Summary
我们提出了一种分离和培养人类原发性唾液腺衍生上皮细胞的方法。这些细胞表现出与唾液上皮起源一致的基因表达模式,可以在从恩格尔布雷斯-霍尔姆-肖温肿瘤细胞中提取的基底膜基质上作为盐层生长,或作为治疗培养皿上的单层细胞生长。
Abstract
唾液腺是对人类疾病多方面感兴趣的研究人员非常感兴趣的场所。研究人员的目标之一是恢复因放射治疗或与Sjögren综合征相关的病理而受损的腺体的功能。研究人员的第二个目标是确定病毒在腺组织内复制的机制,然后它们能够获得对水平传播至关重要的唾液。这些目标突出表明,需要一种强大且易于获取的体外唾液腺模型,供对上述相关研究领域感兴趣的研究人员使用。在这里,我们讨论一个简单的协议,从人类唾液腺分离上皮细胞,并在体外繁殖它们。我们的协议可以进一步优化,以满足个别研究的需要。简单地说,唾液组织是机械和酶分离,以分离单个细胞或小簇细胞。上皮细胞的选择是在存在经过优化以促进上皮细胞生长的介质的情况下,电镀到基底膜基质上。这些生成的培养物可以作为三维簇,称为"盐层",或作为经处理的塑料组织培养皿的单层生长。该协议导致主要上皮细胞的异质种群的生长,在接受细胞衰老之前,可以繁殖5-8个通道(15-20个种群翻倍)。
Introduction
在哺乳动物中,唾液腺被组织成3对主要的唾液腺:小黄体、亚黄土和亚语言腺。也有一系列小腺位于舌头上,分散在整个口腔1。主要腺体负责产生的唾液的体积2。除了通过分泌因子提供抗菌保护外,唾液在咀嚼和润滑食物的过程中也非常重要,因为它通过食道2。因此,唾液腺功能障碍是一个医疗问题,患者谁不能产生足够的唾液更容易发展疾病,如蛀牙或口腔念珠菌病3。此外,唾液减少会导致饮食和消化食物更加困难,对生活质量有显著影响。
唾液腺功能障碍主要发生在患有Sjögren综合征(一种自身免疫性疾病)的患者中,或在接受辐照治疗3、4、5的头部和颈部癌症患者中。 6.由于自身免疫或放射治疗,腺体内受损的分泌性腺体不进行自我更新,导致患者生活在不可逆转的损害6。唾液腺的研究也引起了人们对病毒发病机制的关注或研究人员的关注。一些病原体,如人类巨细胞病毒(HCMV),在唾液腺内持续复制,然后允许通过唾液7、8将新生病毒传染给新的宿主。因此,开发健壮且可重复的唾液腺组织体外模型,以解决和理解各种医疗问题,是未满足的需求。
几个模型的鼠唾腺系统已被用作一个起点,了解和表征不同的上皮细胞,形成唾液腺9,10。人与鼠唾液腺11之间存在明显和重大的差异。最值得注意的是,人类的副体腺体相对于亚曼地腺体较大,而小鼠的亚曼底和花环在大小1、2、11上非常相似。虽然存在不朽的人类亚曼地状细胞系,但人们主要担心永生细胞不能准确维持主要组织的表型,二者担心永生细胞实际上并非来自唾液上皮本身12。由于这些原因,人们有兴趣和需要研究人类的主要唾液组织。
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Protocol
辛辛那提大学机构审查委员会(联邦范围的保障#00003152,IRB 协议 2016-4183) 对这些协议和研究进行了审查和批准。唾液组织通常在许多头部和颈部手术中被切除,并且通常不参与恶性过程。通常,从患者中取出后2-4小时内使用新切除的唾液腺组织(图1A)。
1. 试剂制备
-
支气管上皮细胞生长培养基 (BEGM)
- 从制造商提供的套件中添加组件(参见材料表)。
- 用基材清洗每个管一次,以确保部件完全转移。然后加入木炭剥离胎儿牛血清,使最终浓度为4%的血清。
-
红血球 (RBC) 莱沙缓冲液
- 要生产10x库存,加入40.15克NH4Cl、5.0 g NaHCO3和0.186克乙烯二甲乙酸(EDTA),并使用dH2 O提供200 mL的最终体积。然后过滤消毒,并储存在4°C。
- 使用前,在无菌 dH2O 中稀释至工作浓度为 1 倍的工作浓度。
-
分离解
- 在100 mL瓶的消胶溶液(见材料表)中加入0.15克的胶原酶III型。胶原酶完全溶解后,过滤灭菌新溶液并计分。储存在-20°C。
2. 组织消化
