल (2.3.2), सी के 5 एमएल (2.3.3), 2.5 एमएल के मिश्रण से एफडब्ल्यू तैयार करें डी (2.3.4), ई के 1.5 एमएल (2.3.5), और 1.14 मिलील प्रत्येक पायरुवेट (2.3.6) और गैलेक्टोस (2.3.7)। बाँझ, सेल संस्कृति ग्रेड आसुत पानी का उपयोग कर 100 एमएल करने के लिए मात्रा बनाओ।
- आईसीपी-एमएस का उपयोग करके एक्सपोजर मीडिया में आयनों की सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें जैसा कि कहीं और12वर्णित है ।
नोट: मीडिया की तैयारियों में विश्लेषण आयनिक सांद्रता तालिका 2में प्रस्तुत कर रहे हैं ।
- जिंक(65Zn) बाढ़ परख
- पूर्ण L15/FBS माध्यम में 24-अच्छी प्लेटों (5 x 10 4 कोशिकाओं/अच्छीतरह से) पर RTgutGC कोशिकाओं बीज ।
- 19 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य वातावरण के साथ एक इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
- 2 एमएम एकाग्रता पर एल-मेथियोनिन (एल-मेट) या डीएल-मेथियोनाइन (डीएल-मेट) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 0.5 एम नाओएच का उपयोग करके पीएच 7.4 के लिए सभी प्रयोगात्मक मीडिया तैयारी को समायोजित करें।
नोट: 3.4.3 में वर्णित बफ़र्स के पीएच समायोजन को चरण 3.4.5 में कोशिकाओं के उपचार से पहले हौसले से किया जाना चाहिए। - इनक्यूबेशन अवधि के पूरा होने के बाद, कुएं से माध्यम को हटा दें, और पीबीएस के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें।
- पीएच-समायोजित एफडब्ल्यू प्रायोगिक मीडिया जोड़ें, और 20 मिनट के लिए अनुकूलित करने की अनुमति दें।
- 3.4.3 में वर्णित मीडिया में 3.07, 6.14, 12.27 और 24.55 μM 65Zn (II) (ZnCl2;~ 4 kBq/l) की नाममात्र सांद्रता के लिए RTgutGC कोशिकाओं का पर्दाफाश करें।
- इसके तुरंत बाद, कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए 19 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- 15 मिनट इनक्यूबेशन खत्म होने के बाद, संस्कृति सुपरनेट को एस्पिरेट करें और कुएं से हटा दें।
- बर्फ ठंड FW माध्यम के साथ कोशिकाओं कुल्ला (200 μM Zn के साथ, पीएच 7.4) और फिर 5 mm एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-अमीनोएथिल ईथर)-एन, एन, एन,एन', N'-tetraacetic एसिड (EGTA) बफर (पीएच 7.4) 5 मिनट के लिए जोड़कर बुझाएं, किसी भी adsorbed 65Zn (II) से छुटकारा पाने के लिए।
- 10 mm 2-Aminobicyclo [2.2.1] हेप्टेन-2-कार्बोक्सिलिक एसिड (बीसीएच), एक अमीनो एसिड परिवहन अवरोधक की उपस्थिति या अनुपस्थिति में उपरोक्त मीडिया की तैयारी के लिए कोशिकाओं का पर्दाफाश करें।
- 15 मिनट की एक्सपोजर अवधि के बाद, 3.4.8 और 3.4.9 चरणों को दोहराएं।
- आरटीजीजीसी कोशिकाओं को मोनोलेयर के रूप में कुओं के नीचे का पालन किया जाएगा। 0.2% गर्म सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट (एसडीएस) डिटर्जेंट (100 μL/well) का उपयोग करके कोशिकाओं को पचाएं।
नोट: एसडीएस समाधान को उपयोग करने से पहले 90 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान सेट में 1 घंटे के लिए रखा जाना चाहिए। - एस्पिरेट और कोशिका को 1.5 एमएल ट्यूब में पचा लें।
- गामा काउंटर का उपयोग करके कोशिका पचाने की रेडियोधर्मिता को मापें।
नोट: प्रति मिनट गिनती (सीपीएम) रेडियोधर्मी क्षय, पृष्ठभूमि गतिविधि के लिए सही करने की जरूरत है और ग्लोवर और Hogstrand13द्वारा वर्णित फार्मूले के बाद विशिष्ट गतिविधि गणना के अधीन हैं । - कोशिकाओं की प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 0.5 एम नाओएच के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को समरूप करें।
