Summary
Footprint analyse er en lav-bekostning alternativ å digitalisert gange analyse planer for forskning kvantifisere bevegelse unormalt inne mus. På grunn av sin hastighet, enkelhet, og langsgående potensial, er det ideelt for atferds bestemmelse av fenotype av musemodeller.
Abstract
Måling av dyr bevegelse er et felles atferds verktøy som brukes for å beskrive fenotype av en gitt sykdom, skade, eller medikament modell. Den rimelige metoden for gange analyse demonstrert her er en enkel, men effektiv måling av gange unormalt i murine modeller. Fotavtrykk analyseres ved å male en mus føtter med ikke-giftig vaskbar maling og la motivet til å gå gjennom en tunnel på et ark. Utformingen av testing tunnelen utnytter naturlig mus atferd og deres affinitet for små mørke steder. Skrittlengde, stride bredde, og tå spredning av hver mus er lett måles ved hjelp av en linjal og en blyant. Dette er en veletablert og pålitelig metode, og det genererer flere beregninger som er analoge til digitale systemer. Denne tilnærmingen er følsom nok til å oppdage endringer i skrittlengde tidlig i fenotype presentasjon, og på grunn av sin ikke-invasiv tilnærming, tillater det for testing av grupper på tvers av livet-span eller fenotypiske presentasjon.
Introduction
Bevegelse krever kompleks nevrologisk og muskel koordinering, og underskudd i et enkelt aspekt av motor trasé kan produsere Observer gange unormalt1,2. Gange analyse er et kritisk verktøy for forskere testing mus modeller fordi det gir målbare atferdsdata om hvordan en gitt sykdom, skade, eller narkotika virkninger et dyrs bevegelse3. Men digitalisert gange analyse krever kjøp av en tredemølle, et kamera, og tilhørende programvare, som kan være uoverkommelig dyrt for forskere. Gange analyse brukes ofte periodevis å spore langsgående endringer i motorisk funksjon, derfor kan det være vanskelig å rettferdiggjøre utgiftene hvis sporadisk brukt4. Selv om digitalisert analyser kan gi mer detaljerte gange beregninger enn enkle fotavtrykk analyse, disse mer komplekse tiltak er ikke alltid nødvendig eller relevant for karakterisering av en atferdsdata fenotype5.
Her presenterer vi en rimelig manuell fotavtrykk analysemetode som en rask og følsom alternativ til digitalisert gange analyseprogrammer6,7. Manuell fotavtrykk analyse er blitt demonstrert for å påvise betydelige gange forskjeller i en rekke murine sykdoms modeller4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, og i minst ett tilfelle, denne rimelige metoden identifisert endringer i gange som ble ikke oppdaget av et felles digitalisert gange analyse program12. Den totale kostnaden av materialer er nominell, og det kan lett tilpasses andre gnager forskning modeller.
Mens det er mange forskjellige gange beregninger som data kan trekkes, den metoden vi beskriver fokuserer på tre spesifikke beregninger: skrittlengde, stride bredde (aka "sporbredde"), og tå spredt. Det er viktig å merke seg at parametrene som skal vurderes bør fastsettes på en modell-by-modell basis. Denne metoden for gange analyse er ikke utformet for å måle kognitiv funksjon, og det er ikke anbefalt for studier som krever komplekse biomekaniske målinger av gange16.
Vi presenterer atferdsdata fra en kohort av pre-og post-symptomatisk mus modellering X-knyttet spinal og Bulbar muskel atrofi (SBMA), en nevromuskulær sykdom preget av motoriske Nevron degenerasjon og muskel atrofi. Disse musene utvikler progressive underskudd i gange som sammenfaller med utbruddet av andre sykdoms-spesifikke fenotyper. Dette demonstrerer gyldigheten og spesifisitet av denne metoden, og bekrefter at det kan sikkert diskriminere mellom berørte og ikke-rammede dyr.
