Summary
L'analisi dell'impronta è un'alternativa a basso costo ai programmi di analisi dell'andatura digitalizzata per i ricercatori che quantificano le anomalie di movimento nei topi. A causa della sua velocità, semplicità e potenziale longitudinale, è ideale per la fenotipizzazione comportamentale dei modelli murini.
Abstract
La misurazione della locomozione animale è uno strumento comportamentale comune utilizzato per descrivere il fenotipo di una determinata malattia, lesione o modello di farmaco. Il metodo a basso costo di analisi dell'andatura qui dimostrato è una misura semplice ma efficace delle anomalie dell'andatura nei modelli murini. Le impronte vengono analizzate dipingendo i piedi di un topo con vernice lavabile non tossica e permettendo al soggetto di camminare attraverso un tunnel su un foglio di carta. La progettazione del tunnel di prova sfrutta il comportamento naturale del mouse e la loro affinità per piccoli luoghi bui. La lunghezza del passo, la larghezza del passo e la diffusione dei piedi di ogni mouse sono facilmente misurabili utilizzando un righello e una matita. Si tratta di un metodo consolidato e affidabile e genera diverse metriche analoghe ai sistemi digitali. Questo approccio è abbastanza sensibile da rilevare cambiamenti nel passo all'inizio della presentazione del fenotipo, e a causa del suo approccio non invasivo, consente di testare i gruppi attraverso la durata della vita o la presentazione fenotipica.
Introduction
Locomotion richiede complessa coordinazione neurologica e muscolo-scheletrica, e deficit in un singolo aspetto delle vie motorie in grado di produrre anomalie di andatura osservabili1,2. L'analisi dell'andatura è uno strumento fondamentale per i ricercatori che testano modelli murini perché fornisce dati comportamentali quantificabili su come una determinata malattia, lesione o il farmaco influisce sul movimento di un animale3. Tuttavia, l'analisi dell'andatura digitalizzata richiede l'acquisto di un tapis roulant, una fotocamera e un software associato, che può essere proibitivo costoso per i ricercatori. L'analisi dell'andatura viene spesso utilizzata in modo intermittente per monitorare i cambiamenti longitudinali nella funzione motoria, quindi può essere difficile giustificare la spesa se sporadicamente utilizzato4. Anche se le analisi digitalizzate possono fornire metriche dell'andatura più dettagliate rispetto alla semplice analisi dell'impronta, queste misure più complesse non sono sempre necessarie o rilevanti per la caratterizzazione di un fenotipo comportamentale5.
Qui presentiamo un metodo di analisi manuale dell'impronta a basso costo come alternativa rapida e sensibile ai programmi di analisi dell'andatura digitalizzati6,7. L'analisi manuale dell'impronta è stata dimostrata per rilevare significative differenze di andatura in una moltitudine di modelli di malattia murina4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, e in almeno un caso, questo metodo a basso costo ha identificato le modifiche dell'andatura che non sono stati rilevati da un comune programma di analisi dell'andatura digitalizzata12. Il costo totale dei materiali è nominale e può essere facilmente adattato ad altri modelli di ricerca sui roditori.
Mentre ci sono molte metriche di andatura diverse da cui i dati possono essere disegnati, il metodo che descriviamo si concentra su tre metriche specifiche: lunghezza del passo, larghezza del passo (noto anche come "larghezza traccia"), e la diffusione dei piedi. È importante notare che i parametri da valutare devono essere determinati in base al modello. Questo metodo di analisi dell'andatura non è progettato per misurare la funzione cognitiva, e non è raccomandato per studi che richiedono complesse misurazioni biomeccaniche dell'andatura16.
Presentiamo dati comportamentali provenienti da una coorte di topi pre e post-sintomatici che modellano l'atrofia muscolare X-linked (SBMA), una malattia neuromuscolare caratterizzata dalla degenerazione del motoneurone e dall'atrofia muscolare. Questi topi sviluppano deficit progressivi nell'andatura che coincidono con l'insorgenza di altri fenotipi specifici della malattia. Ciò dimostra la validità e la specificità di questo metodo e conferma che può distinguere in modo affidabile tra gli animali colpiti e quelli non affetti.