- सेल नमूने में प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए ब्रैडफोर्ड परख किट का उपयोग करें, मानक के रूप में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ।
नोट: एक बार प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित होने के बाद, आरटगुटजीसी कोशिकाओं द्वारा जेडएन तेज की दर को पीएमओल्स ज़ेन मिन-1 मिलीग्राम-1 प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है।
4. अटलांटिक सामन(साल्मो सालार)में आहार Zn की स्पष्ट उपलब्धता
नोट: अटलांटिक सामन फ़ीड वाणिज्यिक फ़ीड के आधार पर तैयार किए गए थे, जिसमें मुख्य रूप से संयंत्र आधारित अवयवों (यानी लगभग 5% मछली प्रोटीन, 10% मछली का तेल, 68% संयंत्र आधारित प्रोटीन और 12% पौधे का तेल) से प्रोटीन स्रोत होते हैं। दो फ़ीड को 150 मिलीग्राम/किलोग्राम फ़ीड की जेडएन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक अकार्बनिक स्रोत (जेडएन सल्फेट) या एक कार्बनिक स्रोत (ग्लाइसिन के जेडएन चेलेट) के साथ पूरक किया गया था। इसके अलावा, स्पष्ट उपलब्धता गुणांक की गणना को सक्षम करने के लिए निष्क्रिय मार्कर के रूप में 0.01% पर फ़ीड में Yttrium ऑक्साइड (फीड ग्रेड) जोड़ा गया था।
- अपने संबंधित टैंकों में अटलांटिक सामन (साल्मोब्रीड स्ट्रेन, आयु 1 + वर्ष, मिश्रित-सेक्स समूह) को स्वीकार करें जब तक कि मछली का उपयोग प्रायोगिक परिस्थितियों में नहीं किया जाता है।
- उनके दैनिक फ़ीड सेवन की निगरानी करके अटलांटिक सामन की वृद्धि का आकलन करें।
नोट: यह परीक्षण ट्रिपलिटेट टैंकों में किया गया था, इस प्रकार कुल छह टैंकों का उपयोग किया गया था। फीडिंग ट्रायल के दौरान पानी का तापमान 11.9 ± 0.3 डिग्री सेल्सियस था और घुलित ऑक्सीजन संतृप्ति 101 ± 5% थी। - मछली को 11 दिनों तक प्रायोगिक आहार खिलाएं।
- पानी के प्रति लीटर ट्राइकेन मीथेनसुल्फोनेट स्टॉक समाधान के 6 एमएल का उपयोग करके मछली को अधिक मात्रा में उपयोग करके इच्छामृत्यु दें।
- एक ही टैंक से मछली से मल का एक पूल्ड नमूना एक प्लेट में वेंट्रल फिन से गुदा के लिए पट्टी द्वारा ले लीजिए।
- प्लेट से मल को 50 एमएल शंकु नली में स्पैटुला के साथ निकालें और तुरंत नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: नमूनों को आगे के विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। - फ्रीज -80 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए मल के नमूनों को सूखा।
- मैन्युअल रूप से मूसल और मोर्टार का उपयोग करके मल के नमूने को एक महीन पाउडर में मैन्युअल रूप से समरूप करें।
- आईसीपी-एमएस (जैसा कि कहीं और9वर्णित) का उपयोग करके फ़ीड और मल के नमूनों में जेडएन और Yttrium की एकाग्रता निर्धारित करें।
- निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके स्पष्ट उपलब्धता गुणांक (एएसी, %) निर्धारित करें:
Representative Results
एसईसी-आईसीपी-एमएस विधि का उपयोग करके अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश में जेडएन रासायनिक प्रजातियों का मूल्यांकन
एसईसी-आईसीपी-एमएस विधि अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश में पाई जाने वाली जेडएन रासायनिक प्रजातियों के बारे में डेटा प्रदान करती है। चित्रा 4 घुलनशील अंश में पाए जाने वाले जेडएन के क्रोमेग्राफिक प्रोफाइल को दिखाता है। यह क्रोमेटोग्राम एसईसी-आईसीपी-एमएस विधि का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंशों में पांच जेड युक्त चोटियां पाई गईं । प्रत्येक चोटी का एक अलग आणविक वजन होता है; पीक वन (~ 600 केडीए), पीक टू और पीक थ्री (32 से 17 केडीए), पीक फोर (17 से 1.36 केडीए) और पीक फाइव (> 1.36 केडीए)। पीक फोर सबसे प्रचुर मात्रा में था, इसके बाद क्रमशः पीक दो, तीन, पांच और एक । घुलनशील अंश में पाई जाने वाली जेडएन रासायनिक प्रजातियों में विभिन्न स्रोत हो सकते हैं क्योंकि उपयोग की जाने वाली फ़ीड में समुद्री आधारित और पौधे आधारित सामग्री, और पूरक रूप (यानी, ज़ेन सल्फेट) दोनों होते हैं। जेडएन रासायनिक प्रजातियों की आणविक वजन सीमा ने सुझाव दिया कि ये यौगिक धातुप्रक्रोटीन हो सकते हैं ।
