Summary
Denna artikel förklarar i detalj ett systematiskt tillvägagångssätt för att bedöma tillgången på mikromineral i atlantlax. Metoden omfattar verktyg och modeller med ökande biologisk komplexitet: 1) kemisk speciationsanalys, (2) in vitro-löslighet, (3) upptagsstudier i cellinjer och (4) in vivo-fiskstudier.
Abstract
Att bedöma tillgången på mikromineraler via kosten är en stor utmaning inom mineralnäring av fiskarter. Denna artikel syftar till att beskriva ett systematiskt tillvägagångssätt som kombinerar olika metoder för att bedöma tillgången på zink (Zn) i atlantlax(Salmo salar). Med tanke på att flera Zn kemiska arter kan finnas i ett atlantiskt laxfoder, var det hypotesen att Zn tillgänglighet påverkas av Zn kemiska arter som finns i fodret. Således, i denna studie, det första protokollet handlar om hur man extraherar de olika Zn kemiska arterna från foderet och att analysera dem med en storlek uteslutning kromatografi-induktivt kopplade plasma massa spektroskopi (SEC-ICP-MS) metod. Därefter utvecklades en in vitro-metod för att utvärdera lösligheten hos kosten Zn i atlantiska laxfoder. Det tredje protokollet beskriver metoden för att studera effekten av att ändra Zn kemiska arters sammansättning på upptaget av Zn i en fisk intestinal epitelial modell med hjälp av en regnbåge tarm cellinje (RTgutGC). Tillsammans jämfördes resultaten från in vitro-metoderna med en in vivo-studie som undersökte den uppenbara tillgången på oorganiska och ekologiska källor till Zn kompletterade med atlantlaxfoder. Resultaten visade att flera Zn kemiska arter finns i matar och effektiviteten hos en organisk Zn källa beror mycket på aminosyra ligand används för att kelat Zn. Resultaten av in vitro-metoderna hade mindre korrelation med resultatet av in vivo-studien. In vitro-protokoll som beskrivs i denna artikel gav dock viktig information om Zns tillgänglighet och dess bedömning i fiskfoder.
Introduction
Fiskmjöl och fiskolja användes traditionellt i atlantlaxfoder. Dessa ingredienser ersätts dock alltmer av växtbaserade ingredienser1. Den ovannämnda förändringen i fodersammansättningen har resulterat i låg tillgång på kosten och ett ökat behov av att förbättra mineraltillgången i atlantlaxfoder, särskilt zink (Zn)2. Den minskade tillgängligheten kan bero på en förändring av Zn-nivån, Zn kemiska arter eller/och antinutritional faktorer som finns i fodermatrisen. I detta scenario har en ny rad tillsatser som allmänt betraktas som "organiska källor" uppstått med potential att vara en bättre tillgänglig källa till dietmineraler att fiska. Därför är det viktigt att förstå grundläggande kemi och fysiologi som styr tillgången på mineraler och deras källor till fisk. Zink är ett viktigt spårämne för alla levande organismer3. Zns roll som signalmolekyl har beskrivits på både paracellulär och intracellulär nivå hos fisk4. I atlantlax har Zn brist associerats med skelettet avvikelser och minskad aktivitet av olika Zn metalloenzymes5,6.
Denna studie beskriver ett systematiskt tillvägagångssätt för att förstå Zn tillgänglighet genom att kategorisera den i fyra olika fack av varierande kemisk och biologisk komplexitet. De berörda metoderna beskrivs i fyra avsnitt, vilket kan ses i figur 1:1) utvärdering av Zn-kemiska arter i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder med hjälp av en storleksuteslutning kromatografi-induktivt kopplade plasmamasspektroskopi (SEC-ICP-MS)metod 7. 2. In vitro-löslighet hos kompletterad Zn i atlantlaxfoder. (3) Utvärdering av Zn kemiska arters upptag genom in vitro-tarmmodell (RTgutGC)8. och (4) Uppenbar tillgång på Zn i atlantlax(Salmo salar)9. Liknande protokoll kan utvecklas för andra mineraler (t.ex. mangan, selen, koppar) av näringsintresse för vattenbruksfiskarter.
Protocol
Utfodringsförsöket i avsnitt 4 utfördes enligt norsk (FOR-2015-06 - 18-761) och EU-lagstiftning (direktiv 2010/63/EU).