I topi sperimentali in questo studio erano topi transgenici BAC fxAR121 di 2,5 (pre-sintomatici) e 9 mesi (post-sintomatici) su uno sfondo C57BL/6 (nexptn. 12). Questo modello è stato generato nel nostro laboratorio ed è stato completamente caratterizzato come un potente modello di mouse di SBMA9. Le lettiere non transgeniche sono state usate come controlli (nctrln. 8). SBMA è una malattia a scambio limitata che si manifesta completamente solo nei maschi, quindi i topi maschi sono stati utilizzati esclusivamente per questo studio. Durante le fasi di pianificazione, i ricercatori devono prendere in considerazione le considerazioni del sesso da parte dei National Institutes of Health come variabile biologica per determinare le dimensioni del gruppo e la composizione18.
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Protocol
Tutti i test condotti con i topi sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Duke University. Il personale responsabile dei test e del punteggio deve essere accecato al genotipo animale o alle condizioni sperimentali fino a quando l'analisi dell'andatura e il punteggio dei documenti non sono stati completati per l'intera coorte.
1. Preparazione del materiale di prova
- Condurre test con un tunnel costruito da 3 pannelli acrilici chiari pre-tagliati che sono spessi 0,375 pollici. Assemblare il tunnel incollando i pannelli insieme a un sigillante che lega specificamente l'acrilico e non emette odori quando essiccato.
- Per i mouse Standard C57BL/6, utilizzare le seguenti misurazioni del tunnel: 2.5 in. larghi, 3 in. alti e 13 in. long. I topi devono essere in grado di camminare comodamente attraverso il tunnel e fare abbastanza passi (>4) in modo che l'andatura possa essere misurata.
- Costruire la camera obiettivo con pannelli acrilici grigi pre-tagliati 0.375 pollici di spessore, incollato insieme con lo stesso sigillante utilizzato sul tunnel. Le misure interne della camera sono 4 in. ampia, 4 in. di lunghezza e 3 in. Abbinare l'apertura di questa camera all'apertura del tunnel (2,5 in. larghezza x 3.0 in. altezza). Poiché i topi preferiscono naturalmente gli spazi scuriti agli spazi ben illuminati, utilizzare materiale di colore opaco e scuro.
- Utilizzare la carta per tenere traccia dei passaggi spessi e lisci (la carta ad acquerello funziona bene). Tagliare le singole strisce di carta per essere leggermente più larghe e più lunghe della larghezza e della lunghezza del tunnel. Se si utilizzano le dimensioni del tunnel descritte qui, tagliare le carte a 15 in. long di 3.5 in. di larghezza.
- Utilizzare due colori contrastanti (ad esempio, verde e viola) di vernice a base d'acqua lavabile non tossica. Assegnare un colore per gli arti posteriori, il secondo per gli arti anteriori. I topi lcelmeranno la vernice rimanente dai loro piedi dopo il test, quindi la vernice selezionata deve essere completamente non tossica.
- Utilizzare due pennelli a botte rotondi, uno per ogni colore di vernice (0,5 cm di diametro, punta del pennello rastremato/appuntito).
- Selezionare un righello con marcature fino a millimetri e una pinza con misure fino a 0,1 mm. Matita si consiglia di scrivere sulle carte di punteggio.
- Facoltativo: Per gli animali con alta ansia o bassa motivazione, fornire un incentivo comportamentale nella camera obiettivo. Questo può includere piccole quantità di semi di girasole sterilizzati (posizionati nella gabbia di casa 2 giorni prima del test per consentire l'assuefazione). Il giorno della prova, posizionare i semi di girasole all'interno della camera obiettivo per incoraggiare i topi a camminare senza fermarsi.
2. Raccolta dei dati
- Se il test viene eseguito in una stanza separata, acclimatari i topi nella nuova stanza per 30 minuti e quindi avviare i test comportamentali. Inoltre, poiché i topi sono naturalmente notturni, assicurarsi che tutti i topi siano completamente svegli e attenti per almeno 5 minuti prima del test.
- Preparare la configurazione del test posizionando il tunnel sulla carta e contrassegnando la carta con l'ID del mouse e la data di test. Posizionare la camera obiettivo alla fine del tunnel, collegando entrambe le estremità aperte. Aggiungere i semi di girasole alla fine del tunnel (all'interno della camera obiettivo) per la motivazione, se necessario.
- Rimuovere il mouse da testare dalla sua gabbia e afferrarlo saldamente per la sua misto, assicurandosi di afferrare la coda per stabilizzare il movimento degli arti posteriori.