अटलांटिक सामन फ़ीड में पूरक Zn की विट्रो घुलनशीलता में
अमीनो एसिड की उपस्थिति में पूरक 65जेडएन की घुलनशीलता बढ़ गई। सभी परीक्षण अमीनो एसिड पूरक 65Zn. मेथियोनिन, ग्लाइसिन, सिस्टीन, हिस्टिडीन, और लिसिन सुधार 65Zn घुलनशीलता की घुलनशीलता में वृद्धि हुई; हिस्टिडीन और लिसाइन(चित्रा 5)के साथ उच्च घुलनशीलता पाई गई।
एक इन विट्रो आंतों के मॉडल (RTgutGC) का उपयोग कर Zn प्रजातियों का मूल्यांकन तेज
आरटगुटजीसी कोशिकाओं में एपिकल जिंक तेज 2 एमएम सांद्रता पर एल-मेट या डीएल-मेट की उपस्थिति से काफी प्रभावित थे। इसके अलावा, आरसीएच(चित्र 6)के साथ अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में आरसीएच (एक अमीनो एसिड परिवहन प्रणाली अवरोधक) की उपस्थिति से आरटगुटजीसी कोशिकाओं में जेडएन तेज पर मेथियोनिन का प्रभाव नकारात्मक रूप से प्रभावित हुआ।
अटलांटिक सामन(साल्मो सालार)में आहार Zn की स्पष्ट उपलब्धता
अटलांटिक सामन के लिए व्यावहारिक फ़ीड में, स्पष्ट जेडएन उपलब्धता एक अकार्बनिक स्रोत (जेडएन सल्फेट) या एक कार्बनिक स्रोत (ग्लाइसिन के जेडएन चेलेट) के साथ पूरक होने पर समान थी। अटलांटिक सामन में जेडएन (%, एन = 3) की स्पष्ट उपलब्धता के लिए अनुमानित मूल्य 12% ± 31% थे, जब एक अकार्बनिक स्रोत (जेडएन सल्फेट) के साथ पूरक होते हैं और 31% ± 3% जब एक कार्बनिक स्रोत (ग्लाइसिन का जेडएन चेलेट) पूरक होता है।
चित्र 1:पूरक तरीकों का उपयोग करके खनिज उपलब्धता का आकलन करने के लिए व्यवस्थित दृष्टिकोण कासारांश। इस दृष्टिकोण का उपयोग अटलांटिक सामन में जिंक की उपलब्धता का अध्ययन करने के लिए किया गया था, जिसमें जेडएन स्पेसिवेशन, आंतों के वातावरण में जेडएन घुलनशीलता, आंतों की कोशिकाओं द्वारा जेडएन तेज और जेडएन स्पष्ट उपलब्धता शामिल थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:फ़ीड नमूने से Zn निष्कर्षण के लिए प्रक्रिया का सारांश। जिंक हल्के निष्कर्षण स्थितियों का उपयोग कर एक फ़ीड नमूना से निकाला जाता है। निष्कर्षण Zn नमूना विश्लेषण के बाद किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:RTgutGC कोशिकाओं का एक उदाहरण 1 घंटे (बाएं) और 1 सप्ताह (दाएं) सेल संस्कृति फ्लास्क में सीडिंग के बाद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:एक क्रोमेटोग्राम अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश से Zn युक्त चोटियों दिखा रहा है और एसईसी-आईसीपी-एमएस द्वारा विश्लेषण किया । तीन प्रतिकृति नीले, लाल और काले रंग की रेखाओं की विशेषता है। एक आणविक वजन अंशांकन थायरोग्लोबुलिन (६६० केडीए, निगरानी १२७मैं), Zn/Cu superoxide dismutase (३२ केडीए, निगरानी ६६Zn), myoglobin (17 केडीए, निगरानी ५७Fe), विटामिन बी 12 (१.३६ केडीए, निगरानी ५९कंपनी) का उपयोग किया गया था; पीक 1 (P1): ~ 600 केडीए, प्रतिधारण समय (आरटी) 8.2 मिनट; पीक 2 +3 (P2+3): 32 से 17 केडीए, आरटी 14.2 + 15.3 मिनट; पीक 4 (P4): 17 से 1.36 केडीए, आरटी 16.3 मिनट; पीक 5 (P5): > 1.36 केडीए, आरटी 23.2 मिनट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5:अटलांटिक सामन फ़ीड में पूरक Zn की इन विट्रो घुलनशीलता पर अमीनो एसिड का प्रभाव। डेटा को डीडी (एन = 3) ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। डेटा एक तरह से ANOVA के माध्यम से विश्लेषण किया गया, है Dunnet कई तुलना परीक्षण के बाद, नियंत्रण समूह (कोई ए. ए.) के साथ प्रत्येक ए. ए. समूह के मतलब की तुलना । तारांकन ANOVA (पी मूल्यों < ०.