De eksperimentelle musene i denne studien var 2,5 (pre-symptomatisk) og 9-måneders gammel (post-symptomatisk) BAC fxAR121 transgene mus på en C57BL/6 bakgrunn (nexpt= 12). Denne modellen ble generert i laboratoriet vårt og har blitt fullt karakterisert som en kraftig musemodell av SBMA9. Ikke-transgene littermates ble brukt som kontroller (nCTRL= 8). SBMA er en sex-begrenset sykdom som fullt manifesterer i menn bare, så mannlige mus ble brukt utelukkende for denne studien. Under planleggingen stadier, må forskerne ta hensyn til National Institutes of Health ' s betraktninger av sex som en biologisk variabel for å bestemme gruppe størrelser og sammensetning18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle tester utført med mus ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Duke University. Personell som er ansvarlige for testing og scoring må være blindet av dyre genotype eller eksperimentell tilstand inntil gange analyse og scoring av papirer er fullført for hele kohort.
1. testing materiale forberedelse
- Gjennomføre testing med en tunnel bygget fra 3 pre-cut klar akryl paneler som er 0,375 inches tykk. Monter tunnelen ved å lime paneler sammen med en tetningsmasse som spesielt obligasjoner akryl og vil ikke avgi lukt når tørket.
- Bruk følgende tunnel målinger for standard C57BL/6-mus: 2,5 i. Wide, 3 in. High og 13 in. Long. Mus må være i stand til å komfortabelt gå gjennom tunnelen og ta nok skritt (> 4), slik at gange kan måles.
- Konstruere målet kammer med pre-cut grå akryl paneler 0,375 inches tykk, limt sammen med samme tetningsmasse som brukes på tunnelen. Interiøret målinger av kammeret er 4 i. Wide, 4 i. lang, og 3 i. høy. Matche åpningen av dette kammeret til åpningen av tunnelen (2,5 i. Wide x 3,0 in. høy). Fordi musene foretrekker naturlig mørke områder til godt opplyste områder, bør du bruke materiale som er ugjennomsiktig og mørk i farger.
- Bruk papir til å spore trinn som er tykke og glatte (akvarell papir fungerer godt). Skjær individuelle papirer strimler å være litt bredere og lengre enn bredden og lengden på tunnelen. Hvis du bruker tunnel dimensjonene som er beskrevet her, må du kutte papirene til 15 i. Long med 3,5 i. Wide.
- Bruk to kontrasterende farger (f. eks grønn og lilla) av ikke-giftig vaskbare vannbasert maling. Tilordne en farge for bakbena, den andre for forelimbs. Mus vil slikke den resterende malingen fra sine føtter etter testing, slik at den valgte malingen må være fullstendig ikke giftig.
- Bruk to runde fat malekoster, en for hver maling farge (~ 0,5 cm i diameter, konisk/spiss pensel spissen).
- Velg en linjal med markeringer ned til millimeter, og en tykkelse med målinger ned til 0,1 mm. blyant anbefales å skrive på scoring papirene.
- Valgfritt: for dyr med høy angst eller lav motivasjon, gi en atferdsdata insentiv i mål kammeret. Dette kan inkludere små mengder sterilisert solsikke frø (plassert i hjemmet buret 2 dager før testing for å tillate tilvenning). På dagen for testing, sted solsikke frø inne i målet kammer å oppmuntre mus til å gå gjennom uten å stoppe.
2. data innsamling
- Hvis testingen utføres i et eget rom, acclimate musene til det nye rommet i 30 minutter, og start deretter atferds analysene. I tillegg, fordi mus er naturlig nattlige, sikre at alle mus er fullt våken og våken i minst 5 minutter før testing.
- Klargjør Test oppsettet ved å plassere tunnelen over papiret og merke papiret med muse-ID og test dato. Plasser mål kammeret i enden av tunnelen, og koble begge åpne endene. Legg solsikke frø på slutten av tunnelen (inne i mål kammeret) for motivasjon hvis nødvendig.
- Fjerne musa å bli testet fra dens bur og grep den bestemt av dens scruff, gjør sikker å grep halen å stabilisere bevegelse av dens bakben lemmer.
- Paint forepaws slik at hele undersiden av alle tær og midten av foten er fullstendig dekket av maling. Gjenta dette med en kontrast farge maling på bakbena. Tørk av eventuell maling som musen får på andre deler av kroppen med en ren, fuktig klut for å forhindre flekker som kan forstyrre datainnsamlingen.
Merk: mus håndtering må utføres av erfarne forskere for å minimere dyr stress. - Plasser musen i starten av tunnelen og la den gå hele veien inn i mål kammeret, og deretter hente musen, tørk forsiktig av føttene med en vann-fuktet klut, og returnere den til sitt hjem buret.