1. Utvärdering av Zn kemiska arter i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder med hjälp av en SEC-ICP-MS-metod
- Utsugsbuffert (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
- Förbered extraktionsbufferten genom att lösa upp en lämplig mängd tris (hydroxymethyl)aminometan för att uppnå önskad jonisk styrka (100 mM) i ultrapure H2O.
- Justera lösningens pH-fel till pH 8.5 med HCl-lösning och övervaka pH-bytet med en pH-mätare.
- Beredning av foderprover
OBS: Foderprovet som användes formulerades baserat på kommersiellt foder för atlantlax och innehöll proteinkällor huvudsakligen från växtbaserade ingredienser (dvs. cirka 5 % fiskprotein, 10 % fiskolja, 68 % växtbaserat protein och 12 % växtbaserad olja). Zinksulfat kompletterades med foderet.- Mala foderprovet för hand med en mortel och en mortel.
- Sikta matningsprovet för att säkerställa att extraktionen utförs i en foderfraktion med liknande partikelstorlek (från 850 μm till 1,12 mm).
- Fortsätt med att utföra Zn-extraktionen.
- Zinkextraktion från ett foderprov
- Väg cirka 0,5 g foder i tre exemplar i 15 ml koniska rör.
- Tillsätt utsugningsbufferten (5 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) till proverna.
- Extrahera proverna i en rotator (20 varv/min) vid 4 °C i 24 timmar.
- Separera lösliga och icke-lösliga fraktioner genom centrifugering i 10 minuter vid 3000 x g.
- Använd ett engångssprutafilter på 0,45 μm för att filtrera den lösliga fraktionen.
- Överför de filtrerade proverna till rena rör.
- Utför Zn-speciationsanalysen i lösliga fraktioner med SEC-ICP-MS, enligt beskrivningen i steg 1.6.
OBS: En sammanfattning av förfarandet för Zn-extraktion från ett foderprov beskrivs i figur 2.
- Mobil faslösning (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5)
- Förbered den mobila faslösningen som upplöser 6,057 g tris(hydroxymethyl)aminometan i 1 L av 3% MeOH-lösning (v/v).
- Justera lösningens pH-fel till pH till 7,5 med HCl-lösning och övervaka pH-bytet med en pH-mätare.
- Filtrera den mobila faslösningen genom ett 0,45 μm membranfilter.
- Kalibrering av molekylvikten av SEC-kolumnens separationsområde
- Kalibrera separationsområdet genom att utföra en molekylviktskalibrering.
OBS: I denna studie användes thyroglobulin (660 kDa), Zn/Cu superoxiddemutas (32 kDa), myoglobin (17 kDa) och vitamin B12 (1,36 kDa). - Förbered var och en av standarderna med en känd koncentration i ultrapure H2O.
- Förbered en högpresterande vätskekromatografiflaska (HPLC) genom att tillsätta 250 μL standard till en injektionsflaska.
- Ladda injektionsflaskan med standarder för proverna.
- Kör molekylviktskalibreringen i början och i slutet av analyssekvensen, övervakning 127I (tyroglobulin), 66Zn (Zn/Cu superoxiddemutas), 57Fe (myoglobin) och 59Co (vitamin B12).
OBS: Molekylviktskalibreringen utförs samtidigt med Zn-speciationsanalysen.
- Kalibrera separationsområdet genom att utföra en molekylviktskalibrering.
- Zink speciation analys med SEC-ICP-MS
OBS: Zn speciation analys av SEC-ICP-MS metoden utvecklades baserat på principer som beskrivs någonannanstans 10,11 och ytterligare optimering utfördes för analys av en Atlantisk laxfoder7.- Utför Zn-speciationsanalysen på lösliga fraktioner med hjälp av en kolumn för storleksuteslutningsk kromatografi (SEC) och ett HPLC i kombination med induktivt kopplade plasmamasspektroskopi (ICP-MS).
- Förbered en HPLC-injektionsflaska genom att tillsätta 250 μL löslig fraktion till en injektionsflaska.
- Före analys, spika alla prover med 0,5 μL vitamin B12. Det här steget gör det möjligt att korrigera för lagringstider skift, övervaka 59Co.
- Späd ut den lösliga fraktionen med utsugningsbuffert (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) och justera till en slutlig volym på 1 ml.
- Förbered sekvenskörningen av proverna i slumpmässig ordning.
