Summary
足迹分析是数字化步态分析程序的低成本替代方案,用于研究人员量化小鼠的运动异常。由于其速度、简单性和纵向潜力,它是小鼠模型行为型型的理想选择。
Abstract
动物运动测量是一种常见的行为工具,用于描述特定疾病、损伤或药物模型的表型。这里所展示的低成本步态分析方法是一种简单但有效的测量鼠步态异常的方法。通过用无毒的可洗漆涂一个老鼠的脚,让受试者在一张纸上穿过隧道来分析脚印。测试隧道的设计利用了自然小鼠行为及其对小黑暗场所的亲和力。使用尺子和铅笔可以轻松测量每只鼠标的步长、步幅宽度和脚趾分布。这是一种成熟且可靠的方法,它生成多个类似于数字系统的指标。这种方法足够灵敏,可以检测表型表示的早期步幅变化,并且由于其非侵入性方法,它允许在寿命或表型表示中测试组。
Introduction
运动需要复杂的神经和肌肉骨骼协调,在运动路径的单一方面出现缺陷可以产生可观察到的步态异常1,2。盖特分析是研究人员测试小鼠模型的关键工具,因为它提供了可量化的行为数据,了解特定疾病、损伤或药物如何影响动物的运动3。然而,数字化步态分析需要购买跑步机、照相机和相关软件,这对研究人员来说可能非常昂贵。盖特分析经常间歇性地用于跟踪电机功能的纵向变化,因此,如果偶尔使用4,则很难证明支出的合理性。尽管数字化分析可能比简单的足迹分析提供更详细的步态指标,但这些更复杂的度量并不总是必要的,也并不总是与行为表型5的表征相关。
在这里,我们提出了一个低成本的手动足迹分析方法,作为一个快速和敏感的替代数字化步态分析程序6,7。人工足迹分析已被证明,以检测在众多的鼠病模型4,7,8,9,10,11的显著步态差异 ,12,13,14,15,16,17,和至少一个情况下, 这种低成本的方法识别步态的变化,没有检测到一个常见的数字化步态分析程序12。材料的总成本是象征性的,它可以很容易地适应其他啮齿动物研究模型。
虽然可以从中绘制数据,但我们描述的方法侧重于三个特定的指标:步长、步长宽度(又名"轨道宽度")和脚趾分布。必须指出,应逐个模型确定要评估的参数。这种步态分析方法不是用来测量认知功能的,也不推荐用于需要复杂的步态生物力学测量的研究。
我们提供来自一组症状前和症状后小鼠的行为数据,这些小鼠模拟X链接脊柱和布尔巴肌肉萎缩症(SBMA),这是一种神经肌肉疾病,其特征是运动神经元退化和肌肉萎缩。这些小鼠在步态中出现渐进性缺陷,与其他疾病特异性表型的发病一致。这证明了这种方法的有效性和特异性,并证实它可以可靠地区分受影响的和未受影响的动物。
本研究中的实验鼠为2.5岁(症状前)和9个月大(症状后)BAC fxAR121转基因小鼠,背景为C57BL/6(nexpt=12)。该模型在我们的实验室生成,并已被完全描述为SBMA9的强大鼠标模型。非转基因杂物用作对照(nctrl#8)。SBMA是一种性别限制疾病,只在雄性中完全显现出来,因此雄性小鼠被专门用于这项研究。在规划阶段,研究人员必须考虑到国家卫生研究院对性别作为生物变量的考虑,以确定群体的大小和组成18。
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Protocol
杜克大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)对小鼠进行的所有测试都经过审查和批准。负责测试和评分的人员必须对动物基因型或实验条件视而不见,直到整个队列完成步态分析和论文评分。
1. 测试材料准备
- 使用 3 块厚度为 0.375 英寸的预切割透明丙烯酸面板建造的隧道进行测试。将面板与密封剂结合在一起组装隧道,这种密封剂专门粘结丙烯酸,干燥时不会散发出异味。