- La papir med fotavtrykk tørke helt før scoring. Tørk ned testområdet og tunnelen med etanol eller tilsvarende rengjøringsmiddel mellom hvert dyr.
3. kriterier for poeng
- Bruk trinn som er jevnt fordelt med klare, ikke-flekkete fotavtrykk for scoring. Figur 1B er et godt eksempel på et fotavtrykk sekvens som kan scores. For å kunne generere tilstrekkelig poengsum data, må det være minst 2 påfølgende trinn fra hver fot, men 4-6 trinn per fot anbefales. Ikke ta med første og siste fotavtrykk på papiret, da de neppe vil representere normal gange fordi musen endrer sin gange hastighet.
- Bruk skrittlengde, stride bredde og tå spredt som tre forskjellige mål på gange som kan analyseres ved hjelp av denne metoden.
Merk: stride lengde og bredde krever klare sekvensielle utskrifter der forfoten regionen er godt definert i maling. Toe spredning krever ikke sekvensielle utskrifter for scoring, bare klare utskrifter av den første og siste tærne på en enkelt fot. Men hvis et gitt fotavtrykk ikke er inkludert i målinger av skrittlengde eller bredde, kan det ikke scoret for tå spredning. Alle tre tiltak er vurdert i centimeter.- Definer skrittlengde som avstanden mellom to sekvensielle fotavtrykk som er laget av samme fot (dvs. ett skritt) (figur 1A, 1B).
- Med en blyant, tegne en 2-4 mm sirkel rundt forgrunnen-fots regionen av begge forlemen fotavtrykk (identifisert av tildelt farge ovenfor) i et enkelt skritt og tegne en linje mellom dem ved hjelp av en linjal.
- Registrere avstanden mellom to utskrifter fra midten av hver sirkel (dvs. midten av hver fot pad) som høyre-forgrunnen 1 (RF1) eller venstre-forgrunnen 1 (LF1).
- Gjenta for alle trinnene som kan scores (RF2, LF2, RF3, LF3 og så videre).
- Gjenta for høyre og venstre bakben-lem fotavtrykk.
- Gjennomsnittlig alle individuelle innspilte skrittlengde avstander for hver lem. For statistiske analyser kan individuelle kohort medlemmer være samlet i gjennomsnitt.
- Definer skritt bredde som mål for avstand mellom venstre og høyre forelimbs eller bakbena (figur 1A, 1B).
- For å vurdere denne avstanden, tegner og måler du en linje fra området rundt forfoten i en bakben som skjærer vinkelrett med linjen for skrittlengde på kontralateral bakben.
- Gjenta dette for alle utskrifter som kan scores, og deretter gjennomsnittlige målingene. Beregningsmetoden for skritt bredde er den samme for forgrunnen og bakbena.
- Definer toe Spread som avstanden mellom første og siste tå på et enkelt fotavtrykk eller bakben (figur 1a, 1B).
- Bruk markører for å måle avstanden mellom spissen av den første toe print og spissen av den siste tåen print.
- Gjenta dette for alle Trykk på bakben som kan måles og gjennomsnittlige målingene. Beregningsmetoden for tå spredning er den samme for forgrunnen og bakbena.
- Definer skrittlengde som avstanden mellom to sekvensielle fotavtrykk som er laget av samme fot (dvs. ett skritt) (figur 1A, 1B).
- Hvis papiret ikke kan scores, la dyret hvile i 10 minutter før du prøver på nytt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med tilstrekkelig antall dyr, er denne prosedyren i stand til å oppdage gange forskjeller mellom mus genotyper, innenfor den samme belastningen over tid. Figur 1B viser representative spor av fotavtrykk bilder samlet i laboratoriet vårt, ved hjelp av en mus modell av X-koblet spinal og Bulbar muskel ATROFI (SBMA), en nevrodegenerative lidelse som påvirker lavere motoriske neurons og skjelettlidelser muskel. Vi har tidligere rapportert at mannlige BAC fxAR121 transgene mus utvikle betydelig vekttap, nedskrivninger i grep styrke, og forkortet skrittlengde på post-symptomatisk aldre sammenlignet med ikke-transgene littermate kontroller9.