- 使用100毫米组织培养板,使用高压灭菌消毒解剖剪刀和手术钳(图1B,C),机械地将组织切成1-2毫米的细片。应切割片之间的结缔组织,以确保适当的分离和在进一步的步骤中轻松。
- 将6 mL的消酶/胶原酶溶液加入切碎的组织。然后在37°C孵育约30分钟至1小时。
- 使用 5 mL 血清移液器移液 15-20 次,破坏组织。
- 在 37°C 孵育 30 分钟到 1 小时。
- 重复步骤2.3和2.4两三次,或直到组织类似于浆料,并可以很容易地通过移液器开口(图1D)。
注:组织标本的起始大小以及组织切片的细度将决定需要重复步骤 2.3 和 2.4 的次数。通常,我们接收的组织约 1 厘米 x 1 厘米的大小。此外,可以使用标准倒置组织培养显微镜监测组织分离,以跟踪细胞与组织分离的进度。小细胞簇是唾液细胞作为盐层的初始生长的理想选择。
3. 用基底膜基质涂井
注:基底膜基质(BMM)应在使用前一天4°C解冻过夜。一旦解冻,BMM应持续保持在冰上或4°C,因为它将在较温暖的温度下迅速凝固(即形成凝胶)。此外,如果样品在BMM上电镀之前在冰上冷藏,应小心谨慎,因为冷样品会"融化"BMM,并将细胞暴露到塑料盘上。
- 慢慢地移液BMM(见材料表)进入每个井进行涂布。均匀且缓慢地将 BMM 分布在井上。
注:通常,我们每口六孔板使用500 μL,但此体积可调整为用于12孔或24孔板的其他型号,或用于较厚或更薄的水凝胶。 - 在使用前至少15分钟在37°C下孵育涂层板,使BMM时间凝固。
4. 过滤未消化的组织、RBC解说和细胞电镀
- 将组织均质从步骤2.5转移到15 mL锥形管。洗板一次与6 mL的Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)转移剩余的细胞。
- 通过 70 μm 尼龙网状细胞过滤器将均质化成 50 mL 锥形管,以去除未消化的组织。在500 x g下离心使细胞离心5分钟。
- 在无菌 dH2O 中稀释 10 倍 RBC 解液缓冲液,以做出 1x 工作溶液。
- 吸气上清液。然后重新悬浮细胞颗粒在10 mL的1xRBC赖沙缓冲液。在37°C下孵育5分钟。
- 加入20-25 mL的DPBS中和红着红细胞赖沙缓冲液,并尽量减少唾液细胞的赖沙。在500 x g下离心5分钟。
注:使用RBC莱沙缓冲液治疗后,细胞颗粒应为白色。颗粒中的红色表示并非所有 RBC 都已完全分丝。如果需要完成所有 RBC 的分莱,请重复步骤 4.4 到 4.5。 - 吸气上清液。将颗粒重新悬浮在每口井的 BEGM 的 1-2 mL 中,然后将重新悬浮的细胞放入 BMM 涂层的井中。在37°C孵育。
- 一旦在BMM上镀层,细胞将在2-3天内形成球形结构或"水球"。在BMM开始降解之前,细胞可以作为盐球维持约5-7天,使细胞能够进入并粘附在塑料上,并作为单层体生长。
5. 对沙地层进行分栽,并维护BMM
- 从井中吸出培养基,然后向每口井中加入1 mL的消泡/胶原酶溶液,并在37°C孵育15分钟或直到BMM大部分溶解。
- 将细胞转移到15 mL锥形管中,用DPBS洗水井一次,以获得剩余的细胞。在500 x g下离心5分钟。
- 吸气上清液。将颗粒重新悬浮在2 mL的胰蛋白酶中,然后在37°C孵育15分钟。
- 使用含有10%血清的任何完整培养剂中和胰蛋白酶。在500 x g下离心5分钟。
- 吸气上清液。重新悬浮DPBS中的细胞,以去除残留的培养液、胰蛋白酶和血清。在500 x g下离心5分钟。
- 吸气上清液。在 BEGM 中重新悬浮,并将重新悬浮的细胞盘到凝固的 BMM 涂层培养皿上。再悬浮的细胞也可以直接镀在细胞培养皿上,作为单层进行增殖。有关唾液细胞作为单层生长的更多信息,请参阅第 6 节。在BMM或塑料上生长的细胞应每2~3天喂食一次新鲜的BEGM。
- 培养在加湿培养箱中的细胞保持在37°C与5%CO2。
6. 在经过处理的塑料组织培养皿上对沙地球进行分栽
注:如果将细胞作为单层在塑料上保持,则从此步骤开始。以下协议适用于在100毫米盘中生长的细胞。
- 吸气介质。用 DPBS 清洗一次以去除残余介质。