- Ställ in ICP-MS enligt tillverkarens instruktioner.
- Följ instrumentinställningarna för HPLC och ICP-MS som utför Zn-speciationsanalysen (se tabell 1).
2. In vitro-löslighet hos kompletterad Zn i atlantlaxfoder
OBS: Foderprovet som användes formulerades baserat på kommersiellt foder för atlantlax och innehöll proteinkällor främst från växtbaserade ingredienser (dvs. cirka 5 % fiskmjöl, 10 % fiskolja, 68 % växtbaserade ingredienser och 12 % vegetabilisk olja).
- Mala atlantlaxfoderproverna i 10 s vid 3000 varv/min med hjälp av ett knivbruk och förvara vid 4 °C tills vidare analys.
- Väg ~0,2 g av foderproverna i steg 2.1 och tillsätt Zn radiotracer(65Zn) av känd specifik aktivitet i ett provrör med en volym på 5 ml (med lock).
VARNING: Denna procedur måste utföras i en radionuklidsvit. Den person som utför detta steg bör utbildas och certifieras för att hantera radioisotoper. De säkerhets- och försiktighetsåtgärder som rekommenderas av institutets administrationen av strålsäkerhet måste följas strikt. - Förbered sedan sötvatten tarm luminal buffertlösning enligt beskrivningen nedan.
- För saltlösning A, väg 11,65 g NaNO3,0,55 g KNO3 och 0,4 g MgSO4. Lös salterna i ultrapure H2O och justera till en slutlig volym på 60 ml.
- För saltlösning B, väg 0,31 g Ca(NR3)2· 4 (på 2) H2O. Lös salterna i ultrapure H2O och justera till en slutlig volym på 10 ml.
- Använd 500 mM HEPES lagerlösning som saltlösning C.
- För saltlösning D, väg 1,2 g MgCl2, lös saltet i ultrapure H2O och justera till en slutlig volym på 20 ml.
- För saltlösning E, väg 0,9 g MgSO4, lös saltet i ultrapure H2O och justera till en slutlig volym på 20 ml.
- Förbered pyruvatlösningen genom att lösa upp 0,55 g CH3COCOONa i 10 ml ultrapure H2O.
- Lös upp 0,9 g galaktos (C6H12O6) i ultrapure H2O.
- Lös upp väl med en magnetisk omrörare och sterilisera saltlösningarna A, B, D och E genom autoklavering och lösning C, pyruvat och galaktos genom filtrering genom ett 200 μm sprutfilter.
- Efter beredning av de olika stamlösningarna, för att förbereda 100 ml arbetslösning av bufferten, blanda ovanstående beredda lösningar i följande proportion: 6,8 ml saltlösning A, 4,14 ml B, 5 ml C, 2,5 ml D, 1,5 ml E och 1,14 ml pyruvat och galaktos. Gör upp volymen till 100 ml med avjoniserat vatten.
OBS: Ovanstående buffert kommer nu att representera den joniska sammansättningen av tarmlumen som finns i sötvattenlaxfiskar.
- Förbered sex andra alikvoter av bufferten som beskrivs i steg 2.6 och tillsätt en av följande aminosyror (cystein, metionin, glycin, histidin, lysin och arginin) för att nå en slutlig molarkoncentration på 5 mM.
- Tillsätt den luminala bufferten för sötvattens tarm (reaktionsvolym = 3 ml; pH 7.4) i foderprovet.
- Upprepa steg 2. 5 med de buffertar som beskrivs i 2.4 (i närvaro av olika aminosyror vid 5 mM koncentration).
- Stäng rören och låt dem snurra i en roterande snurra i 30 min vid 25 varv/min.
- Separera de lösliga och icke-lösliga fraktionerna genom att centrifugera i 10 minuter vid 1157 x g.
- Använd en gamma teller för att mäta antalet per minut (cpm) på 65Zn i lösliga och icke-lösliga fraktioner.
- Beräkna andelen radioisotoper av Zn(65Zn) som finns i de lösliga och icke-lösliga fraktionerna.
3. Utvärdering av Zn kemiska arter upptag med hjälp av en in vitro intestinal modell (RTgutGC)
- RTgutGC-cellkultur
OBS: Alla arbetsmaterial som används i detta steg ska vara sterila.- Återuppliva de frusna RTgutGC-cellerna försiktigt i ett vattenbad vid 20 °C.