Her presenterer vi gange analyseresultater fra en kohort av pre-symptomatisk (2,5 måneders alder) og post-symptomatisk (9 måneders alder) BAC fxAR121 transgene og littermate kontroll mannlige mus (figur 2). Før sykdomsutbruddet viser BAC fxAR121 transgene mus tilsvarende skrittlengde, skritt bredde og tå spredning sammenlignet med deres littermate ikke-transgene kontroller. Etter sykdomsutbruddet viser BAC fxAR121 transgene mus betydelig kortere skrittlengde (pforlemen= 0,001, phind-lemmer= 0,009) (figur 2a). Lignende langsgående analyse avdekket ingen forskjeller i skrittlengde bredde på enten alder testet (p2.5 måneder= 0,709, p9 måneder= 0,204) (figur 2b). Post-symptomatisk BAC fxAR121 transgene mus har også betydelig smalere hind toe spredning (p = 0,01) enn alder-matchet littermate kontroller (figur 2C). BAC fxAR121 mus modell en nevromuskulær sykdom som hovedsakelig påvirker hind-lemmer, så detaljerte tiltak for forlemen gange ble ikke samlet inn. Vi oppfordrer forskere bruker denne gange analysemetode for å vurdere fenotype av deres mus modeller og velge forlemen eller hind-lem gange beregninger tilsvarende.
Figur 1: gange analyse tiltak og feilsøking.
A. skjematisk fremstilling av gange analyse på mus, som viser skrittlengde, skritt bredde, og toe spre informasjon. B. representativt eksempel på en gange analyse fotavtrykk sekvens som kan scores, som viser måling av alle tre parametrene. C. representative eksempler på problematisk gange analyse fotavtrykk sekvenser som ikke kan scores. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: SBMA BAC fxAR121 transgene mus viser en progressiv, nevrodegenerative gange fenotype som kan oppdages via gange analyse.
A. til tross for ingen forskjeller på pre-symptomatisk aldre (2,5 måneder, nCTL= 11, nEXPT= 12), BAC fxAR121 mus utvikle betydelig redusert skrittlengde i forhold til deres ikke-transgene littermate kontroller på post-symptomatisk stadier (9 måneder, nCTL= 8, nexpt= 12). B. ingen endringer ble oppdaget i skrittlengde bredde i begge aldre. C. SYMPTOMATISK SBMA BAC fxAR121 transgene mus viser signifikant redusert tå i bakben lem i forhold til ikke-transgene littermate kontroller. N = 8-12/gruppe. ANOVA med post-hoc Tukey test * p < 0,05, * * p < 0,01. Feilfelt representerer SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruke lave kostnader gange analysemetoden beskrevet ovenfor, viser vi vellykket identifisering av flere parametre for gange dysfunksjon på post-symptomatisk aldre i BAC fxAR121 musemodell av SBMA. Reduksjoner i skrittlengde er konsistent med tidligere SBMA studier av musemodeller og menneskelige pasienter9. Vi viser også for første gang at det er betydelige forskjeller i tå i bakben i symptomatisk SBMA-mus sammenlignet med ikke-transgene littermate kontroller. Interessant, nedgang inne bakben toe spredning kan forårsaket av svakhet inne pote extensor muskelen, tetthet inne pote flexor muskelen, eller fattig nerve innervasjon2,19, hvilke er likeledes forenlig med det etiologi av SBMA.
Musene bør lett kjøre til målet kammeret på grunn av deres naturlige atferdsmessige preferanse for små mørke mellomrom, men noen mus kan ikke kontinuerlig bevege seg gjennom tunnelen. Hvis en mus hopper, stopper eller snur seg rundt i tunnelen (se eksempler i figur 1C), gjentar du analysen etter en hvileperiode på et nytt resultat papir. Resultatene kan bli salvageable hvis en mus stopper helt i begynnelsen av tunnelen, siden den ofte kan prodded til å kjøre til mål boksen.
Bruk for mye eller for lite maling til en mus føtter kan produsere ubrukelige resultater. Overflødig maling kan føre til flekkete eller forvrengte utskrifter, mens utilstrekkelig maling kan produsere svake eller uidentifiserbar utskrifter (figur 1C). I begge tilfeller, gjenta analysen på en ren scoring papir for å hindre unøyaktige målinger.
Svært unge mus (< 3 måneder gammel) er mer sannsynlig å hoppe fremover i tunnelen, mens eldre (> 8 måneder gammel) eller svært fenotypiske mus er mer sannsynlig å stoppe eller motstå fremover bevegelse helt. Legge til en atferdsdata insentiv (solsikke frø) i mål kammeret kan bidra til å redusere hyppigheten av problematisk atferd ved å oppmuntre umotivert mus å krysse tunnelen uten å stoppe.