- 对于标准 C57BL/6 鼠标,使用以下隧道测量值:2.5 in.宽、3 in.高和 13 in 长。老鼠必须能够舒适地穿过隧道,并采取足够的步骤(>4),以便可以测量步态。
- 用预切灰色丙烯酸板0.375英寸厚,用隧道上相同的密封剂粘在一起建造目标室。室内测量值为 4 英寸宽、4 英寸长和 3 英寸高。将此腔室的开口与隧道的开口(2.5 英寸宽 x 3.0 英寸高)相匹配。因为老鼠自然更喜欢暗空间而不是光线充足的空间,因此使用不透明和深色的材料。
- 使用纸张跟踪厚而光滑的步骤(水彩纸效果良好)。切纸条略宽,长于隧道的宽度和长度。如果使用此处描述的隧道尺寸,将纸张切割为 15 in.长 3.5 in. 宽。
- 使用两种对比色(如绿色和紫色)的无毒水性涂料。为后肢指定一种颜色,为前肢指定第二种颜色。老鼠在测试后会上剩余的油漆 , 所以选定的油漆必须完全无毒。
- 使用两个圆形桶刷,每幅油漆颜色一个(直径约0.5厘米,锥形/尖刷笔尖)。
- 选择一个标尺,其标记低于毫米,和卡尺的测量低于0.1毫米。 铅笔建议写在评分纸上。
- 可选:对于焦虑情绪高或动机低的动物,在目标室中提供行为激励。这可能包括少量灭菌的葵花籽(在测试前2天放入家庭笼子,以便习惯)。在测试当天,将葵花籽放入目标室,以鼓励老鼠不停的行走。
2. 数据收集
- 如果在单独的房间进行测试,让小鼠适应新房间30分钟,然后开始行为测定。此外,由于小鼠是自然夜间的,确保所有小鼠在测试前完全清醒并提醒至少5分钟。
- 通过在纸张上放置隧道,并用鼠标 ID 和测试日期标记纸张来准备测试设置。将目标室放置在隧道末端,连接两个开放端。如果需要,在隧道末端(目标室内)添加向日葵种子以激发动力。
- 将要测试的老鼠从笼子里取出,用毛骨牢牢地抓住它,确保抓住尾巴以稳定后肢的运动。
- 油漆前爪,使所有脚趾和脚的中心全部覆盖油漆的整个下侧。重复这个与油漆的后爪的对比色。用干净的湿布擦去鼠标在身体其他部位上的任何油漆,以防止可能干扰数据收集的污迹。
注:鼠标处理必须由经验丰富的研究人员执行,以尽量减少动物压力。 - 将鼠标放在隧道的开头,让它一直走到球门室,然后取回鼠标,用防水布轻轻擦去它的脚,然后把它送回家里的笼子。
- 在打分之前,让有脚印的纸张完全干燥。在每个动物之间用乙醇或等效的清洁溶液擦拭测试区域和隧道。
3. 评分标准
- 使用始终以清晰、无污迹的脚印间隔的步骤进行评分。图 1B是可以评分的占用空间序列的一个好示例。为了生成足够的评分数据,每英尺必须至少连续走 2 步,但建议每英尺 4-6 步。不要在纸上包括第一个和最后一个脚印,因为它们不太可能代表正常的步态,因为鼠标正在改变其行走速度。
- 使用步长、步宽和脚趾分布作为三种不同的步态度量,可以使用此方法进行分析。
注: 步长和宽度要求在油漆中明确定义前脚区域的地方进行清晰的顺序打印。脚趾传播不需要顺序打印进行评分,只需在单脚上清晰打印第一个和最后一个脚趾。但是,如果给定的足迹未包含在步长或宽度的测量中,则无法为脚趾传播评分。所有三个度量均以厘米为单位进行评估。- 将步长定义为由同一英尺(即一个步长)创建的两个顺序足迹之间的距离(图 1A,1B)。
- 用铅笔在两个前肢脚印的前脚区域周围绘制一个 2-4 mm 的圆圈(通过上面指定的颜色标识),并用标尺在它们之间画一条线。
- 将每个圆的中间(即每个脚垫的中心)的两个打印件之间的距离记录为右前 1 (RF1) 或左前 1 (LF1)。
- 对可以评分的所有步骤(RF2、LF2、RF3、LF3 等)重复上述步骤。
- 对左右后肢脚印重复上述步骤。
- 平均每个肢体的所有个人记录的步长距离。对于统计分析,单个队列成员可以一起求平均值。