- Pipetten försiktigt ut lösningen som innehåller cellerna och suspendera dem i 10 ml L15 medium som innehåller 10% fetala nötkreatursserum (FBS).
OBS: 10% FBS används endast för att återuppliva de frusna cellerna. För efterföljande passage används FBS vid 5%. Sammansättningen av FBS kan variera mellan partier, så det är lämpligt att köpa och lagra så mycket som krävs från en enda sats för att undvika variationer mellan partier i serumsammansättningen. - Tillsätt cellupphängningen till 75 cm2 cellkulturflaskor och inkubera i en inkubator inställd vid 19 °C under normal atmosfär.
- Kontrollera cellerna och när de är sammanflöde (80% sammanflöde, bedöm visuellt genom att undersöka cellytans densitet under ett mikroskop), dela cellerna till nya flaskor (efterföljande passage) eller skörda för att använda i experiment.
OBS: Ett exempel på RTgutGC-cellerna 1 tim och 1 vecka efter sådd till cellkulturkolvarna visas i figur 3.
- Cellskörd och förberedelse för exponeringsexperiment
- Tvätta cellerna två gånger med 1 ml etylendiamintetraacetikasyralösning (EDTA). Efter varje tvätt, sug ut EDTA-lösningen med ett sterilt sugrör.
- Behandla cellerna med trypsin (0,7 ml trypsin, i 0,25% i fosfatbuffrad saltlösning [PBS]).
- Rotera försiktigt kolven i akuta vinklar för att sprida trypsinet längs kolvens yta.
- Fortsätt rotationen i 2 minuter, medan cellerna lossar.
- Efter att försiktigt ha roterat i 2 min, tillsätt 10 ml L15/FBS medium för att neutralisera trypsin.
- Dekantera den resulterande cellfjädringen i ett koniskt bottencentrifugrör med en steril pipett och centrifugera i 3 minuter vid 130 x g.
- Bestäm densiteten hos de skördade cellerna genom manuell räkning med hjälp av hemocytometer.
- Lägg till önskad volym L15/FBS-medium för att uppnå en celltäthet på 5 x 104 celler/ml.
- Frö cellerna på 24-brunnsplattor genom att pipetting 1 ml cellfjädring gäller väl för att uppnå den slutliga celltätheten på 5 x 104 celler / brunn.
OBS: Använd helst flerdispenserande pipetter för att minimera variation och minska tiden. - Placera de sådda plattorna i en inkubator under normal atmosfär vid 19 °C i 48 timmar före försök.
OBS: Trypsin ska förvaras vid -20 °C. EDTA-lösning och L15/FBS-media vid 4 °C. Justera temperaturen på alla arbetslösningar och media till 19 °C strax före användning.
- Förberedelse av exponeringsmedier
OBS: Detta steg måste göras under rökhuven under aseptiska och sterila förhållanden.- Förbered L15/ex genom att blanda 6,8 ml saltlösning A (steg 2.3.1), 1,14 ml B (steg 2.3.2), 5 m CL (steg 2.3.3) och 1,14 ml pyruvat (steg 2.3.6) och galaktos (steg 2.3.7). Gör upp volymen till 100 ml med sterilt cellkultursklassat destillerat vatten.
- Förbered FW genom att blanda 6,8 ml saltlösning A (2.3.1), 4,14 ml B (2,3,2), 5 ml C (2,3,3), 2,5 ml D (2,3,4), 1,5 ml E (2,3,5) och 1,14 ml pyruvat (2,3,6) och galaktos (2.3.7). Gör upp volymen till 100 ml med sterilt destillerat vatten av cellkulturkvalitet.
- Kvantifiera koncentrationerna av joner i exponeringsmedierna med hjälp av ICP-MS enligt beskrivningen på annat håll12.
OBS: Jonkoncentrationer som analyseras i mediepreparaten presenteras i tabell 2.
- Zink(65Zn) tillströmningsanalyser
- Så RTgutGC-cellerna på 24-brunnsplattor (5 x 104 celler/brunn) i komplett L15/FBS-medium.
- Inkubera i 48 timmar i en inkubator med normal atmosfär vid 19 °C.
- Justera alla experimentella mediepreparat till pH 7, 4 med 0, 5 M NaOH i närvaro eller frånvaro av L-metionin (L-Met) eller DL-metionin (DL-Met) vid 2 mM koncentration.