Tunnel dimensjoner bør gjenspeile dimensjonene av faget; Hvis du bruker mus som er betydelig større eller mindre enn en gjennomsnittlig lab mus (på grunn av alder, diett, eller genetiske mutasjoner), anbefaler vi å endre tunnelen og mål kammer dimensjoner for å matche dyrets størrelse. I tunnelen, bør musene være i stand til å gå komfortabelt i en rett linje, men bør ha noen problemer med å snu rundt for å motvirke dette problemet. Mål kammeret skal samsvare med høyden på tunnelen og mus skal passe komfortabelt inne i kammeret.
Forskere som bruker toe-klipping metode for identifisering for sine mus kan ikke være i stand til å samle inn data på tå spredt, men andre tiltak for å gange som skrittlengde og stride bredde kan fortsatt bli samlet. Toe-klipping ikke signifikant innvirkning gange i mus så lenge ikke mer enn to tær er avkuttet per mus20.
Denne metoden for gange analyse reflekterer ikke kognitiv funksjon, så det bør ikke brukes som et mål på kognisjon. Andre har til hensikt å bruke denne metoden bør vurdere nevromuskulær grupper berørt i deres musemodell, og deretter velge fore-eller bak benet beregninger tilsvarende. Denne metoden for gange analyse er ikke anbefalt for forskere som studerer smerte reaksjoner som krever footpad injeksjoner, eller for studier som krever biomekaniske tiltak av bevegelse som ikke kan beskrives av fotavtrykk alene, som timelige målinger av lem bevegelse eller felles rotasjon21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke A.M. for dyr identifisering assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra US National Institutes of Health (R01 7 RF1 AG057264 til A.R.L.S. og C.J.C. og R01 NS100023 til S.a. S) og muskuløse dystrofi Association (Basic Research Grant til A.R.L.S., Development Grant til C.J.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Caliper | n/a | n/a | must have markings down to 0.1 mm |
| Craft Glue | E6000 | n/a | |
| Footprint Paint (Tempera Paint) | Artmind | n/a | must be non-toxic |
| Round Barrel Paintbrushes | Symply Simmons | n/a | 0.5 cm diameter |
| Ruler | n/a | n/a | must have markings down to millimeters |
| Scoring Paper (Watercolor Pads) | Canson | n/a | cut to size |
| Tunnel and Goal Chamber | Interstate Plastics | n/a | cut to size |
References
- Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73 (1-2), 159-164 (2001).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 Unit 8 (2001).
- Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Exercise induces behavioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson's disease. Neuroscience. 119 (3), 899-911 (2003).
- Pallier, P. N., Drew, C. J., Morton, A. J. The detection and measurement of locomotor deficits in a transgenic mouse model of Huntington's disease are task- and protocol-dependent: influence of non-motor factors on locomotor function. Brain Research Bulletin. 78 (6), 347-355 (2009).
- Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
- Cortes, C. J., et al. Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 82 (2), 295-307 (2014).
- D'Hooge, R., et al. Neuromotor alterations and cerebellar deficits in aged arylsulfatase A-deficient transgenic mice. Neuroscience Letters. 273 (2), 93-96 (1999).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
- Harper, S. Q., et al. RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5820-5825 (2005).
- Lin, C. H., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
- Sopher, B. L., et al. Androgen receptor YAC transgenic mice recapitulate SBMA motor neuronopathy and implicate VEGF164 in the motor neuron degeneration. Neuron. 41 (5), 687-699 (2004).
- Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178 (1), 80-90 (2002).
- Wheeler, V. C., et al. Early phenotypes that presage late-onset neurodegenerative disease allow testing of modifiers in Hdh CAG knock-in mice. Human Molecular Genetics. 11 (6), 633-640 (2002).
- Clayton, J. A., Collins, F. S. Policy: NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 509 (7500), 282-283 (2014).
- Maricelli, J. W., Lu, Q. L., Lin, D. C., Rodgers, B. D. Trendelenburg-Like Gait, Instability and Altered Step Patterns in a Mouse Model for Limb Girdle Muscular Dystrophy 2i. PLoS One. 11 (9), e0161984 (2016).
- Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Animals. 44 (2), 88-103 (2010).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