- 将步幅宽度定义为左右前肢或后肢之间的距离度量(图1A,1B)。
- 要评估此距离,从一个后肢的圆前脚区域绘制和测量一条线,该区域与反向后肢上的步长线垂直相交。
- 对于可以评分的所有后肢打印重复此操作,然后对测量值进行平均。步幅宽度的计算方法与前肢和后肢相同。
- 将脚趾扩散定义为单个前肢或后肢外周外周的第一个和最后一个脚趾之间的距离(图1A,1B)。
- 使用卡钳测量第一个脚趾打印的尖端和最后一个脚趾打印的尖端之间的距离。
- 对所有可评分的后肢打印重复上述步骤,并平均测量值。脚趾扩散的计算方法对于前肢和后肢相同。
- 将步长定义为由同一英尺(即一个步长)创建的两个顺序足迹之间的距离(图 1A,1B)。
- 如果纸张无法评分,请让动物休息 10 分钟,然后再尝试。
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Representative Results
由于动物数量充足,这个程序能够检测小鼠基因型之间的步态差异,随着时间的推移,在相同的应变内。图1B显示了在我们的实验室收集的足迹图像的代表性痕迹,使用X链接脊柱和布尔巴肌肉萎缩(SBMA)的小鼠模型,这是一种影响下部运动神经元和骨骼肌的神经退行性疾病。我们以前曾报道过,雄性BACfxAR121转基因小鼠与非转基因杂物对照组相比,在症状后年龄出现显著体重减轻、抓地力受损和步长缩短。
在这里,我们介绍从一组症状前(2.5个月大)和后症状(9个月大)的步态分析结果(图2)。在发病前,BAC fxAR121转基因小鼠表现出与非转基因对照相比,其步幅长度、步幅宽度和脚趾分布情况相似。发病后,BAC fxAR121转基因小鼠的步幅明显缩短(p前肢= 0.001,p后肢= 0.009)(图2A)。类似的纵向分析表明,在测试的两个年龄(p2.5 个月=0.709,p9 个月=0.204)的步幅宽度没有差异(图2B)。症状后BAC fxAR121转基因小鼠的后脚趾传播(p=0.01)也明显小于年龄匹配的乱幼崽对照组(图2C)。BAC fxAR121小鼠模拟一种主要影响后肢的神经肌肉疾病,因此没有收集前肢步态的详细测量。我们鼓励研究人员使用这种步态分析方法考虑其小鼠模型的表型,并相应地选择前肢或后肢步态指标。
图1:盖特分析测量和故障排除。
A.在小鼠上进行步态分析的图式表示,描述步长、步幅宽度和脚趾传播信息。B.可以评分的步态分析足迹序列的代表性示例,描述所有三个参数的测量。C. 无法评分的问题步态分析足迹序列的代表性示例。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:SBMA BAC fxAR121转基因小鼠表现出一种渐进性、神经退行性步态,可通过步态分析检测出来。
A.尽管在症状前年龄(2.5个月,nctl=11,nexpt=12)没有差异,BAC fxAR121小鼠在症状后阶段与非转基因的杂物对照相比,步幅明显缩短(9月,nctl#8,nexpt=12)。B.在任一年龄都未检测到步幅宽度的变化.C.症状SBMA BAC fxAR121转基因小鼠表现出显著减少后肢脚趾传播相比,非转基因的杂物对照。N= 8-12/组。带后点位图基测试的 ANOVA = p < 0.05, = p < 0.01。错误栏代表SEM。请点击这里查看此图的较大版本。
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Discussion