- Dipingere le zampe anteriori in modo che l'intera parte inferiore di tutte le diciture e il centro del piede sono completamente coperti di vernice. Ripetere questo con un colore contrastante di vernice sulle zampe posteriori. Pulire qualsiasi vernice che il mouse ottiene su altre parti del suo corpo con un panno umido pulito per evitare macchie che possono interferire con la raccolta dei dati.
NOTA: La movimentazione del mouse deve essere eseguita da ricercatori esperti per ridurre al minimo lo stress degli animali. - Posizionare il mouse all'inizio del tunnel e lasciarlo camminare fino alla camera di meta, e poi recuperare il mouse, pulire delicatamente i piedi con un panno smorzato d'acqua, e riportarlo alla sua gabbia di casa.
- Lasciare asciugare completamente la carta con impronte prima del punteggio. Pulire l'area di prova e il tunnel con etanolo o una soluzione di pulizia equivalente tra ogni animale.
3. Criteri di punteggio
- Utilizzare i passaggi che sono costantemente distanziati con impronte chiare e non sbavate per il punteggio. Figura 1B è un buon esempio di una sequenza di impronte che può essere valutata. Per generare dati di punteggio sufficienti, ci devono essere almeno 2 passi consecutivi da ogni piede, ma si consigliano 4-6 passi per piede. Non includere la prima e l'ultima impronta sulla carta, in quanto è improbabile che rappresentino l'andatura normale perché il mouse sta cambiando la sua velocità di camminata.
- Utilizzare la lunghezza del passo, la larghezza del passo e la diffusione del dito come tre diverse misure di andatura che possono essere analizzate utilizzando questo metodo.
NOTA: la lunghezza e la larghezza dello stride richiedono stampe sequenziali chiare in cui la regione dell'avampiede è ben definita nella vernice. La diffusione della toe non richiede stampe sequenziali per il punteggio, ma solo stampe chiare della prima e dell'ultima dicitula su un solo piede. Tuttavia, se una determinata impronta non è inclusa nelle misure di lunghezza o larghezza del passo, non può essere segnata per la diffusione dei dicidi. Tutte e tre le misure sono valutate in centimetri.- Definire la lunghezza del passo come la distanza tra due impronte sequenziali create dallo stesso piede (cioè un passo) (Figura 1A, 1B).
- Con una matita, disegna un cerchio di 2-4 mm intorno alla regione anteriore di entrambe le impronte degli arti anteriori (identificate dal colore assegnato sopra) in un unico passo e traccia una linea tra di esse usando un righello.
- Registrare la distanza tra due stampe dal centro di ogni cerchio (cioè al centro di ogni pedale) come Right-Fore 1 (RF1) o Left-Fore 1 (LF1).
- Ripetere l'operazione per tutti i passaggi che possono essere segnati (RF2, LF2, RF3, LF3 e così via).
- Ripetere l'operazione per le impronte degli arti posteriori destro e sinistro.
- Media di tutte le singole distanze di passo registrate per ogni arto. Per l'analisi statistica, i singoli membri della coorte possono essere mediati insieme.
- Definire la larghezza del passo come misura della distanza tra gli arti anteriori o posteriori sinistro e destro (Figura 1A, 1B).
- Per valutare questa distanza, disegnare e misurare una linea dalla regione dell'avampiede cerchiato di un arto posteriore che interseca perpendicolarmente con la linea per la lunghezza del passo sull'arto posteriore contralaterale.
- Ripetere questa operazione per tutte le stampe degli arti posteriori che possono essere segnate e quindi calcolare la media delle misurazioni. Il metodo di calcolo per la larghezza del passo è lo stesso per gli arti anteriori e posteriori.
- Definire la distesa dei piedi come distanza tra la prima e l'ultima punta su un singolo ingombro anteriore o posteriore (Figura 1A, 1B).
- Utilizzare le pinze per misurare la distanza tra la punta della prima stampa del dito del piedi e la punta dell'ultima stampa dell'ultimo dito.
- Ripetere l'operazione per tutte le stampe degli arti posteriori che possono essere segnate e calcolare la media delle misurazioni. Il metodo di calcolo per la diffusione delle alci è lo stesso per gli arti anteriori e posteriori.
- Definire la lunghezza del passo come la distanza tra due impronte sequenziali create dallo stesso piede (cioè un passo) (Figura 1A, 1B).