OBS: PH-justeringen av de buffertar som beskrivs i 3.4.3 måste göras på ett nytt sätt före behandling av cellerna i steg 3.4.5. - Efter inkubationstidens slut, ta bort mediet från brunnarna och skölj noggrant med PBS.
- Tillsätt det pH-justerade FW-experimentmedierna och låt acklimatisera sig i 20 minuter.
- Exponera RTgutGC-cellerna för nominella koncentrationer på 3, 07, 6,14, 12,27 och 24,55 μM 65Zn(II) (som ZnCl2; ~ 4 kBq / mL) i de medier som beskrivs i steg 3.4.3.
- Omedelbart därefter, håll cellerna i inkubatorn vid 19 °C i 15 min.
- När inkubationen på 15 minuter är över, aspirera kulturens supernatant och ta bort från brunnen.
- Skölj cellerna med iskallt FW-medium (med 200 μM Zn, pH 7.4) och sedan släcka genom att tillsätta bufferten 5 mM etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraacetikasyra (EGTA) (pH 7.4) i 5 minuter, för att bli av med alla adsorberade 65Zn(II).
- Exponera cellerna för ovanstående mediepreparat i närvaro eller frånvaro av 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptan-2-karboxylsyra (BCH), en aminosyratransporthämmare.
- Efter exponeringsperioden på 15 minuter, upprepa steg 3.4.8 och 3.4.9.
- RtgutGC-cellerna kommer att fästas på brunnens botten som ett monoskikt. Smält cellerna med hjälp av 0,2% varmt natriumddecylsulfat (SDS) tvättmedel (100 μL/brunn).
OBS: SDS-lösningen måste placeras i 1 timme i ett vattenbad som är inställt på 90 °C före användning. - Aspirera och återhämta cellen smälter till ett 1,5 ml-rör.
- Mät cellens radioaktivitet med hjälp av en gammaräknare.
OBS: Räkningarna per minut (cpm) måste korrigeras för radioaktivt sönderfall, bakgrundsaktivitet och utsätts för specifika aktivitetsberäkningar enligt de formler som beskrivs av Glover och Hogstrand13. - För att kvantifiera cellernas proteinkoncentration, homogenisera cellerna med 500 μL 0,5 M NaOH.
- Använd ett Bradford-analyskit för att mäta proteinkoncentrationen i cellprovet, med bovint serumalbumin (BSA) som standard.
OBS: När proteinkoncentrationen har kvantifierats kan frekvensen av Zn-upptag av RTgutGC-celler uttryckas som pmoles Zn min-1 mg-1 protein.
4. Uppenbar tillgång till kosten Zn i atlantlax(Salmo salar)
OBS: Atlantlaxfoderna formulerades baserat på kommersiella foder, som huvudsakligen innehöll proteinkällor från växtbaserade ingredienser (dvs. cirka 5% fiskprotein, 10% fiskolja, 68% växtbaserat protein och 12% växtolja). Två matar kompletterades med en oorganisk källa (Zn sulfat) eller en organisk källa (Zn kelat av glycin) för att uppnå en Zn koncentration av 150 mg/kg foder. Dessutom tillsattes Yttriumoxid (foderkvalitet) till fodret med 0,01 % som inert markör för att möjliggöra beräkning av synbar tillgänglighetskoefficient.
- Acklimatisera atlantlaxen (SalmoBreed stam, ålder 1 + år, blandade kön grupper) i sina respektive tankar tills fisken används till de experimentella förhållandena.
- Utvärdera acklimatisering av atlantlaxen genom att övervaka deras dagliga foderintag.
OBS: Denna studie utfördes i triplicate tankar, således användes totalt sex tankar. Under utfodringsförsöket var vattentemperaturen 11,9 ± 0,3 °C och upplöst syremättnad var 101 ± 5%. - Mata fisken med experimentella matar i 11 dagar.
- Avliva fisken genom överdosering med 6 ml trikainmetansulfonatbuljonglösning per liter vatten.
- Samla ett poolat prov av avföring från fisken från samma tank i en tallrik genom att strippa från ventral fenan till anus.
- Ta bort avföringen från plattan med en spatel i ett koniskt rör på 50 ml och förvara omedelbart proverna vid -20 °C.