०५ (*), < ०.०१ (**), < ०.००१ (***) और < ०.०००१ (*)) के महत्व के स्तर को दर्शाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6:मेथिओनिन और एक अमीनो एसिड परिवहन अवरोधक (2-अमीनोबिकीक्लो [2.2.1] हेप्टेन-2-कार्बोक्सिलिक एसिड, बीसीएच, 10 mM) का प्रभाव। डेटा को डीडी (एन = 3) ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। डेटा दो तरह से ANOVA के माध्यम से विश्लेषण किया गया, पी < ०.०५ महत्व के स्तर के साथ Tukey कई तुलना परीक्षण के बाद । समूहों के बीच तदर्थ मतभेदों को सलाखों के ऊपर सुपरस्क्रिप्ट पत्र के रूप में दर्शाया जाता है; विभिन्न सुपरस्क्रिप्ट वाले बार सांख्यिकीय रूप से अलग हैं (पी < 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| एचपीएलसी सेटिंग्स | |
| स्तम्भ | एसईसी कॉलम (30 सेमी x 7.8 मिमी, 5 माइक्रोन कण आकार) + गार्ड कॉलम (7 माइक्रोन कण आकार) |
| अंशांकन रेंज | 1.0 × 104 - 5.0 × 105 डीए |
| मोबाइल चरण | 50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (पीएच 7.5) |
| प्रवाह दर | 0.7 एमएल न्यूनतम−1 |
| इंजेक्शन की मात्रा | 50 माइक्रोन |
| आईसीपी-एमएस सेटिंग्स | |
| फॉरवर्ड पावर | 1550 डब्ल्यू |
| प्लाज्मा गैस प्रवाह | 15.0 एल न्यूनतम−1 |
| कैरियर गैस प्रवाह | 0.86 एल मिनट−1 |
| मेकअप गैस प्रवाह | 0.34 एल न्यूनतम−1 |
| बस समय | 0.1 एस प्रति आइसोटोप |
| आइसोटोप की निगरानी | 127 I, 66Zn, 59कं, 57Fe |
तालिका 1. एचपीएलसी और आईसीपी-एमएस के लिए इंस्ट्रूमेंट सेटिंग्स का अवलोकन।
| रासायनिक संरचना (एमएमए) | L15/ex | प्रायोगिक माध्यम (L15/FW) |
| सोडियम नाइट्रेट | 155 | 155 |
| पोटेशियम नाइट्रेट | 6.2 | 6.2 |
| मैग्नीशियम सल्फेट | 3.8 | 19.5 |
| कैल्शियम नाइट्रेट | 1.5 | 5.4 |
| हेपेस | 5 | 5 |
| मैग्नीशियम क्लोराइड | - | 15 |
| सोडियम पायरुवेट | 5.7 | 5.7 |
| गैलेक्टोस | 5.7 | 5.7 |
| पीएच | 7.1 | 7.4 |
| आयनिक ताकत | 178 | 258 |
| आयनिक संरचना (एमएन) | ||
| कैल्शियम, Ca2 + * | 1.6 ± 0.1 | 5.3 ± 0.2 |
| मैग्नीशियम, एमजी2 + * | 3.9 ± 0.3 | 32.5 ± 0.7 |
| पोटेशियम, कश्मीर+ * | 8.2 ± 1.2 | 8.6 ± 1.1 |
| सोडियम, ना+ * | 160 ± 3 | 157 ± 2 |
| नाइट्रेट, कोई3- ** | 164 | 172.4 |
| सल्फेट, एसओ4- ** | 3.8 | 18.7 |
| क्लोराइड, सीएल- ** | 1.5 | 31.5 |
तालिका 2. प्रायोगिक मीडिया की रासायनिक और आयनिक संरचना का परीक्षण किया गया।
Discussion
जेडएन का आंतों का अवशोषण13जेडएन प्रजाति के रासायनिक रूप से प्रभावित प्रतीत होता है . इस संबंध में, इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल के उपयोग ने अटलांटिक सामन में जेडएन की 'उपलब्धता' में अंतर्निहित रासायनिक और जैविक पहलुओं के क्रमिक अध्ययन की अनुमति दी।
इस अध्ययन में जेडएन स्पेसाइजेशन विश्लेषण विधि के उपयोग की सूचना दी गई। एसईसी-आईसीपी-एमएस विधि ने अटलांटिक सामन फीड के घुलनशील अंश में मौजूद जेडएन रासायनिक प्रजातियों के आणविक वजन से संबंधित गुणात्मक डेटा प्रदान किया । यह आणविक वजन अंशांकन मानकों (यानी, थायरोग्लोबुलिन (660 केडीए), जेडएन/सीयू सुपरऑक्साइड डिस्म्यूटेज (32 केडीए), मायोग्लोबिन (17 केडीए) और विटामिन बी 12 (1.36 केडीए) के अवधारण समय की तुलना में हासिल किया गया था जिसमें चोटियों वाले ज़ैन के अवधारण समय थे। जेडएन स्पेसिफिकेशन एनालिसिस में मिली एक चुनौती