- Se la carta non può essere segnata, lasciare riposare l'animale per 10 minuti prima di riprovare.
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Representative Results
Con un numero sufficiente di animali, questa procedura è in grado di rilevare le differenze di andatura tra i genotipi del topo, entro la stessa varietà nel tempo. La figura 1B mostra tracce rappresentative delle immagini dell'impronta raccolte nel nostro laboratorio, utilizzando un modello murino di Atrofia Muscolare Spinale e Bulbar (SBMA), un disturbo neurodegenerativo che colpisce i neuroni motori inferiori e il muscolo scheletrico. Abbiamo precedentemente riferito che i topi transgenici BAC fxAR121 maschi sviluppano una significativa perdita di peso, menomazioni della forza di presa e ridotta lunghezza del passo a età post-sintomatica rispetto ai controlli non transgenici della lettiera9.
Qui presentiamo i risultati dell'analisi dell'andatura da una coorte di topi maschi di controllo pre-sintomatica (2,5 mesi) epost-sintomatica (9 mesi di età) BAC Prima dell'insorgenza della malattia, i topi transgenici BAC fxAR121 mostrano una lunghezza del passo, la larghezza del passo e la diffusione della dicia in quanto i loro controlli non transgenici. Dopo l'insorgenza della malattia, i topi transgenici BACfxAR121 mostrano una lunghezza del passo significativamente più corta (p premonitori - 0,001, plimbposteriore - 0,009) (Figura 2A). Un'analisi longitudinale simile non ha rivelato differenze nella larghezza del passo a entrambe le età testate (p.2,5 mesi0,709, p.9mesi0,204) (Figura 2B). Anche i topi transgenici BAC fxAR121 post-sintomatici hanno una diffusione delle piedi posteriore significativamente più stretta (p.0,01) rispetto ai controlli della lettiera corrispondente all'età (Figura 2C). I topi BAC fxAR121 modellano una malattia neuromuscolare che colpisce principalmente gli arti posteriori, quindi non sono state raccolte misure dettagliate dell'andatura degli arti anteriori. Incoraggiamo i ricercatori a utilizzare questo metodo di analisi dell'andatura a considerare il fenotipo dei loro modelli murini e a scegliere di conseguenza le metriche dell'andatura degli arti anteriori o degli arti posteriori.
Figura 1: Misure di analisi dell'andatura e risoluzione dei problemi.
R.Rappresentazione schematica dell'analisi dell'andatura sui topi, che raffigura la lunghezza del passo, la larghezza del passo e le informazioni di diffusione dei piedi. B.Esempio rappresentativo di una sequenza di impronta di analisi dell'andatura che può essere valutata, raffigurante la misurazione di tutti e tre i parametri. C.Esempi rappresentativi di sequenze di impronta di analisi dell'andatura problematica che non possono essere valutate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I topi transgenici SBMA BAC fxAR121 presentano un fenotipo progressivo dell'andatura neurodegenerativa che può essere rilevato tramite l'analisi dell'andatura.
A. Nonostante le differenze in età pre-sintomatica (2,5 mesi, nctl11, nexpt12), i topi BAC ARAR121 sviluppano una lunghezza del passo significativamente ridotta rispetto ai loro controlli non transgenici della lettiera in fasi post-sintomatiche (9 mesi, nctln 8, nexpt12). B. Non sono state rilevate variazioni nella larghezza del passo a entrambe le età. C.I topi transgenici SBMA BAC fxAR121 mostrano una significativa riduzione della diffusione della punta degli arti posteriori rispetto ai controlli non transgenici della lettiera. 8-12/gruppo. ANOVA con test tukey post-hoc - p < 0,05, p < 0,01. Le barre di errore rappresentano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando il metodo di analisi dell'andatura a basso costo descritto in precedenza, mostriamo con successo l'identificazione di diversi parametri di disfunzione dell'andatura in età post-sintomatica nel modello murino BAC FXAR121 di SBMA. Le diminuzioni della lunghezza del passo sono coerenti con gli studi SBMA precedenti di modelli murini e pazienti umani9. Mostriamo anche per la prima volta che ci sono differenze significative nella diffusione delle zampe degli arti posteriori nei topi sintomatici SBMA rispetto ai controlli non transgenici della lettiera. È interessante notare che, diminuzioni nella diffusione delle piedi posteriori possono essere causate da debolezza nei muscoli estensori delle zampe, tenuta nei muscoli flessori delle zampe, o scarsa innervazione nervosa2,19, che è anche coerente con l'eziologia di SBMA.