- 加入2 mL的胰蛋白酶,然后在37°C孵育15分钟,或直到细胞完全分离。
- 使用含有10%血清的任何完整培养剂使用4 mL中和胰蛋白酶。将细胞转移到15 mL锥形管中。
- 用大约 5 mL 的 DPBS 清洗一次板以收集剩余的细胞。在500 x g下离心5分钟。
- 吸气上清液。在 DPBS 的 6-10 mL 中重新悬浮细胞以去除残余介质。
- 在500 x g下离心5分钟。
- 吸出上清液,并在 BEGM 中重新悬浮。将细胞盘到经过处理的塑料组织培养皿上。每 2-3 天喂一次新鲜的 BEGM。
- 培养在加湿培养箱中的细胞保持在37°C与5%CO2。
7. 细胞冷冻保存
注:细胞的冷冻保存可以从源自盐层或单层生长细胞的单细胞悬浮液中完成。
- 计算造血细胞仪上的细胞,以计算存在的细胞总量。
- 在500 x g下离心5分钟。
- 吸气上清液。用10%二甲基亚硫酸盐(DMSO)在BEGM中重新悬浮颗粒。细胞的浓度应为2 x 106细胞/mL至10 x 106细胞/mL。
- 将异位细胞放入无菌低温储存管中。将管子放在绝缘泡沫架中,在-80°C孵育过夜,缓慢冻结细胞。
- 第二天,将管子放入液氮中进行长期储存。
注:细胞应在37°C处快速解冻。解冻后,应在500 x g处颗粒,并在电镀前去除含DMSO的介质。
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Representative Results
在将细胞从消化组织电镀到BMM后两三天,细胞将很容易形成小簇,每个簇的大小将继续扩大至15-20个细胞(图2A)。通常可以看到细胞碎片和分离的死细胞,应通过吸气和补充新鲜介质来清除。细胞将继续增殖为盐层约3-10天,或只要BMM层保持完整。有时,由于BMM的部分分解,细胞将附着在底层塑料上,并开始增殖为单层。生长在BMM上的盐层在尺寸和结构复杂性方面将表现出可变性。盐层可以通过将它们传递到新准备的BMM上,如协议中所述来维持。在传递到新的BMM后的2-3天内,细胞将变成球体。盐层细胞也可以被镀在细胞培养处理的塑料上,并成长为单层,它们表现出形态与上皮起源细胞一致,如图2B所示。虽然在BMM上生长的盐层细胞作为盐层可能保持唾液组织的表型更具有特征,但作为单层生长的细胞对于某些实验方案可能有利。需要进行更广泛的表征,以确定与作为脂肪层生长的细胞相比,在单层上生长的细胞在何种程度上保持唾液表型。
图 1:用于沙利层制备的人类亚曼地的初始处理。切除的唾液腺组织直径约1厘米(A),用锋利的剪刀(B)机械地切成小块,直到腺体被分离成大约1-2毫米大小的可消化块(C)。然后,在脱乳/胶原酶溶液中孵育腺片30-90分钟,定期通过血清学移液器,直到样品被消化到大部分单个细胞或小团细胞(D )。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:初级人类盐层细胞可以培养为基底膜基质上的球体,或作为经过处理的细胞培养皿上的单层。在唾液组织初步消化后,消化的腺体直接镀在BMM上,培养3-10天。细胞每2-3天喂食一次,以提供新鲜的营养。一旦初级脂肪层发育,基质可以消化在去帕西/胶原酶溶液中,试胰酶产生单个细胞,并重新镀入新鲜的BMM,在那里他们被改造成球体(A)或镀在细胞培养皿上,容易形成一个鹅卵石形态,典型的上皮单层 (B).请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
唾液功能障碍代表了对Sjögren综合征患者以及接受唾液腺3、4、5附近癌症放射治疗的人的生活质量的关注。 16.治疗这些病人的一种建议疗法是在体外生长功能性唾液干细胞或器官,然后可以插入受损的唾液腺,以取代受影响的组织9。此外,唾液腺通常是人类病原体的持久性和传播的场所。例如,人类疱疹病毒,如人类巨细胞病毒(HCMV)已知感染和使用唾液腺和唾液传播病毒到新的宿主7,8,17。唾液腺中病毒持久性和唾液运动的分子机制仍不得而知。体外唾液细胞系统的发展将为探索这种力学信息提供一个基本的模型系统。