विश्लेषणात्मक मानकों की कमी के कारण अज्ञात जेडएन रासायनिक प्रजातियों की पहचान थी । एसईसी में, अणुओं का पृथक्करण स्थिर चरण में छिद्रों के सापेक्ष उनके आकार पर आधारित होता है। सिद्धांत रूप में, बड़े अणु तेजी से यात्रा करेंगे, पहले eluting, और छोटे अणुओं धीमी यात्रा करेंगे, बाद में14eluting । नतीजतन, प्रत्येक जेड युक्त चोटी में समान आणविक वजन15के साथ कई यौगिक हो सकते हैं। यह अज्ञात जेडएन रासायनिक प्रजातियों की पहचान करने की चुनौती में भी योगदान देता है। इसके अलावा, जेडएन निकालने के लिए कई हल्के निष्कर्षण स्थितियों का परीक्षण किया गया था। निकाले गए Zn कम (~ 10%) जेडएन रासायनिक प्रजातियों को अक्षुण्ण रखने के लिए हल्के निष्कर्षण की स्थिति लागू की गई थी लेकिन इससे निष्कर्षण दक्षता7से समझौता हो सकता है ।
इन विट्रो घुलनशीलता परख में, पूरक जेडएन (रेडियो आइसोटोप 65जेडएनसीएल2के रूप में) की घुलनशीलता ने संकेत दिया कि अमीनो एसिड, विशेष रूप से हिस्टिडीन और लिसाइन, जेडएन(चित्रा 5)की घुलनशीलता में वृद्धि हुई। नकली गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थितियों के तहत इन विट्रो घुलनशीलता के लिए सीधे फीड नमूनों का उपयोग करना इस ज्ञान पर आधारित है कि जेडएन विशिष्टता में परिवर्तन पीएच निर्भरहै 16। हालांकि, जीआई पथ की शुरुआत में अम्लीय स्थितियों के परिणामस्वरूप विशिष्टता में कुछ परिवर्तन हो सकते हैं जो अपरिवर्तनीय हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, जेडएनओ-> जेडएनएल2,पेट में अम्लीय परिस्थितियों में एचसीएल की उपस्थिति में)। फिर भी, यहां उपयोग किया जाने वाला जेडएन स्रोत जेडएनएसओ4 है और जिसकी घुलनशीलता को माध्यम में अमीनो एसिड द्वारा सुधारा गया था। अगले सवाल का जवाब दिया जाना था, क्या बढ़ी हुई घुलनशीलता का उपलब्धता में अनुवाद किया जा सकता है? इस प्रश्न का अध्ययन करने के लिए आरटगुटजीसी आंतों की कोशिका रेखा का उपयोग किया गया था। जानवरों में खनिज पोषण के संदर्भ में, 'उपलब्धता' शब्द को परिभाषित करना कठिन है और जानवर (वीवो में) की तुलना में कोशिकाओं (इन विट्रो) में अंतर से विनियमित किया जा सकता है। इसलिए, जब आंतों की सेल लाइन का उपयोग करके इन विट्रो मूल्यांकन की बात आती थी तो 'तेज' शब्द का उपयोग किया जाता था। सेल लाइन ने आंतों के एपिथेलियम में जेडएन तेज तंत्र पर उपयोगी जानकारी प्रदान की जो जटिल नियामक प्रक्रिया का हिस्सा है जो जानवरों में खनिज उपलब्धता को नियंत्रित करता है। आरटगुटजीसी कोशिकाओं ने अमीनो एसिड (यानी, मेथिओनिन) की उपस्थिति में जेडएन के एपिकल तेज के लिए बेहतर क्षमता प्राप्त की; चित्रा 6)। हालांकि, वीवो में स्पष्ट उपलब्धता अटलांटिक सामन में अकार्बनिक और कार्बनिक Zn स्रोतों के बीच काफी अलग नहीं थी। वीवो उपलब्धता अध्ययन में, Zn स्रोत तुलना आहार Zn स्तर पर अच्छी तरह से अटलांटिक सामन17, १५०मिलीग्राम/किलो फ़ीड के कुल Zn एकाग्रता के ज्ञात Zn आवश्यकताओं से अधिक किया गया था । उपलब्धता में अंतर बेहतर कल्पना कर रहे है जब आहार के स्तर का परीक्षण रैखिक गतिशील रेंज में गिरावट से पहले पशु संतृप्ति तक पहुंचता है । वीवो अध्ययन में वर्तमान में, यह संभव है कि अटलांटिक सामन अच्छी तरह से इस्तेमाल स्रोतों के बीच Zn अवशोषण में अंतर मनाया संतृप्त थे ।