采用上述低成本步态分析方法,在SBMA的BAC fxAR121小鼠模型中,成功地识别了症状后年龄的步态功能障碍的几个参数。步幅长度的减小与先前SBMA对小鼠模型和人类患者的研究一致。我们还首次表明,与非转基因的杂物对照相比,有症状的SBMA小鼠的后肢脚趾扩散存在显著差异。有趣的是,后脚趾扩张的减少可能是由爪子扩张肌肉的虚弱、爪子屈肌的紧绷或神经内侧不良2,19引起,这也与SBMA的病因一致。
由于老鼠对小暗空间的自然行为偏好,它们应该很容易地跑到目标室,但有些老鼠可能不会连续地穿过隧道。如果鼠标在隧道内跳跃、停止或转动(参见图1C中的示例),在新的评分纸上重复一段时间的休息后进行测定。如果鼠标在隧道的开头停止,结果可能是可以挽救的,因为它通常可以轻轻推动运行到目标框。
在鼠标脚上涂太多或过少的油漆会产生无法使用的结果。过度的油漆会导致打印污迹斑斑或扭曲,而油漆不足会产生模糊或无法识别的打印(图1C)。在这两种情况下,在干净的评分纸上重复测定,以防止测量不准确。
非常年轻的小鼠(<3个月大)更有可能在隧道中向前跳跃,而年龄较大的(>8个月大)或非常表型的小鼠更有可能完全停止或抵抗向前运动。在目标室中添加行为激励(向日葵种子)可以帮助减少问题行为的频率,鼓励没有动力的老鼠在不停止的情况下穿越隧道。
隧道尺寸应反映主体的尺寸;如果使用比普通实验鼠大或小得多的小鼠(由于年龄、饮食或基因突变),我们建议更改隧道和球室尺寸以匹配动物的大小。在隧道里,老鼠应该能够沿着直线舒适地行走,但是应该有一些困难来阻止这种行为。球室应与隧道的高度相匹配,小鼠应舒适地放入室内。
研究人员使用脚趾剪法识别他们的老鼠可能无法收集脚趾传播的数据,但其他步态测量,如步长和步幅宽度仍然可以收集。只要每只老鼠20只脚趾不超过两个脚趾,脚趾削对小鼠的步态没有显著影响。
这种步态分析方法不反映认知功能,因此不应作为认知的度量。打算使用此方法的其他人应考虑其小鼠模型中受影响的神经肌肉组,然后相应地选择前肢或后肢指标。对于研究需要脚垫注射的疼痛反应的研究人员,或需要生物力学测量不能仅用脚印来描述的运动的研究,如肢体的时间测量,不推荐采用这种步态分析方法。运动或联合旋转21。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢A.M.提供的动物鉴定援助。这项工作得到了美国国家卫生研究院(R01 7 RF1 AG057264 至 A.R.L.S.和 C.J.C.和 R01 NS100023 到 A.R.L.S) 和肌肉萎缩协会(基础研究补助金给 A.R.L.S.S.,发展赠款给 C.J.C.S.)的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Caliper | n/a | n/a | must have markings down to 0.1 mm |
| Craft Glue | E6000 | n/a | |
| Footprint Paint (Tempera Paint) | Artmind | n/a | must be non-toxic |
| Round Barrel Paintbrushes | Symply Simmons | n/a | 0.5 cm diameter |
| Ruler | n/a | n/a | must have markings down to millimeters |
| Scoring Paper (Watercolor Pads) | Canson | n/a | cut to size |
| Tunnel and Goal Chamber | Interstate Plastics | n/a | cut to size |
References
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