我们在这里报告一个强大的协议,用于生成原发唾液"盐层",可以在体外生长为BMM上的簇或塑料上的单层。培养和繁殖人类原发性唾液腺上皮细胞的能力是一个重要的平台,研究人员可以(1)为唾液腺缺乏症患者开发替代疗法,而患者没有其他选择存在;(2)更好地了解唾液腺发育、增殖、分泌等基础生理;(3) 定义病原体用于复制和传播到新宿主的机制。
使用这些唾液细胞培养物,我们已经报告,HCMV需要五角糖蛋白复合物的主要感染,并且病毒持续较长时间,让人想起在体内HCMV发生的情况7。此外,我们的功能研究表明,唾液培养物不包含作为成纤维细胞的成纤维细胞,实验室适应的病毒无法感染和复制在主要的唾液衍生细胞7。虽然我们使用该协议生成细胞以评估HCMV复制并在一级唾液系统中传播,但该协议可以很容易地被调整,以产生可用于上述广泛研究课题的唾液细胞。此外,该协议可以进行调整,以适应每个研究人员的需要和预算。虽然我们还没有验证其他条件,但其他人已经报告在不同的培养条件下成功生长唾液上皮细胞。例如,Dulbeco的改性Eagle的介质(DMEM):F12混合物辅以表皮生长因子和成纤维细胞生长因子-2,已报告促进唾液细胞的强健生长18。或者,Nam等人在将细胞转移到角蛋白细胞生长培养基的无血清版本之前,使用与胎儿牛血清补充的最小基本介质,并报告在塑料15上唾液细胞的强劲增长。因此,唾液上皮细胞似乎并不表现出对一种特定介质类型的绝对要求,而是在一些商用介质类型上似乎生长和增殖。
除了介质配方外,还可以评估不同的基底膜配方支持强健的唾液上皮细胞生长的能力。在市售的基底膜基质上生长的细胞很容易产生沙地球,并提供一个简单,虽然昂贵的培养系统7,19。与上面讨论的细胞生长介质选择类似,研究人员已经报道了在许多不同的基质和水凝胶系统上沙地球的生长和发育。由透明质酸制成的水凝胶在创建与所需化学成分交联的细胞外基质方面具有额外的益处,以研究其相互作用和对细胞的影响。Srinivasan等人利用主要人类组织衍生的唾液细胞,报告在透明质酸水凝胶中唾液祖细胞群的生长和维持方面取得了成功;当水凝胶与从基底膜蛋白(如perlecan和laminin20)中提取的肽结合时,进一步观察到祖细胞生长增加。Foraida等人最近开发的另一个系统报告使用"电纺"来开发由聚物酸(乳胶-共糖酸)(PLGA)制成的纳米纤维支架。含有添加艾利他素的PLGA水凝胶被发现能促进极化亚明比细胞系统的发展,这可能有助于确定细胞极化如何影响唾液生物学和生物化学21。
在该协议中,我们提出了一种用于分离和生长原发性唾液腺衍生上皮细胞的简单方法。该协议导致上皮细胞群的快速外生长,平均可维持5-8个通道。在治疗过程中,使用消沉/胶原酶监测组织至关重要,以确保按照协议中提到的适当消化。不完全的消化会严重减少生存的脂肪球的数量。监测成纤维细胞的培养物,其生长具有拉长形状,并且与通常以离散斑块或团块生长的多边形上皮细胞截然不同,这一点也很重要。我们已经使用这个协议从人类和小鼠分离上皮细胞,但似乎它可以被调整用于其他哺乳动物系统。此外,该协议还可以通过使用基于细胞表面标记表达和流动细胞学的附加纯化步骤进一步修改,从而生成更均匀的初始细胞群。同样,该协议可用于确定不同的介质或基质/水凝胶配方如何导致特定细胞类型的生成,当第一次产生盐球。总之,该协议应成为一个可靠的起始平台,用于分离和生长原发性唾液细胞,这些细胞可以很容易地适应各种实验协议和研究领域。
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Disclosures
作者报告没有披露任何内容。
Acknowledgments
我们要感谢詹姆斯·布里奇斯就培养原细胞的方法提供了重要指导。Matthew J. Beucler 得到了国家卫生训练学院 T32-ES007250 的支持。这项工作还得到了国家卫生研究院授予威廉·米勒的R01-AI121028和R21-DE026267的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
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