संक्षेप में, पहली विधि ने अटलांटिक सामन फ़ीड के घुलनशील अंश में पाई जाने वाली विभिन्न जेडएन रासायनिक प्रजातियों के बारे में गुणात्मक जानकारी प्रदान की; दूसरी विधि, अमीनो एसिड लिगामेंट्स की उपस्थिति में पूरक जेडएन की इन विट्रो घुलनशीलता में सुधार किया गया था; तीसरी विधि ने पुष्टि की कि अमीनो एसिड द्वारा बेहतर घुलनशीलता आंतों के एपिथेलियम में तेज में सुधार कर सकती है; इसके विपरीत, चौथी विधि अकार्बनिक या कार्बनिक स्रोत से अटलांटिक सामन के लिए Zn की उपलब्धता में अंतर खोजने में विफल रहा । समाप्त करने के लिए, हालांकि वीवो निष्कर्षों के साथ संरेखण में नहीं, इन विट्रो प्रोटोकॉल ने जेडएन उपलब्धता के विभिन्न घटकों को समझने में दिलचस्प अंतर्दृष्टि प्रदान की।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम परियोजना APREMIA (स्पष्ट उपलब्धता और अटलांटिक सामन में खनिजों की आवश्यकता, अनुदान संख्या २४४४९०) नार्वे अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित के तहत किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
| 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| 10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
| 1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
| 24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
| 2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
| DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
| D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
| Experimental fish feeds | Skretting | ||
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
| L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
| HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
| Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
| Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
| L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
| L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
| Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
| Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
| Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
| Pasteur pipette | VWR | ||
| pH meter | inoLab | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
| RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
| SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
| Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm) | Retsch | ||
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
| Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
| Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
| Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
| Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
| Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
| Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
| Zinc sulphate | Vilomix |
References
- Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
- Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
- Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).
- Hogstrand, C. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).
- Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
- Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
- Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
- Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
- Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
- Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
- Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
- Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
- Ekman, R. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).