I topi dovrebbero facilmente correre alla camera obiettivo a causa della loro naturale preferenza comportamentale per piccoli spazi scuri, ma alcuni topi potrebbero non muoversi continuamente attraverso il tunnel. Se un mouse salta, arresta o gira all'interno del tunnel (vedere esempi nella Figura 1C), ripetere l'esempio dopo un periodo di riposo su una nuova carta da punteggio. I risultati possono essere recuperabili se un topo si ferma all'inizio del tunnel poiché spesso può essere delicatamente spinto a correre verso la scatola degli obiettivi.
Applicare troppo o troppo poca vernice ai piedi di un topo può produrre risultati inutilizzabili. La vernice in eccesso può portare a stampe sbavate o distorte, mentre la vernice insufficiente può produrre stampe deboli o non identificabili (Figura 1C). In entrambi i casi, ripetere il saggio su una carta da punteggio pulita per evitare misurazioni imprecise.
I topi molto giovani (<3 mesi) hanno maggiori probabilità di saltare in avanti nel tunnel, mentre i topi più anziani (>8 mesi) o molto fenotipici hanno maggiori probabilità di fermare o resistere completamente al movimento in avanti. L'aggiunta di un incentivo comportamentale (semi di girasole) nella camera obiettivo può aiutare a ridurre la frequenza dei comportamenti problematici incoraggiando i topi non motivati ad attraversare il tunnel senza fermarsi.
Le dimensioni del tunnel devono riflettere le dimensioni del soggetto; se si utilizzano topi significativamente più grandi o più piccoli di un topo da laboratorio medio (a causa di età, dieta o mutazioni genetiche), si consiglia di modificare le dimensioni del tunnel e della camera obiettivo in modo che corrispondano alle dimensioni dell'animale. Nel tunnel, i topi dovrebbero essere in grado di camminare comodamente in linea retta, ma dovrebbero avere qualche difficoltà a girarsi per scoraggiare questo comportamento. La camera di meta dovrebbe corrispondere all'altezza del tunnel e i topi dovrebbero adattarsi comodamente all'interno della camera.
I ricercatori che utilizzano il metodo di identificazione del ritaglio delle alci per i loro topi potrebbero non essere in grado di raccogliere dati sulla diffusione delle piedi, ma altre misure di andatura come la lunghezza del passo e la larghezza del passo possono ancora essere raccolte. Il ritaglio dei toni non influisce in modo significativo sull'andatura nei topi finché non più di due diciture vengono ritagliate per mouse20.
Questo metodo di analisi dell'andatura non riflette la funzione cognitiva, quindi non dovrebbe essere utilizzato come misura della cognizione. Altri che intendono utilizzare questo metodo dovrebbero prendere in considerazione i gruppi neuromuscolari colpiti nel loro modello di topo, e quindi scegliere le metriche degli arti anteriori o posteriori di conseguenza. Questo metodo di analisi dell'andatura non è raccomandato per i ricercatori che studiano le risposte al dolore che richiedono iniezioni di pad del piede, o per studi che richiedono misure biomeccaniche della locomozione che non possono essere descritte solo dalle impronte, come le misurazioni temporali degli arti movimento o rotazione del giunto21.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare A.M. per l'assistenza all'identificazione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni degli Stati Uniti National Institutes of Health (R01 7 RF1 AG057264 ad A.R.L.S. e C.J.C. e R01 NS100023 ad A.R.L.S) e dalla Muscular Dystrophy Association (Basic Research Grant to A.R.L.S., Development Grant to C.J.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Caliper | n/a | n/a | must have markings down to 0.1 mm |
| Craft Glue | E6000 | n/a | |
| Footprint Paint (Tempera Paint) | Artmind | n/a | must be non-toxic |
| Round Barrel Paintbrushes | Symply Simmons | n/a | 0.5 cm diameter |
| Ruler | n/a | n/a | must have markings down to millimeters |
| Scoring Paper (Watercolor Pads) | Canson | n/a | cut to size |
| Tunnel and Goal Chamber | Interstate Plastics | n/a | cut to size |
References
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