OBS: Proverna förvarades vid -20 °C tills vidare analys. - Frys ut avföringsproverna i 72 timmar vid -80 °C.
- Homogenisera manuellt avföringsprovet till ett fint pulver med en mortel och mortel.
- Bestäm koncentrationen av Zn och Yttrium i foder- och avföringsproverna med hjälp av en ICP-MS (enligt beskrivningen på annat håll9).
- Bestäm uppenbar tillgänglighetskoefficient (AAC, %) med hjälp av följande formel:
Representative Results
Utvärdering av Zn kemiska arter i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder med hjälp av en SEC-ICP-MS-metod
SEC-ICP-MS-metoden ger data om Zn-kemiska arter som finns i den lösliga fraktionen av Atlantlaxfoder. Figur 4 illustrerar Zns kromatografiska profil som finns i den lösliga fraktionen. Detta kromatogram erhölls med sec-ICP-MS-metoden. Fem Zn som innehåller toppar hittades i de lösliga fraktionerna av Atlantlaxfoder. Varje topp har olika molekylvikt; topp ett (~ 600 kDa), topp två och topp tre (från 32 till 17 kDa), topp fyra (från 17 till 1,36 kDa) och topp fem (> 1,36 kDa). Topp fyra var den mest rikliga, följt av topp två, tre, fem respektive en. Zn-kemiska arter som finns i den lösliga fraktionen kan ha olika källor eftersom det foder som används innehåller både marina och växtbaserade ingredienser och kompletterad form (dvs. Zn-sulfat). Molekylviktsintervallet för Zn kemiska arter föreslog att dessa föreningar kan vara metalloproteiner.
In vitro-löslighet av kompletterad Zn i atlantlaxfoder
Löslighet av kompletterad 65Zn ökade i närvaro av aminosyror. Alla testade aminosyror ökade lösligheten av kompletterade 65Zn. Metionin, glycin, cystein, histidin och lysin förbättrade 65Zn löslighet; högre löslighet hittades med histidin och lysin (Figur 5).
Utvärdering av Zn arter upptag med hjälp av en in vitro intestinal modell (RTgutGC)
Apical zink upptag i RTgutGC celler påverkades avsevärt av förekomsten av L-Met eller DL-Met vid 2 mM koncentrationer. Dessutom påverkades effekten av metionin på Zn upptag i RTgutGC celler negativt av förekomsten av BCH (en aminosyra transport system blockerare), jämfört med celler obehandlade med BCH (Figur 6).
Uppenbar tillgång till kosten Zn i atlantlax(Salmo salar)
I praktiska matar för atlantlax var den uppenbara Zn-tillgången densamma när man kompletterade med en oorganisk källa (Zn sulfat) eller en organisk källa (Zn kelat av glycin). De uppskattade värdena för uppenbar tillgänglighet av Zn (%, n = 3) i atlantlax var 31% ± 12% vid komplettering med en oorganisk källa (Zn sulfat) och 31% ± 3% vid komplettering av en organisk källa (Zn kelat av glycin).
Figur 1: En sammanfattning av det systematiska tillvägagångssättet för att bedöma mineraltillgången med hjälp av kompletterande metoder. Detta tillvägagångssätt användes för att studera zinktillgång i atlantlax, inklusive Zn-speciation, Zn-löslighet i tarmmiljön, Zn-upptag av tarmceller och Zn uppenbar tillgänglighet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: En sammanfattning av förfarandet för Zn-extraktion från ett foderprov. Zink extraheras från ett foderprov med milda extraktionsförhållanden. Extraktionen följs av Zn speciation analys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Ett exempel på RTgutGC-cellerna 1 h (vänster) och 1 vecka (höger) efter sådd i cellkulturkolvarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:Ett kromatogram som visar Zn-innehållande toppar från den lösliga fraktionen av atlantlaxfoder och analyserat av SEC-ICP-MS. De tre replikaten kännetecknas av de blå, röda och svarta linjerna. En molekylviktskalibrering utfördes med thyroglobulin (660 kDa, övervakning 127I), Zn/Cu superoxiddemutas (32 kDa, övervakning 66Zn), myoglobin (17 kDa, övervakning 57Fe), vitamin B12 (1,36 kDa, övervakning 59Co); Topp 1 (P1): ~600 kDa, retentionstid (RT) 8,2 min; Topp 2+3 (P2+3): från 32 till 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Topp 4 (P4): från 17 till 1,36 kDa, RT 16,3 min; Topp 5 (P5): > 1,36 kDa, Rt 23,2 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Aminosyrors inverkan på in vitro-lösligheten hos kompletterad Zn i atlantlaxfoder. Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 3). Data analyserades genom enkelvägs ANOVA, följt av Dunnets flerfaldiga jämförelsetest, där medelvärdet för varje AA-grupp jämfördes med kontrollgruppens (No AA). Asteriskerna betecknar ANOVA:s betydelsenivå (P-värdena < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) och < 0,0001 (****)). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Påverkan av metionin och en aminosyratransporthämmare (2-Aminobicyclo [2.2.1] heptan-2-karboxylsyra, BCH, 10 mM). Data presenteras som medelvärde ± SD (n = 3). Data analyserades genom tvåvägs ANOVA, följt av Tukeys flera jämförelsetest med p < 0,05-nivå av betydelse. Post hoc-skillnader mellan grupper representeras som upphöjd bokstav ovanför staplarna. staplar med olika upphöjda är statistiskt olika (p < 0,05). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| HPLC-inställningar | |
| Spalt | KOLUMN SEC (30 cm x 7,8 mm, 5 μm partikelstorlek) + skyddskolonn (7 μm partikelstorlek) |
| Kalibreringsområde | 1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da |
| Mobil fas | 50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5) |
| Flöde | 0,7 ml min−1 |
| Injektionsvolym | 50 μL |
| ICP–MS-inställningar | |
| Framåtkraft | 1550 W |
| Plasmagasflöde | 15.0 L min−1 |
| Flödet av bärgas | 0,86 L min−1 |
| Gasflöde i smink | 0.34 L min−1 |
| Uppehållstid | 0,1 s per isotop |
| Isotoper övervakade | 127 (på 127) Jag, 66Zn, 59Co, 57Fe |
Tabell 1. En översikt över instrumentinställningarna för HPLC och ICP-MS.
| Kemisk sammansättning (mM) | L15/ex | Experimentellt medium (L15/FW) |
| Natriumnitrat | 155 | 155 |
| Kaliumnitrat | 6.2 | 6.2 |
| Magnesiumsulfat | 3.8 | 19.5 |
| Kalciumnitrat | 1.5 | 5.4 |
| HEPES (HEPES) | 5 | 5 |
| Magnesiumklorid | - | 15 |
| Natrium pyruvat | 5.7 | 5.7 |
| Galaktos | 5.7 | 5.7 |
| pH | 7.1 | 7.4 |
| Jonisk styrka | 178 | 258 |
| Jonisk komposition (mM) | ||
| Kalcium, Ca2+ * | 1,6 ± 0,1 | 5.3 ± 0.2 |
| Magnesium, Mg2+ * | 3.9 ± 0.3 | 32,5 ± 0,7 |
| Kalium, K+ * | 8.2 ± 1.2 | 8.6 ± 1.1 |
| Natrium, Na+ * | 160 ± 3 | 157 ± 2 |
| Nitrat, NR3- ** | 164 | 172.4 |
| Sulfat, SO4- ** | 3.8 | 18.7 |
| Klorid, Cl- ** | 1.5 | 31.5 |
Tabell 2. Den kemiska och joniska sammansättningen av de experimentella medier som testats.
Discussion
Intestinal absorption av Zn verkar påverkas av den kemiska formen av Zn-arten13. I detta avseende gjorde användningen av de protokoll som beskrivs i denna artikel det möjligt att i tur och grad studera de kemiska och biologiska aspekter som ligger till grund för "tillgången" på Zn i atlantlax.
Denna studie rapporterade användningen av en Zn speciation analysmetod. SEC-ICP-MS-metoden tillhandahöll kvalitativa data om molekylvikten hos Zn-kemiska arter som finns i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder. Detta uppnåddes genom jämförelse av retentionstiderna för kalibreringsstandarderna för molekylvikt (dvs. tyroglobulin (660 kDa), Zn/Cu superoxiddemutas (32 kDa), myoglobin (17 kDa) och vitamin B12 (1,36 kDa)) med retentionstiderna för Zn som innehåller toppar. En utmaning som hittades i Zn speciation analys var identifiering av den okända Zn kemiska arten på grund av brist på analytiska standarder. I SEC är separationen av molekylerna baserad på deras storlekar i förhållande till porerna i den stationära fasen. I princip kommer större molekyler att färdas snabbare, eluera först och mindre molekyler kommer att färdas långsammare, eluera senare14. Följaktligen kan varje Zn som innehåller topp innehålla flera föreningar med liknande molekylvikt15. Detta bidrar också till utmaningen att identifiera okända Zn kemiska arter. Dessutom testades flera milda extraktionsförhållanden för extraktion av Zn. Den extraherade Zn var låg (~ 10%). Milda extraktionsförhållanden tillämpades för att hålla Zn kemiska arter intakta men detta kan ha äventyrat extraktionseffektiviteten7.
I in vitro-löslighetsanalysen indikerade lösligheten hos kompletterad Zn (som radioisotop 65ZnCl2) att aminosyrorna, särskilt histidin och lysin, ökade Zns löslighet (figur 5). Användning av foderprover direkt för in vitro-löslighetsanalyser under simulerade gastrointestinala förhållanden baseras på vetskapen om att förändringen i Zn-speciation är pH-beroende16. Sura förhållanden i början av mag-tarmkanalen kan dock leda till någon förändring i speciationen som kan vara irreversibel (t.ex. ZnO -> ZnCl2, i närvaro av HCl under sura förhållanden i magen). Ändå är Zn-källan som används här ZnSO4 och vars löslighet förbättrades av aminosyror i mediet. Nästa fråga som skulle besvaras var, kan den ökade lösligheten översättas till tillgänglighet? RTgutGC intestinala cellinjen användes för att studera denna fråga. När det gäller mineralnäring hos djur är termen "tillgänglighet" svår att definiera och kan regleras differentiellt i cellerna (in vitro) jämfört med ett djur (in vivo). Därför användes termen "upptag" när det gällde in vitro-utvärderingen med hjälp av tarmcelllinjen. Cellinjen gav användbar information om Zn-upptagsmekanismerna vid tarmepiteleriet, som är en del av den komplexa regleringsprocessen som styr mineraltillgången hos djur. RTgutGC-cellerna framkallade en bättre kapacitet för apical upptag av Zn i närvaro av en aminosyra (dvs. metionin; Figur 6). Den uppenbara tillgången in vivo skilde sig dock inte nämnvärt mellan oorganiska och ekologiska Zn-källor i atlantlax. I in vivo-tillgänglighetsstudien gjordes Zn-källjämförelsen på Zn-nivåer som låg långt över de kända Zn-kraven för atlantlax17, den totala Zn-koncentrationen på 150 mg/kg foder. Skillnaderna i tillgänglighet visualiseras bättre när de testade kostnivåerna faller i det linjära dynamiska intervallet innan djuret når mättnad. I den aktuella in vivo-studien är det möjligt att atlantlaxen var väl mättad till observerad skillnad i Zn-absorption mellan de källor som användes.
Sammanfattningsvis gav den första metoden kvalitativ information om olika kemiska Zn-arter som finns i den lösliga fraktionen av ett atlantiskt laxfoder. den andra metoden, in vitro löslighet av kompletterade Zn förbättrades i närvaro av aminosyra ligands. Den tredje metoden bekräftade att förbättrad löslighet av aminosyror kan förbättra upptaget vid intestinal epitel. Omvänt kunde den fjärde metoden inte hitta skillnader i tillgången på Zn från oorganisk eller ekologisk källa till atlantlax. Sammanfattningsvis, även om de inte var i linje med in vivo-resultaten, gav in vitro-protokollen intressanta insikter om att förstå de olika komponenterna i Zn-tillgängligheten.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete utfördes inom ramen för projektet APREMIA (Apparent availability and requirement of minerals in Atlantic salmon, grant no. 244490) finansierat av Norges forskningsråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
| 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| 10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
| 1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
| 24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
| 2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
| DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
| D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
| Experimental fish feeds | Skretting | ||
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
| L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
| HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
| Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
| Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
| L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
| L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
| Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
| Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
| Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
| Pasteur pipette | VWR | ||
| pH meter | inoLab | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
| RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
| SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
| Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm) | Retsch | ||
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
| Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
| Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
| Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
| Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
| Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
| Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
| Zinc sulphate | Vilomix |
References
- Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
- Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
- Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).
- Hogstrand, C. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).
- Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
- Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
- Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
- Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
- Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
- Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
- Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
- Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
- Ekman, R. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).
